Summary
这项工作描述了一种基于波马利多米德的合成和表征,即一种基于双功能的同质性PROTAC,作为诱导E3泛性联苯基雷布龙(CRBN)的泛化和降解的新方法,该物质是沙利度胺类比靶的目标。
Abstract
免疫调节药物 (IMiDs) 沙利度胺及其类似物, 利利多米德和波马利多米德, 所有FDA批准的药物用于治疗多发性骨髓瘤, 诱导淋巴转录因子伊卡罗斯 (IKZF1) 和 Aiolos 的泛化和降解(IKZF3)通过脑蛋白酶(CRBN)E3泛蛋白联苯,用于蛋白酶降解。IMiDs最近被用于生成双功能蛋白解靶向嵌合物(PROTACs),以针对CRBN E3附和酶的泛化和蛋白酶降解的其他蛋白质。我们设计并合成了基于波马利多米德的同质功能PROTC,并分析了它们诱导CRBN自导无化和降解的能力。在这里,CRBN同时充当E3泛基丁和靶子。同质-PROTAC化合物8降解CRBN具有高效力,对IKZF1和IKZF3仅产生最小剩余影响。化合物8的CRBN失活对细胞活力和不同多发性骨髓瘤细胞系的增殖没有影响。这种同质性PROTAC可以废除多发性骨髓瘤细胞中IMiD的作用。因此,我们的同质性波马利多米德化合物可能有助于识别CRBN的内源基质和生理功能,并研究IMiD的分子机制。
Introduction
免疫调节药物 (IMiDs) 沙利度胺及其类似物, 利利多米德和波马利多米德, 所有批准用于治疗多发性骨髓瘤, 结合 E3 泛素结合脑素 (CRBN), 基质适配器的 cullinin4A-RING E3 泛素结合(CRL4CRBN)1,2,3.IMiD 的结合增强了 CRL4CRBN与淋巴转录因子 Ikaros (IKZF1) 和 Aiolos (IKZF3) 的亲和力,导致其泛化和降解(图 1)4,5 ,6,7,8. 由于 IKZF1 和 IKZF3 对多发性骨髓瘤细胞至关重要,因此它们的失活会导致生长抑制。SALL4最近被发现作为CRBN的另一种IMiD诱导的新基质,可能是导致致畸和所谓的康特甘灾难在1950年代由沙利多米德9,10造成的。相反,卡辛激酶1+(CK1+)是CRBN的一种利利多米德特异性基质,与染色体5q缺失11的骨髓增生综合征的治疗效果有关。
小分子靶向特定蛋白质降解的能力是现代药物开发中令人振奋的一个暗示。虽然沙利度胺及其类似物的机制是在人类首次使用后发现的,但所谓的Proteolyis Targeting Chimeras (PROTACs) 被设计为专门针对感兴趣的蛋白质 (POI)(图2)12,13,14,15,16,17,18。PROTACs 是异体功能分子,由 POI 的特定配体组成,通过链接器连接到 E3 泛性联苯的配体,如 CRBN 或 von-Hippel-Lindau (VHL)18、19、20、 21,22.PROTACs诱导形成瞬态三元复合物,将POI定向到E3泛基质连体酶,导致其泛化和蛋白酶降解。与常规抑制剂相比,PROTACs的主要优点是,与POI结合就足够了,而不是其抑制作用,因此PROTACs可能针对更广泛的蛋白质,包括那些被认为无法药物的蛋白质,转录因子15.此外,嵌合分子具有催化作用,因此具有高效力。在泛基辛转移到POI后,三元复合物分离,可用于形成新的复合物。因此,非常低的PROTAC浓度足以降解靶蛋白23。
在这里,我们描述了一个波马利多米德-波马利多米德共聚物(化合物8)的合成,它招募CRBN来降低自身24。E3 泛基苯甲二苯CRBN 同时充当招募者和目标(图 3)。为了验证我们的数据,我们还合成了负绑定控制(化合物9)。 我们的数据证实,新合成的同质性PROTAC是CRBN降解的特异性,对其他蛋白质的影响最小。
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Protocol
1. PROTAC分子的制备
注意:使用前请查阅所有相关材料安全数据表 (MSDS)。这些合成中使用的几种化学品具有毒性和致癌性。请使用所有适当的安全操作和个人防护设备。
- 制备三丁基N-(2,6-二恶英-3-烟酸)碳水化合物(化合物1)
- 在带搅拌棒并配有反流冷凝器的100 mL圆形底瓶中,在100 mL圆形瓶中加入1,1'-碳二甲酰胺(1.95克,12毫摩尔)和4-(二甲基氨基)丙氨酸(5mg)的混合物(2.46克,10毫摩尔)。回流时加热10小时,搅拌至形成清晰的溶液。
- 用旋转蒸发器在减压下去除溶剂,加入EtOAc(200 mL),并将其转移到分集漏斗中。用H2 O(50 mL)和盐水(50 mL)清洗有机层,并在Na2SO4上干燥。
- 通过短垫的硅胶(5 厘米直径和 5 厘米高)过滤溶液,再用埃托克的体积(200 mL)渗滤溶液。
- 蒸发溶剂,在真空中干燥获得的无色固体。
- 制备三丁基N-(1-甲基-2,6-二恶英-3-烟酸)碳水化合物(化合物2)
- 将化合物1 (2.28 g, 10 mmol) 与研磨的碳酸钾 (2.76 g, 20 mmol) 和 DMF (25 mL) 结合在 100 mL 圆底瓶中。使用注射器加入碘多甲烷(1.42克、0.62 mL、10 mmol),为烧瓶配备被刺穿的橡胶隔膜。将反应容器放入超声波浴中 2 小时。
- 用EtOAc(100 mL)稀释反应混合物并将其转移到分集漏斗中。用 1 N NaOH (2x 25 mL)、H2O (25 mL) 和盐水 (25 mL) 清洗有机层,并在 Na2SO4上将其干燥。
- 过滤并蒸发溶剂。使用石油醚/EtOAc(2:1)在硅胶(6厘米柱直径和20厘米高)上通过柱色谱法净化产品。
- 制备 2-(2,6-二恶英-3-yl)-4-氟索林-1,3-二烯(化合物3)
- 将3-氟乙胺氢化物(1.25克,7.5毫摩尔)、谷氨酸1(1.14克,5毫摩尔)和醋酸钠溶液(0.50克,6.0毫摩尔)结合在50 mL圆形底瓶中,带搅拌棒并配有反流冷凝器。 将混合物加热至120°C6小时。
- 冷却后,将紫色混合物倒入H2O(100 mL)上,搅拌10分钟。通过过滤收集成型的固体,用H2O(3 × 5 mL)和石油醚(3 ~5 mL)洗涤,在真空中干燥。
- 制备4-氟-2-(1-甲基-2,6-二氧乙酰-3-基)异氨酸-1,3-二烯(化合物4)
- 将3-氟乙胺氢化物(1.25克,7.5毫摩尔)、谷氨酸2(1.21克,5毫摩尔)和醋酸钠溶液(0.50克,6.0毫摩尔)结合在冰川醋酸(20 mL)中的100 mL圆形底瓶中,带搅拌棒并配有反流冷凝器。 将混合物加热至120°C6小时。
- 冷却后,将紫色混合物倒入H2O(100 mL)上,搅拌10分钟。通过过滤收集成型的固体,用H2O(3 × 5 mL)和石油醚(3 ~5 mL)洗涤,在真空中干燥。
- 制备三丁基N-2-2-2-*2-2-2-2-2-2-2-二恶英-1,3-二恶英-异二醇-4-yl_氨基甲氧乙基_碳水化合物(化合物7)
- 用三丁基N-[2-+2-2-(氨基)乙基乙酸二甲酸酯(5,0.41克,1.65毫摩尔)、化合物3(0.41克,1.50毫摩尔)、干DMF(10 mL)和DIPEA(0.39克,0.51 mL,3.0mmol)充电50mL圆底瓶。 配有搅拌棒和回流冷凝器。在 90°C 的高温下加热 10 小时。
- 冷却至室温后,将深绿色混合物倒入H2O (100 mL)上,并在分集漏斗中用 EtOAc (3x 50 mL) 萃取。用H2O (50 mL) 和盐水 (50 mL) 清洗组合的有机层,在 Na2SO4上干燥,过滤,并浓缩在真空中。
- 使用石油醚/EtOAc梯度(1:1至1:2)在硅胶(3厘米柱直径和60厘米高)上通过柱色谱法净化原油产品。
- 霍莫默的制备(化合物8)
- 将 β、α-二胺连结器 6(0.22 g、0.22 mL、1.50 mmol)、DIPEA(1.05 mL、6.00 mmol)和3(0.83克,3.00 mmol)溶液结合在50 mL圆形底烧瓶中,并配有反流器。 在 90°C 的高温下加热 18 小时。
- 冷却至室温后,将深绿色混合物倒入H2O (100 mL)上,并在分集漏斗中用 EtOAc (3x 50 mL) 萃取。用H2 O(50 mL)和盐水(50 mL)清洗组合的有机层,在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩在真空中。
- 使用石油醚/EtOAc梯度(1:2)至EtOAc,通过柱色谱在硅胶(3厘米柱直径和50厘米高)上纯化原油产品。
- 异体制剂(化合物9)
- 将化合物7(0.83克,1.65毫摩尔)溶解在干CH 2 Cl 2(10mL)中。加入三氟乙酸(10 mL),在40°C下搅拌黄色混合物2小时,在封闭的50 mL圆形底瓶中搅拌。
- 去除挥发物,用 CH2Cl2 (4x 5 mL) 进行共蒸发。将残留物在真空中干燥 10 小时。
- 在干燥的 DMF (20 mL) 中重新溶解材料。加入化合物4(0.44克,1.50毫摩尔)和DIPEA(0.78克,1.05 mL,6.00 mmol),并为烧瓶配备反流冷凝器。 在 90°C 的高温下加热 10 小时。
- 冷却至室温后,将深绿色混合物倒入H2O (100 mL)上,并在分集漏斗中用 EtOAc (3x 50 mL) 萃取。用饱和的NaHCO 3(50 mL)、H2O(50 mL)、10%KHSO4(50 mL)、H2O(50 mL)和盐水(50 mL)清洗组合有机层,在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩在真空中。
- 使用石油醚/EtOAc梯度(1:2)至EtOAc,通过柱色谱在硅胶(3厘米柱直径和50厘米高)上纯化原油产品。
- 在核磁共振(NMR)上,通过1H NMR和13C NMR光谱在DMSO-d6上阐明和验证分子结构(图5A化合物8,5B化合物9) 光谱仪。通过液相色谱-质谱法(LC-MS),在220~500nm下应用二极管阵列检测(DAD),检查两种化合物的纯度是否高于97%。
2. PROTAC分子的功能验证
- PROTACCRBN降解的西方污点分析
注:化合物的影响8和化合物9通过西方污点分析对CRBN蛋白水平进行了测试。此外,对IKZF1和IKZF3水平的影响也可得到确认(图 6).-
样品制备
- 在DMSO中溶解化合物8和9,lenalidomide(Len)、pomalidomide(Pom)、MG132和MLN-4924,浓度为10mM,等分并储存在-80°C,直至进一步使用。
- 种子 1 x 106 MM1S 细胞在 6 孔板中,带 2.5 mL 介质,用 100 nM 或 1 μM 化合物8或9处理细胞,24 小时。
- 处理后收获细胞,在700 x g,5分钟,4°C下离心。用冷1x PBS清洗细胞颗粒,去除剩余的介质,在700 x g、5分钟、4°C下离心,并丢弃上清液。重复此步骤一次。
- 莱沙缓冲液中的酶细胞(25 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% 甘油, 1x 蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒) 在冰上10分钟, 离心机在320 x g 10分钟, 4°C.根据制造商的协议,通过双辛酸蛋白测定(BCA测定)采集上清液并确定蛋白质浓度。
- 变性蛋白质(15~30 μg/样品),具有1xLDS载荷缓冲液(5%2-甲壳乙醇),煮10分钟,75°C。
-
SDS-PAGE
- 修复凝胶三明治与10%分离凝胶#4 mL 3x凝胶缓冲液(3M Tris/HCl, 0.3% (w/v) 硫酸钠 (SDS), pH 8.45), 4 mL 丙烯酰胺 30%, 2.52 mL 甘油 50%, 1.395 mL H2O, 75 μL 11% 硫酸铵 (APS), 和 9.75 [L TEMED] 和 4% 堆叠凝胶 [1.992 mL 3x 凝胶缓冲液,0.792 mL 30% 丙烯酰胺、3.168 mL H2O、36 μL 11% APS 和 6[L TEMED] 在电极组件单元中。拆下梳子,用阴极缓冲液冲洗孔(100 mM Tris/HCl,100 mM 三重体,0.1%(w/v)SDS),并装载样品。
- 将阳极缓冲液(100 mM Tris/HCl,pH 8.9)填充油箱。从步骤 2.1.1.4 加载蛋白质样本,以 70 V、20 分钟运行 SDS-PAGE,然后以恒定电压运行 115 V,150 分钟。
-
CRBN、IKZF1和IKZF3的免疫印迹和检测
- 在100%甲醇中激活PVDF膜(0.45μm,1分钟.平衡膜和分离凝胶在1x转移缓冲液[10x转移缓冲液(192 mM甘氨酸,25 mM Tris-base/HCl,900 mL H2O),20%甲醇,0.1%SDS,pH 8.3]。
- 根据制造商的协议组装印迹盒。在180 mA下转移凝胶90分钟。
- 在 1x TBS-T 中清洗膜 3 倍(25 mM Tris/HCl,150 mM NaCl,pH 7.6,0.1% 补间 20),在室温下每次清洗 5-10 分钟。在室温下将膜块在5%脱脂干牛奶(NFDM),TBS-T1小时。在室温下,在 1X TBS-T 中清洗膜 3 倍,每次清洗 5-10 分钟。
- 用CRBN原抗体孵育膜(1:500在5%BSA,TBS-T),在4°C处轻轻摇动,过夜。
- 在室温下,在 1X TBS-T 中清洗膜 3 倍,每次清洗 5-10 分钟。用抗小鼠(5% NFDM,TBS-T)或抗兔子(5% NFDM,TBS-T)的1:5.000与马萝卜过氧化物酶HRP(室温下1小时)结合的二次抗体孵育膜。
- 在室温下,将膜在 1X TBS-T 中洗涤 2 倍,每次清洗 5-10 分钟。使用 1x TBS 重复此步骤两次。
- 根据制造商的协议,使用HRP基板溶液孵育膜2分钟,并在化学发光检测装置中检测化学发光。
- 在1X TBS中清洗膜1倍,在室温下每次清洗5~10分钟。为了释放抗体,在市售的剥离缓冲液中剥离膜15分钟,在1X TBS中清洗膜3倍,在室温下各5~10分钟。
- 在5%脱脂干牛奶中重新粘附膜,TBS-T在室温下1小时。根据步骤 2.1.3.4,在室温下将膜在 1x TBS-T 中清洗 3 倍,每次 5-10 分钟,然后根据步骤 2.1.3.4 重新探针 IKZF1、IKZF3 或 Tubulin。
-
样品制备
- MG132、MLN4942 或 pomalidomide 的竞争实验
注:为了确认CRBN是否通过泛基蛋白-蛋白酶体途径降解,我们用蛋白酶抑制剂MG132和内酰化活化酶(NAE)抑制剂MLN4942(图7)进行了竞争实验。- 种子 1 x 106 MM1S 细胞每孔在 6 孔板。预处理10μM MG132、10μM MLN4942或利纳利多米德(100x)的细胞,并在37°C下孵育1小时,CO2为5%。
- 在37°C时加入100 nM化合物8,3小时,CO2为5%。
- 根据步骤 2.1.1 为西部污点采集细胞。
- 多骨髓瘤细胞系中的细胞活力测定
注:此测定用于测试对细胞活力的影响,此外,通过预处理化合物8的细胞来对抗IId对多骨髓瘤细胞的影响(图8,图9A,B)。- 种子 5 x 104 MM1S 细胞每孔在 96 孔板中的生物三元片,用于可行性测定。对于西方印斑分析,种子 1 x 106 MM1S 细胞每孔在生物三元板的 6 孔板。
- 用DMSO或100 nM、1 μM或10 μM化合物8、化合物9或波马利多米德处理细胞,在37°C、5%CO2下孵育24小时、48小时或96小时。 对于救援实验,使用100 nM化合物8处理细胞3小时,在加入1μM波马利多米德之前或之后,孵育96小时。
- 根据制造商在板读取器上的协议或从 6 孔板中采集细胞进行西印子分析,使用发光细胞可行性测定测量 96 孔板发光。
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Representative Results
在这里,我们描述了基于同质的波马利多米德PROTAC用于CRBN降解的设计、合成和生物评价。我们的PROTAC与两个CRBN分子同时相互作用,形成三元复合物,诱导CRBN自泛化和原体降解,仅对波马利多米德诱导的新基质IKZF1或IKZF3产生最小剩余影响。
在以前公布的一系列基于波马利多米德的PROTAC分子24中,化合物8在CRBN的化学降解中特别有效。其合成可以如下完成(图4)。1,1'-碳二甲酰胺促进凝结的Boc保护l-谷氨酰胺导致循环化imid1。 N-甲基化模拟2可通过甲基碘化物的烷基化获得。在酸性条件下,N-去保护后,两个积木(1和2)在环开/回收反应过程中,使用3- 氟phphthalic氢化物。一般来说,沙利度胺类比易受水解分解,只有在充分干燥后才能在下一步使用。化合物3易用原发性脂肪胺25进行芳香核亲子替代;只有在使用干溶剂时,这种转换才能有效地进行。真正的同构产品的设计意味着两个相同功能子结构的连结连接和对称链接器的应用。作为PROTAC 8的一部分的连杆代表一个N到N,聚乙烯基的线性链。当在90°C下与DMSO中1:2的摩尔配给中的积木3发生反应时,相应的α,α--二胺6导致所需的最终化合物8。 在其他分析数据24中,NMR光谱验证了8的结构(图5A)。化合物9,设计为合适的负控制,与有源同质-PROTAC 8相比,只有最小但关键的结构偏差。 据了解,谷氨酸部分内的N-甲基化废除CRBN结合26,27。负控制化合物9的一个波马利多米德部分含有N-甲基残留物。它可以通过第一个核亲子替代3与N单保护链接器构建基块5,其次是裂解的Boc保护组和随后的耦合到中间4。 由于其不对称的结构,一些相应的碳表现出明显的13CNMR信号(图5B)。
同源PROTAC 8被观察到是高度有效的,导致CRBN几乎完全蛋白酶体降解。西方印斑分析(图6,图7,图9B)证实了多骨髓瘤细胞中CRBN、IKZF1和IKZF3蛋白水平的解释(图6,图7,图9B),这是一种半定量的标准方法,其中蛋白质的变化表达式很容易检测到。本文使用的抗体质量良好,是本实验室中一种优化的标准程序。
此外,化合物8降解CRBN不影响细胞活力,并产生对IMiD的抵抗力(图8,图9A),这与SgRNA24对CRBN的CRISPR/Cas9介导敲除一致。细胞活力测定中的发光信号基于ATP释放,可解释为死细胞计数。此方法可以在短时间内轻松执行,具有大量样本。测量活细胞/死细胞的另一种方法是用流式细胞测定法进行附件V/7-AAD染色。
图1:E3泛性联苯CRBN是IMiDs的主要目标。免疫调节药物与CRBN结合,并招募几种新基质用于蛋白酶体降解。IMiD引起的淋巴转录因子IKZF1和IKZF3的降解对多发性骨髓瘤细胞和一些免疫调节特性的影响负责。卡辛激酶1+被利纳利多米德选择性地降解,但不是其他IMiDs,并且有助于在骨髓增生综合征中,在染色体5q的丧失中,莱利多米德的活性。SALL4最近被发现是所有IMID的共同靶点,可能与沙利度胺及其类似物引起的致畸性有关。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:PROTACs 降解感兴趣的蛋白质 (POI)。PROTACs 是异质函数分子,其中链接器将泛基体联结体与 POI 配体连接。通过形成三元复合物,一种泛基蛋白的联带,如CRBN,然后泛化POI,导致其前体降解。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:E3泛性联苯CRBN降解的双功能同质PROTAC。在基于波马利多米德的同质-PROTAC中,两个泛基蛋白结合剂粘合剂连接在一起,诱导CRBN的交叉泛化,导致CRBN的化学诱导敲除。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:异体8和异体9的合成。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:1个H NMR(顶部)和13个CNMR(底部)光谱。化合物8 ( A) 和化合物9 (B) 的光谱在DmSO-d6中记录在NMR光谱仪上.化学转移以百万分之一 (ppm) 的零件为单位。请点击此处查看此图的较大版本。
图6:化合物8和9对CRBN、IKZF1和IKZF3的影响。基于波马利多米德的同质-PROTAC化合物8诱导CRBN降解,对IKZF1和IKZF3的波马利多米德的微弱剩余影响。相比之下,在其中一种波马利多米德残留物上含有甲基基的化合物9对指示的浓度(μM)没有影响。MM1S细胞经过24小时治疗。用西污点分析了CRBN、IKZF1、IKZF3和图布林(载荷控制)的影响。请点击此处查看此图的较大版本。
图7:CRBN降解可通过蛋白酶体抑制剂MG132或MLN4942阻断,通过脱皮抑制间接阻断泛性利气。多发性骨髓瘤细胞系MM1s在10μM MG132、10μM MLN4924进行1小时预处理,在100 nM加入同型PROTAC化合物8,进行3小时联合治疗。请点击此处查看此图的较大版本。
图 8:MM1S多发性骨髓瘤细胞中的细胞活力测定。化合物8和阴性结合控制化合物9在24小时、48小时和96小时治疗后对pomalidomide敏感骨髓瘤细胞系MM1S中的细胞活力的影响。 细胞活力在三胞胎4天后被测量。请点击此处查看此图的较大版本。
图 9:化合物8对抗多骨髓瘤细胞系中的波马利多米德效应。细胞用100 nM化合物8预处理3小时,然后加入1μM波马利多米德。细胞活力在三胞胎4天后被测量。p <0.001 根据学生的 t-测试 (A)CRBN、IKZF1、IKZF3和图布林(载荷控制)的西斑分析,在预处理MM1S细胞后,用100 nM化合物8进行3小时,然后再加入1μM波马利多米德(B)。转载(改编)经施泰纳巴赫许可,C.等人201824.版权所有 2019 美国化学学会。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
此处描述的CRBN此类同质-PROTAC的设计依赖于波马利多米德与CRBN的具体亲和力,该设计已成功应用于众多异质功能PROTAC,并使得PROTAC 8的发展成为高度选择性CRBN降解剂。我们的分子的特异性已经通过蛋白体分析24得到证实。对于基因介导的淘汰,排除和验证副作用是具有挑战性的和耗时的。此外,化学诱导的敲除是可逆的,快速和直接适用于广泛的细胞和组织类型28。
IMiDs 沙利多米德、利利多米德和波马利多米德已成为治疗多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤和骨髓增生综合征的支柱。IMiD通过调节CRBN-CRL4 E3偶联体特异性来调节其活性,以降解新基质IKZF1、IKZF3或CK1+6、11、29。此外,IMiD已被证明可以废除CRBN对另外两种蛋白质MCT-1和BSG的伴松功能,这对多发性骨髓瘤生长30也很重要。大多数测试的多发性骨髓瘤细胞系对CRBN的降解得到了很好的耐受性,这意味着仅CRBN失活不足以导致多骨髓瘤细胞的杀伤。相反,对化合物8的预处理废除了IMiDs对IKZF1/3降解的影响,并从利纳利多米德和波马利多米德中挽救了多个骨髓瘤细胞。这与在耐利利多米德多骨髓瘤患者中发现的CRBN和有害的CRBN突变的基因失活一致,并强调了CRBN在IMiDs31、32机制中的重要作用.因此,同质PROTAC 8可以是一个有用的工具,以模拟IID电阻状态。尚未完全理解的IMiD的其他影响,如抑制血管原性或TNF®释放,可能来自CRBN功能的抑制,我们的同质-PROTAC是进一步调查CRBN失活的合适工具。此外,化合物8对CRBN的化学诱导敲除可能有助于识别CRBN的新内源基质,阐明CRBN的生理功能。鉴于我们的化合物8对癌细胞系增殖没有影响,仅CRBN抑制就无抗肿瘤活性。然而,CRBN降解剂可能临床上适用于癌症以外的疾病。在这方面,CRBN灭活最近显示,对败血症具有抵抗力,并防止小鼠33、34、35的高脂肪饮食引起的肥胖。
最后,我们生成并验证了CRBN的第一种化学抑制剂,它可以作为未来对沙利度胺及其类似物的CRBN相关信令和分子机制进行生物医学研究的有用工具。
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Disclosures
提交人没有宣布潜在的财务利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了德国福森斯格明舍夫特(Emmy-Noether计划Kr-3886/2-1和SFB-1074到J.K.)的支持;FOR2372 到 M.G.)
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M.
Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017). - Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al.
Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016). - Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).