Summary
Dette arbejde beskriver syntesen og karakteriseringen af en pomalidomid-baseret, bifunktionel homo-PROTAC som en ny metode til at fremkalde allestedsnærværende og nedbrydning af E3 ubiquitin ubiquitinligase cereblon (CRBN), målet for thalidomid analogerne.
Abstract
De immunmodulerende lægemidler (Imid'er) thalidomid og dets analoter, lenalidomid og pomalidomid, alle FDA-godkendte lægemidler til behandling af multipelt myelom, inducerer allestedsnærværende og nedbrydning af de lymfoide transkriptionsfaktorer Ikaros (IKZF1) og Aiolos (IKZF3) via cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ubiquitinligase for proteasomal nedbrydning. Imid'er er for nylig blevet udnyttet til generering af bifunktionel proteolyse rettet mod kimærer (protacs) til at målrette mod andre proteiner til allestedsnærværende og proteasomal nedbrydning ved crbn E3-Ligase. Vi designede og syntetiserede pomalidomid-baserede homobifunktionelle PROTACs og analyserede deres evne til at inducere selvstyret allestedsnærværende og nedbrydning af CRBN. Her fungerer CRBN både som E3 ubiquitin ubiquitinligase og målet på samme tid. Homo-PROTAC sammensatte 8 nedbryder crbn med en høj potens med kun minimal resterende effekt på IKZF1 og IKZF3. CRBN inaktivering af sammensatte 8 havde ingen effekt på cellelevedygtighed og spredning af forskellige multipelt myelomatose cellelinjer. Denne homo-PROTAC ophæver virkningerne af Imid'er i multipelt myelomatose celler. Derfor kan vores homodikemeje pomalidomid-baserede forbindelser hjælpe med at identificere CRBN ' endogene substrater og fysiologiske funktioner og undersøge den molekylære mekanisme af Imid'er.
Introduction
De immunomodulatoriske lægemidler (Imid'er) thalidomid og dets analoker, lenalidomid og pomalidomid, som alle er godkendt til behandling af multipelt myelom, binder sig til E3 ubiquitin ubiquitinligase cereblon (CRBN), en substrat adapter til cullin4A-RING E3 ubiquitin ubiquitinligase (CRL4crbn)1,2,3. Binding af imid'er øger affiniteten af CRL4crbn til de lymfoide transkriptionsfaktorer Ikaros (IKZF1) og Aiolos (IKZF3), hvilket fører til deres allestedsnærværende og nedbrydelighed (figur 1)4,5, 6 , 7 , 8. da IKZF1 og IKZF3 er afgørende for multipelt myelomatose celler, deres inaktivering resulterer i væksthæmning. SALL4 blev for nylig fundet som et ekstra imid-induceret neo-substrat af crbn, der sandsynligvis er ansvarlig for den teratogenicitet og den såkaldte contergan-katastrofe i 1950 ' erne forårsaget af thalidomid9,10. I modsætning hertil er Casein kinase 1α (CK1α) et lenalidomid-specifikt substrat af CRBN, som er impliceret i den terapeutiske virkning af myelodysplastisk syndrom med kromosom 5q sletninger11.
Muligheden for små molekyler til at målrette et bestemt protein til nedbrydning er en spændende konsekvens for moderne narkotika udvikling. Mens mekanismen for thalidomid og dets analoter blev opdaget efter deres første anvendelse i mennesker, er såkaldte proteolyse targeting Chimeras (protacs) blevet designet til specifikt at MÅLRETTE et protein af interesse (POI) (figur 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs er heterobifunktionelle molekyler, der består af en specifik ligand for POI forbundet via en linker til en ligand af en E3 ubiquitin ubiquitinligase som crbn eller Von-Hippel-Lindau (vhl)18,19,20, 21,22. PROTACs inducerer dannelsen af et forbigående ternære kompleks, der dirigerer POI til E3 ubiquitin Ligase, hvilket resulterer i dets allestedsnærværende og proteasomale nedbrydning. De største fordele ved PROTACs over konventionelle hæmmere er, at binding til en POI er tilstrækkelig i stedet for dets hæmning, og derfor kan PROTACs potentielt målrette et langt bredere spektrum af proteiner, herunder dem, der blev anset for at være uforruggable som transkriptionsfaktorer15. Derudover virker chimeriske molekyler katalytisk og har derfor en høj potens. Efter ubiquitin overførsel til POI, det ternære kompleks dissocierer og er til rådighed for dannelsen af nye komplekser. Derfor er meget lave PROTAC-koncentrationer tilstrækkelige til nedbrydning af målproteinet23.
Her beskriver vi syntesen af en pomalidomid-pomalidomid konjugeret homo-PROTAC (sammensatte 8), der REKRUTTEREDE crbn til nedbrydning af sig selv24. E3 ubiquitin ubiquitinligase CRBN fungerer både som rekrutteringsmedarbejder og mål på samme tid (figur 3). For at validere vores data syntetiserede vi også en negativ bindings kontrol (sammensatte 9). Vores data bekræfter, at den nyligt syntetiserede homo-PROTAC er specifik for CRBN nedbrydning og har kun minimal effekt på andre proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af PROTAC molekyler
Forsigtig: Se alle relevante sikkerhedsdatablade (MSD'ER) før brug. Flere af de kemikalier, der anvendes i disse synteser er giftige og kræftfremkaldende. Brug venligst alle relevante sikkerhedspraksisser og personlige værnemidler.
- Klargøring af tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamat (forbindelse 1)
- Tilsæt 1, 1 '-carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) og en katalytisk mængde af 4-(dimethylamino) pyridin (5 mg) til en blanding af BOC-GLN-OH (2,46 g, 10 mmol) i THF (50 mL) i 100 mL rund bund kolbe med omrørbar og udstyret med en tilbageløbs kondensator. Opvarmes ved refluks i 10 timer under omrøring, indtil der dannes en klar opløsning.
- Fjern opløsningsmidlet under reduceret tryk med en rotationsfordamper, tilsæt EtOAc (200 mL) og overfør det til en skilletragt. Det organiske lag vaskes med H2O (50 ml) og saltlage (50 ml), og det tørres over na2så4.
- Opløsningen filtreres gennem en kort pude af silicagel (5 cm i diameter og 5 cm højde), og der eluerer med yderligere volumen (200 mL) EtOAc.
- Fordampningen af opløsningsmidlet og tør det fremstillede farveløse fast stof i vakuo.
- Klargøring af tert-butyl N-(1-methyl-2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamat (forbindelse 2)
- Kombiner sammensatte 1 (2,28 g, 10 mmol) med sleben kaliumcarbonat (2,76 g, 20 mmol) og DMF (25 ml) i en 100 ml rund bund kolbe. Tilsæt iodomethan (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) drop-Wise ved hjælp af en sprøjte og udstyre kolben med en punkteret gummi septum. Placer reaktionsbeholderen i et ultralydbad i 2 timer.
- Reaktionsblandingen fortyndes med EtOAc (100 mL) og overføres til en separerende tragt. Det organiske lag vaskes med 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml) og saltlage (25 ml), og det tørres over na2så4.
- Filter og fordampe opløsningsmidlet. Produktet anvendes ved kolonne kromatografi over silicagel (6 cm kolonne diameter og 20 cm højde) med petroleums ether/EtOAc (2:1).
- Præparat af 2-(2, 6-dioxopiperidin-3-yl) -4-fluoroisoindoline-1, 3-Dione (sammensatte 3)
- Kombiner 3-fluorophthalic anhydrid (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) og en opløsning af natriumacetat (0,50 g, 6,0 mmol) i iseddike (20 ml) i en 50 ml rund bund kolbe med en Stir stang og udstyret med en tilbageløbs kondensator. Blandingen opvarmes ved 120 °C i 6 timer.
- Efter afkøling hældes den lilla blanding på H2o (100 ml) og omrøres i 10 min. Saml den dannede faste ved filtrering, vask med h2o (3 × 5 ml) og petroleums ether (3 × 5 ml) og tør i vacuo.
- Præparat af 4-fluoro-2-(1-methyl-2, 6-dioxopiperidin-3-yl) isoindoline-1, 3-Dione (sammensatte 4)
- Kombiner 3-fluorophthalic anhydrid (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimid 2 (1,21 g, 5 mmol) og en opløsning af natriumacetat (0,50 g, 6,0 mmol) i iseddike (20 ml) i en 100 ml rund bund kolbe med en Stir stang og udstyret med en tilbageløbs kondensator. Blandingen opvarmes ved 120 °C i 6 timer.
- Efter afkøling hældes den lilla blanding på H2o (100 ml) og omrøres i 10 min. Saml den dannede faste ved filtrering, vask med h2o (3 × 5 ml) og petroleums ether (3 × 5 ml) og tør i vacuo.
- Præparat af tert-Butyln-[2-[2-[2-[[2-(2, 6-dioxo-3-piperidyl)-1, 3-dioxo-isoindolin-4-yl] amino] ethoxy] ethoxy] ethyl] carbamat (sammensatte 7)
- Oplad en 50 mL rund bund kolbe med tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl] carbamat (5, 0,41 g, 1,65 mmol), sammensatte 3 (0,41 g, 1,50 mmol), tør DMF (10 ml) og dipea (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Udstyre med en Stir bar og en tilbageløbs kondensator. Varme under argon-atmosfære ved 90 °C i 10 timer.
- Efter afkøling til stuetemperatur hældes den mørke grønne blanding på H2O (100 ml) og ekstrahere med etoac (3X 50 ml) i en separerende tragt. De kombinerede organiske lag vaskes med H2O (50 ml) og saltlage (50 ml), tør over na2så4, Filtrer og koncentrer i vakuo.
- Rense det rå produkt ved kolonne kromatografi over silicagel (3 cm kolonne diameter og 60 cm højde) ved hjælp af en gradient af råolie ether/EtOAc (1:1 til 1:2).
- Tilberedning af homodimer (forbindelse 8)
- Kombiner α, ω-diamin-link 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), dipea (1,05 mL, 6,00 mmol) og en opløsning på 3 (0,83 g, 3,00 MMOL) i tør DMSO (20 mL) i en 50 ml rund bund kolbe med en Stir stang og udstyret med en tilbageløbs kondensator. Varme under argon-atmosfære ved 90 °C i 18 timer.
- Efter afkøling til stuetemperatur hældes den mørke grønne blanding på H2O (100 ml) og ekstrahere med etoac (3X 50 ml) i en separerende tragt. De kombinerede organiske lag vaskes med H2O (50 ml) og saltlage (50 ml), tør over na2så4, Filtrer og koncentrer i vakuum.
- Det rå produkt ved kolonne kromatografi over silicagel (3 cm kolonne diameter og 50 cm højde) ved hjælp af en gradient af råolie ether/EtOAc (1:2) til EtOAc.
- Fremstilling af heterodimer (forbindelse 9)
- Sammensatte 7 (0,83 g, 1,65 mmol) opløses i tør LM2CL2 (10 ml). Tilsæt trifluoroeddikesyre (10 mL) og rør den gule blanding ved 40 °C i 2 timer i en lukket 50 mL rund bund kolbe.
- Fjern flygtige og cofordampere med LM2CL2 (4X 5 ml). Remanensen tørres i vakuo i 10 timer.
- Materialet opopløses i tørt DMF (20 mL). Tilsæt sammensatte 4 (0,44 g, 1,50 mmol) og dipea (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) og udstyre kolben med en tilbageløbs kondensator. Varme under argon-atmosfære ved 90 °C i 10 timer.
- Efter afkøling til stuetemperatur hældes den mørke grønne blanding på H2O (100 ml) og ekstrahere med etoac (3X 50 ml) i en separerende tragt. De kombinerede organiske lag vaskes med mættet NaHCO3 (50 ml), H2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), H2o (50 ml) og saltlage (50 ml), tør over na2så4, Filtrer og koncentrer i vacuo.
- Det rå produkt ved kolonne kromatografi over silicagel (3 cm kolonne diameter og 50 cm højde) ved hjælp af en gradient af råolie ether/EtOAc (1:2) til EtOAc.
- Elucidate og kontrol molekyle struktur (figur 5a sammensatte 8, 5b sammensatte 9) af 1H NMR og 13C NMR Spectra i DMSO-d6 på en nuklear magnetisk resonans (NMR) Spektrometer. Kontroller, at renheden af begge forbindelser er højere end 97% ved hjælp af væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), der anvender en diodearray Detection (far) ved 220 – 500 nm.
2. funktionel validering af PROTAC-molekyler
- Western blot analyse af CRBN nedbrydning af PROTACs
Bemærk: virkningerne af sammensatte8og sammensatte9på CRBN-Proteinniveau blev testet af Western blot-analyse. Desuden kunne indvirkningen på IKZF1 og IKZF3 niveauer også bekræftes (Figur 6).-
Forberedelse af prøver
- Forbindelser 8 og 9opløses, lenalidomid (len), pomalidomid (POM), MG132 og MLN-4924 i DMSO i en koncentration på 10 mm, alikvot og opbevares ved-80 °c indtil videre anvendelse.
- Frø 1 x 106 MM1S celler i en 6-brønd plade med 2,5 ml medier og behandle celler med 100 nm eller 1 μM sammensatte 8 eller 9 for 24 h.
- Høst celler efter behandling og centrifuge ved 700 x g, 5 min, 4 °c. Vask celle pellet med kold 1x PBS for at fjerne de resterende medier, centrifuge ved 700 x g, 5 min, 4 °c, og kassér supernatanten. Gentag dette trin én gang.
- Lyse celler i lysis buffer (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1x protease & Fosfatasehæmmer cocktail) i 10 min på is, centrifuge ved 320 x g i 10 min, 4 °c. Høst supernatanten og bestemme proteinkoncentrationen ved en bicinchoninsyre protein assay (BCA assay) i henhold til producentens protokol.
- Denatur proteiner (15 – 30 μg/prøve) med 1x LDS loading buffer (5% 2-mercaptoethanol) og kog 10 min, 75 °C.
-
SDS-SIDE
- Fix gel sandwich med en 10% skille gel [4 mL 3x gel buffer (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8,45), 4 mL acrylamid 30%, 2,52 mL glycerol 50%, 1,395 mL H2O, 75 μl 11% ammonium PERSULFAT (APS) og 9,75 ΜL TEMED] og en 4% stabel gel [1,992 mL 3x gel buffer, 0,792 mL 30% acrylamid, 3,168 mL H2O, 36 μl 11% ApS og 6 ΜL TEMED] i en elektrode montage enhed. Fjern kamme, skylle brønde med katode buffer (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS) og belastningsprøver.
- Fyld anode buffer (100 mM Tris/HCl, pH 8,9) i tanken. Indlæs protein prøve fra trin 2.1.1.4 og køre SDS-side på 70 V, 20 min, efterfulgt af 115 V, 150 min ved konstant spænding.
-
Immunoblotting og påvisning af CRBN, IKZF1 og IKZF3
- Aktiver PVDF-membran (0,45 μm) i 100% methanol i 1 min. Ækvibratmembran og adskillelse af gel i 1x overførsels buffer [10x Transfer buffer (192 mM glycin, 25 mM Tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20% methanol, 0,1% SDS, pH 8,3].
- Saml blotting kassette i henhold til producentens protokol. Overfør gel ved 180 mA for 90 min.
- Vask membran 3x i 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) for 5 – 10 min hver ved stuetemperatur. Blok membran i 5% ikke-fedt tørret mælk (NFDM), TBS-T for 1 t ved stuetemperatur. Vask membran 3x i 1X TBS-T for 5 – 10 min hver ved stuetemperatur.
- Incubate membran med primær antistof for CRBN (1:500 i 5% BSA, TBS-T) med blid omrystning ved 4 °C, natten over.
- Vask membran 3x i 1X TBS-T for 5 – 10 min hver ved stuetemperatur. Incubate membran med anti-mus (1:10.000 i 5% NFDM, TBS-T) eller anti-kanin (1:5.000 i 5% NFDM, TBS-T) sekundært antistof koblet til peberrod peroxidase HRP (1 h ved stuetemperatur.)
- Vask membranen 2x i 1X TBS-T for 5 – 10 min hver ved stuetemperatur. Gentag dette trin to gange med 1x TBS.
- Inkuber membranen i 2 min med HRP substratopløsning i henhold til producentens protokoller og detekterer chemiluminescens i en kemiluminescens detekterings anordning.
- Vask membran 1x i 1X TBS for 5 – 10 min hver ved stuetemperatur. Til frigivelse af antistoffer, Strip membran i kommercielt tilgængelige stripping buffer i 15 min. vask membran 3x i 1X TBS for 5 – 10 min hver ved stuetemperatur.
- Reblock membran i 5% ikke-fedt tørret mælk, TBS-T for 1 h ved stuetemperatur. Vask membran 3x i 1x TBS-T for 5 – 10 min hver ved stuetemperatur og reprobe med IKZF1, IKZF3 eller Tubulin i henhold til trin 2.1.3.4.
-
Forberedelse af prøver
- Konkurrence eksperimenter med MG132, MLN4942 eller pomalidomid
Bemærk: for at bekræfte, om CRBN nedbrydes via ubiquitin-proteasomet-vejen, udførte vi konkurrence eksperimenter med proteasomet-hæmmeren MG132 og et neddylation-enzym (NAE)-inhibitor MLN4942 (figur 7).- Frø 1 x 106 MM1S celler pr brønd i en 6-brønd plade. Forbehandl celler med 10 μM MG132, 10 μM MLN4942 eller lenalidomid (100x), og Inkuber 1 t ved 37 °C, 5% CO2.
- Tilsæt 100 nM sammensatte 8 for 3 h ved 37 °c, 5% Co2.
- Høst celler til Western blot i henhold til trin 2.1.1.
- Cellelevedygtighed assays i multipelt myelomatose cellelinjer
Bemærk: denne analyse bruges til at teste virkningen på cellernes levedygtighed og derudover antagonisere virkningen af Imid'er på multipelt myelomatose ved forbehandling af cellerne med sammensatte 8 (figur 8, figur 9a, B).- Frø 5 x 104 MM1S celler pr brønd i en 96-brønd plade i biologiske triplicater for levedygtighed assay. For Western blot analyse, frø 1 x 106 MM1S celler pr brønd i en 6-brønd plade i biologiske triplicater.
- Behandling af celler med DMSO eller 100 nM, 1 μM eller 10 μM sammensatte 8, sammensatte 9 eller pomalidomid og inkubator i 24 timer, 48 h eller 96 h ved 37 °C, 5% Co2. Til redning eksperimenter, behandle celler med 100 nM sammensatte 8 for 3 h, før eller efter tilsætning af 1 μM pomalidomid og inkubatet for 96 h.
- Mål 96-brønd plade luminescens med en lysende viser cellelevedygtighed analyse, i henhold til producentens protokol på en plade læser eller høst celler fra 6-brønd pladen for Western blot analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskrev vi design, syntese og biologisk evaluering af en homodimert pomalidomid-baseret PROTAC til nedbrydning af CRBN. Vores PROTAC interagerer samtidig med to CRBN-molekyler og danner ternære komplekser, der inducerer selv allestedsnærværende og proteasomal nedbrydning af CRBN med kun minimale resterende virkninger på pomalidomid-inducerede neo-substrater IKZF1 eller IKZF3.
Ud af en serie af tidligere udgivne pomalidomid-baserede PROTAC-molekyler24var compound 8 særlig effektiv i den kemisk INDUCEREDE nedbrydning af crbn. Dens syntese kan opnås som følger (figur 4). En 1, 1 '-carbonyldiimidazol-fremmet kondensation af BOC-beskyttet l-glutamin fører til den cycliserede imid 1. N-methyleret analog 2 er tilgængelig via alkylering med methyliodid. Begge byggeklodser (1 og 2) omdannes efter N-debeskyttelse under sure forhold til phthalimid-derivater (3 og 4) i forbindelse med en ring-åbnende/genudklipnings reaktion med 3- fluorofthalanhydrid. Thalidomid analover er generelt modtagelige for hydrolytisk nedbrydning og bør kun anvendes i næste trin efter tilstrækkelig tørring. Forbindelse 3 er modtagelig for en aromatisk nukleofile substitution med primære alifatiske aminer25; denne konvertering blev fundet for at fortsætte effektivt, når der anvendes tørre opløsningsmidler. Udformningen af en ægte homodikemeje produkt indebærer linker tilslutning af to identiske funktionelle understrukturer og anvendelsen af symmetrisk linker. Den linker, der er en del af PROTAC 8 , repræsenterer en n-til-n, polyethylen-baseret lineær kæde. Den tilsvarende α, ω-diamin 6 fører til den ønskede forbindelse 8 , når den reagerede med byggesten 3 i Molar ration af 1:2 i DMSO ved 90 °c. Blandt andre analytiske data24blev strukturen af 8 verificeret af NMR Spectra (figur 5a). Sammensatte 9, designet som en passende negativ kontrol, har en kun minimal, men kritisk strukturelle afvigelser, sammenlignet med den aktive homo-Protac 8. Det vides, at N-methylering inden for glutarimid-delen afskaffer crbn-bindingen26,27. En pomalidomid del af den negative kontrol forbindelse 9 bærer en N-methylrester. Det kan fremstilles ved en første nukleofile substitution af 3 med N-monoprotected Link Building blok 5, efterfulgt af spaltning af BOC beskyttelse gruppe og en efterfølgende kobling til mellemliggende 4. På grund af sin asymmetriske struktur viste nogle af de tilsvarende kulstofatomer forskellige 13C NMR-signaler (figur 5b).
Homo-PROTAC 8 blev observeret for at være yderst potent, hvilket førte til en næsten fuldstændig proteasomal nedbrydning af crbn. Fortolkningen af CRBN-, IKZF1-og IKZF3-protein niveauerne i multipelt myelomceller blev bekræftet af Western blot-analysen (figur 6, figur 7, figur 9b), en semi-kvantitativ standardmetode, hvor ændringen i protein udtryk kan påvises nemt. De antistoffer, der anvendes i dette papir er af god kvalitet, og metoden er en optimeret standardprocedure i vores laboratorium.
Desuden påvirkede nedbrydningen af CRBN med sammensatte 8 ikke cellernes levedygtighed og gav resistens over for imid'er(figur 8, figur 9a), hvilket er på linje med crispr/Cas9-medieret knockout af crbn af sgrnas24. Luminescens signalet i celle levedygtigheds analysen var baseret på ATP-frigivelse, som kan tolkes som dødt celletal. Denne metode kan nemt udføres på kort tid med et stort antal prøver. En alternativ metode til måling af levedygtige/døde celler er et bilagI V/7-AAD-farvning ved flow cytometri.
Figur 1: E3 ubiquitin ubiquitinligase CRBN er det primære mål for Imid'er. Immunomodulatoriske lægemidler binder sig til CRBN og rekrutterer flere neo-substrater til proteasomal nedbrydning. IMiD-induceret nedbrydning af lymfoid transkriptionsfaktorerne IKZF1 og IKZF3 er ansvarlig for virkningerne på multipelt myelomatose celler og nogle af de immunmodulerende egenskaber. Kasein kinase 1α nedbrydes selektivt af lenalidomid, men ikke de andre Imid'er og bidrager til aktiviteten af lenalidomid i myelodysplastisk syndrom med tab af kromosom 5q. SALL4 blev for nylig opdaget som et fælles mål for alle Imid'er, der sandsynligvis er forbundet med den teratogenicitet induceret af thalidomid og dets analover. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Protacs nedbryder proteinet af interesse (POI). PROTACs er heterobifunktionelle molekyler, hvor en linker forbinder en ubiquitin ubiquitinligase ligand til en POI ligand. Ved dannelsen af ternære komplekser, en ubiquitin Ligase, såsom CRBN, derefter allestedsnærværende POI, hvilket resulterer i sin proteasomal nedbrydning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Bifunktionel homo-PROTAC til nedbrydning af E3 ubiquitin-ubiquitinligase-CRBN. I en pomalidomid-baseret homo-PROTAC forbindes to ubiquitinligase bindere for at fremkalde Cross-allesteds nærning af CRBN, hvilket resulterer i et kemisk induceret Knockdown af CRBN. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: syntese af homodimer 8 og heterodimer 9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: 1H NMR (top) og 13C NMR (nederst) Spectra. Spektre af sammensatte 8 (A) og sammensatte 9 (B) blev registreret i DMSO-d6 på et NMR-spektrometer. Kemiske forskydninger er givet i ppm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: virkninger af forbindelser 8 og 9 på CRBN, IKZF1 og IKZF3. Pomalidomid-baseret homo-PROTAC-forbindelse 8 INDUCERER crbn-nedbrydning med svage resterende virkninger af POMALIDOMID på IKZF1 og IKZF3. I modsætning hertil har sammensatte 9 , der indeholder en methylgruppe på et af pomalidomidresterne, ingen effekt ved de angivne koncentrationer (μM). MM1S celler blev behandlet for 24 timers behandling. Effekter på CRBN, IKZF1, IKZF3 og Tubulin (loading Control) blev analyseret af Western blot. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: nedbrydning af CRBN kan blokeres af proteasomet-hæmmeren MG132 eller af MLN4942, som blokerer ubiquitinligaser indirekte via neddylation hæmning. Den multipelt myelomatose cellelinje MM1s blev forbehandlet med 10 μM MG132, 10 μM MLN4924 for 1 t før tilsætning af Homo-PROTAC sammensatte 8 ved 100 nm for 3 t kombineret behandling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Cellelevedygtighed assay i MM1S multipelt myelomatose celler. Virkninger af sammensatte 8 og negative bindings kontrol sammensatte 9 på cellens levedygtighed i pomalidomid følsom myelomatose cellelinje MM1S efter 24 h, 48 h og 96 h behandling. Cellernes levedygtighed blev målt efter 4 dage i tre triplicater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Sammensatte 8 antagonerer virkningen af pomalidomid i cellelinjer med myelomatose. Celler blev forbehandlet med 100 nM sammensatte 8 for 3 h. bagefter blev der tilsat 1 μM pomalidomid. Cellernes levedygtighed blev målt efter 4 dage i tre triplicater. p <0,001 ifølge elevens t-test (A). Western blot analyse for CRBN, IKZF1, IKZF3 og Tubulin (loading Control) efter forbehandling af MM1S celler med 100 nM sammensatte 8 for 3 h, før tilsætning af 1 μM pomalidomid (B). Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Steinebach, C. et al. 201824. Copyright 2019 det amerikanske kemikalie selskab. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udformningen af sådanne homo-PROTACs som beskrevet her for CRBN afhænger af pomalidomids specifikke affinitet til CRBN, som er blevet udnyttet med succes i talrige heterobifunktionelle PROTACs og resulterede i udviklingen af PROTAC 8 som en meget selektive CRBN Degrader. Specificiteten af vores molekyle er allerede blevet bekræftet af proteomiske analyser24. For genetisk medieret knockout, udelukkelse og validering af bivirkninger er udfordrende og tidskrævende. Desuden er en kemisk induceret Knockdown reversibel, hurtig og direkte anvendelig på et bredt spektrum af celler og vævstyper28.
IMiDs thalidomid, lenalidomid og pomalidomid er blevet en grundpille i behandlingen af myelomatose, B-celle-lymfomer og myelodysplastisk syndrom. Imid'er mægle deres aktivitet ved at moduere specificiteten af crbn-CRL4 E3 ubiquitinligase til at nedbryde neo-substrater IKZF1, IKZF3 eller CK1α6,11,29. Desuden har Imid'er vist sig at ophæve den chaperone funktion af CRBN på to andre proteiner, MCT-1 og BSG, der er også vigtige for multipelt myelomatose vækst30. Nedbrydningen af CRBN fra homo-bifunctional PROTAC blev veltolereret af de fleste testede cellelinjer med multipelt myelomatose, hvilket antyder, at CRBN inaktivering alene ikke er tilstrækkelig til at forårsage drab af multipelt myelom celler. I modsætning hertil, forbehandling med sammensatte 8 ophævet virkningerne af imid'er på IKZF1/3 nedbrydning og reddet multipelt myelomatose celler fra lenalidomid og pomalidomid. Dette er i overensstemmelse med genetisk inaktivering af crbn og skadelige crbn -mutationer fundet hos patienter med lenalidomid-resistent myelomatose og fremhæver crbn ' væsentlige rolle i mekanismen for imid'er31,32 . Homo-PROTAC 8 kan derfor være et nyttigt værktøj til at efterligne en tilstand af imid modstand. Andre virkninger af Imid'er, der endnu ikke er fuldt forstået, såsom hæmning af angiogenicitet eller TNFα-frigivelse, kan stamme fra en hæmning af CRBN-funktionen, og vores homo-PROTAC er egnede værktøjer til at undersøge Inaktiveringen af CRBN yderligere. Desuden kan det kemisk inducerede Knockdown af CRBN med sammensatte 8 bidrage til at identificere nye endogene substrater af crbn og belyse de fysiologiske funktioner i crbn. I betragtning af, at vores sammensatte 8 havde ingen effekt på Cancer cellelinje proliferation, crbn hæmning alene har ingen anti-tumor aktivitet. CRBN-nedbrydere kan dog være klinisk anvendelige i andre sygdomme end cancer. I denne henseende, crbn inaktivering blev for nylig påvist at give resistens over for sepsis og for at forhindre høj-fedt-diæt-induceret fedme i mus 33,34,35.
Afslutningsvis har vi genereret og valideret den første kemiske hæmmer af CRBN, der kan tjene som et nyttigt redskab til fremtidige biomedicinske undersøgelser af CRBN-relateret signalering og molekyl mekanisme af thalidomid og dets analover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke en potentiel økonomisk interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether-programmet kr-3886/2-1 og SFB-1074 til J.K.; FOR2372 til M.G.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M.
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al.
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
