Summary
Menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC)-afledte tarm organoider tilbyder spændende muligheder for at modellere enteriske sygdomme in vitro. Vi demonstrerer differentieringen af Hipsc'er i tarm organoider (iHOs), stimulering af disse iHOs med cytokiner og mikroinjektion af salmonella typhimurium i IHO-lumen, hvilket gør det muligt at studere en epitelial invasion af denne Patogen.
Abstract
Den intestinale ' organoid ' (iHO) system, hvori 3-D strukturer repræsentative for epitel foring af den menneskelige tarm kan fremstilles af menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSCs) og vedligeholdes i kultur, giver en spændende mulighed for at lette modellering af epitelial respons på enteriske infektioner. In vivo, tarm epitelial celler (IECs) spiller en central rolle i reguleringen af intestinal homøostase og kan direkte hæmme patogener, selv om de mekanismer, som dette sker ikke er fuldt belyst. Cytokin interleukin-22 (IL-22) har vist sig at spille en rolle i opretholdelsen og forsvaret af tarm epitelial barrieren, herunder inducere en frigivelse af antimikrobielle peptider og chemokiner som reaktion på infektion.
Vi beskriver differentieringen af sund kontrol hiPSCs til iHOs via tilsætning af specifikke cytokin kombinationer til deres kulturmedium før indlejring dem i en kælder membran matrix-baseret prointestinal kultur system. Når indlejret, iHOs er dyrket i medier suppleret med Noggin, R-spondin-1, epidermal vækstfaktor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, og Y-27632 dihydrochloridmonohydrat. Ugentlige passager ved manuel afbrydelse af IHO ultrastruktur føre til dannelsen af okulerede ihos, med nogle udstiller en krypt/villus struktur. Alle iHOs udviser et differentieret epitel bestående af Pokal celler, enteroendokrine celler, Paneth-celler og polariserede enterocytter, som kan bekræftes via immunofarvning for specifikke markører for hver celle delmængde, transmissionselektronmikroskopi (TEM) og kvantitativ PCR (qPCR). Til model infektion er salmonella enterica Serovaren typhimurium SL1344 mikroindsprøjtet i lumen af ihos og inkuerede i 90 min ved 37 °c, og der udføres en modificeret gentamicin beskyttelses analyse for at identificere niveauerne af intracellulære bakteriel invasion. Nogle iHOs er også forbehandlet med rekombinant humant IL-22 (rhIL-22) før infektion for at fastslå, om dette cytokin er beskyttende mod salmonella infektion.
Introduction
I de seneste år, studiet af Host-patogen interaktioner er blevet forstærket af udviklingen af ' organoid ' modeller, hvor 3-D repræsentationer af tarm epitelet kan produceres fra forskellige progenitors. » Primære «organoider kan genereres direkte fra tarm stamceller høstet fra intestinal biopsier. Desuden kan tarm organoider genereres fra hiPSCs. Det samme kan siges om talrige væv, med gastrisk1, leveren2, pancreatisk3,4, hjernen5,6, lunge7, og prostata8 organoider bruges af mange forskere til model Sygdom. Der er talrige spændende anvendelser af organoid system, herunder modellering kræft9 og Drug screening10, men her fokuserer vi på brugen af ihos som en infektion model, ved hjælp af S. enterica Serovaren typhimurium (S. Typhimurium) som et eksemplarisk patogen og forbehandling med IL-22 som en terapi.
I denne undersøgelse er de Hipsc'er, der bruges til at generere iHO, "Kolf2" iPSCs, der er genereret af en sund person og tilgængelig fra det menneskeskabte pluripotente stamcelle initiativ konsortium (HipSci; www.hipsci.org), et åbent referencepanel af karakteriserede hiPSC-linjer11. En fordel ved at bruge hipscs som forfædre for organoider er, at der nu er omfattende banker af sunde donor IPSC linjer til rådighed, hvilket betyder, at resultaterne kan valideres i en række cellelinjer med forskellige genetiske baggrunde. Hvis forskerne ønsker at se nærmere på specifikke sygdoms associerede enkelt nukleotidpolymorfier (SNP'er), er det muligt at anvende CRISPR/Cas9 til at konstruere mutationer i en sund cellelinje og derved producere både en mutant linje og bevare den isogene kontrollinje til sammenligning12. I vores erfaring, hiPSC-afledte tarm organoider er større i størrelse end deres primære modparter og mere konsekvent i kulturen, hvilket gør for en mindre teknisk udfordrende mikroindsprøjtning og potentielt tillade en mere varieret vifte af patogener, der skal Studerede. iHOs kan være kryogenisk bevaret, og vi har formeret iHO kulturer i op til et år til at producere materiale til eksperimenter.
In vivo, IECs spille en central rolle i reguleringen af intestinal homøostase og kan direkte hæmme patogener, selv om de mekanismer, som dette sker, er ikke godt forstået. Cytokin IL-22 er kendt for at have en rolle i opretholdelsen af tarm epitelial barriere13 og er involveret i induktion og sekretion af antimikrobielle peptider og chemokiner som reaktion på infektion14. Det er fremstillet af aktiverede T-celler (især, Th17 celler) samt af naturlige Killer (NK) celler og binder sig til en heterodimerisk receptor bestående af IL-22R1 og IL-10R2 under enheder15. Receptoren for IL-22 udtrykkes basalt på IECs, hvilket betyder, at i iHO model, er det muligt at forbehandle organoider med rhIL-22 blot ved tilsætning til kulturmedium16. En ulempe ved det organoide system er, at det mangler den tilknyttede immunrespons normalt leveres af andre immuncelle typer; Men, modeller er ved at opstå, at forsøge at coculture organoider med intestinal lymfocytter til bedre repræsentere denne17,18.
Brugen af mikroindsprøjtnings systemet er nøglen til simulering af infektioner i iHO-modellen, da dette giver mulighed for direkte levering af patogener til den apiske overflade af epitel, som det ville forekomme i tilfælde af in vivo-infektion. Tilsætning af phenol rød til bakteriel opløsning injiceres i iHO markerer dem, der er blevet smittet, og dermed undgå gentagne injektioner af samme iHO. Organoider som beholdere til infektions modellering vokser i brug med patogener som Helicobacter pylori,19 norovirus,20 rotavirus,21 Shiga-toksinproducerende Escherichia coli22, Cryptosporidium23, og Zika virus24 har vist sig at overleve og replikere inden for disse systemer. Denne teknologi kan anvendes på en bredere vifte af patogener, især til organismer, der er vanskelige at kultur, såsom protozoer, eller menneskelige begrænset patogener, for at få direkte oplysninger om den humane epitel respons på infektion.
Protocol
1. kulturering og passage af inducerede pluripotente stamceller
Bemærk: Alle metoder, der er beskrevet her, bruger kommercielt tilgængelige humane cellelinjer. Alt arbejde med vævskulturer, der er beskrevet nedenfor, skal udføres i en klasse II-laminar flow hætte. iPSCs vedligeholdes rutinemæssigt i stamcelle dyrkningsmediet (Se tabellen over materialer) i henhold til producentens anvisninger, som giver mulighed for en weekend-fri kultur af ipscs. iPSCs kan tilpasses fra andre iPSC-kultur systemer med relativ lethed.
- Passage cellerne, når kolonierne dækker ca. 80% – 90% af pladens overflade.
- Der fremstilles plader til passage 1 timer før brug ved tilsætning af vitronectin 10 μg/mL fortyndet i Dulbeccos fosfatbuffer (DPBS; uden calcium [ca] eller magnesium [mg]) til plader med vævskultur. Mængden af belægning afhænger af plade størrelsen og kan findes i producentens vejledning. I løbet af denne tid, varme stamcelle kulturmedium til stuetemperatur (RT).
- Fjern mediet fra iPSCs klar til passage og vask cellerne 2x med DPBS (uden ca eller mg).
- Tilføj EDTA-løsning (Se tabellen over materialer) til pladerne, og sørg for, at hele overfladen er belagt og INKUBE ved rt i 5 – 8 min. Når huller begynder at dukke op i midten af iPSC kolonier, Aspirér og kassere EDTA løsning.
- Tilsæt stamcelle kulturmedium til brøndene; frakoblet iPSCs ved forsigtigt at vaske medier over plade overfladen et par gange. Den iPSCs er passage som klumper og ikke som enkeltceller, så sørg for, at EDTA løsning er ikke efterladt i for lang tid. Flyt eventuelle uindleverede iPSCs til et 15 mL konisk rør.
- Vitronectin aspireret fra de præbelagte plader og Udskift det med stamcelle kulturmedium. Vend iPSC-suspensionen et antal gange for at sikre, at iPSCs ikke har slået sig ned i bunden af det koniske rør, og tilsæt den passende mængde suspension for at give en 1:10-fortynding af celler på en ny plade. Split nøgletal kan justeres afhængigt af iPSC-vækstraten, som kan variere mellem iPSC-linjer.
- Sæt pladen på for at sprede iPSCs over overfladen og anbring den i en inkubator ved 37 °C/5% CO2. Tilfør iPSCs dagen efter passage.
2. differentiering fra iPSCs til Hindgut
- På dag 0, split ipscs på en 10 cm vævs-kultur-behandlet fad, forbelagt med vitronectin som beskrevet i trin 1,2, i 10 ml stamcelle kulturmedium suppleret med Activity a (10 ng/ml) + grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF; 12 ng/ml). Tilsæt vækstfaktorerne til mediet direkte før brug; gøre dette i alle efterfølgende trin.
- På dag 1skiftes mediet (10 ml stamcelle kulturmedium med aktiviteter A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]).
- På dag 2, begynde differentieringen ved at ændre mediet til 10 ml stamcelle kulturmedium suppleret med følgende vækstfaktorer: Activity a (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), knogle morfogenetisk protein 4 (BMP-4; 10 ng/ml), phosphoinositol 3- kinasehæmmer LY294002 (10 μM) og GSK3-hæmmer CHIR99021 (3 μM).
- På dag 3skiftes mediet til 10 ml stamcelle kulturmedium suppleret med Activity a (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml) og LY294002 (10 μM). Endoderm specifikation induceret af dette medie bør resultere i synlige ændringer i iPSC koloni morfologi i løbet af de næste 24 h.
- På dag 4skiftes mediet til 10 ml Rpmi/B27 Media suppleret med Activity a (100 ng/ml) og bFGF (100 ng/ml).
Bemærk: RPMI/B27 medier indeholder 500 mL RPMI medium med L-Glutamin supplement (Se tabel 1), 10 ml af B27 supplement (50x, serum fri), og 5 ml ikke-essentielle aminosyrer. Valgfrit: Tilsæt 5 mL penicillin-streptomycin (10.000 e/mL). Filtrer-Steriliser før brug. - På dag 5skal mediet ændres til 10 ml Rpmi/B-27 medier suppleret med aktivitet a (50 ng/ml).
- På dag 6skal du ændre mediet til 10 ml rpmi/B27-medier suppleret med CHIR99021 (6 μm) + retinoinsyre (3 μm) for at begynde mønstret af den bageste endoderm til bagtarmen.
- Gentag trin 2,7 på dag 7, 8og 9. Under disse trin bør synlige 3-D strukturer i bagtarmen blive synlige, der dækker overfladen af pladen.
- På dag 10, indlejre den resulterende hindgut i kælder membran matrix (Se tabellen over materialer).
3. integrering af Hindgut i Basement membran matrix
- Udgør iHO base vækstmedier (500 mL avanceret Dulbecco's modificerede ørne medium [DMEM]/F12, 10 mL B27 supplement [50x, serum fri], 5 mL N2 supplement [100x, serum fri], 5 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES) og 5 mL ikke-essentielle aminosyrer [100x]. Valgfrit: Tilsæt 5 mL penicillin-streptomycin [10.000 U/mL]; filter-Steriliser før brug. Se tabel 1).
-
Fjern mediet fra bagtarm pladen, og vask pladen 1x med DPBS (uden ca eller mg). Der tilsættes 5 mL kollagenaseopløsning til pladen, og der inkueres ved 37 °C i 5 min.
- Fremstilling af kollagenaseopløsning ved tilsætning af 500 mg kollagenase IV pulver til 400 ml fremskreden DMEM/F12. Efter dette tilsættes 100 mL serum erstatning (Se tabellen over materialer), 5 ml L-glutamin (200 mm) og 3,5 μl 2-mercaptoethanol, og opløsningen hvirvles op for at blande. Filter-Steriliser opløsningen, når kollagenasepulveret er helt opløst.
Bemærk: Dette kan opbevares ved-20 °C i op til 6 måneder i mindre aliquoter.
- Fremstilling af kollagenaseopløsning ved tilsætning af 500 mg kollagenase IV pulver til 400 ml fremskreden DMEM/F12. Efter dette tilsættes 100 mL serum erstatning (Se tabellen over materialer), 5 ml L-glutamin (200 mm) og 3,5 μl 2-mercaptoethanol, og opløsningen hvirvles op for at blande. Filter-Steriliser opløsningen, når kollagenasepulveret er helt opløst.
- Inaktivere kollagenase ved at tilsætte 5 mL iHO base vækstmedier til pladen og skrabe ud af bagtarm cellerne ved hjælp af en celle skraber, opsamling af hindgut suspensionen i et 15 mL konisk rør.
- Der centrifugeres ved 240 x g i 1 min. og pipette fra supernatanten.
- Tilsæt 10 mL medier, Opdel bagtarmen i mindre stykker ved forsigtigt at pipette, og centrifuge igen ved 95 x g i 1 min.
- Vask cellerne 2x i iHO base vækstmedier ved at gentage trin 3,5. Cellerne resuspenderes i en lille mængde basis vækstmedium (~ 300 – 500 μL), og der tilsættes ca. 100 μL af denne opløsning til 1,5 mL kælder membran matrix. Matrixen skal forblive på is i denne periode, da den vil begynde at størkne hurtigt ved RT.
-
Sæt en 24-brønd plade på en plade varmer ved 37 °C og spot ud 60 μL i en brønd af 24-brønd pladen. Lad det sætte kort og kontrollere tætheden under et mikroskop.
- Hvis det er nødvendigt, tilsættes mere hindgut opløsning til kælderen membran matrix i intervaller, indtil den ønskede koncentration er opnået, og spot ud opløsningen i de resterende brønde.
- Der inkubeeres ved 37 °C i 10 min. Tilsæt derefter 800 μL af iHO base vækstmedier indeholdende vækstfaktorer til hver brønd af 24-brønd pladen ved følgende koncentrationer (Se tabel 1): 500 ng/ml R-spondin-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml epidermal vækstfaktor (EGF), 3 μM CHIR99021, 2,5 μM prostaglandin E2 og 10 μM Y-27632 dihydrochloridmonohydrat (ROCK-hæmmer).
-
Skift iHO base vækstmedier hver 2 – 3 dage, eller straks, hvis mediet begynder at misfarve. Efter den indledende såning i kælderen membran matrix, tillade iHOs at udvikle sig i 7 dage før opdeling dem. Ved dag 3 – 4 skal forskellige kugler være synlige i kulturen.
- For medieskift alene skal du udelade Y-27632, da dette kun er nødvendigt ved opdeling/såning.
4. vedligeholdelse og passage af iHOs
- For at tillade gradvis optøning, skal du sætte den nødvendige mængde af kælder membran matrix i en overdækket isspand ved 4 °C natten, 24 timer før opdeling.
-
Fjern mediet fra iHOs, og Udskift det med 500 μL celle opløftnings opløsning (se tabellen over materialer) pr. brønd. Der inkube ved 4 °C i 40 – 50 min., hvorefter iHOs skal flyde i opløsningen.
- Valgfrit: Brug et billedsystem i hætten til kun at vælge iHOs med den ønskede morfologi (Se tabellen over materialer).
- Pipettér forsigtigt iHO/Cell løfte opløsningen suspension i 15 mL koniske rør, forsøger ikke at bryde op iHOs. Lad IHOs at nøjes med 3 – 5 min og fjerne supernatanten og enkeltceller.
- Gensuspension af iHOs i 5 mL af iHO base vækstmedium og pipetter dem forsigtigt for at vaske. Der centrifugeres ved 95 x g i 2 min.
- Sæt en 24-brønd plade på en plade varmer ved 37 °C i hætten.
- Fjern supernatanten, og resuspér iHOs i ~ 300 – 500 μL basis vækstmedier, brug af en P1000-pipette til at opdele iHOs i mindre bidder. Bemærk, at den kraft, der skal anvendes, vil variere afhængig af iHO linje og modning tilstand, så start forsigtigt, øge kraften, hvis det kræves.
- Sted ~ 100 μL af iHOs (volumenet afhænger af opløsningens densitet) i 1,5 mL kælder membran matrix og pipette kortvarigt for at blande.
- Spot ud 1 x 60 μL af kælder membran matrix i en brønd af 24-brønd pladen, overlade det til størkne for ~ 30 s, og derefter kontrollere tætheden under mikroskopet. Hvis tætheden er for lav, tilsættes flere iHOs til matrixen.
- Gentag trin 4,8 indtil den korrekte tæthed er erhvervet, og derefter spot ud resten af matrixen i en 24-brønd plade.
- Den anbringes i en inkubator ved 37 °C i 10 minutter og overlejres derefter med 800 μL basis vækstmedium med vækstfaktorer som beskrevet i trin 3,7.
-
For at forberede iHOs til en invasion analyse eksperiment (skitseret nedenfor), passage iHOs 4 – 5 dage før eksperimentet som beskrevet i trin 4.1 – 4.10, men sted 120 μL af matrix iHO opløsning genereret i trin 4,7 i 5 mm glas-bottomed mikroinjektionsketter.
- Snarere end at forlade IHO suspension i en dråbe som med rutinemæssig passage, sprede dråbe over bunden af skålen til at skabe et tyndt lag af matrix. Dæk den med 2,5 mL basis vækstmedium plus vækstfaktorer.
Bemærk: Hvis antibiotika har været anvendt i kulturmedium, disse skal fjernes og erstattes med nonantibiotikum suppleret medier til mikroinjektion eksperimenter.
- Snarere end at forlade IHO suspension i en dråbe som med rutinemæssig passage, sprede dråbe over bunden af skålen til at skabe et tyndt lag af matrix. Dæk den med 2,5 mL basis vækstmedium plus vækstfaktorer.
5. prestimulation af iHOs med rhIL-22
- Aspirer mediet fra iHOs og Udskift det med friske base vækstmedier (som ikke må indeholde antibiotika) 18 timer før invasions analysen.
- Tilsæt rhIL-22 til dyrkningsmediet til en endelig koncentration på 100 ng/mL.
6. mikroindsprøjtning af iHOs og intracellulære invasion assays
- På dagen forud for eksperimentet, oprette S. Typhimurium SL1344 kultur i 10 mL Luria-Bertani bouillon og inkuberet ved 37 °C natten over med rystelser.
- Hvis der på forsøgs dagen er et mikroskop med et lukket varme kammer til rådighed, skal det tændes, og temperaturen kan nå op på 37 °C, inden analysen påbegyndes.
- Fortyndet natten bakteriekulturer i DPBS (indeholdende ca og mg) til en optisk tæthed på 2 ved 600 nm (OD600) og derefter blande det 1:1 med phenol rød.
- Læg mikroinjektionskålen, der indeholder iHOs, på mikroskopet, Fjern låget, og Bring iHOs i fokus, klar til at injektionen begynder.
- Drej injektoren og armkontrolstationerne på. Sørg for, at injektoren er indstillet til et tryk på 600 kPa og en injektionstid på 0,5 s. Hvis den ikke allerede er bakket væk fra mikroskopet, skal du dreje injektions armen for at sikre, at den er.
- Indstil en 6 μm mikroinjektionsspids ved at fjerne indpakningen og plastik cylinderen fra nålen. Fjern gribe hovedet fra injektions armen.
- Bore spidsen skal indlæses med 10 μL inokulum, og bore spidsen skal forsigtigt gribes i den stumpe ende. Anbring bore spidsen i grebs hovedet, og sæt den i mikroinjektionsarmen igen.
-
Bevæg forsigtigt armen på plads, så nålen er placeret 1 – 2 cm over mikroinjektionskålen. Brug arm-knappen til at placere nålens spids i midten af skålen og sænk den, indtil den er lige over overfladen af mediet.
- Program armen kontrolstation til at returnere nålen til dette punkt efter alle injektioner.
- Fokuser mikroskopet på iHOs, og vælg det mål, der skal indsprøjtes. Anbring nålen lige over og til højre for den iHO, der skal injiceres, og bevæg nålen nedad og sidelæns ind i iHO lumen.
- Tryk på knappen Injicer på mikroinjektoren. den phenol-farvede bakterie blanding vil dukke op fra nålen. Injicer hver iHO 3x. Injicer mindst 30 iHOs pr. betingelse.
Bemærk: På grund af heterogenitet i iHO størrelse og struktur i en kultur, er det nødvendigt at injicere et stort antal af iHOs at kontrollere for variation. - Når alle påkrævede iHOs indsprøjtes, fjernes mikroinjektionpladen fra scenen, låget udskiftes, og pladen inkueres ved 37 °C i 90 min.
- Efter 90 min, Aspirer vækstmediet og Udskift det med 3 mL celle løftning løsning; inkube ved 4 °C i 45 min.
- Bevæg forsigtigt iHOs/Cell-løfte opløsningen til et 15 mL konisk rør, der indeholder 5 mL DPBS. Sørg for, at alle injicerede iHOs er blevet fjernet fra pladen (skyl pladen med 1 mL af DPBS, hvis det er nødvendigt). Der centrifugeres ved 370 x g i 3 min.
- Supernatanten fjernes, og iHOs i base vækstmediet, der indeholder gentamicin, udtages på 0,1 mg/mL (der tilsættes 1 mL af mediet, og derefter bruges en P1000-pipette ~ 50x til at opdele iHOs, og der tilsættes 4 mL yderligere medier).
- Inkubes ved 37 °C i 1 time for at dræbe ekstracellulære bakterier.
- Centrifuger iHOs ved 370 x g i 3 min., og udsug supernatanten, så lidt som muligt. Vask iHOs 1x med DPBS, og centrifuge igen.
Bemærk: Dette trin fjerner gentamicin, hvilket er vigtigt, da eventuelle resterende gentamicin kan dræbe intracellulære bakterier, når cellerne er lysed. - Gensuspension af iHOs i 500 μL af lysis buffer (Se tabellen over materialer) og manuelt dissociere organoider ved pipettering ~ 50x. Lad denne blanding være 5 min ved RT.
- Den resulterende opløsning 10 gange i DPBS fortyndes serielt for at generere 10-1, 10-2og 10-3 koncentrationer. Pipette 3 x 20 μl dråber af de pæne og fortyndede opløsninger på forvarmede lb agar plader.
- Der inkubieres natten over ved 37 °C, og der foretages kolonitælling og beregning af kolonidannende enheder (CFU). Koloni tællinger vil afspejle antallet af intracellulære bakterier, der blev frigivet under celle lyserende proces.
7. celle frysning og genoprettelse
Bemærk: Som nævnt tidligere, er det muligt at kryogenisk bevare iHOs og rekonstruere dem, når det ønskes. De fast frysnings-og optøningsprocesser er skitseret nedenfor.
- Vælg brønde af iHOs du ønsker at fryse. Tilsæt celle løfte opløsning til brøndene og inkuperer i 40 – 50 min ved 4 °C. Den iHOs bør flyde i løsningen.
- Pipetter forsigtigt iHOs i et 15 mL konisk rør og lad dem slå sig ned. Fjern mediet og vask iHOs 1x med base vækstmedier (ingen vækstfaktorer).
-
Centrifuge ved 95 x g i 2 min., Fjern supernatanten, og Udskift den med en passende volumen af celle fryse medium (se tabellen over materialer; brug mediet i henhold til producentens anvisninger), dekantering af ihos i kryogene hætteglas.
- Opbevar hætteglassene i en-80 °C fryser natten over for at tillade en mere gradvis nedfrysning; derefter overføre dem til flydende kvælstof opbevaring.
-
For at rekonstruere iHOs, hurtigt afrimning et kryogen hætteglas ved 37 °C ved hjælp af en vand/perle bad; derefter forsigtigt pipette indholdet i 10 mL base vækstmedier (ingen vækstfaktorer). Tillad iHOs at bosætte og erstatte medierne med ~ 300 μL af friske base vækstmedier.
- Undlad at adskille iHOs manuelt. Tilsæt iHOs til kælderen membran matrix og læg dem ud som beskrevet i punkt 3.
Representative Results
Efter påbegyndelsen af differentierings processen, bør cellerne passere gennem fase af definitive endoderm dannelse efterfulgt af hindgut mønster før indlejring i kælder membran matrix. Spheroids vil danne og kulturer med store mængder af kontaminerende materiale vil klare over en periode på flere uger som iHOs moden. Eksemplarbilleder af differentierings-, indlejrings-og passage processen er vist i figur 1.
Opsætningen af mikroindsprøjtnings systemet er som påvist i figur 2. Den iHOs er mikroindsprøjtet med phenol rød/bakteriel opløsning og bevare deres røde farve, så identifikationen af inficerede iHOs at forhindre dobbelt injektioner. Tælling af belagte intracellulære bakterier udføres efter den modificerede beskyttelses analyse af gentamicin. en prestimulation med rhIL-22 begrænser S. Typhimurium-infektion, hvor der blev observeret færre intracellulære bakterier efter behandling med rhIL-22 (figur 3). Vi har også rutinemæssigt behandle inficerede iHOs for immun farvning, eller TEM, for at lette visualisering af Host IEC-bakterielle interaktioner (figur 4).
Figur 1: målrettet differentiering af iPSCs til iHOs. Repræsentativ sekvens af differentiering fra iPSCs til iHOs, demonstrere de morfologiske ændringer observeret og de vækstfaktorer, der kræves for at drive disse ændringer. Endelig endoderm dannes på dag 4 af differentieringen, efter eksponering for specifikke koncentrationer af kombinationer af aktiviteter A, FGF, BMP-4, LY294002 og CHIR99021. Efter 8 dage resulterer mønstret af denne definitive endoderm med specifikke koncentrationer af CHIR99021 og retinsyre i hindgut dannelse. Postemsengetøj, sfæoide dannelse observeres. Efter vedvarende passage ved hjælp af en understøttende kælder membran matrix overlagt med medium suppleret med prointestinal proliferation faktorer R-spondin 1, Noggin, EGF, CHIR99021, og prostaglandin E2, sfæroider fremskridt i okulerede ihos. (Billeder blev taget ved 4X-10x forstørrelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mikroindsprøjtning af en iHO med S. Typhimurium. (A) mikroindsprøjtnings systemet (Se materiale oversigten), der er vedlagt i miljøkammeret; Dette giver mulighed for injektion af iHOs i et kontrolleret miljø (37 °C/5% CO2). B) bakteriernes inokulum leveres direkte ind i IHO-lumen ved hjælp af et mikrokapillar, der er fastgjort til mikroinjektionsystemet. (C) ved at blande bakteriel inokulum med phenol rød, er det klart, hvilke ihos er blevet smittet, og dermed undgå dobbelt injektioner af samme IHO. Billederne blev taget ved 10x forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forbehandling af iHOs afledt af Kolf2 cellelinje med rhIL-22 begrænser S. Typhimurium SL1344 invasion i tarm epitelial celler. For gentamicin beskyttelsesundersøgelser blev iHOs behandlet med 100 ng/mL rhIL-22 18 h før infektion, eller venstre ubehandlet, og inkuerede for 90 min post infektion. Dataene er midler til tre tekniske replikater for tre biologiske replikater ± SEM. Til signifikanstest blev Mann-Whitney U-tests anvendt; p < 0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: interaktion mellem IECs og S. typhimurium SL1344. Disse paneler demonstrere iHOs injiceres med S. Typhimurium SL1344 og inkueret i 3 timer før fiksering og behandling af (a) immunofluorescens eller (B) transmissionselektronmikroskopi. I panel Ases bakterier i IHO lumen og interagerer med epithelium. Kerner er farvet med 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) dilactat (blå), cellemembraner med phalloidin (rød), og bakterier med CSA-1 (grøn). Billederne er taget ved 20x forstørrelse. Panel B viser tre forskellige intracellulære behandlings veje af salmonella efter invasionen. bakterier ses (a) inden for en salmonella-indeholdende vacuole, (b) fri i cytoplasma, og (c) undergår autophagy. Klik her for at se en større version af dette tal.
| RPMI/B27 medium | |
| Komponent: | Beløb: |
| RPMI 1640 medier med Glutamin supplement | 500 mL |
| B27 serum-fri supplement 50x | 10 mL af |
| iHO base vækstmedium | |
| Komponent: | Beløb: |
| Avanceret DMEM/F12 | 500 mL |
| B27 serum-fri supplement 50x | 10 mL af |
| N2 serum-fri supplement 100x | 5 mL af |
| HEPES 1 M | 5 mL af |
| L-glutamin 200 mM | 5 mL af |
| Vækstfaktorer for iHO base vækstmedium | |
| Komponent: | Beløb: |
| Rekombinant humant R-spondin1 | 500 ng/mL |
| Rekombinant Human Noggin | 100 ng/mL |
| Epidermal vækstfaktor (EGF) | 100 ng/mL |
| Prostaglandin E2 | 2,5 μM |
| CHIR99021 | 3 μM og |
| Y-27632 dihydrochloridmonohydrat | 10 μM og |
Tabel 1: medie opskrifter.
Discussion
Denne protokol skitserer differentieringen af hiPSCs til iHOs og deres nytte som en model til at simulere enteriske infektioner. Nedenfor skitserer vi de kritiske trin i protokollen og eventuelle ændringer eller forbedringer, vi har foretaget.
Denne protokol strømliner differentierings processen for hiPSCs i forhold til tidligere publiceret arbejde25. Tidligere anvendte metoder krævede overførsel af Hipsc'er fra andre hiPSC-kultur systemer (f. eks. feeder-afhængig hiPSC-kultur) til kemisk defineret medium – polyvinylalkohol (CDM-PVA). Denne overførsel til CDM-PVA tager typisk 2 – 3 uger og kræver daglig fodring af hiPSCs. Denne protokol var heller ikke konsekvent effektiv, og nogle differentieringer mislykkedes. Derfor, vi retssag differentiering ved hjælp af de samme vækstfaktorer, men starter med hipscs dyrkes i stamcelle kulturmedium (snarere end CDM-PVA) og udskiftning af CDM-PVA med stamcelle kulturmedium i differentieringen dag 0 – 3. Dette har været en succes for de fem uafhængige hipsc linjer retssag hidtil, hvilket gør differentierings processen meget hurtigere og mere effektiv. Dette giver også mulighed for weekend-fri dyrkning af Hipsc'er før differentiering, hvilket giver mere fleksibilitet i hiPSC kulturen. iHO linjer produceret af denne metode er blevet phenoindtastet for markører for intestinal epitel som vi tidligere har beskrevet for hiPSC linjer Kolf2, Yemz1, og Lise116 og synes phenotypisk skelnes fra ihos produceret ved hjælp af den tidligere Protokollen.
Efter såning, iHOs kræver mindst 1 måned rutinemæssig passage, med opdeling hver 4-7 dage for at lette modning. Bemærk, at der vil være nogle variationer i iHO udvikling afhængigt af iPSC linje, der anvendes, og tætheden af den oprindelige kultur. I de første få passager vil der være synlige kontaminerende celler, som ikke er iHOs. Disse vil i sidste ende dø, forlader en ren kultur af sfærisk og efter ca 4 uger, okulerede ihos. Desuden kan en in-Hood billedsystem bruges til at vælge og passage kun iHOs med den ønskede morfologi. Som iHOs moden, vil de kræve opdeling hver 6 – 7 dage, afhængig af vækstrate og tæthed. Hvis nogen af følgende forekommer, bør iHOs opdeles før dette punkt: de luminale kaviteter af iHOs begynder at fylde op med døde celler, kælderen membran matrix begynder at opløses, den iHOs begynder at vokse ud af kælderen membran matrix, eller kulturen er for tætte og medierne begynder at gå gult meget hurtigt.
Når IHO kulturen er etableret, hvis udseendet af ihos ændringer eller er anderledes end forventet (for eksempel, kulturerne forbliver sfæriske, snarere end spirende), fænotype via Immunohistokemi og qPCR for celle markører bør være gentages for at sikre, at differentieringen af celle typerne i iHOs (f. eks. bæger celler, Paneth-celler) forbliver intakt. Hvis iHOs ikke længere differentierer, så bør de kasseres og redifferentieret eller en tidligere passage af iHOs bør optøet og rekonstitueres. Hvis iHOs ophører med at differentiere, er de potentielle årsager kulturens alder (hvis den er over 6 måneder gammel), aktiviteten af vækstfaktorerne (Sørg for, at disse er rekonstitueret i henhold til producentens anvisninger og holdt indefrosset i små aliquoter for at undgå flere fryse-tø-cyklusser), for hyppige eller voldelige passager (i almindelighed, bør passage kun ske en gang om ugen, og hvis iHOs er manuelt dissocieret for energisk på en regelmæssig basis, vil de ophøre med at helt differentiere).
Vi etablerede via RNA sekvensering, at IL-22 stimulation 18 h før infektion opregulerer antimikrobielle gener og dem, der er involveret i barrieren forsvar fænotype. Forud for brugen af nye ihso for analyser, der involverer prestimulation med rhil-22 (eller en alternativ cytokin hvis systemet anvendes til dette), er det tilrådeligt at kontrollere aktiviteten af gener vides at være upreguleret af cytokin (i tilfælde af Il-22 brugte vi DUOX2 og LCN2) via qPCR efter stimulering af ihos for at sikre receptor ekspression og intakt signalgivning. Før den første brug af IL-22 udførte vi også Immunohistokemi for at lokalisere IL-22-receptoren på iHOs for at fastslå, at ekspressionen af IL-22-receptoren var basal, hvilket betyder, at prestimulation kunne opnås ved blot at tilføje rhIL-22 til iHO-kulturen Medium. Men hvis en receptor er rammende udtrykt, kan denne protokol skal tilpasses til at levere ligander apisk.
Faldgruber vedrørende mikroindsprøjtnings systemet er generelt relateret til delikatesse af de nåle, der kræves til injektionen. Her bruger vi kommercielt tilgængelige bore spidser med et 6 μm lumen. Det er muligt at trække injektionnåle fra glas kapillærer26 selv om dette kan være mindre ensartet, hvilket fører til lækager fra nålespidsen eller inkonsekvente mængder injiceres i ihos. Det er vigtigt at være sikker på, at injektionen har fundet sted i iHO lumen, hvilket er en af grundene til brugen af phenol rød som et farvestof; iHOs vil synligt udvide og holde den røde inokulum, hvilket giver vished om, hvilke iHOs er blevet injiceret. Lejlighedsvis nåle vil tilstoppe med snavs fra iHO væggen; Hvis dette er tilfældet, skal du fjerne nålens spids indefra iHO og trykke på Clean -knappen på mikroindsprøjtnings systemet. Dette vil resultere i en kort periode med højere lufttryk, som bør rydde blokeringen. Det vil også fremkalde en vis lækage af bakteriel inokulum på pladen; Hvis dette sker, bør den rene handling derfor gentages på alle plader for at sikre lighed for bakteriel inokulum pr. plade. En stor fordel ved hiPSC-afledte iHOs er deres størrelse. Tarm organoider fra mus og primære menneskelige organoider er meget mindre (måler op til ~ 100 μm og 100 – 300 μm, henholdsvis27, versus 250 – 1500 μm for hipsc-afledte ihos), hvilket betyder, at injektioner af store mængder af organoider vil være langsommere. Dette giver mulighed for større injektion eksperimenter, der skal retssag i hipsc-afledte ihos. Det er også muligt at studere det luminale indhold af iHOs ved at høste dem efter infektion og manuelt dissociere iHOs i DPBS, frigive deres luminale indhold. Til mikroinjektion anbefaler vi at bruge en høj koncentration af bakterier. Vi konstaterede, at lavere koncentrationer ikke var tilstrækkelige til at generere et svar fra de Iec'er, der bestod af iHOs. Derudover var det svært at efterfølgende finde internaliserede bakterier ved hjælp af mikroskopi. Inokulum skal muligvis optimeres til forskellige bakteriestammer.
Sammenfattende, hiPSC-afledte iHOs giver en lovende model for direkte dissekere epitel respons på enteriske infektioner, enten ved at studere intracellulære invasion tæller, billeddannelse, måling af cytokin niveauer i iHO supernatants, eller høst RNA til undersøgelser af transkriptionelle ændringer efter eksponering for patogener. Deres nytte vil blive endnu tydeligere i fremtiden for at etablere infektions modeller for menneske-begrænset patogener og udnytte mulighederne for at bruge denne teknologi til at tilpasse forskningen ved at studere specifikke sygdomsrelaterede genetiske mutationer og lægemiddel respons.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af støtte fra Wellcome Trust, the Gates Foundation og Cambridge Biomedical Research Centre. E.A.L. er en klinisk Ph.D. studerende støttet af Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 5 mm glass bottom injection dishes | MatTek corporation | P50G-0-14-F | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Alexa fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A22287 | Use at 1:1,000 concentration |
| B27 serum-free supplement | Life Technologies | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| BMP-4 recombinant human protein | R&D | PHC9534 | Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL |
| Cell recovery solution (cell lifting solution) | BD | 354253 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890-5mg | Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM |
| Collagenase, type IV powder | Life Technologies | 17104019 | Reconstitute at 0.1% |
| Corning cryogenic vials | Corning | 430487 | |
| Costar TC treated 24 well culture plates | Corning | CLS3527 | |
| DAPI dilactate | Sigma-Aldrich | D9564-10MG | Use at 10 nM concentration |
| Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662-100ML | |
| Epidermal growth factor | R&D | 236-EG-200 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) | Eppendorf | 920000011 | |
| Eppendorf Femtojet express (microinjection system) | Eppendorf | 5248 000.017 | |
| Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) | Life Technologies | A2858501 | |
| EVOS XL imaging system (in-hood imaging system) | |||
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272-10ML | Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL |
| Goat anti-Salmonella, CSA-1 | Insight Biotechnology | 02-91-99 | Use at 1:20 concentration |
| HEPES 1 M | Life Technologies | 15630056 | |
| KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) | Gibco | 10828010 | |
| GlutaMAX supplement (glutamine supplement | ThermoFisher | ||
| L-glutamine | Life Technologies | A2916801 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| LY294002 | Promega UK | V1201 | Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM |
| Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| MEM non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| N2 serum-free supplement | Life Technologies | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140163 | Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter | Eppendorf | 5195000087 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma | P0409-1MG | Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM |
| Recombinant human FGF basic | R&D | 233-FB-025 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human IL-22 | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human R-spondin1 | R&D | 4645-RS-025 | Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | R&D | 338-AC-050 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) | Gibco | 12648010 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Stock concentration 3 μM, final concentration 3 mM |
| RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) | Life Technologies | 61870010 | |
| Triton X-100 (cell lysis buffer) | Sigma-Aldrich | RES9690T-A101X | Use at 1% concentration |
| Versene (EDTA solution) | Life Technologies | 15040066 | |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 dihydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM |
References
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine. Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).
- Leha, A., et al. A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines. Methods. 96, 85-96 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).
- Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K. Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (1), 21-38 (2014).
- Kotenko, S. V., et al. Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).
- Forbester, J. L., et al. Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).
- Nozaki, K., et al. Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes. Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
- Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli. PLOS ONE. 12 (6), e0178966 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System. Methods in Molecular Biology. , (2016).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
