Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Химическая инактивация E3 Ubiquitin Ligase Cereblon по помалидомидной основе Homo-PROTACs

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59472
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 2, 1
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn
* These authors contributed equally

Summary

Эта работа описывает синтез и характеристику помалидомида основе, бифункциональный гомо-PROTAC как новый подход, чтобы вызвать убиквитинирование и деградацию E3 убиквитин лигазе цереблон (CRBN), цель аналогов талидомида.

Abstract

Иммуномодулирующие препараты (IMiDs) талидомид и его аналоги, леналидомид и помалидомид, все одобренные FDA препараты для лечения множественной миеломы, вызывают униквитивание и деградацию лимфоидных транскрипционных факторов Ikaros (IK-F1) и Aiolos (IK-F3) через цереблон (CRBN) E3 убиквитин лигаза для протеасомальной деградации. IMIDs недавно были использованы для генерации бифункционального протеолиза ориентации химер (PROTACs) для целевой других белков для убликвитина и протеасомальной деградации CRBN E3 лигазы. Мы разработали и синтезировали помалидомидна основе гомобифункциональных PROTACs и проанализировали их способность вызывать самостоятельной повсеместности и деградации CRBN. Здесь, CRBN служит как, E3 убиквитин лигаза и цель в то же время. Соединение гомо-ПРОТАК 8 ухудшает CRBN с высокой потенцией с минимальным оставшимся воздействием на Ik-F1 и IK-F3. Инактивация CRBN соединением 8 не оказала влияния на жизнеспособность клеток и пролиферацию различных линий клеток миеломы. Это гомо-PROTAC отменяет эффекты ИМИД в нескольких клетках миеломы. Таким образом, наши гомодимерные соединения на основе помалидомида могут помочь определить эндогенные субстраты и физиологические функции CRBN и исследовать молекулярный механизм ИМИД.

Introduction

Иммуномодулирующие препараты (IMiDs) талидомид и его аналоги, леналидомид и помалидомид, все одобренные для лечения множественной миеломы, связываются с E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), субстратным адаптером для cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Связывание ИМиД повышает сродство CRL4CRBN к лимфоидным транскрипционным факторам Ikaros (IK-F1) и Айолосу (Ik-F3), что приводит к их увсеквитизации и деградации(рисунок 1)4,5, 6 , 7 (г. , 8. В виду того что IK-F1 и IK-F3 необходимы для множественных клеток миеломы, их инактивация приводит к ингибированию роста. SALL4 был недавно найден в качестве дополнительного IMiD-индуцированного нео-субстрата CRBN, который, вероятно, несет ответственность за тератогенность и так называемую катастрофу Контерган в 1950-х годов, вызванных талидомид9,10. В отличие от этого, казеин киназы 1 "(CK1" является леналидомид-специфический субстрат CRBN, который вовлечен в терапевтический эффект в миелодиспластический синдром с хромосомой 5q делети11.

Способность малых молекул ориентироваться на конкретный белок для деградации является захватывающим следствием для современного развития лекарств. В то время как механизм талидомида и его аналогов был обнаружен после их первого использования в организме человека, так называемый Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) были разработаны специально для целевой белок, представляющий интерес (POI) (Рисунок 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs являются гетеробифункциональные молекулы, которые состоят из конкретного лиганд для POI подключен через ссылку на лиганд E3 убиквитин лигаза, как CRBN или фон-Гиппель-Линдау (VHL)18,19,20, 21,22. PROTACs индуцировать формирование переходного тернари комплекса, направляя POI к E3 убиквитин лигаза, в результате его повсеместности и протеасомальной деградации. Основные преимущества PROTACs по сравнению с обычными ингибиторами заключается в том, что связывание с POI является достаточным, а не его ингибирование и, следовательно, PROTACs потенциально может целевой гораздо более широкий спектр белков, включая те, которые считались неприсменяемыми, как транскрипции факторы15. Кроме того, химерные молекулы действуют каталитически и поэтому обладают высокой потенцией. После переноса убиквитина в POI, тернарийкомплекс отделяется и доступен для формирования новых комплексов. Таким образом, очень низких концентраций PROTAC достаточно для деградации целевого белка23.

Здесь мы описываем синтез pomalidomide-pomalidomide конъюгированный гомо-PROTAC (соединение 8), который набирает CRBN для деградации себя24. E3 ubiquitin ligase CRBN служит как вербовщики и цели в то же время (Рисунок 3). Для проверки наших данных мы также синтезировали отрицательный связывающий контроль (соединение 9). Наши данные подтверждают, что недавно синтезированный homo-PROTAC специфичен для деградации CRBN и оказывает лишь минимальное воздействие на другие белки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка молекул PROTAC

ПРЕДУправление: Пожалуйста, проконсультируйтесь со всеми соответствующими листами данных о безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в этих синтезах, являются токсичными и канцерогенными. Пожалуйста, используйте все соответствующие методы безопасности и средства индивидуальной защиты.

  1. Препарат терт-бутил N-(2,6-диоксо-3-пиперидиил)карбамат (соединение 1)
    1. Добавьте 1,1'-карбонимидидазол (1,95 г, 12 ммоль) и каталитическое количество 4-(диметиламино)пиридин (5 мг) в смесь Бок-Глн-ОХ (2,46 г, 10 ммоль) в THF (50 мл) в 100 мл нижней флакны с песочкой и сжимать. Тепло при рефлюксе в течение 10 ч при помешивая, пока не образуется четкий раствор.
    2. Снимите растворитель под пониженным давлением с помощью роторного испарителя, добавьте EtOAc (200 мл) и перенесите его в сепараторную воронку. Вымойте органический слой с H2O (50 мл) и рассол (50 мл) и высушите его над Na2SO4.
    3. Фильтр раствора через короткую площадку кремнезема гель (5 см в диаметре и 5 см высотой) и eluate с дальнейшим объемом (200 мл) EtOAc.
    4. Испарите растворитель и высушите полученный бесцветный твердый в вакуо.
  2. Приготовление терт-бутил N-(1-метил-2,6-диоксо-3-пиперидиил) карбамат (соединение 2)
    1. Смешайте соединение 1 (2,28 г, 10 ммоль) с карбонатом из флята из фрезерова (2,76 г, 20 ммоль) и DMF (25 мл) в круглой нижней колбе 100 мл. Добавьте йодометан (1,42 г, 0,62 мл, 10 ммоль) с помощью шприца и оборудуйте колбу проколотой резиновой перегородкой. Поместите реакционный сосуд в ультразвуковую ванну на 2 ч.
    2. Разбавить реакционную смесь EtOAc (100 мл) и перенести ее в сепараторную воронку. Вымойте органический слой с 1 N NaOH (2x 25 мл), H2O (25 мл), и рассол (25 мл), и высушить его над Na2SO4.
    3. Фильтр и испарять растворитель. Очистите продукт по колонке хроматографии над кремнеземом гель (6 см диаметр омицы и 20 см высотой) с помощью нефтяного эфира / EtOAc (2:1).
  3. Препарат 2-(2,6-диоксопипитридин-3-ил)-4-фтороизоиндолин-1,3-дион (соединение 3)
    1. Смешайте 3-фтортофталинический ангидрид (1,25 г, 7,5 ммоль), глутаримид 1 (1,14 г, 5 ммоль) и раствор ацетата натрия (0,50 г, 6,0 ммоль) в ледниковой уксусной кислоте (20 мл) в 50 мл круглой нижней колбы с перемешиванием и оборудованным рефлексом. Нагрейте смесь при температуре 120 градусов по Цельсию в течение 6 ч.
    2. После охлаждения залить фиолетовую смесь на H2O (100 мл) и перемешать в течение 10 мин. Соберите образовавшиеся твердые фильтрации, промойте H2O (3 х 5 мл) и нефтяной эфир (3 - 5 мл) и высушите в вакуо.
  4. Препарат 4-фтор-2-(1-метил-2,6-диоксопипипидин-3-ил) изоиндолин-1,3-дион (соединение 4)
    1. Смешайте 3-фтортофтальный ангидрид (1,25 г, 7,5 ммоль), глутаримид 2 (1,21 г, 5 ммоль) и раствор ацетата натрия (0,50 г, 6,0 ммоль) в ледниковой уксусной кислоте (20 мл) в 100 мл круглого нижнего колбы с перемешиванием и оснащенным рекоменсом. Нагрейте смесь при температуре 120 градусов по Цельсию в течение 6 ч.
    2. После охлаждения залить фиолетовую смесь на H2O (100 мл) и перемешать в течение 10 мин. Соберите образовавшиеся твердые фильтрации, промойте H2O (3 х 5 мл) и нефтяной эфир (3 - 5 мл) и высушите в вакуо.
  5. Приготовление терт-бутил N--2-2--2--2-(2,6-диоксо-3-пиперидиил)-1,3-диоксо-изоиндолин-4-ил-амино-этикси-этил-карбамат (соединение 7)
    1. Заряжайте 50 мл круглой нижней колбы с тертом-бутил N- 2---2-(2-аминоэтокси)этил-карбамат (5, 0,41 г, 1,65 ммоль), соединение 3 (0,41 г, 1,50 ммоль), сухой DMF (10 мл) и DIPEA (0,39 г, 0,51 мл, 3,0 ммоль). Оборудуйте с перемешивания бар и рефлюкс конденсатор. Тепло под атмосферой аргона при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 10 ч.
    2. После охлаждения до комнатной температуры, залить темно-зеленую смесь на H2O (100 мл) и извлечь с EtOAc (3x 50 мл) в сепараторной воронке. Вымойте комбинированные органические слои с H2O (50 мл) и рассолом (50 мл), высушите над Na2SO4,фильтруйте и концентрируйте в vacuo.
    3. Очистите сырой продукт по колонке хроматографии над кремнезема гель (3 см диаметром колонки и 60 см высотой) с помощью градиента нефтяного эфира / EtOAc (1:1 до 1:2).
  6. Приготовление омодимера (соединение 8)
    1. Объедините связующее звено 6 (0,22 г, 0,22 мл, 1,50 ммоль), DIPEA (1,05 мл, 6,00 ммоль) и раствор 3 (0,83 г, 3,00 ммоль) в сухом ДМСО (20 мл) в 50 мл нижнего флаконса с помощью бара и сжимателя. Тепло под атмосферой аргона при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 18 ч.
    2. После охлаждения до комнатной температуры, залить темно-зеленую смесь на H2O (100 мл) и извлечь с EtOAc (3x 50 мл) в сепараторной воронке. Вымойте комбинированные органические слои с H2O (50 мл) и рассолом (50 мл), высушите над Na2SO4,фильтруйте и концентрируйте в vacuo.
    3. Очистите сырой продукт по колонке хроматографии над кремнезема гель (3 см диаметр омицы и 50 см высотой) с помощью градиента нефтяного эфира / EtOAc (1:2) к EtOAc.
  7. Приготовление неогородимного (соединение 9)
    1. Растворите соединение 7 (0,83 г, 1,65 ммоль) в сухом CH2Cl2 (10 мл). Добавить трифтороацетической кислоты (10 мл) и перемешать желтую смесь при 40 градусах по Цельсию в течение 2 ч в закрытой 50 мл круглой нижней колбы.
    2. Удалите летучие вещества и coevaporate с CH2Cl2 (4x 5 мл). Высушите остатки в вакуо в течение 10 ч.
    3. Растворите материал в сухом DMF (20 мл). Добавьте соединение 4 (0,44 г, 1,50 ммоль) и DIPEA (0,78 г, 1,05 мл, 6,00 ммоль) и оборудуйте колбу рефлюксным конденсатором. Тепло под атмосферой аргона при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 10 ч.
    4. После охлаждения до комнатной температуры, залить темно-зеленую смесь на H2O (100 мл) и извлечь с EtOAc (3x 50 мл) в сепараторной воронке. Вымойте комбинированные органические слои насыщенными NaHCO3 (50 мл), H2O (50 мл), 10% KHSO4 (50 мл), H2O (50 мл) и рассолом (50 мл), сухим над Na2SO4,фильтром и концентратом в vacuo.
    5. Очистите сырой продукт по колонке хроматографии над кремнезема гель (3 см диаметр омицы и 50 см высотой) с помощью градиента нефтяного эфира / EtOAc (1:2) к EtOAc.
    6. Разъясняйте и проверяйте структуру молекулы(Рисунок 5A соединение 8, 5B соединение 9) на 1H NMR и 13C NMR спектра в DMSO-d6 на ядерном магнитном резонансе (NMR) Спектрометр. Убедитесь, что чистота обоих соединений выше 97% с помощью жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS), применяя диодное обнаружение массива (DAD) на уровне 220-500 нм.

2. Функциональная проверка молекул PROTAC

  1. Западный анализ поблужки деградации CRBN PROTACs
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффекты соединения8и соединения9 До 9на уровне белка CRBN были протестированы западным анализом поблучника. Кроме того, можно было бы также подтвердить влияние на уровни ИК-Ф1 и ИК-Ф3 (Рисунок 6).
    1. Подготовка образцов
      1. Растворите соединения 8 и 9,леналидомид (Лен), помалидомид (Пом), MG132 и MLN-4924 в DMSO при концентрации 10 мМ, аликот и хранить при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего использования.
      2. Семена 1 х 106 MM1S клеток в 6-колодец пластины с 2,5 мл средств массовой информации и лечения клеток с 100 НМ или 1 ММ соединение 8 или 9 для 24 ч.
      3. Урожайные клетки после лечения и центрифуга при 700 х г,5 мин, 4 кв. C. Вымойте клеточные гранулы с холодной 1x PBS, чтобы удалить оставшиеся средства массовой информации, центрифуга на 700 х г, 5 мин, 4 КК, и отбросить супернатанта. Повторите этот шаг один раз.
      4. Лисы клетки в буфере лисиса (25 мм Tris HCl рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1 мМ EDTA, 5% глицерол, 1x Протеазия и Фивидис Ингибитор Коктейль) для 10 мин на льду, центрифуга на 320 x г. Урожай супернатант и определить концентрацию белка по анализу белка bicinchoninicкислоты (BCA анализ) в соответствии с протоколом производителя.
      5. Денатурные белки (15–30 мкг/образец) с 1x буфером загрузки СПД (5% 2-меркаптоэтанол) и кипятить 10 мин, 75 градусов по Цельсию.
    2. SDS-PAGE
      1. Исправить гель сэндвич с 10% отделяющий гель 4 мл 3x гель буфер (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) сульфат натрия додецил (SDS), рН 8,45), 4 мл акриламида 30%, 2,52 мл глицерола 50%, 1,395 мл H2O, 75 л 11% гульфата аммония (APS), и 9,75 л TEMED и 4% укладка геля Буфер геля 1,992 мл, 0,792 мл 30% акриламида, 3,168 мл Л Н2О, 36 л 11% APS и 6 л TEMED в блоке сборки электродов. Удалите гребни, промыть скважины катодным буфером (100 мм Tris/HCl, 100 мМ трицин, 0,1% (w/v) SDS), и загрузить образцы.
      2. Заполните буфер анода (100 мМ Tris/HCl, pH 8.9) в бак. Загрузите протеиновый образец со ступени 2.1.1.4 и запустите SDS-PAGE на 70 В, 20 мин, а затем 115 V, 150 мин при постоянном напряжении.
    3. Иммуноблоттинг и обнаружение CRBN, IK-F1 и IK-F3
      1. Активировать мембрану PVDF (0,45 мкм) в 100% метанола на 1 мин. Экипратная мембрана и отделяющий гель в 1x переносном буфере (192 мМ глицин, 25 мм Трис-база/HCl, 900 мл H2O), 20% метанол, 0,1% SDS, pH 3.
      2. Соберите блоттинг кассеты в соответствии с протоколом производителя. Передача геля при 180 мА за 90 мин.
      3. Вымойте мембрану 3x в 1x TBS-T (25 мм Tris/HCl, 150 мМ NaCl, рН 7.6, 0.1% Tween 20) для 5-10 мин каждый при комнатной температуре. Блок мембрана в 5% обезжиренного молока (NFDM), TBS-T на 1 ч при комнатной температуре. Вымойте мембрану 3x в 1X TBS-T в течение 5-10 минут каждый при комнатной температуре.
      4. Инкубировать мембрану с первичным антителом для CRBN (1:500 в 5% BSA, TBS-T) с нежной тряской при 4 C, на ночь.
      5. Вымойте мембрану 3x в 1X TBS-T в течение 5-10 минут каждый при комнатной температуре. Инкубировать мембрану с анти-мышь (1:10.000 в 5% NFDM, TBS-T) или анти-кролик (1:5.000 в 5% NFDM, TBS-T) вторичные антитела в сочетании с хреном перекисчиваны HRP (1 ч при комнатной температуре.)
      6. Вымойте мембрану 2x в 1X TBS-T в течение 5-10 минут каждый при комнатной температуре. Повторите этот шаг дважды с 1x TBS.
      7. Инкубировать мембрану на 2 мин с субстратом HRP раствором в соответствии с протоколами производителя и обнаружить хемилюминесценцию в устройстве обнаружения хемилюминесценции.
      8. Вымойте мембрану 1x в 1X TBS в течение 5-10 минут каждый при комнатной температуре. Для высвобождения антител, полоса мембраны в коммерчески доступных зачистки буфера в течение 15 мин. Мыть мембраны 3x в 1X TBS для 5-10 мин каждый при комнатной температуре.
      9. Переблокируйте мембрану в 5% обезжиренного молока, TBS-T на 1 ч при комнатной температуре. Вымойте мембрану 3x в 1x TBS-T в течение 5-10 мин каждый при комнатной температуре и повторно с IK-F1, IK-F3 или тубулин в соответствии с шагом 2.1.3.4.
  2. Конкурсные эксперименты с MG132, MLN4942 или помалидомидом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить, является ли CRBN деградирует через убиквитин-протеасомы пути, мы провели конкурсные эксперименты с ингибитором протеасомы MG132 и недиляционных активации фермента (NAE) ингибитор MLN4942 (Рисунок 7).
    1. Семена 1 х 106 MM1S клеток на хорошо в 6-колодец пластины. Предварительное лечение клеток с 10 ММ MG132, 10 мкм MLN4942, или леналидомид (100x), и инкубировать 1 ч при 37 кс, 5% CO2.
    2. Добавить 100 нм соединение 8 для 3 ч при 37 КС, 5% CO2.
    3. Клетки урожая для западной поместья в соответствии с шагом 2.1.1.
  3. Анализ жизнеспособности клеток в нескольких линиях клеток миеломы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ используется для проверки воздействия на жизнеспособность клеток и, кроме того, антагонизировать влияние ИМИД на несколько клеток миеломы путем предварительной обработки клеток с соединением 8 (Рисунок 8, Рисунок 9A, B).
    1. Семена 5 х 104 MM1S клеток на хорошо в 96-хорошо пластины в биологических трипликации для жизнеспособности асссе. Для западного анализа помок, семена 1 х 106 MM1S клеток на хорошо в 6-хорошо пластины в биологических триплики.
    2. Лечить клетки с DMSO или 100 нм, 1 ММ, или 10 мкм соединение 8, соединение 9 или pomalidomide и инкубировать на 24 ч, 48 ч, или 96 ч при 37 КС, 5% CO2. Для спасательных экспериментов, лечить клетки с 100 нм соединение 8 на 3 ч, до или после добавления 1 ММ помалидомида и инкубировать на 96 ч.
    3. Измерьте люминесценцию пластины 96-наилучшим образом с люминесцентным анализом жизнеспособности клеток, согласно протоколу производителя на считывателе плиты или клетках урожая от 6-хорошей плиты для западного анализа подись.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы описали дизайн, синтез и биологическую оценку гомодимерного помалидомида на основе PROTAC для деградации CRBN. Наш PROTAC взаимодействует одновременно с двумя молекулами CRBN и формирует тернариальные комплексы, которые индуцируют самоубиквитинацию и протеасомальную деградацию CRBN с минимальным оставшимся воздействием на помалидомидные неосубстраты IK-F1 или IK-F3.

Из серии ранее опубликованных помалидомида основе PROTAC молекул24, соединение 8 было особенно эффективным в химической индуцированной деградации CRBN. Его синтез может быть выполнен следующим образом (Рисунок 4). 1,1'-карбонимидазол-раскрученный конденсации Boc защищены l-глютамин приводит к циклизированной имид 1. АналогN-метилированный 2 доступен через алкилирование с метиловым йодидом. Оба строительных блока (1 и 2) преобразуются, после N-де-защиты в кислых условиях, в производные phthalimide (3 и 4) в ходе кольце-открытия / реакции на переработку с использованием 3 флюорофталицический ангидрид. Аналоги талидомида, в целом, подвержены гидролитическому разложению и должны использоваться только на следующем этапе после достаточной высыхания. Соединение 3 подвержено ароматической нуклеофильной замене первичными алифатическими аминами25; было установлено, что это преобразование эффективно осуществляется только при использовании сухих растворителей. Конструкция истинного гомодимерного продукта подразумевает соединение двух одинаковых функциональных подструктур и применение симметричного связующим. Связующее звено, являющееся частью PROTAC 8, представляет собой линевую цепочку на основе N-к-N, полиэтиленовой основе. Соответствующий no, No-диамин 6 приводит к желаемому окончательному составу 8 при реакции со строительным блоком 3 в моляровом рационе 1:2 в ДМСО при 90 градусах По кв. м. Среди других аналитических данных24, структура 8 была проверена Спектра ЯМР (рисунок5A). Соединение 9, разработанное как подходящий отрицательный контроль, имеет лишь минимальные, но критические структурные отклонения, по сравнению с активным гомо-PROTAC 8. Известно, что N-метилирование в рамках части глютаримид отменяет CRBN связывания26,27. Одна часть помалидомида отрицательного контрольного соединения 9 содержит остатки N-метила. Он может быть подготовлен первой нуклеофильной замены 3 с N-монозащищенный связующий строительный блок 5, а затем расщепление Группы защиты Boc и последующее соединение с промежуточным 4. Благодаря своей асимметричной структуре, некоторые из соответствующих углеродов показали различные 13Сигналов NMR C(рисунок 5B).

Гомо-PROTAC 8 был замечен как очень мощный, что приводит к почти полной протеасомальной деградации CRBN. Интерпретация crBN, IK-F1 и IK-F3 уровни белка в нескольких клетках миеломы были подтверждены западным анализом пятнистов(Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 9B), полуколичественный стандартный метод, где изменение белка выражение может быть легко обнаружено. Антитела, используемые в этой работе, имеют хорошее качество, и метод является оптимизированной стандартной процедурой в нашей лаборатории.

Кроме того, деградация CRBN по соединению 8 не повлияла на жизнеспособность клеток и придала сопротивление иМиД (рисунок8, Рисунок 9A), который соответствует CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута CRBN по sgRNAs24. Сигнал люминесценции в анализе жизнеспособности клетки был основан на выпуске АТФа, который может быть истолкован как количество мертвых клеток. Этот метод может быть легко выполнен в течение короткого времени с большим количеством образцов. Альтернативным методом измерения жизнеспособных/мертвых клеток является окрашивание annexin V/ 7-AAD цитометрией потока.

Figure 1
Рисунок 1: E3 ubiquitin лигаза CRBN является основной целью ИД. Иммуномодулирующие препараты связываются с CRBN и вербуют несколько нео-субстратов для протеасомальной деградации. Индуцированная IMiD деградация лимфоидных транскрипционных факторов IK-F1 и IK-F3 отвечает за воздействие на множественные клетки миеломы и некоторые иммуномодулирующие свойства. Казеин киназа 1 "избирательно деградирует леналидомида, но не другие ИМИД и способствует активности леналидомида в миелодиспластический синдром с потерей хромосомы 5q. SALL4 был недавно обнаружен в качестве общей цели всех ИМиД, что, вероятно, связано с тератогенностью, индуцированной талидомидом и его аналогами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: PROTACs деградируют белок интерес (POI). PROTACs являются гетеробифункциональные молекулы, где связующий соединяет убиквитин лигажный лиганд с LIGand POI. При формировании тернариных комплексов, убиквитин лигаза, такие как CRBN, затем убиквитинат POI, в результате чего его протеасомальной деградации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Бифункциональный гомо-ПРОТАК для деградации E3 убиквитин лигаза CRBN. В помалидомид основе гомо-PROTAC, два убиквитин лигаза связующих связаны, чтобы вызвать перекрестное убиквитивание CRBN в результате химически индуцированной нокдаун CRBN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Синтез гомодимера 8 и неогородников 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: 1H NMR (вверху) и 13C NMR (внизу) спектра. Спектры соединения 8 (A) и соединения 9 (B) были зарегистрированы в DMSO-d6 на спектрометре NMR. Химические сдвиги даются по частям на миллион (ppm). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Воздействие соединений 8 и 9 на CRBN, IK-F1 и IK-F3. Соединение на основе помалидомида гомо-ПРОТАК 8 индуцирует деградацию CRBN со слабым оставшимся воздействием помалидомида на ИК-Ф1 и ИК-Ф3. В отличие от этого, соединение 9, содержащее метиловую группу на одном из остатков помалидомида, не влияет на указанные концентрации (ММ). Клетки MM1S лечились для лечения 24 ч. Влияние на CRBN, IK-F1, IK-F3 и тубулин (контроль загрузки) были проанализированы западным пятном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Деградация CRBN может быть заблокирована ингибитором протеасомы MG132 или MLN4942, который блокирует убиквитин лигаза косвенно через ингибирование недитилации. Множественная линия клеток миеломы MM1s была предварительно обработана с 10 мкм MG132, 10 мкм MLN4924 для 1 ч до добавления соединения гомо-PROTAC 8 на 100 нм для 3 ч комбинированного лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Переживание клеток в MM1S множественных клеток миеломы. Эффекты соединения 8 и отрицательного связывающего контрольного соединения 9 на жизнеспособность клеток в помалидомидной чувствительной линии клеток миеломы MM1S после лечения 24 ч, 48 ч и 96 ч. Жизнеспособность клеток измерялась после 4 дней в триплики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: Соединение 8 антагонизирует эффект помалидомида в нескольких линиях клеток миеломы. Клетки были предварительно обработаны с 100 нм соединение 8 для 3 ч. После 1 ММ помалидомд был добавлен. Жизнеспособность клеток измерялась после 4 дней в триплики. р Злт;0,001 в соответствии сT-тест студента (A ). Западный анализ помок для CRBN, IK-F1, IK-F3 и тубулина (контроль загрузки) после предварительной обработки клеток MM1S с соединением 100 нМ 8 на 3 ч, до добавления 1 мкм помалидомида (B). Перепечатано (адаптировано) с разрешения Steinebach, C. et al. 201824. Авторское право 2019 Американское химическое общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Конструкция таких гомо-ПРОТАК, описанных здесь для CRBN, опирается на специфическую близость помалидомда к CRBN, которая успешно используется в многочисленных гетеробифункциональных ПРОТАКи и привела к развитию PROTAC 8 как высоко селективный деградер CRBN. Специфика нашей молекулы уже подтверждена протеомическими анализами24. Для генетически опосредованного нокаута, исключение и проверка побочных эффектов является сложной задачей и отнимает много времени. Кроме того, химически индуцированный нокдаун обратим, быстр и непосредственно применим к широкому спектру клеток и тканей типов28.

IMiDs талидомид, леналидомид и помалидомид стали основой в лечении множественной миеломы, В-клеточных лимфомы и миелодиспластического синдрома. IMIDs посредничают в их деятельности, модулируя специфику лигазы CRBN-CRL4 E3, чтобы ухудшить нео-субстраты IK-F1, IK-F3, или CK1 '6,11,29. Кроме того, IMIDs было показано, чтобы аннулировать функцию сопровождающего CRBN на двух других белков, MCT-1 и BSG, которые также важны для роста множественной миеломы30. Деградация CRBN гомо-бифункциональный PROTAC хорошо переносится большинством протестированных множественных линий клеток миеломы, что означает, что одной инактивации CRBN недостаточно, чтобы вызвать убийство нескольких клеток миеломы. В отличие от этого, предварительное лечение соединением 8 отменило воздействие ИМИД на деградацию ИК-Ф1/3 и спасло несколько клеток миеломы от леналидомида и помалидомида. Это в соответствии с генетической инактивации CRBN и вредных мутаций CRBN, найденных у lenalidomide-резистентных пациентов с множественной миеломой и подчеркивает важную роль CRBN в механизме ИМД31,32 . Таким образом, homo-PROTAC 8 может быть полезным инструментом для имитации состояния сопротивления IMiD. Другие эффекты ИМИД, которые еще не до конца поняты, как ингибирование ангиогенности или высвобождение ТНФЗ, могут быть получены от ингибирования функции CRBN, и наш гомо-ПРОТАК является подходящим инструментом для дальнейшего исследования инактивации CRBN. Кроме того, химически индуцированный нокдаун CRBN соединением 8 может помочь определить новые эндогенные субстраты CRBN и выяснить физиологические функции CRBN. Учитывая, что наше соединение 8 не оказало никакого влияния на пролиферацию линии раковых клеток, торможение CRBN само по себе не имеет противоопухолевой активности. Тем не менее, CRBN деградаторов могут быть клинически применимы при заболеваниях, кроме рака. В этой связи, CRBN инактивации недавно было показано, чтобы придать устойчивость к сепсису и для предотвращения с высоким содержанием жира диеты индуцированного ожирения у мышей 33,34,35.

В заключение мы создали и подтвердили первый химический ингибитор CRBN, который может служить полезным инструментом для будущих биомедицинских исследований по сигнальному и молекулярному механизму талидомида, связанным с CRBN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о потенциальном финансовом конфликте интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (Программа Эмми-Ноэтер Kr-3886/2-1 и SFB-1074 в J.K.; FOR2372 до M.G.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1'-Carbonyldiimidazole TCI chemicals C0119
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) Sigma-Aldrich 385506 Compound 6
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-Fluorophthalic anhydride, 98 % Alfa Aesar A12275
4-Dimethylaminopyridine, 99 % Acros 148270250 Toxic
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) Carl Roth 3029.1
Aiolos (D1C1E) mAB Cell signaling 15103S
Anti-CRBN antibody produced in rabbit Sigma HPA045910
Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody Sigma 7074S
Ammonium Persulfate Roth 9592.2
Boc-Gln-OH TCI chemicals B1649
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Promega G7571
ChemiDoc XRS+ Bio-Rad 1708265
DMF, anhydrous, 99.8 % Acros 348435000 Extra Dry over Molecular Sieve
DMSO, anhydrous, 99.7 % Acros 348445000 Extra Dry over Molecular Sieve
Glycine Sigma-Aldrich 15523-1L-R
Goat anti-mouse (HRP conjugated) Santa Cruz biotechnology sc-2005
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) Thermo Scientific 1861280
Ikaros (D6N9Y) Mab Cell signaling 14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) Merck IPVH000010
Iodomethane, 99 % Sigma-Aldrich I8507 Highly toxic
Methanol Sigma-Aldrich 32213-2.5L
Mg132 Selleckchem S2619
Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell Bio-Rad 1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658004
MLN4942 biomol (cayman) Cay15217-1
Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) Sigma T5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99 % Alfa Aesar A11801
Nonfat dried milk powder PanReac AppliChem A0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate Thermo Scientific 136101
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Thermo Scientific NP0008
Pierce BCA Protein Assay kit Thermo Scientific 23225
Pomalidomide Selleckchem S1567
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 46430
sodium dodecyl sulfate Carl Roth 183.1
Sodium Chloride Sigma-Aldrich A9539-500g
TEMED Carl Roth 2367.3
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate Sigma-Aldrich 89761 Compound 5
Tricin Carl Roth 6977.4
Trizma base Sigma-Aldrich T1503-1kg
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949-500ml
WesternBright ECL spray Advansta K-12049-D50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
  2. Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
  5. Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
  6. Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
  8. Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
  9. Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
  10. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  11. Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
  12. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  13. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  14. Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
  16. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  17. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
  18. Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  19. Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
  20. Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  21. Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  22. Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
  23. Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
  24. Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
  25. Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
  26. Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  27. Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  28. Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
  29. Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
  30. Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
  31. Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
  32. Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
  33. Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
  34. Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
  35. Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).

Tags

Химия Выпуск 147 CRBN PROTAC IMiD помалидомид убиквитин лигаза множественная миелома протеасома
Химическая инактивация E3 Ubiquitin Ligase Cereblon по помалидомидной основе Homo-PROTACs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lindner, S., Steinebach, C., Kehm,… More

Lindner, S., Steinebach, C., Kehm, H., Mangold, M., Gütschow, M., Krönke, J. Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs. J. Vis. Exp. (147), e59472, doi:10.3791/59472 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter