Summary
עבודה זו מתארת את הסינתזה והאפיון של המבוסס על המוח, bifunctional הומו-protac כגישה הרומן כדי לגרום אובילינציה והשפלה של E3 אוביקוויב ליגאז המוח (crbn), המטרה של תלידומיד אנלוגיים gs.
Abstract
התרופות האימונומודולטוריים (שפוניים) תלידומיד ו האנלוגית שלה, lenalidomide ו pomalidomide, כל ה-FDA אישר תרופות לטיפול מיאלומה נפוצה, לגרום אוביקווינציה והשפלה של שעתוק הלימפה הגורמים אימוס (IKZF1) ו aiolos (IKZF3) באמצעות המוח (crbn) E3 אוביקוויב ליגאז עבור השפלה פרוטאספאואל. הסרדים לאחרונה כבר נוצל עבור הדור של bifunctional פרוטפוליזיס מיקוד הצ (PROTACs) כדי למקד חלבונים אחרים עבור אוביקווינציה ו השפלה פרוטאספאל על ידי CRBN E3 ligase. עיצבנו ו מסונתז pomalidomide מבוססי מבוסס PROTACs וניתח את היכולת שלהם כדי לגרום לעצמי אוביקווינציה והשפלה של CRBN. כאן, crbn משמש שניהם, the E3 אוביקוויב ליגאז ואת המטרה באותו זמן. מתחם הומו-פרוטואק 8 מאשר crbn עם עוצמה גבוהה עם השפעות שנותרו מינימליות בלבד על IKZF1 ו IKZF3. Crbn איון פעלה על ידי מתחם 8 לא היתה השפעה על הכדאיות התא והתפשטות של שונים תאים מיאלומה נפוצה. זה הומו-PROTAC abrogates ההשפעות של שפתוכים בתאי מיאלומה נפוצה. לכן, תרכובות מבוססות שלנו pomalidomide שלנו עשוי לסייע לזהות מצעים האנדוגניים של CRBN ופונקציות פיזיולוגיות ולחקור את המנגנון המולקולרי של הפתוכים.
Introduction
התרופות האימונומודולטוריים (שפתוכים) תלידומיד ו האנלוגית שלה, lenalidomide ו pomalidomide, כל מאושר לטיפול מיאלומה נפוצה, לאגד את המידע e3 אוביקוויב ליגאז (crbn), מתאם מצע עבור cullin4A-RING e3 לליגאז (CRL4crbn)1,2,3. איגוד של הסרדים מגביר את האהדה של CRL4crbn כדי שעתוק הלימפה גורמים אינוס (IKZF1) ו aiolos (IKZF3), המוביל שלהם אוביגינציה והשפלה (איור 1)4,5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , 8. מאז IKZF1 ו IKZF3 חיוניים עבור תאים מיאלומה נפוצה, תוצאות חוסר ההפעלה שלהם מעכבות גדילה. SALL4 נמצאה לאחרונה כמו הגנום הניאו המושרה נוסף של crbn כי הוא כנראה אחראי על טראטוגניזה ואת האסון contergan בשנות החמישים שנגרמו על ידי תלידומיד9,10. לעומת זאת, שהקזאין (CK1α) הוא מצע מיוחד של CRBN, שהוא מעורב באפקט הטיפולי בתסמונת המיאלודיספלסטית עם מחיקות 5q של כרומוזום11.
היכולת של מולקולות קטנות למקד חלבון מסוים להשפלה היא רמז מרגש להתפתחות הסמים המודרנית. בעוד המנגנון של תלידומיד ואת האנלוגיות שלה התגלתה לאחר השימוש הראשון שלהם בבני אדם, כך קרא Proteolysis Targeting Chimeras (protacs) תוכננו במיוחד למקד חלבון של עניין (הדמות) (איור 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs הם מולקולות הטרובייוטיות המורכבות של ליגנד עבור פוי מחובר באמצעות מקשר ל ליגו של E3 אוביקוויב ליגאז כמו crbn or פון-היפרפל-ינדאו (vhl)18,19,20, 21,22. PROTACs לגרום להיווצרות של מתחם טרנארי חולף, הנחיית פוי ל-E3 אוביקוויב ligase, וכתוצאה מכך אוביקווינציה שלה והשפלה פרוטאספאואל. היתרונות העיקריים של PROTACs על פני מעכבי קונבנציונלי היא כי קשירה של פוי הוא מספיק ולא העכבות שלה ולכן PROTACs יכול למקד ספקטרום רחב הרבה יותר של חלבונים כולל אלה שנחשבו להיות undruggable כמו גורמים שעתוק15. בנוסף, מולקולות צ'יאריק לפעול באופן מזרז ולכן יש עוצמה גבוהה. לאחר העברת אוביקוויב לנקודת ההפוי, הקומפלקס הטרארי מנתק וזמין להיווצרות מתחמים חדשים. כך, ריכוזי PROTAC נמוך מאוד מספיקים עבור השפלה של חלבון היעד23.
כאן אנו מתארים את הסינתזה של pomalidomide-פוליאנide הומו-PROTAC (מתחם 8) כי המגוייסים עבור השפלה של עצמו24. The E3 אוביקוויט ליגאז crbn משמש הן המגייס ואת המטרה באותו זמן (איור 3). כדי לאמת את הנתונים שלנו, מסונתז גם בקרת מחייב שלילי (מתחם 9). הנתונים שלנו לוודא כי מסונתז הומו-PROTAC החדש הוא ספציפי עבור השפלה CRBN ויש לו רק השפעות מינימליות על חלבונים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מולקולות PROTAC
התראה: נא להתייעץ עם כל גליונות הנתונים הרלוונטיים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש. כמה מהכימיקלים המשמשים בתחביתזות אלה רעילים ומסרטנים. נא להשתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים וציוד הגנה אישי.
- הכנת טרט-בוטיל N-(2, 6-דיאוקסו-3-piperidyl) carbamate (תרכובת 1)
- הוסף 1, 1-קרבונדיסרשאזול (1.95 g, 12 ממול) וכמות קטליטי של 4-(dimethylamino) pyridine (5 מ"ג) לתערובת של Boc-Gln-הו (2.46 g, 10 מ מול) ב THF (50 mL) ב 100 mL עגול בקבוקון עם בר מהומה מצויד עם מעבה ריפלוקס. חום על ריפלוקס עבור 10 h תוך כדי ערבוב עד לפתרון ברור נוצר.
- הסר את הממס תחת לחץ מופחת עם מאייד רוטרי, להוסיף אטואק (200 mL) ולהעביר אותו משפך מופרדים. לשטוף את השכבה האורגנית עם H2O (50 mL) ואת המלח (50 mL) ולייבש אותו על Na2SO4.
- מסננים את הפתרון באמצעות משטח קצר של סיליקה ג'ל (קוטר 5 ס"מ ו 5 ס"מ גובה) ומשחרל עם נפח נוסף (200 mL) של אטואק.
- להתנדף את הממס ולייבש את החסר צבע מוצק בתוך וחללים.
- הכנת טרט-בוטיל N-(1-מתיל -2, 6-דיאוקסו-3-piperidyl) carbamate (תרכובת 2)
- לשלב תרכובת 1 (2.28 g, 10 ממול) עם האשלגן פחמתי (2.76 g, 20 mmol) ו dmf (25 מ ל) ב 100 ml התחתון עגול בקבוקון. הוסף שפתי-שיני (1.42 g, 0.62 mL, 10 ממול) ירידה בחכמה באמצעות מזרק ולצייד את הבקבוקון עם מחיצת גומי נוקב. מניחים את כלי התגובה לתוך אמבטיה ultrasonication עבור 2 h.
- לדלל את תערובת התגובה עם אטואק (100 mL) ולהעביר אותו משפך מופרדים. שטוף את השכבה האורגנית עם 1 N NaOH (2x 25 מ ל), H2O (25 מ ל), ואת המלח (25 מ ל), ויבש אותו על Na2כל כך4.
- לסנן ולאדות את הממס. לטהר את המוצר על ידי כרומטוגרפיה עמודה על סיליקה ג'ל (6 ס"מ קוטר עמודה 20 ס"מ גובה) באמצעות אתר הנפט/אטואק (2:1).
- הכנה של 2-(2, 6-diox, 3-yl) -4-fluoroisoindoline-1, 3-dione (תרכובת 3)
- לשלב 3-fluorophthalic אנהידריד (1.25 g, 7.5 mmol), גלוטמיד 1 (1.14 g, 5 ממול) ופתרון של סודיום אצטט (0.50 g, 6.0 mmol) ב חומצה אצטית קרחוני (20 מ ל) ב בקבוקון התחתון בתוך 50 mL עם בר מהומה מצויד עם הקבל ריפלוקס. מחממים את התערובת ב-120 ° c עבור 6 שעות.
- לאחר הקירור, יוצקים את התערובת הסגולה על H2O (100 mL) ומערבבים עבור 10 דקות. לאסוף את הקימו מוצק על ידי סינון, לשטוף עם H2O (3 × 5 ml) ו הנפט אתר (3 × 5 ml) ויבש בתוך הריק.
- הכנת 4-fluoro-2-(1-מתיל-2, 6-diox, 3-yl) isoindoline-1, 3-dione (מתחם 4)
- לשלב 3-פלואור אנהידריד (1.25 g, 7.5 mmol), גלוטמיד 2 (1.21 g, 5 ממול) ופתרון של סודיום אצטט (0.50 g, 6.0 mmol) ב חומצה אצטית קרחוני (20 מ ל) ב בקבוקון התחתון 100 mL עם בר מהומה מצויד עם הקבל ריפלוקס. מחממים את התערובת ב-120 ° c עבור 6 שעות.
- לאחר הקירור, יוצקים את התערובת הסגולה על H2O (100 mL) ומערבבים עבור 10 דקות. לאסוף את הקימו מוצק על ידי סינון, לשטוף עם H2O (3 × 5 ml) ו הנפט אתר (3 × 5 ml) ויבש בתוך הריק.
- הכנה של tert-בוטיל N-[2-[2-[2-[2-(2, 6-דיאוקסו-3-piperidyl)-1, 3-דיאוקקסו-isoindolin-4-yl] איטורוקסי] אתיל] קרבאט (תרכובת 7)
- מטען 50 mL בקבוק התחתונה העגולה עם טרט-בוטיל N-[2-[2-(2-עמינח ethoxy) אתיל] carbamate (5, 0.41 g, 1.65 mmol), מתחם 3 (0.41 g, 1.50 mmol), יבש dmf (10 מ"ל) ו dipea (0.39 g, 0.51 mL, 3.0 mmol). צייד עם בר המהומה ואת הקבל ריפלוקס. מחממים את אווירת הארגון ב-90 ° c תמורת 10 שעות.
- לאחר קירור לטמפרטורת החדר, יוצקים את התערובת הירוקה כהה על H2O (100 ml) ולחלץ עם אטואק (3x 50 mL) במשפך משפך. שטוף את הרבדים האורגניים המשולבים עם H2O (50 mL) והמלח (50 ml), יבש מעל Na2כל כך4, מסנן, ולהתרכז בריק.
- לטהר את המוצר גולמי על ידי כרומטוגרפיה טור על סיליקה ג'ל (3 ס"מ קוטר עמודה ו 60 ס"מ גובה) באמצעות מעבר הדרגתי של הנפט אתר/אטואק (1:1 ל 1:2).
- הכנת הומודימר (תרכובת 8)
- לשלב α, ω-diamine מקשר 6 (0.22 g, 0.22 mL, 1.50 ממול), dipea (1.05 ml, 6.00 mmol) ופתרון של 3 (0.83 g, 3.00 MMOL) יבש Dmso (20 מ ל) בבקבוקון התחתון של 50 mL עם בר מהומה מצויד עם הקבל ריפלוקס. מחממים את אווירת הארגון ב-90 ° c תמורת 18 שעות.
- לאחר קירור לטמפרטורת החדר, יוצקים את התערובת הירוקה כהה על H2O (100 ml) ולחלץ עם אטואק (3x 50 mL) במשפך משפך. לשטוף את הרבדים האורגניים המשולבים עם H2O (50 mL) ותמיסת מלח (50 mL), יבש מעל Na2כל כך4, לסנן ולהתרכז והתרכז.
- לטהר את המוצר גולמי על ידי כרומטוגרפיה טור על סיליקה ג'ל (3 ס"מ קוטר עמודה ו 50 ס"מ גובה) באמצעות מעבר הדרגתי של הנפט אתר/אטואק (1:2) כדי אטואק.
- הכנת הטרודימר (תרכובת 9)
- התמוססות תרכובת 7 (0.83 g, 1.65 ממול) ב-CH יבש2Cl2 (10 מ"ל). הוסף חומצה trifluoroacetic (10 mL) ומערבבים את התערובת הצהובה ב 40 ° צ' עבור 2 h בבקבוקון סגור 50 mL עגול.
- הסר את הוולאטילס והתנדפים עם CH2Cl2 (4x 5 מ"ל). . תייבש את השאריות בתוך האבק במשך 10 שעות
- מפזר מחדש את החומר ב-DMF יבש (20 mL). הוסף תרכובת 4 (0.44 g, 1.50 mmol) ו dipea (0.78 g, 1.05 mL, 6.00 mmol) ולצייד את הבקבוקון עם הקבל ריפלוקס. מחממים את אווירת הארגון ב-90 ° c תמורת 10 שעות.
- לאחר קירור לטמפרטורת החדר, יוצקים את התערובת הירוקה כהה על H2O (100 ml) ולחלץ עם אטואק (3x 50 mL) במשפך משפך. לשטוף את הרבדים האורגניים המשולבים עם רווי נחקו3 (50 mL), H2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), h2o (50 mL), ואת המלח (50 ml), יבש מעל Na2כל כך4, לסנן ולהתרכז בריק.
- לטהר את המוצר גולמי על ידי כרומטוגרפיה טור על סיליקה ג'ל (3 ס"מ קוטר עמודה ו 50 ס"מ גובה) באמצעות מעבר הדרגתי של הנפט אתר/אטואק (1:2) כדי אטואק.
- להבהיר ולוודא מבנה מולקולה (איור 5A מתחם 8, 5a מתחם 9) על ידי 1H NMR ו 13C nmr ספקטרום ב dmso-d6 על תהודה מגנטית גרעינית (nmr) ספקטרומטר. בדוק כי הטוהר של שני תרכובות הוא גבוה מ 97% באמצעות ספקטרומטריה כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS), החלת זיהוי מערך דיודה (אבא) ב 220 – 500 ננומטר.
2. אימות פונקציונלי של מולקולות PROTAC
- ניתוח כתמי מערבי של ירידה CRBN על ידי PROTACs
הערה: השפעות התרכובת8ומתחם9ברמת החלבון CRBN נבדקו על ידי ניתוח כתמי אבן מערבית. בנוסף, ההשפעה על רמות IKZF1 ו IKZF3 יכול גם להיות מאושר (איור 6).-
הכנה לדוגמא
- התמוססות תרכובות 8 ו -9, lenalidomide (Len), pomalidomide (פום), MG132, ו mln-4924 ב dmso בריכוז של 10 מ"מ, סדרת מחלקים ו החנות ב-80 ° צ' עד שימוש נוסף.
- זרע 1 x 106 MM1S תאים בצלחת 6-באר עם מדיה 2.5 mL ולטפל בתאים עם 100 nM או 1 μm מתחם 8 או 9 עבור 24 h.
- הקציר תאים לאחר הטיפול והצנטריפוגה ב 700 x g, 5 דקות, 4 ° c. לשטוף את הגלולה תא עם קר 1x PBS להסיר את המדיה הנותרים, צנטריפוגה ב 700 x g, 5 דקות, 4 ° צ', ו להיפטר supernatant. . חזור על השלב הזה פעם אחת
- Lyse תאים במאגר הליזה (25 מ"מ הHCl 7.4 מילימטר, 150 מ"מ, 1% NP-40, 1 מ"מ EDTA, 5% גליצרול, 1x פרוטאז & מעכבי פוספספטאז קוקטייל) עבור 10 דקות על קרח, צנטריפוגה בשעה 320 x g עבור 10 דקות, 4 ° c. הקציר הסופר ולקבוע ריכוז החלבון על ידי שיטת חלבון החומצה הבינותית (שיטת BCA) על פי פרוטוקול היצרן.
- חלבונים בספרות (15 – 30 μg/מדגם) עם מאגר העמסה 1x המילד (5% 2-mercaptoethanol) ומרתיחים 10 דקות, 75 ° c.
-
מדים-עמוד
- כריך לתקן ג'ל עם 10% הפרדה ג'ל [4 mL 3x ג'ל מאגר (3 M טריס/HCl, 0.3% (w/v) נתרן dodecyl סולפט (SDS), pH 8.45), 4 מ ל אקרילאמיד 30%, 2.52 mL גלירול 50%, 1.395 mL2O, 75 μl 11% אמוניום פרסולפט (APS), ו-9.75 μl) ו-4% הערמה ג'ל [1.992 mL 3x ג'ל מאגר, 0.792 mL 30% אקרילאמיד, 3.168 mL H2O, 36 μl 11% APS, ו 6 ΜL temed] ביחידת הרכבה אלקטרודה. להסיר מסרקים, ריקון בארות עם מאגר קתודה (100 mM טריס/HCl, 100 mM tricine, 0.1% (w/v) SDS), ו לטעון דגימות.
- מילוי מאגר אנודת (100 mM טריס/HCl, pH 8.9) לתוך המיכל. לטעון דגימת חלבון משלב 2.1.1.4 ולהפעיל SDS-PAGE ב 70 V, 20 דקות, ואחריו 115 V, 150 דקות במתח קבוע.
-
בלוק חיסוני וזיהוי של CRBN, IKZF1 ו IKZF3
- הפעל ממברנה PVDF (0.45 μm) ב 100% מתנול עבור 1 דקות. ממברנה מוספרטה והפרדת ג'ל ב 1x מאגר העברה [10x מאגר העברה (192 מילימטר גליצין, 25 מ"מ בסיס טריס/HCl, 900 mL2O), 20% מתנול, 0.1% Sds, pH 8.3].
- הכנס את הקלטת הלבנה בהתאם לפרוטוקול היצרן. העברה ג'ל ב 180 mA עבור 90 דקות.
- לשטוף ממברנה 3x ב-1x TBS-T (25 מ"מ Tris/HCl, 150 מ"מ היאl, pH 7.6, 0.1% הרצף 20) עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לחסום קרום ב 5% שומן חלב יבש (NFDM), TBS-T עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לרחוץ ממברנה 3x ב-1X TBS-T עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
- ממברנה דגירה עם נוגדן ראשוני עבור CRBN (1:500 בתוך 5% BSA, TBS-T) עם טלטול עדין ב 4 ° c, לילה.
- לרחוץ ממברנה 3x ב-1X TBS-T עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. ממברנה דגירה עם אנטי עכבר (1:10.000 ב 5% NFDM, TBS-T) או נגד ארנב (1:5.000 ב 5% NFDM, TBS-T) הנוגדן המשני מצמידים לחזרת peroxidase HRP (1 h בטמפרטורת החדר.)
- שטוף ממברנה 2x ב-1X TBS-T עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה פעמיים באמצעות TBS 1x.
- ממברנה דגירה עבור 2 דקות עם פתרון המצע HRP על פי הפרוטוקולים של היצרן ולזהות chemiluminescence במכשיר זיהוי כימואומיננסנציה.
- שטוף ממברנה 1x ב-1 x TBS עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לשחרור של נוגדנים, קרום רצועת במאגר מסחרי זמין להתפשט עבור 15 דקות. לשטוף ממברנה 3x ב-TBS 1X עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
- לחסום ממברנה ב 5% שומן חלב מיובש, TBS-T עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לרחוץ ממברנה 3x ב-1x TBS-T עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר ו reprobe בדוק עם IKZF1, IKZF3 או טובולין לפי שלב 2.1.3.4.
-
הכנה לדוגמא
- תחרות ניסויים עם MG132, MLN4942 או פוליאנדומיד
הערה: כדי לאשר אם CRBN מושפל באמצעות מסלול אוביקוויב-פרוטאסדום, ביצעו ניסויים בתחרות עם MG132 מעכב פרוטסליב ' ו מפעיל neddylation הפעלת אנזים (לא) מעכב MLN4942 (איור 7).- זרע 1 x 106 MM1S תאים לכל טוב בצלחת 6-היטב. לטפל בתאים עם 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, או lenalidomide (100x), ו-דגירה 1 h ב 37 ° צ', 5% CO2.
- הוסף 100 ננומטר מתחם 8 עבור 3 h ב 37 ° c, 5% CO2.
- בתאי הקציר לאבן החשופה המערבית לפי שלב 2.1.1.
- הכדאיות התאית בקווים מרובים של תאים מיאלומה
הערה: שיטת הבדיקה משמשת כדי לבחון את ההשפעה על הכדאיות בתאים ובנוסף, להרגיז את ההשפעה של הסרדים על מספר תאי מיאלומה על ידי טיפול מקדים של התאים עם תרכובת 8 (איור 8, איור 9a, B).- זרע 5 x 104 MM1S תאים בבאר בצלחת 96 ביולוגי בטרילקטים ביולוגיים לצורך הכדאיות. עבור ניתוח כתמי מערבי, זרע 1 x 106 MM1S תאים בו בצלחת 6-היטב בטריליטים ביולוגיים.
- לטפל בתאים עם DMSO או 100 nM, 1 μM, או 10 μM מתחם 8, מתחם 9 או pomalidomide ו דגירה עבור 24 h, 48 h, או 96 h ב 37 ° c, 5% CO2. עבור ניסויים הצלה, לטפל בתאים עם 100 ננומטר מתחם 8 עבור 3 h, לפני או אחרי תוספת של 1 μm pomalidomide ו דגירה עבור 96 h.
- מדידה 96-צלחת לומיזנציה עם שיטת הכדאיות של התא זורח, על פי פרוטוקול של היצרן על קורא צלחת או בתאי הקציר מן הצלחת 6-הבאר עבור ניתוח כתמי מערבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן תיארנו את העיצוב, סינתזה והערכה ביולוגית של homodimeric pomalidomide מבוסס PROTAC עבור השפלה של CRBN. PROTAC שלנו אינטראקציה בו זמנית עם שני מולקולות CRBN וטפסים מתחמי מתחמים הגורמת עצמית אוביקווינציה והשפלה proteasomal של CRBN עם תופעות הנותרים מינימלי רק על pomalidomide המושרה ניאו מצעים IKZF1 או IKZF3.
מתוך סדרה של מולקולות מבוססות PROTALIDOMIDE שפורסמו בעבר, מתחם 8 היה יעיל במיוחד בירידה כימית המושרה של crbn. הסינתזה שלה יכולה להתבצע כדלקמן (איור 4). 1, 1-פחמן מתקדם העיבוי של ה-l-גלוטמין המוגן מוביל אל המחזוריות אימיד 1. האנלוגי מתילנטי 2 נגיש באמצעות אלקיללציה עם מתיל יודיד. שני אבני הבניין (1 ו- 2) משתנים, לאחר N-deprotection בתנאים חומציים, כדי נגזרות phthalimide מיד (3 ו 4) במהלך התגובה טבעת/recyclization באמצעות 3- . אני מבין באופן כללי, התאלידומיד מקבילים לפירוק ההידרוליטי, יש להשתמש רק בשלב הבא לאחר ייבוש מספיק. מתחם 3 הוא פגיע החלפת הנוקלאופילית ארומטי עם אמינים העיקרי של25; ההמרה הזאת נמצאה ביעילות רק כאשר נעשה שימוש במיסים יבשים. העיצוב של מוצר homodimeric אמיתי מרמז על חיבור המקשר בין שני מבני משנה פונקציונליים זהים ויישום של מקשר סימטרי. המקשר שהוא חלק PROTAC 8 מייצג שרשרת n-to-n, פוליאתילן מבוסס על-גבי שרשראות. Α המקביל, ω-diamine 6 מוביל את המתחם הסופי הרצוי 8 כאשר הגיב עם בניין 3 ב הקצבה הטוחנת של 1:2 ב dmso ב 90 ° c. בין נתונים אנליטיים אחרים24, המבנה של 8 אומת על ידי Nmr ספקטרום (איור 5a). מתחם 9, שתוכנן כפקד שלילי מתאים, יש סטיות מבניות בלבד, אך ביקורתית, לעומת ההומו-protac 8הפעיל. ידוע כי N-מתילציה בתוך החלק הגלוטמיד מבטל את כריכת crbn26,27. החלק השני של מתחם הבקרה. השלילית 9 נושא שאריות N-מתיל זה יכול להיות מוכן על ידי החלפת הנוקלאופילית הראשון של 3 עם מקשר N-מחדרוטבניין הבניין 5, ואחריו מחשוף של קבוצת ההגנה boc וזיווג הבא לתווך 4. בשל מבנה סימטרי שלה, כמה הפחמנים המתאימים הראו ברורים 13C nmr אותות (איור 5b).
ההומו-PROTAC 8 נצפה להיות חזק מאוד, המוביל בירידה כמעט מלאה פרוטאסאואל השפלה של crbn. הפרשנות של CRBN, IKZF1 ו IKZF3 רמות החלבון בתאי מיאלומה נפוצה אושרו על ידי ניתוח כתמי אבן מערבית (איור 6, איור 7, איור 9b), שיטה כמותית למחצה, היכן שינוי חלבון ביטוי ניתן לזיהוי בקלות. הנוגדנים המשמשים בנייר זה הם באיכות טובה, השיטה היא הליך מיטבי התקן במעבדה שלנו.
בנוסף, השפלה של CRBN על ידי מתחם 8 לא השפיע על הכדאיות תא הענקת עמידות לחקות (איור 8, איור 9a), אשר בקנה אחד עם crispr/Cas9-בתיווך הנוקאאוט של crbn by sgrnas24. האות הלומינסאלי בתוך שיטת הכדאיות של התא התבססה על שחרור ATP, אשר ניתן לפירוש כספירת תאים מתים. ניתן לבצע בקלות שיטה זו תוך זמן קצר עם מספר גבוה של דגימות. שיטה חלופית עבור המדידה של תאים בר קיימא/מתים הוא מכתים אנשין V/7 עמ ' על ידי הזרמת cy, לנסות.
איור 1: את היעד העיקרי של הסרדים. תרופות אימונומודולדוקליות לאגד CRBN ולגייס מספר מצעים ניאו עבור השפלה proteasomal. השפלה IMiD-המושרה של שעתוק הלימפה גורמים IKZF1 ו IKZF3 אחראי על ההשפעות על תאים מיאלומה נפוצה וכמה מאפיינים אימונומודולטוריים. קזאין קינאז 1α הוא באופן סלקטיבי מושפל על ידי lenalidomide אבל לא האחרים האחרים ותורם לפעילות של lenalidomide בתסמונת המיאלודיספלסטית עם אובדן של כרומוזום 5q. SALL4 התגלתה לאחרונה כמטרה משותפת של כל הקוצרידים שקשורים כנראה לטרטוגניזה הנגרמת על ידי תלידומיד ואת האנלוגיות שלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: Protacs לבזות את החלבון של עניין (פוי). פרוטואקס הם מולקולות הטרובייוטיות, כאשר מקשר מקשר בין אוביקוויב ליגייסה לליגואל ליגוליו. על ידי היווצרות של מתחמי טרארי, אוביקוויב לligase, כגון CRBN, לאחר מכן אוביקוויטים את הפוי, וכתוצאה מכך השפלה שלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: bifunctional הומו-protac עבור השפלה של E3 אוביקוויב לליגאז crbn. בתוך הומו מבוסס pomalidomide, שני כאוגדן אוביקוויב ליגייב מחוברים לגרום לצלב-אוביברינות של CRBN וכתוצאה מכך מתוך הסתרה כימית המושרה של CRBN. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סינתזה של הומודימר 8 ו הטרודימר 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: 1H nmr (למעלה) ו 13ג nmr (למטה) ספקטרום. ספקטרום של מתחם 8 (א) ותרכובת 9 (ב) נרשמו ב-DMSO-d6 בספקטרומטר nmr. משמרות כימיות ניתנות בחלקים למיליון (ppm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: השפעות של תרכובות 8 ו -9 על CRBN, IKZF1, ו IKZF3. Pomalidomide מבוססי הומו-PROTAC מתחם 8 מעורר השפלה crbn עם ההשפעות הנותרות חלש של pomalidomide על IKZF1 ו IKZF3. לעומת זאת, תרכובת 9 המכילה קבוצת מתיל על אחד מפסולת הפומדומיד אינה משפיעה על הריכוזים המצוינים (μm). MM1S תאים טופלו עבור 24 h טיפול. השפעות על CRBN, IKZF1, IKZF3 ו טובולין (בקרת טעינה) נותחו על ידי אבן החשופה המערבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: השפלה CRBN יכול להיות חסום על ידי מעכב פרוטאסדום MG132 או על ידי MLN4942 כי חוסם אוביקוויב ליגטיות בעקיפין באמצעות מעכבות neddylation. התא מיאלומה נפוצה קו MM1s היה מטופל עם 10 μM MG132, 10 μM MLN4924 עבור 1 h לפני תוספת של הומו-PROTAC מתחם 8 ב 100 nM עבור 3 שעות של טיפול משולב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: שיטת הכדאיות התאית ב MM1S תאים מיאלומה נפוצה. ההשפעות של מתחם 8 בקרת קשירה שלילית מתחם 9 על הכדאיות התא בשורה מיאלומה הרגישות POMALIDOMIDE MM1S לאחר 24 h, 48 h ו 96 h הטיפול. יכולת הקיום של התא נמדדה. לאחר 4 ימים בטריפליטים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: מתחם 8 לאנטיוניזים את ההשפעה של pomalidomide בקווי מיאלומה נפוצה מרובים. התאים טופלו מראש עם 100 ננומטר מתחם 8 עבור 3 h. לאחר מכן 1 μm מצורף נוספה. יכולת הקיום של התא נמדדה. לאחר 4 ימים בטריפליטים p <0.001 לפי מבחן t ́s סטודנט (א). ניתוח כתמי המערבי של CRBN, IKZF1, IKZF3 ו טובולין (טעינת בקרת) לאחר טרום טיפול של תאים MM1S עם 100 ננומטר מתחם 8 עבור 3 שעות, לפני התוספת של 1 μm pomalidomide (ב). הודפסה מודפס (מותאם) באישור שדרנבאך, C. et al. 201824. זכויות יוצרים 2019 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העיצוב של כזה הומו-PROTACs כפי שתואר כאן עבור CRBN מסתמך על הזיקה הספציפית של pomalidomide כדי CRBN, אשר כבר נוצל בהצלחה ברבים הטרובידותיום PROTACs והביא לפיתוח PROTACS 8 כמו מאוד CRBN degrader סלקטיבית. הספציפיות של המולקולה שלנו כבר אושרה על-ידי ניתוחים פרוטאואריים24. עבור הסתרה מתווכת גנטית, הדרה ואימות של תופעות לוואי הוא מאתגר זמן רב. בנוסף, מנוק הנגרמת כימית הוא הפיך, מהירה וישימה ישירות לקשת רחבה של תאים וסוגי רקמות28.
הסרפדים thalidomide, lenalidomide, ו pomalidomide הפכו התווך בטיפול של מיאלומה נפוצה, B-cell לימפומה ותסמונת מיאלודיספלסטית. הסרדים מתווכים בפעילותם על ידי מודלדירוג הספציפיות של crbn-CRL4 E3 ליגאז כדי לבזות את הניאו מצעים IKZF1, IKZF3, או CK1α6,11,29. בנוסף, הסרדים הוכחו לאשר את הפונקציה המלווה של CRBN על שני חלבונים אחרים, MCT-1 ו-BSG, כי הם גם חשובים עבור צמיחה מיאלומה נפוצה30. השפלה של CRBN על ידי הומו-bifunctional PROTAC נסבל היטב על ידי מספר רב של קווי מיאלומה התאים נבדק, רומז כי ההפעלה CRBN לבד אינו מספיק כדי לגרום להרוג מספר תאים מיאלומה. לעומת זאת, טרום טיפול עם מתחם 8 פרתה את ההשפעות של הסרדים על IKZF1/3 השפלה והצילה תאים מיאלומה נפוצה מ lenalidomide ו pomalidomide. זה בשורה עם הפעלה גנטית של crbn ומוטציות crbn למחיקה מצאו ב lenalidomide עמידים בפני חולים מיאלומה נפוצה ומדגיש את התפקיד החיוני של crbn במנגנון של הנצרידים31,32 . הומו-PROTAC 8 יכול אפוא להיות כלי שימושי כדי לחקות מצב של התנגדות imid. תופעות אחרות של שפתוכים שאינם מובנים לחלוטין עדיין כמו עיכוב של אנגיוגנציה או TNFα שחרור עשוי לנבוע עיכוב של הפונקציה CRBN ו-הומו-PROTAC שלנו הם כלים מתאימים לחקור את ההפעלה של CRBN יותר. בנוסף, את הנוק כימית המושרה של CRBN על ידי מתחם 8 עשוי לסייע לזהות מצעים אנדוגניים חדשים של crbn ולהבהיר את הפונקציות הפיזיולוגיות של crbn. בהינתן כי המתחם שלנו 8 היו השפעות על התפשטות התאים של הסרטן, העיכוב crbn לבד אין פעילות נגד הגידול. עם זאת, CRBN degraders עשויים להיות מתאימים קלינית מחלות מאשר סרטן. בהקשר זה, crbn איון הפעלה הוצגה לאחרונה להעניק עמידות לאלח דם, כדי למנוע השמנה גבוהה-fat-דיאטה המושרה בעכברים 33,34,35.
לסיכום, יצרנו ובתוקף את המעכב הכימי הראשון של crbn שיכול לשמש כלי שימושי לחקירות ביורפואי עתידיים על מנגנון הקשורות ל-crbn ו מולקולרית של תלידומיד ואת האנלוגיות שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מצהירים על ניגוד אינטרסים כספי פוטנציאלי.
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת על ידי הגרמני של הפרויקט (אמי-נתר התוכנית Kr-3886/2-1 ו-SFB-1074 לג; FOR2372 to מ)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M.
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al.
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
