Summary
이 작품은 탈리도마이드 유사체의 표적인 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론(CRBN)의 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 새로운 접근법으로서 포말리도마이드 계, 이중 기능적 호모-PROTAC의 합성 및 특성화를 설명한다.
Abstract
면역 조절 약물 (IMiDs) 탈리도마이드와 그 유사체, 레날리도마이드 및 포말리도마이드, 다발성 골수종의 치료를 위한 모든 FDA 승인 약물, 림프성 전사 인자 이카로스(IKZF1) 및 아이올로스의 유비퀴틴화 및 분해를 유도 (IKZF3) 세레블론 (CRBN) E3 유비퀴틴 리가아제를 경질 분해를 경유한다. IMiDs는 최근 CRBN E3 ligase에 의한 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 위한 다른 단백질을 표적으로 하는 이중 기능성 프로테오분해 표적화 키메라(PROTACs)의 생성을 위해 활용되고 있다. 우리는 포말리도마이드 기반의 호모비기능 PROTACs를 설계 및 합성하고 CRBN의 자기 주도적 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 능력을 분석했습니다. 여기서, CRBN은 E3 유비퀴틴 리가제와 동시에 표적을 모두 작용한다. 호모-PROTAC 화합물 8은 IKZF1 및 IKZF3에 최소한의 남은 효과만 으로 높은 효능으로 CRBN을 저하시고 있습니다. 화합물 8에 의한 CRBN 불활성화는 상이한 다발성 골수종 세포주들의 세포 생존 및 증식에 영향을 미치지 않았다. 이 호모-PROTAC는 다발성 골수종 세포에서 IMiDs의 효과를 제거합니다. 따라서, 우리의 동형 포말리도마이드 계 화합물은 CRBN의 내인성 기질 및 생리기능을 확인하고 IMiDs의 분자 메커니즘을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
면역 조절 약물 (IMiDs) 탈리도마이드와 그 유사체, 레날리도마이드와 포말리도마이드, 모두 다발성 골수종의 치료를 위해 승인, E3 유비퀴틴 리가세 세레블론에 결합(CRBN), 컬린4A-RING E3 유비퀴틴 리가에 대한 기질 어댑터 (CRL4CRBN)1,2,3. IMiDs의 결합은 림프성 전사 인자 이카로스 (IKZF1) 및 아이올로스 (IKZF3)에 CRL4CRBN의 친화성을 향상시켜, 그들의 유비퀴틴화 및 저하로 이어지는 (그림1)4,5 ,5, 6개 , 7명 , 8. IKZF1 및 IKZF3는 다발성 골수종 세포에 필수적이므로 불활성화는 성장 억제를 초래합니다. SALL4는 최근 탈리도마이드9,10에의한 1950년대의 기형및 소위 Contergan 재앙에 대한 책임이 있는 CRBN의 추가적인 IMiD 유도 신기판으로서 발견되었다. 대조적으로, 카제인 키나아제 1α(CK1α)는 염색체 5q 델레이션을 가진 골수이형성 증후군에서 치료 효과에 연루되는 CRBN의 레날리도마이드특이적 기질(11)이다.
분해를 위해 특정 단백질을 표적으로 하는 작은 분자의 능력은 현대 약물 발달을 위한 흥미진진한 의미입니다. 탈리도마이드와 그 유사체의 메커니즘은 인간에서 처음 사용한 후에 발견되었지만, 소위 Proteolysis Targeting C히메라스 (PROTACs)는 특히 관심단백질(POI)을 표적으로 하도록 설계되었습니다(그림) 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs는 CRBN 또는 폰-히펠-린다우(VHL)18,19,20,E3 유비퀴틴 리가제의 리간드에 링커를 통해 연결된 POI에 대한 특정 리간드로 구성된 헤테로비기능 분자이다. 21,22. PROTACs는 일시적인 삼차 복합체의 형성을 유도하여 POI를 E3 유비퀴틴 리가제에 지시하여 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 초래합니다. 기존의 억제제에 비해 PROTACs의 주요 장점은 POI에 결합하는 것이 그것의 억제 보다는 오히려 충분하다는 것입니다 및 그러므로 PROTACs는 잠재적으로 약용으로 여겨지는 단백질을 포함하여 단백질의 훨씬 더 넓은 스펙트럼을 표적으로 할 수 있습니다 전사 인자15. 또한 키메라 분자는 촉매작용을 하므로 효능이 높습니다. POI로 유비퀴틴이 전달된 후, 삼차 복합체는 해리되고 새로운 복합체의 형성에 사용할 수 있다. 따라서, 매우 낮은 PROTAC 농도는 표적단백질(23)의분해에 충분하다.
여기서 우리는 자체(24)의 분해를 위해 CRBN을 모집하는 포말리도마이드-포말리도마이드 공액호-PROTAC(화합물 8)의합성을 설명한다. E3 유비퀴틴 리가제 CRBN은 모집자 및 대상을 동시에 제공합니다(그림 3). 데이터의 유효성을 검사하기 위해 음의 결합 제어(화합물 9)도 합성했습니다. 우리의 데이터는 새로 합성된 호모-PROTAC가 CRBN 분해에 특이적이고 다른 단백질에 최소한의 효과만 가지고 있음을 확인합니다.
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Protocol
1. PROTAC 분자의 준비
주의: 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트(MSDS)를 참조하십시오. 이러한 합성에 사용 되는 화학 물질의 몇 가지 독성 및 발암성. 모든 적절한 안전 관행과 개인 보호 장비를 사용하십시오.
- 테르트-부틸 N-(2,6-디옥소-3-피프리딜)카르바메이트(화합물 1)
- THF(50 mL)에서 1,1-카르보닐디미다졸(1.95 g, 12 mmol)과 촉매량 4-(디메틸아미노) 피리딘(5 mg)을 THF(50 mL)에 100 mL 의 바닥 플라스크와 함께 바락을 넣은 바락에 보크-글란-OH(2.46 g, 10 mmol)의 혼합물에 첨가한다. 명확한 용액이 형성 될 때까지 교반하면서 10 시간 동안 역류에서 가열하십시오.
- 회전 식 증발기로 감소 된 압력하에서 용매를 제거하고 EtOAc (200 mL)를 추가하고 분리 깔때기로 옮김으로 옮니다. H2O (50 mL)와 염수 (50 mL)로 유기 층을 씻고 Na2SO4위에 건조시십시오.
- 짧은 실리카 겔 패드(직경 5cm 및 높이 5cm)를 통해 용액을 걸러내고 EtOAc의 추가 부피(200 mL)로 용출합니다.
- 용매를 증발시키고 얻어진 무색 고체를 진공에서 건조시다.
- 테르트-부틸 N-(1-메틸-2,6-디옥소-3-피프리딜)카르바메이트(화합물 2)
- 화합물 1(2.28 g, 10 mmol)을 분쇄된 탄산칼륨(2.76 g, 20 mmol)과 DMF(25 mL)를 100 mL 라운드 바닥 플라스크에 결합합니다. 주사기를 사용하여 낙하 시 요오드메탄 (1.42 g, 0.62 mL, 10 mmol)을 추가하고 플라스크에 구멍이 뚫린 고무 중격을 장착하십시오. 반응 용기를 초음파 욕조에 2 시간 동안 놓습니다.
- 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석하고 분리 깔때기로 옮김으로 옮니다. 유기층 1N NaOH(2x 25 mL),H2 O(25 mL), 염수(25 mL)로 세척하고 Na2SO4위에 건조시다.
- 용매를 걸러내고 증발시.. 석유 에테르 /EtOAc (2 :1)를 사용하여 실리카 젤 (6cm 열 직경 및 20cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 제품을 정화합니다.
- 2-(2,6-디옥소피리딘-3-yl)-4-플루오로이소인돌린-1,3-디온(화합물 3)의 제제
- 3-플루오로프탈리 안수소(1.25 g, 7.5 mmol), 글루타미드 1(1.14 g, 5 mmol) 및 아세테이트 나트륨 용액(0.50 g, 6.0 mmol)을 빙하 아세트산(20 mL)에 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 콘렌드와 함께 사용한다. 혼합물을 120 °C에서 6 시간 동안 가열합니다.
- 냉각 후, 보라색 혼합물을H2O(100 mL)에 붓고 10분 간 저어주면서 여과에 의해 형성된 고체를 수집하고, H2 O(3×5 mL) 및 석유 에테르(3×5 mL)로 세척하고 진공에서 건조시다.
- 4-플루오로-2-(1-메틸-2,6-디옥소피리딘-3-yl)이소인돌린-1,3-디온(화합물 4)
- 3-플루오로프탈리 안수소(1.25 g, 7.5 mmol), 글루타미드 2(1.21 g, 5 mmol) 및 아세테이트 나트륨 용액(0.50 g, 6.0 mmol)을 빙하 아세트산(20 mL)에 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 콘덴트와 함께 탄압을 결합합니다. 혼합물을 120 °C에서 6 시간 동안 가열합니다.
- 냉각 후, 보라색 혼합물을H2O(100 mL)에 붓고 10분 간 저어주면서 여과에 의해 형성된 고체를 수집하고, H2 O(3×5 mL) 및 석유 에테르(3×5 mL)로 세척하고 진공에서 건조시다.
- 테르트-부틸N-[2-[2-][2-[2-(2--2-2-2-6-다이옥소-3-피프리딜)-1,3-다이옥소-이소인돌린-4-yl]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트(화합물 7)
- 50 mL 둥근 바닥 플라스크를 터트-부틸 N-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸]카르바메이트(5, 0.41 g, 1.65 mmol), 화합물 3 (0.41 g, 1.50 mmol), 건조 DMF (10 mL) 및 DIPEA (0.39 g, 0.51 mL, 3.0 mmol). 볶음 바 및 환류 응축기가 장착됩니다. 아르곤 대기하에서 90°C에서 10시간 동안 가열합니다.
- 실온으로 냉각한 후, 진한 녹색혼합물을 H2 O(100 mL)에 붓고 분리 깔때기에 EtOAc(3x 50 mL)로 추출합니다. H2O (50 mL)와 염수 (50 mL)로 결합 된 유기 층을 씻고 Na2SO4, 필터를 건조시키고 진공에 농축하십시오.
- 석유 에테르/EtOAc(1:1 ~ 1:2)의 그라데이션을 사용하여 실리카 겔(3cm 기둥 직경 및 60cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 제품을 정화합니다.
- 호모디머의 준비 (화합물 8)
- α, ω-diamine 링커 6(0.22 g, 0.22 mL, 1.50 mmol), DIPEA(1.05 mL, 6.00 mmol) 및 3(0.83 mL, 3.00 mmol)의 용액을 건조 DMSO(20 mL)에 결합하여 50 mL 의 둥근 바닥 플라스크와 함께 바플록을 재장착한 바플래드를 장착한 바플래드를 장착한 바플래드를 결합합니다. 아르곤 대기하에서 90°C에서 18시간 동안 가열합니다.
- 실온으로 냉각한 후, 진한 녹색혼합물을 H2 O(100 mL)에 붓고 분리 깔때기에 EtOAc(3x 50 mL)로 추출합니다. H2O (50 mL)와 염수 (50 mL)로 결합 된 유기 층을 씻고 Na2SO4,필터 및 진공 에 농축하십시오.
- 석유 에테르/EtOAc(1:2)의 그라데이션을 사용하여 실리카 겔(3cm 기둥 직경 및 50cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 제품을 정결화하였다.
- 이종화의 준비 (화합물 9)
- 화합물 7 (0.83 g, 1.65 mmol)을 건조 CH2Cl2 (10 mL)에 용해시고. 삼투오와세트산(10 mL)을 첨가하고 폐쇄된 50 mL 둥근 바닥 플라스크에서 2시간 동안 40°C에서 황색 혼합물을 저어줍니다.
- 휘발성을 제거하고 CH2Cl2 (4x 5 mL)로 coevaporate. 잔여물을 10시간 동안 바쿠오에서 건조시고 다.
- 건조 한 DMF (20 mL)에서 재료를 다시 용해. 화합물 4 (0.44 g, 1.50 mmol)와 DIPEA (0.78 g, 1.05 mL, 6.00 mmol)를 추가하고 플라스크에 환류 응축기장착하십시오. 아르곤 대기하에서 90°C에서 10시간 동안 가열합니다.
- 실온으로 냉각한 후, 진한 녹색혼합물을 H2 O(100 mL)에 붓고 분리 깔때기에 EtOAc(3x 50 mL)로 추출합니다. 포화 NaHCO3 (50 mL), H2O (50 mL), 10 % KHSO4 (50 mL), H2O (50 mL), 염수 (50 mL)로 결합 된 유기 층을 세척하고 Na2SO4,필터및 농축물을 통해 건조시다.
- 석유 에테르/EtOAc(1:2)의 그라데이션을 사용하여 실리카 겔(3cm 기둥 직경 및 50cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 제품을 정결화하였다.
- 핵 자기 공명(NMR)에 대한 DMSO-d6에서 1HNMR 및 13CNMR 스펙트럼에 의한 분자 구조(그림5A 화합물 8, 5B 화합물 9)를해명 및 검증 분 광 계. 220-500 nm에서 다이오드 어레이 검출(DAD)을 적용하여 두 화합물의 순도가 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS)을 통해 97% 이상 높은지 확인합니다.
2. PROTAC 분자의 기능적 검증
- PROTACs에 의한 CRBN 열화의 서부 얼룩 분석
참고 : 화합물의 효과8개및 화합물9개CRBN 단백질 수준에서 서부 블롯 분석에 의해 시험되었다. 또한 IKZF1 및 IKZF3 수준에 미치는 영향도 확인할 수 있습니다(그림 6).-
샘플 준비
- 화합물 8 및 9, 레날리도마이드(Len), 포말리도마이드(Pom), MG132 및 MLN-4924를 10 mM의 농도로 DMSO에서 용해시키고, 추가 사용까지 -80°C에서 저장한다.
- 시드 1 x 106 MM1S 세포를 2.5 mL 의 매질로 6웰 플레이트에 제거하고 24시간 동안 100 nM 또는 1 μM 화합물 8 또는 9로 세포를 치료한다.
- 처리 후 세포를 수확하고 700 x g, 5 분, 4 °C에서 원심 분리기를 수확합니다. 차가운 1x PBS로 셀 펠릿을 씻어 남은 매체를 제거하고 원심 분리기를 700 x g, 5 분, 4 °C에서 제거하고 상류제를 폐기하십시오. 이 단계를 한 번 반복합니다.
- 용해 완충액의 용해 세포 (25 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5 % 글리세롤, 1 x 프로테아제 & 포스파타제 억제제 칵테일) 얼음에 10 분 동안, 원심 분리기에서 10 00 x g에서 10 °C. 제조자의 프로토콜에 따라 비신초닌산 단백질 분석(BCA 분석)에 의한 단백질 농도를 상수로 수확하고 결정합니다.
- 1x LDS 로딩 버퍼 (5 % 2-메르카포에탄올)를 가진 변성 단백질 (15-30 μg / 샘플)을 10 분, 75 ° C로 끓입니다.
-
SDS-페이지
- 젤 샌드위치를 10% 분리 젤로 고정 [4 mL 3x 젤 버퍼(3M Tris/HCl, 0.3% (w/v) 나트륨 도데실 황산염 (SDS), pH 8.45), 4 mL 아크릴 아블릴아미드 30%, 2.52 mL 글리세롤 50%, 1.395 mL H2O, 75% 11% 암모늄 퍼황페이트 (APS), 및 9.75 μL TEMED] 및 4% 스태킹 젤 [1.992 mL 3x 젤 버퍼, 0.792 mL 30% 아크릴아미드, 3.168 mL H2O, 36 μL 11% APS, 및 6 μL TEMED] 전극 조립 유닛. 빗을 제거하고 음극 버퍼 (100 mM Tris / HCl, 100 mM 트리신, 0.1 % (v) SDS)로 우물을 씻어 내고 샘플을 로드하십시오.
- 양극 버퍼 (100mM Tris / HCl, pH 8.9)를 탱크에 채웁니다. 2.1.4 단계에서 단백질 샘플을 로드하고 70 V, 20 분에서 SDS-PAGE를 실행한 다음 일정한 전압에서 115 V, 150 분.
-
CRBN, IKZF1 및 IKZF3의 면역 블롯팅 및 검출
- PVDF 멤브레인(0.45 μm)을 100% 메탄올에서 1분 동안 활성화하고 1x 전사 완충액에서 겔을 분리[10x 전사 완충제(10x 전달 완충제, 25mMM 트리스 베이스/HCl, 900 mL H2O), 20% 메탄올, 0.1% SDS, pH 8.3].
- 제조업체의 프로토콜에 따라 블로팅 카세트를 조립합니다. 90 분 동안 180 mA에서 젤을 옮김.
- 1x TBS-T (25 mM Tris /HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6, 0.1 % 트웬 20)에서 멤브레인 3 x를 실온에서 각각 5-10 분 동안 씻으하십시오. 실온에서 5 % 무지방 건조 우유 (NFDM), TBS-T에서 막 을 1 시간 동안 차단하십시오. 실온에서 멤브레인을 1X TBS-T로 3x 5-10분 동안 세척하십시오.
- CRBN (5 % BSA, TBS-T에서 1 :500)에 대한 기본 항체와 인큐베이션 멤브레인을 4 °C에서 부드럽게 흔들어 밤새.
- 실온에서 멤브레인을 1X TBS-T로 3x 5-10분 동안 세척하십시오. 항 마우스 (5 % NFDM, TBS-T에서 1 : 10.000) 또는 항 토끼 (5 % NFDM, TBS-T에서 1 : 5.000) 고추 냉기 퍼옥시다아제 HRP에 결합 된 보조 항체 (실온에서 1 시간).
- 실온에서 멤브레인 2x를 1X TBS-T로 5-10분 동안 세척하십시오. 이 단계를 1x TBS로 두 번 반복합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 HRP 기질 용액으로 2 분 동안 인큐베이션하고 화학 발광 검출 장치에서 화학 발광을 감지합니다.
- 실온에서 멤브레인 1x를 1X TBS로 5-10분 동안 세척하십시오. 항체의 방출을 위해, 시판시적으로 이용 가능한 스트리핑 버퍼의 스트립 멤브레인은 실온에서 각각 5-10분 동안 1X TBS에서 멤브레인 3x를 세척한다.
- 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 건조 우유, TBS-T로 멤브레인을 다시 차단합니다. 실온에서 각각 5-10분 동안 1x TBS-T에서 멤브레인 3x를 세척하고 2.1.3.4단계에 따라 IKZF1, IKZF3 또는 튜불린으로 재프로브합니다.
-
샘플 준비
- MG132, MLN4942 또는 포말리도마이드와의 경쟁 실험
참고: 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통해 CRBN이 분해되는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 프로테아좀 억제제 MG132 및 네딜화 활성화 효소(NAE) 억제제MLN4942(그림 7)와 경쟁 실험을 수행하였다.- 시드 1 x 106 MM1S 셀을 6 웰 플레이트에서 잘 당. 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, 또는 레날리도마이드(100x)를 가진 프리트트 세포는 37°C, 5% CO2에서 1h 배양한다.
- 37 °C, 5 % CO2에서 3 시간 동안100 nM 화합물 8을 추가하십시오.
- 2.1.1 단계에 따라 웨스턴 블롯에 대한 수확 세포.
- 다발성 골수종 세포주에서 세포 생존력 시험
참고: 이 분석실험은 세포 생존력에 미치는 영향을 시험하고 추가적으로 화합물 8을 이용한 세포의 전처리를 통해 다발성 골수종 세포에 대한 IMiDs의 효과를 적대하는 데 사용된다(도8,도 9A,B).- 시드 5 x 104 MM1S 세포는 생존성 분석에 대한 생물학적 삼각수에서 96 웰 플레이트에서 웰 당. 서쪽 얼룩 분석을 위해, 종자 1 x 106 MM1S 세포는 생물학적 삼중체에서 6 웰 플레이트에서 잘 당.
- DMSO 또는 100 nM, 1 μM, 또는 10 μM 화합물 8,화합물 9 또는 포말리도마이드및 37°C에서 96시간 동안 배양하여 37°C, 5% CO2로 세포를 치료한다. 구조 실험을 위해, 세포를 100 nM 화합물 8에서 3 시간 동안 치료하고, 1 μM 포말리도마이드를 첨가하기 전 또는 후에 96 시간 동안 배양합니다.
- 발광 세포 생존성 분석으로 96 웰 플레이트 발광을 측정, 플레이트 리더또는 서부 블롯 분석을위한 6 웰 플레이트에서 세포를 수확 하는 제조 업체의 프로토콜에 따라.
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Representative Results
여기서 우리는 CRBN의 분해를 위한 동형 포말리도마이드 계 PROTAC의 설계, 합성 및 생물학적 평가를 기술하였다. 우리의 PROTAC는 두 개의 CRBN 분자와 동시에 상호 작용하고 포말리도마이드 유도 네오 기질 IKZF1 또는 IKZF3에 최소한의 남은 효과로 CRBN의 자가 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 유도하는 삼차 복합체를 형성합니다.
이전에 발표된 일련의 포말리도마이드 계 PROTAC 분자(24)에서, 화합물 8은 CRBN의 화학적 유도 열화에서 특히 효율적이었다. 그 합성은 다음과 같이달성될 수 있다(도 4). 1,1-카본디미다졸-보크 보호 l-글루타민의 응축은 순환화된 이미드 1로이어집니다. N-메틸화형 아날로그 2는 메틸 요오드화물을 가진 알킬화를 통해 접근할 수 있다. 두 빌딩 블록(1 및 2)은 산성 조건하에서 N-deprotectionedprotection 후, 3-를 사용하여 링 개구부/재활용 반응의 과정에서 phthalimide 유도체(3 및 4)로변형됩니다. 플루오로프탈릭 무수화물. 탈리도마이드 유사체는 일반적으로 가수분해에 취약하며 충분한 건조 후에 다음 단계에서만 사용해야 합니다. 화합물 3은 1차 알리파틱 아민(25)을 가진 방향족 핵성 치환에 취약하다; 이러한 변환은 건식 용매가 사용될 때만 효율적으로 진행되는 것으로 나타났다. 진정한 동형 화질 제품의 설계는 두 개의 동일한 기능 하부 구조의 링커 연결과 대칭 링커의 적용을 의미합니다. PROTAC 8의 일부인 링커는 N-to-N, 폴리에틸렌 계 선형 체인을 나타낸다. 상응하는 α,ω-디아민 6은 90°C에서 DMSO에서 1:2의 몰 배급에서 빌딩 블록 3과 반응할 때 원하는 최종 화합물 8을 유도한다. 다른 분석데이터(24)중에서, 8의 구조는 NMR 스펙트럼(도5A)에의해 확인되었다. 화합물 9는 적합한 음극 대조군으로 설계되었으며, 활성 호모-PROTAC 8에 비해 최소한의, 그러나 중요한 구조적 편차를 가지고 있다. 글루타리마이드 부 내N-메틸화는 CRBN 결합26,27을폐지하는 것으로 알려져 있다. 음성 대조군 화합물 9의 하나의 포말리도마이드 부분은 N-메틸 잔류물을 진다. N-모노보호링커 빌딩 블록(5)을 가진 3의 제1 핵성 치환에 의해 제조될 수 있고, 이어서 Boc 보호기의 분열 및 중간 4로의 후속 결합이 뒤따른다. 그것의 비대칭 구조 때문에, 대응하는 탄소의 일부는 뚜렷한 13C NMR 신호를 보였다 (도5B).
호모-PROTAC 8은 매우 강력한 것으로 관찰되었고, CRBN의 거의 완전한 프로테아소말 분해를 초래한다. 다발성 골수종 세포에서 CRBN, IKZF1 및 IKZF3 단백질 수준의해석은 서양 얼룩 분석(도 6, 도7, 도 9B)단백질의 변화가 있는 반정량 표준 방법에 의해 확인되었습니다. 식을 쉽게 감지할 수 있습니다. 이 논문에 사용된 항체는 양호한 품질이며 이 방법은 실험실에서 최적화된 표준 절차입니다.
또한, 화합물 8에 의한 CRBN의 분해는 sgRNAs24에의한 CRBN의 CRISPR/Cas9 매개 녹아웃과 일치하는 IMiDs(도 8, 도 9A)에대한 세포 생존가능성 및 수여 저항성에 영향을 미치지 않았다. 세포 생존성 분석에서 발광 신호는 ATP 방출에 기초하였으며, 이는 죽은 세포 수로 해석될 수 있다. 이 방법은 많은 수의 샘플로 짧은 시간에 쉽게 수행 할 수 있습니다. 생존/죽은 세포의 측정을 위한 대체 방법은 유세포측정에 의한 Annexin V/7-AAD 염색입니다.
그림 1: E3 유비퀴틴 리가제 CRBN은 IMiDs의 주요 표적입니다. 면역 조절 약물은 CRBN에 결합하고 프로테아소말 분해를 위한 몇몇 신기판을 모집합니다. 림프성 전사 인자 IKZF1 및 IKZF3의 IMiD 유발 분해는 다발성 골수종 세포 및 일부 면역 조절 특성에 대한 영향을 담당한다. 카제인 키나아제 1α는 다른 IMiDs가 아닌 레날리도마이드에 의해 선택적으로 저하되고 염색체 5q의 손실을 가진 골수이형성 증후군에서 레날리도마이드의 활성에 기여한다. SALL4는 최근에 탈리도마이드와 그 유사체에 의해 유도된 기형에 연결될 가능성이 있는 모든 IMiDs의 일반적인 표적으로 발견되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PROTACs는 관심 단백질을 저하 (POI). PROTACs는 헤테로비기능 분자이며, 여기서 링커는 유비퀴틴 리가제 리간드를 POI 리간드에 연결합니다. 삼차 복합체의 형성에 의해 CRBN과 같은 유비퀴틴 리가제는 POI를 유비퀴틴화하여 프로테소말 분해를 초래합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: E3 유비퀴틴 리가제 CRBN의 분해를 위한 이중 기능적 호모-PROTAC. 포말리도마이드 계 호모-PROTAC에서, 2개의 유비퀴틴 리가제 바인더는 CRBN의 교차 유비퀴틴화를 유도하여 CRBN의 화학적으로 유도된 녹다운을 유도하기 위해 연결된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 호모디머 8 및 이종odimer 의 합성 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 1H NMR (상단) 및 13C NMR (하단) 스펙트럼. 화합물 8(A)및 화합물 9(B)의 분광은 NMR 분광계에서 DMSO-d6에 기록하였다. 화학 적 변화는 백만 (ppm) 당 부품으로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: CRBN, IKZF1 및 IKZF3에 대한 화합물 8 및 9의 효과. 포말리도미드 계 호모-PROTAC 화합물 8은 IKZF1 및 IKZF3에 대한 포말리도마이드의 약한 잔여 효과와 함께 CRBN 분해를 유도한다. 대조적으로, 포말리도마이드 잔기 중 하나에 메틸기류를 함유하는 화합물 9는 지시된 농도(μM)에 아무런 영향을 미치지 않는다. MM1S 세포를 24시간 치료를 위해 처리하였다. CRBN, IKZF1, IKZF3 및 튜불린(로딩 제어)에 대한 효과를 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: CRBN 분해는 프로테아좀 억제제 MG132 또는 네딜화 억제를 통해 간접적으로 유비퀴틴 리가아를 차단하는 MLN4942에 의해 차단될 수 있다. 다발성 골수종 세포주 MM1s는 10 μM MG132, 10 μM MLN4924로 전처리한 후 100 nM에서 100 nM에서 3시간 동안 결합된 처리에 대해 호모-PROTAC 화합물 8을 첨가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: MM1S 다발성 골수종 세포에서세포 생존성 분석. 화합물 8 및 음성 결합 대조군 화합물 9의 효과는 24 시간, 48 시간 및 96 h 치료 후 포말리도마이드 민감한 골수종 세포주 MM1S에서의 세포 생존가능성에 대한 것이다. 세포 생존력은 삼중체에서 4일 후에 측정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 화합물 8은 다발성 골수종 세포주에서 포말리도마이드의 효과를 길항한다. 세포를 100 nM 화합물 8로 3시간 동안 전처리하였다. 세포 생존력은 삼중체에서 4일 후에 측정되었다. p <0.001 학생의 T-테스트에 따라 (A). CRBN, IKZF1, IKZF3 및 튜불린(로딩 제어)에 대한 웨스턴 블롯 분석은 1 μM 포말리도마이드(B)를 첨가하기 전에100 nM 화합물 8을 3시간 동안 100 nM 화합물8로 전처리한 후. Steinebach, C. 외. 201824의허가를 받아 전재 (적응) . 저작권 2019 미국 화학 협회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
CRBN에 대해 여기에 설명된 바와 같이 이러한 호모-PROTAC의 설계는 CRBN에 대한 포말리도마이드의 특정 친화성에 의존하며, 이는 수많은 heterobifunctional PROTAC에서 성공적으로 활용되었으며 PROTAC 8의 개발을 매우 높게 초래했습니다. 선택적 CRBN 저하기. 우리의 분자의 특이성은 이미 proteomic 분석24에의해 확인되었습니다. 유전적으로 중재된 녹아웃의 경우, 부작용의 배제와 검증은 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 또한, 화학적으로 유도된 녹다운은 가역적이고, 신속하며, 광범위한 세포및 조직 유형(28)에 직접 적용가능하다.
IMiDs 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드는 다발성 골수종, B 세포 림프종 및 골수이형성 증후군의 치료에 주류가 되었습니다. IMiDs는 신기판 IKZF1, IKZF3, 또는 CK1α6,11,29를분해하기 위해 CRBN-CRL4 E3 리가제의 특이성을 조절함으로써 그들의 활성을 중재한다. 또한, IMiDs는 다발성 골수종 성장30에대해서도 중요한 두 개의 다른 단백질인 MCT-1 및 BSG에 CRBN의 샤페론 기능을 폐지하는 것으로 나타났다. 호모 이중 기능 PROTAC에 의한 CRBN의 분해는 시험된 대부분의 다발성 골수종 세포주에 의해 잘 용인되었고, 이는 CRBN 불활성화만으로는 다발성 골수종 세포의 살해를 유발하기에 충분하지 않다는 것을 암시한다. 대조적으로, 화합물 8을 가진 전처리는 IKZF1/3 분해에 대한 IMiDs의 효력을 폐지하고 레날리도마이드와 포말리도마이드에서 다발성 골수종 세포를 구출했습니다. 이것은 LENalidomide 저항하는 다발성 골수종 환자에서 찾아낸 CRBN및 해로운 CRBN 돌연변이의 유전 불활성화와 일치하고 IMiDs 31의 기계장치에 있는 CRBN의 필수적인 역할을 강조합니다31,32 . 따라서 호모-PROTAC 8은 IMiD 저항 상태를 모방하는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 혈관신생 또는 TNFα 방출의 억제와 같이 아직 완전히 이해되지 않은 IMiDs의 다른 효과는 CRBN 기능의 억제로부터 유래될 수 있으며, 우리의 호모-PROTAC는 CRBN의 불활성화를 더 조사하기에 적합한 도구이다. 또한, 화합물 8에 의한 CRBN의 화학적 유도 녹다운은 CRBN의 새로운 내인성 기판을 식별하고 CRBN의 생리적 기능을 해명하는 데 도움이 될 수 있다. 우리의 화합물 8 암 세포 주 증식에 아무 런치 가 없었다 감안할 때, CRBN 억제 혼자 항 종양 활성. 그러나, CRBN 디더는 암 이외의 질환에서 임상적으로 적용 가능하다. 이와 관련하여, CRBN 불활성화는 최근 마우스 33,34,35에서패혈증에 대한 저항성을 부여하고 고지방 식이 유발 비만을 예방하는 것으로 나타났다.
결론적으로, 우리는 탈리도마이드와 그 유사체의 CRBN 관련 신호 및 분자 메커니즘에 대한 미래의 생체 의학 조사를 위한 유용한 도구로 작용할 수 있는 CRBN의 첫 번째 화학 억제제들을 생성하고 검증했습니다.
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Disclosures
저자는 잠재적 인 재정적 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(에미-노에테르 프로그램 Kr-3886/2-1 및 SFB-1074-J.K.)에 의해 지원되었다. FOR2372 - M.G.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
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