Summary
Detta arbete beskriver syntesen och karakterisering av en pomalidomid-baserade, bifunktionella homo-PROTAC som en ny metod för att inducera ubiquitination och nedbrytning av E3 ubiquitin Ligase cereblon (CRBN), målet för talidomid analoger.
Abstract
Immunmodulerande läkemedel (imider) talidomid och dess analoger, lenalidomid och pomalidomid, alla FDA-godkända läkemedel för behandling av multipelt myelom, inducera ubiquitination och nedbrytning av lymfoida transkriptionsfaktorerna Ikaros (IKZF1) och Aiolos (IKZF3) via cereblon (crbn) E3 ubiquitin Ligase för proteasomen nedbrytning. Imids har nyligen utnyttjats för generering av bifunktionell proteolys inriktning chimärer (PROTAC) att rikta andra proteiner för ubiquitination och proteasomen nedbrytning av crbn E3 Ligase. Vi designade och syntetiserade pomalidomid-baserade homobifunktionella PROTAC och analyserade deras förmåga att inducera självstyrd ubiquitination och nedbrytning av CRBN. Här fungerar CRBN som båda, E3 ubiquitin Ligase och målet på samma gång. Homo-PROTAC Compound 8 försämrar crbn med en hög potens med endast minimala kvarvarande effekter på IKZF1 och IKZF3. CRBN inaktivering av sammansatta 8 hade ingen effekt på cellernas lönsamhet och spridning av olika multipelt myelom cellinjer. Denna homo-PROTAC upphäver effekterna av imider i multipelt myelomceller. Därför, våra homodimeric pomalidomid-baserade föreningar kan bidra till att identifiera CRBN ' s endogena substrat och fysiologiska funktioner och undersöka den molekylära mekanismen för imider.
Introduction
Immunmodulerande läkemedel (imider) talidomid och dess analoger, lenalidomid och pomalidomid, alla godkända för behandling av multipelt myelom, binder till E3 ubiquitin Ligase cereblon (CRBN), en substratadapter för cullin4A-RING E3 ubiquitin Ligase (CRL4crbn)1,2,3. Bindning av imider ökar affiniteten av CRL4crbn till lymfoida transkriptionsfaktorerna Ikaros (IKZF1) och Aiolos (IKZF3), vilket leder till deras ubiquitination och nedbrytning (figur 1)4,5, 6 , 7 , 8. eftersom IKZF1 och IKZF3 är väsentliga för multipelt myelomceller, resulterar deras inaktivering i tillväxthämning. SALL4 hittades nyligen som en ytterligare Imid-inducerad Neo-substrat av crbn som sannolikt är ansvarig för teratogenicitet och den så kallade Contergan katastrof på 1950-talet orsakas av talidomid9,10. Däremot är kasein Kinas 1 α (CK1α) ett lenalidomid-specifikt substrat för crbn som är inblandad i den terapeutiska effekten i myelodysplastiskt syndrom med kromosom 5q borttagningar11.
Möjligheten för små molekyler att rikta ett specifikt protein för nedbrytning är en spännande implifiering för modern läkemedelsutveckling. Medan mekanismen för talidomid och dess analoger upptäcktes efter deras första användning hos människor, så kallade PRoteolysis targeting CHimeras (PROTAC) har utformats för att specifikt rikta ett protein av intresse (POI) (figur 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTAC är heterobifunktionella molekyler som består av en specifik ligand för POI ansluten via en länkare till en ligand av en E3 ubiquitin Ligase som crbn eller von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. PROTAC inducerar bildandet av en övergående ternära komplex, styra POI till E3 ubiquitin Ligase, vilket resulterar i dess ubiquitination och proteasomen nedbrytning. De stora fördelarna med PROTAC jämfört med konventionella hämmare är att bindningen till en POI är tillräcklig snarare än dess hämning och därför kan PROTAC potentiellt rikta ett mycket bredare spektrum av proteiner, inklusive sådana som ansågs vara oruggbara som transkriptionsfaktorer15. Dessutom, chimär molekyler agera katalytiskt och därför har en hög potens. Efter ubiquitin överföring till POI, separerar ternära komplexet och är tillgänglig för bildandet av nya komplex. Därför är mycket låga PROTAC-koncentrationer tillräckliga för nedbrytningen av målproteinet23.
Här beskriver vi syntesen av en pomalidomid-pomalidomid konjugerad homo-PROTAC (förening 8) som rekryterar crbn för nedbrytning av sig själv24. Den E3 ubiquitin Ligase CRBN fungerar som både rekryterare och målet på samma gång (figur 3). För att validera våra data syntetiserade vi också en negativ bindnings kontroll (sammansatt 9). Våra data bekräftar att den nyligen syntetiserade homo-PROTAC är specifik för CRBN nedbrytning och har endast minimala effekter på andra proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av PROTAC molekyler
VAR försiktig: Se alla relevanta Materialsäkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Flera av de kemikalier som används i dessa synteser är giftiga och cancerframkallande. Använd alla lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning.
- Beredning av tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) karbamat (sammansatt 1)
- Tillsätt 1, 1 '-karbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) och en katalytisk mängd av 4-(dimethylamino) pyridin (5 mg) till en blandning av BOC-GLN-OH (2,46 g, 10 mmol) i THF (50 mL) i 100 mL rund botten kolv med en rör bar och utrustad med en återloppskylare. Värm vid reflux under 10 h under omrörning tills en klar lösning bildas.
- Ta bort lösningsmedlet under reducerat tryck med en roterande indunstare, tillsätt EtOAc (200 mL) och överför det till en separatorisk tratt. Tvätta det organiska skiktet med H2O (50 ml) och saltlake (50 ml) och torka den över na2så4.
- Filtrera lösningen genom en kort dyna av kiselgel (5 cm i diameter och 5 cm höjd) och eluera med ytterligare en volym (200 mL) av EtOAc.
- Avdunstnings vätskan och torka den erhållna färglösa fasta i vacuo.
- Beredning av tert-butyl N-(1-metyl-2, 6-dioxo-3-piperidyl) karbamat (förening 2)
- Kombinera sammansatt 1 (2,28 g, 10 mmol) med frästa kaliumkarbonat (2,76 g, 20 mmol) och DMF (25 ml) i en 100 ml rund botten kolv. Tillsätt Jodmetan (1,42 g, 0,62 ml, 10 mmol) droppvis med hjälp av en spruta och utrusta kolven med en punkterad gummiseptum. Placera reaktionskärlet i ett ultraljud bad för 2 h.
- Späd reaktionsblandningen med EtOAc (100 mL) och överför den till en separatorisk tratt. Tvätta det organiska skiktet med 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml), och saltlake (25 ml), och torka den över na2så4.
- Filtret och avdunstnings vätskan. Rengör produkten med kolonnkromatografi över kiselgel (6 cm kolonndiameter och 20 cm höjd) med hjälp av petroleumeter (2:1).
- Beredning av 2-(2, 6-dioxopiperidin-3-yl) -4-fluoroisoindolin-1,3-Dione (Compound 3)
- Kombinera 3-fluorophthalic anhydrid (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) och en lösning av natriumacetat (0,50 g, 6,0 mmol) i isättika (20 ml) i en 50 ml rund botten kolv med en röra bar och utrustad med en återloppskylare. Värm blandningen vid 120 ° c i 6 h.
- Efter kylning, häll den lila blandningen på H2o (100 ml) och rör om i 10 min. samla bildade fast genom filtrering, tvätta med h2o (3 × 5 ml) och petroleumeter (3 × 5 ml) och torr i vacuo.
- Beredning av 4-fluoro-2-(1-metyl-2, 6-dioxopiperidin-3-yl) isoindolin-1,3-Dione (sammansatt 4)
- Kombinera 3-fluorophthalic anhydrid (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 2 (1,21 g, 5 mmol) och en lösning av natriumacetat (0,50 g, 6,0 mmol) i isättika (20 ml) i en 100 ml rund botten kolv med en röra bar och utrustad med en återloppskylare. Värm blandningen vid 120 ° c i 6 h.
- Efter kylning, häll den lila blandningen på H2o (100 ml) och rör om i 10 min. samla bildade fast genom filtrering, tvätta med h2o (3 × 5 ml) och petroleumeter (3 × 5 ml) och torr i vacuo.
- Beredning av tert-butyl N-[2-[2-[2-[2-(2, 6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl] amino] ETHOXY] ETHOXY] etylkarbamat (förening 7)
- Ladda en 50 mL rund botten kolv med tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy) ETHOXY] etoxi] karbamat (5, 0,41 g, 1,65 mmol), compound 3 (0,41 g, 1,50 mmol), torr DMF (10 ml) och dipea (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Utrusta med en rör bar och en återloppskylare. Värme under argon atmosfär vid 90 ° c för 10 h.
- Efter kylning till rumstemperatur, häll den mörkgröna blandningen på H2O (100 ml) och extrahera med etoac (3x 50 ml) i en separatorisk tratt. Tvätta de kombinerade organiska lagren med H2O (50 ml) och saltlake (50 ml), torka över na2så4, filter, och koncentrera sig i vacuo.
- Rena råprodukten genom kolonnkromatografi över kiselgel (3 cm kolonndiameter och 60 cm höjd) med en gradient av petroleumeter/EtOAc (1:1 till 1:2).
- Beredning av homodimer (sammansatt 8)
- Kombinera α, ω-diamine Linker 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), dipea (1,05 mL, 6,00 mmol) och en lösning av 3 (0,83 g, 3,00 MMOL) i torrt DMSO (20 mL) i en 50 ml rund botten kolv med en röra bar och utrustad med en återloppskylare. Värme under argon atmosfär vid 90 ° c för 18 h.
- Efter kylning till rumstemperatur, häll den mörkgröna blandningen på H2O (100 ml) och extrahera med etoac (3x 50 ml) i en separatorisk tratt. Tvätta de kombinerade organiska lagren med H2O (50 ml) och saltlake (50 ml), torka över na2så4, filtrera och koncentrera sig i vakuum.
- Rena råprodukten genom kolonnkromatografi över kiselgel (3 cm kolonndiameter och 50 cm höjd) med en gradient av petroleumeter/EtOAc (1:2) till EtOAc.
- Beredning av heterodimer (sammansatt 9)
- Lös upp substansen 7 (0,83 g, 1,65 mmol) i torr CH2cl2 (10 ml). Tillsätt trifluorättiksyra (10 mL) och rör den gula blandningen vid 40 ° c i 2 timmar i en stängd 50 mL rund botten kolv.
- Ta bort flyktiga ämnen och coevaporate med CH2cl2 (4x 5 ml). Torka återstoden i vakuum för 10 h.
- Redissolve materialet i torrt DMF (20 mL). Tillsätt Compound 4 (0,44 g, 1,50 mmol) och dipea (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) och utrusta kolven med en återloppskylare. Värme under argon atmosfär vid 90 ° c för 10 h.
- Efter kylning till rumstemperatur, häll den mörkgröna blandningen på H2O (100 ml) och extrahera med etoac (3x 50 ml) i en separatorisk tratt. Tvätta de kombinerade organiska lagren med mättade NaHCO3 (50 ml), H2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), h2o (50 mL), och saltlake (50 ml), torka över na2så4, filtrera och koncentrera sig i vacuo.
- Rena råprodukten genom kolonnkromatografi över kiselgel (3 cm kolonndiameter och 50 cm höjd) med en gradient av petroleumeter/EtOAc (1:2) till EtOAc.
- Belysa och kontrollera molekylstrukturen (figur 5a , sammansatt 8, 5b sammansatt 9) med 1H NMR och 13C NMR Spectra i DMSO-d6 på en kärnmagnetisk resonans (NMR) Spektrometer. Kontrollera att renheten hos båda föreningarna är högre än 97% med hjälp av vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS), tillämpa en diodarray Detection (DAD) vid 220 – 500 Nm.
2. funktionell validering av PROTAC molekyler
- Western blot-analys av CRBN nedbrytning av PROTAC
Obs: effekterna av sammansatta8och sammansatta9på CRBN proteinnivå testades av Western blot-analys. Dessutom kan effekterna på IKZF1 och IKZF3 nivåer också bekräftas (Figur 6).-
Provberedning
- Lös upp föreningarna 8 och 9, lenalidomid (len), pomalidomid (POM), MG132 och MLN-4924 i DMSO vid en koncentration av 10 mm, alikvot och förvara vid-80 ° c tills ytterligare användning.
- Utsäde 1 x 106 MM1S celler i en 6-brunn tallrik med 2,5 ml media och behandla celler med 100 nm eller 1 μm sammansatta 8 eller 9 för 24 h.
- Skörd celler efter behandling och centrifugera vid 700 x g, 5 min, 4 ° c. Tvätta cellpelleten med kallt 1x PBS för att avlägsna kvarvarande material, Centrifugera vid 700 x g, 5 min, 4 ° c och Kassera supernatanten. Upprepa detta steg en gång.
- Lyse celler i lysis buffert (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1x proteas & Phosphatase hämmare cocktail) för 10 min på is, Centrifugera vid 320 x g för 10 min, 4 ° c. Skörd supernatanten och bestämma protein koncentrationen av en och syra protein assay (BCA assay) enligt tillverkarens protokoll.
- Denaturering av proteiner (15 – 30 μg/prov) med 1x LDS lastbuffert (5% 2-merkaptoetanol) och koka 10 min, 75 ° c.
-
SDS-PAGE
- Fix gel Sandwich med 10% separerande gel [4 mL 3x gelbuffert (3 M Tris/HCl, 0,3% (vikt/volym) natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8,45), 4 mL akrylamid 30%, 2,52 mL glycerol 50%, 1,395 mL H2O, 75 μl 11% ammoniumpersulfat (APS) och 9,75 μl TEMED] och en 4% Staplings gel [1,992 mL 3x gelbuffert, 0,792 mL 30% akrylamid, 3,168 mL H2O, 36 μl 11% APS och 6 μl TEMED] i en elektrod monteringsenhet. Avlägsna kammar, spola brunnar med katodbuffert (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS) och lastprover.
- Fyll anodbuffert (100 mM Tris/HCl, pH 8,9) i tanken. Fyll på protein prov från steg 2.1.1.4 och kör SDS-sidan på 70 V, 20 min, följt av 115 V, 150 min vid konstant spänning.
-
Immunoblotting och detektion av CRBN, IKZF1 och IKZF3
- Aktivera PVDF membran (0,45 μm) i 100% metanol för 1 min. Equilibrate membran och separera gel i 1x överföringbuffert [10X överföringsbuffert (192 mM glycin, 25 mM Tris-Base/HCl, 900 mL H2O), 20% metanol, 0,1% SDS, pH 8,3].
- Montera blotting kassett enligt tillverkarens protokoll. Överför gel på 180 mA för 90 min.
- Tvätta membran 3x i 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) för 5 – 10 min vardera vid rumstemperatur. Block membran i 5% nonfat-torkad mjölk (NFDM), TBS-T för 1 h vid rumstemperatur. Tvätta membranet 3x i 1X TBS-T i 5 – 10 minuter vardera vid rumstemperatur.
- Inkubera membran med primär antikropp för CRBN (1:500 i 5% BSA, TBS-T) med skonsam skakning vid 4 ° c, över natten.
- Tvätta membranet 3x i 1X TBS-T i 5 – 10 minuter vardera vid rumstemperatur. Inkubera membran med anti-mus (1:10.000 i 5% NFDM, TBS-T) eller anti-kanin (1:5.000 i 5% NFDM, TBS-T) sekundär antikropp kopplad till pepparrot peroxidas HRP (1 h vid rumstemperatur.)
- Tvätta membran 2x i 1X TBS-T för 5 – 10 min vardera vid rumstemperatur. Upprepa detta steg två gånger med 1x TBS.
- Inkubera membran i 2 min med HRP-substratlösning enligt tillverkarens protokoll och detektera kemiluminiscensen i en kemiluminiscensdetekterings apparat.
- Tvätta membran 1x i 1X TBS för 5 – 10 min vardera vid rumstemperatur. För frisättning av antikroppar, remsor membran i kommersiellt tillgängliga strippning buffert för 15 min. Tvätta membran 3x i 1X TBS för 5 – 10 min vardera vid rumstemperatur.
- Reblock membran i 5% nonfat-torkad mjölk, TBS-T för 1 h vid rumstemperatur. Tvätta membran 3x i 1x TBS-T för 5 – 10 min vardera vid rumstemperatur och reprobe med IKZF1, IKZF3 eller tubulin enligt steg 2.1.3.4.
-
Provberedning
- Tävlings experiment med MG132, MLN4942 eller pomalidomid
Anmärkning: för att bekräfta om crbn bryts ned via ubiquitin-proteasom-vägen utförde vi konkurrens experiment med proteasom-hämmaren MG132 och en neddylationaktiverande enzym (Nae)-hämmare MLN4942 (figur 7).- Utsäde 1 x 106 MM1S celler per brunn i en 6-brunn tallrik. Pretreat celler med 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, eller lenalidomid (100x), och inkubera 1 h vid 37 ° c, 5% CO2.
- Tillsätt 100 nM Compound 8 för 3 h vid 37 ° c, 5% Co2.
- Skörde celler för Western blot enligt steg 2.1.1.
- Cell viabilitet analyser i multipelt myelom cellinjer
Anmärkning: denna analys används för att testa effekten på cellernas lönsamhet och dessutom, antagonisera effekten av imider på multipelt myelom celler genom förbehandling av cellerna med sammansatta 8 (figur 8, figur 9a, B).- Utsäde 5 x 104 MM1S celler per brunn i en 96-brunn tallrik i biologiska tripletter för genomförbarhet assay. För Western blot-analys, utsäde 1 x 106 MM1S celler per brunn i en 6-brunn tallrik i biologiska triplicates.
- Behandla celler med DMSO eller 100 nM, 1 μM eller 10 μM sammansatta 8, sammansatta 9 eller pomalidomid och inkubera i 24 h, 48 h eller 96 h vid 37 ° c, 5% Co2. För räddnings experiment, behandla celler med 100 nM Compound 8 för 3 h, före eller efter tillsats av 1 μm pomalidomid och inkubera för 96 h.
- Åtgärd 96-väl plattan luminiscens med en självlysande cell genomförbarhet test, enligt tillverkarens protokoll på en tallrik läsare eller skörd celler från 6-brunnen plattan för Western blot analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskrev vi design, syntes och biologisk utvärdering av en homodimeric pomalidomid-baserade PROTAC för nedbrytningen av CRBN. Vår PROTAC samverkar samtidigt med två crbn-molekyler och bildar ternära komplex som inducerar själv ubiquitination och proteasomen nedbrytning av crbn med endast minimala kvarvarande effekter på pomalidomid-inducerad Neo-substrat IKZF1 eller IKZF3.
Av en serie tidigare publicerade pomalidomidbaserade PROTAC-molekyler24var sammansatta 8 särskilt effektiva i den kemisk-INDUCERADE nedbrytningen av crbn. Dess syntes kan vara fulländad som följer (figurera 4). A 1, 1-carbonyldiimidazol-främjat kondensation av BOC-skyddat l-glutamin blytak till den cyclized imiden 1. Den N-metylerade analoga 2 är tillgänglig genom alkylering med metyljodid. Båda byggklossar (1 och 2) omvandlas, efter N-deprotection under sura förhållanden, till phthalimide derivat (3 och 4) under loppet av en ring-öppning/recyclization reaktion med 3- fluorophthalic anhydrid. Talidomid analoger, i allmänhet, är mottagliga för Hydrolytisk nedbrytning och bör endast användas i nästa steg efter tillräcklig torkning. Förening 3 är mottaglig för en aromatisk nukleofil substitution med primära alifatiska aminer25; denna omvandling konstaterades att gå vidare effektivt endast när torra lösningsmedel används. Utformningen av en sann homodimeric produkt innebär länkare anslutning av två identiska funktionella substrukturer och tillämpningen av symmetriska länkare. Den länkare som ingår i PROTAC 8 representerar en linjär kedja i n-till-n-polyeten. Motsvarande α, ω-diamine 6 leder till önskad slutlig förening 8 när reagerade med byggsten 3 i molar ration av 1:2 i DMSO vid 90 ° c. Bland andra analysdata24kontrollerades strukturen för 8 av NMR Spectra (figur 5a). Sammansatta 9, utformad som en lämplig negativ kontroll, har en enda minimal, men kritisk strukturella avvikelser, jämfört med den aktiva homo-PROTAC 8. Det är bekant att N-methylation inom glutarimiden portionr avskaffar crbn bindning26,27. En pomalidomid del av den negativa kontrollen sammansatta 9 bär en N-metylrester. Det kan förberedas genom en första nukleofila substitution av 3 med N-monoprotected Linker Building block 5, följt av klyvning av BOC skyddande grupp och en efterföljande koppling till mellanliggande 4. På grund av dess asymmetriska struktur uppvisade vissa av de motsvarande kol signalerna distinkta 13C NMR-signaler (Figur 5b).
Den homo-PROTAC 8 observerades för att vara mycket potent, vilket leder till en nästan fullständig proteasomen nedbrytning av crbn. Tolkningen av CRBN-, IKZF1-och IKZF3 proteinnivåer i multipelt myelomceller bekräftades genom analys av Western blot (figur 6, figur 7, figur 9b), en semikvantitativ standardmetod, där förändringen av protein uttryck kan upptäckas enkelt. De antikroppar som används i detta papper är av god kvalitet och metoden är en optimerad standardprocedur i vårt labb.
Dessutom påverkade nedbrytningen av CRBN genom sammansatt 8 inte cellernas lönsamhet och gav resistens mot imider (figur 8, figur 9a), som är i linje med CRISPR/Cas9-medierad knockout av crbn genom sgrnas24. Luminiscens signalen i cellen genomförbarhet analysen baserades på ATP release, som kan tolkas som döda celler. Denna metod kan enkelt utföras på kort tid med ett stort antal prover. En alternativ metod för mätning av livskraftiga/döda celler är en Annexin V/7-AAD färgning av flödescytometri.
Figur 1: den E3 ubiquitin Ligase CRBN är det huvudsakliga målet för IMiDs. Immunmodulerande läkemedel binder till crbn och rekryterar flera Neo-substrat för proteasomen nedbrytning. IMiD-inducerad nedbrytning av lymfoida transkriptionsfaktorer IKZF1 och IKZF3 är ansvarig för effekterna på multipelt myelom celler och några av de immunmodulerande egenskaper. Kasein Kinas 1 α bryts ned selektivt av lenalidomid men inte de andra imiderna och bidrar till aktiviteten av lenalidomid i myelodysplastiskt syndrom med förlust av kromosom 5q. SALL4 upptäcktes nyligen som ett gemensamt mål för alla imider som sannolikt är kopplade till den teratogenicitet som induceras av talidomid och dess analoger. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: PROTAC försämrar proteinet av intresse (POI). PROTAC är heterobifunktionella molekyler, där en länkare ansluter en ubiquitin Ligase ligand till en POI ligand. Genom bildandet av ternära komplex, en ubiquitin Ligase, såsom crbn, sedan ubiquitinates POI, vilket resulterar i dess proteasomen nedbrytning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bifunktionell homo-PROTAC för nedbrytning av E3 ubiquitin Ligase CRBN. I en pomalidomid-baserad homo-PROTAC, två ubiquitin ligasbindemedel är anslutna för att inducera Cross-ubiquitination av CRBN resulterar i en kemiskt inducerad knockdown av CRBN. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: syntes av homodimer 8 och heterodimer 9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: 1H NMR (topp) och 13C NMR (botten) Spektra. Spektrum av sammansatta 8 (a) och sammansatta 9 (B) registrerades i DMSO-d6 på en NMR-spektrometer. Kemiska skiften anges i ppm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: effekter av föreningar 8 och 9 på CRBN, IKZF1, och IKZF3. Pomalidomid-baserad homo-PROTAC-förening 8 INDUCERAR crbn-nedbrytning med svaga kvarvarande effekter av pomalidomid på IKZF1 och IKZF3. Däremot har sammansatta 9 som innehåller en metylgrupp på ett av pomalidomidrester ingen effekt vid de angivna koncentrationerna (μm). MM1S-celler behandlades för 24 h-behandling. Effekter på CRBN, IKZF1, IKZF3 och tubulin (lastning kontroll) analyserades av Western blot. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: crbn nedbrytning kan blockeras av proteasom hämmare MG132 eller av MLN4942 som blockerar ubiquitin Ligaser indirekt via neddylation hämning. Multipelt myelom cellinjer MM1s förbehandlats med 10 μm MG132, 10 μm MLN4924 för 1 h före tillsats av homo-PROTAC sammansatta 8 vid 100 Nm för 3 h kombinerad behandling. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Analys av cellernas genomförbarhet i MM1S multipelt myelomceller. Effekter av sammansatt 8 och negativ bindnings kontroll sammansatt 9 på cellviabilitet i pomalidomid Sensitive myelom cell line MM1S efter 24 h, 48 h och 96 h behandling. Cellernas lönsamhet mättes efter 4 dagar i tre exemplar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Sammansatt 8 gäckar effekten av pomalidomid i multipelt myelom cellinjer. Cellerna var förbehandlade med 100 nM Compound 8 för 3 h. därefter tillsattes 1 μm pomalidomid. Cellernas lönsamhet mättes efter 4 dagar i tre exemplar. p <0,001 enligt Students t-test (a). Western blot analys för CRBN, IKZF1, IKZF3 och tubulin (lastning kontroll) efter förbehandling av MM1S celler med 100 nM Compound 8 för 3 h, före tillsats av 1 μm pomalidomid (B). Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Steinebach, C. et al. 201824. Copyright 2019 amerikanska kemiska sällskapet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utformningen av sådana homo-PROTAC som beskrivs här för CRBN förlitar sig på pomalidomid specifika affinitet till CRBN, som framgångsrikt har utnyttjats i många heterobifunktionella PROTAC och resulterat i utvecklingen av PROTAC 8 som en mycket selektiv CRBN degrader. Specificiteten hos vår molekyl har redan bekräftats av proteomiska analyser24. För genetiskt medierad knockout, uteslutning och validering av biverkningar är utmanande och tidskrävande. Dessutom är en kemiskt inducerad knockdown reversibel, snabb och direkt tillämplig på ett brett spektrum av celler och vävnadstyper28.
IMiDs talidomid, lenalidomid och pomalidomid har blivit en stöttepelare vid behandling av multipelt myelom, B-cells lymfom och myelodysplastiskt syndrom. Imider medla sin aktivitet genom att modulera specificiteten hos crbn-CRL4 E3 Ligase för att försämra Neo-substrat IKZF1, IKZF3, eller CK1α6,11,29. Dessutom har imider visats upphäva den förkläde funktion av crbn på två andra proteiner, MCT-1 och BSG, som också är viktiga för multipelt myelom tillväxt30. Nedbrytningen av crbn av den homo-bifunktionella PROTAC tolererades väl av de flesta multipelt myelom cellinjer testade, vilket innebär att crbn inaktivering ensamt inte är tillräckligt för att orsaka dödande av multipelt myelomceller. Däremot förbehandling med sammansatt 8 upphävts effekterna av imider på IKZF1/3 nedbrytning och räddade multipelt myelom celler från lenalidomid och pomalidomid. Detta är i linje med genetisk inaktivering av crbn och skadliga crbn mutationer som finns i lenalidomid-resistenta multipelt myelom patienter och belyser den viktiga roll crbn i mekanismen för imider31,32 . Den homo-PROTAC 8 kan därför vara ett användbart verktyg för att efterlikna ett tillstånd av Imid motstånd. Andra effekter av imider som inte är helt klarlagda ännu som hämning av angiogenitet eller TNFα frisättning kan bero på en hämning av CRBN funktion och vår homo-PROTAC är lämpliga verktyg för att undersöka inaktivering av CRBN ytterligare. Dessutom kan den kemiskt inducerade knockdown av CRBN av Compound 8 bidra till att identifiera nya endogena substrat av crbn och belysa de fysiologiska funktionerna i crbn. Med tanke på att vår förening 8 hade inga effekter på cancer cell line proliferation, crbn hämning ensam har ingen anti-tumöraktivitet. CRBN-nedbrytare kan dock vara kliniskt tillämpbara vid andra sjukdomar än cancer. I detta avseende, crbn inaktivering visades nyligen att ge resistens mot sepsis och för att förhindra fettrik-diet-inducerad fetma hos möss 33,34,35.
Sammanfattningsvis genererade vi och validerade den första kemiska hämmare av CRBN som kan fungera som ett användbart verktyg för framtida biomedicinska undersökningar om CRBN-relaterade signalering och molekylär mekanism av talidomid och dess analoger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inte en potentiell ekonomisk intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether-programmet kr-3886/2-1 och SFB-1074 till JK; FOR2372 till M.G.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M.
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al.
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
