在这里,我们提出了一个协议,有效地结合串行块面和聚焦电束扫描电子显微镜的目标领域。这允许在三维中进行高效的搜索,并在大型视野中定位罕见事件。
该协议允许在电子显微镜的分辨率水平上对细胞或组织样本进行三维的高效成像。多年来,电子显微镜(EM)一直是一种固有的二维技术。随着串行扫描电子显微镜成像技术(体积 EM)的出现,使用集成的微原子或聚焦的电束进行切片,然后查看嵌入组织,第三个维度变得易于访问。串行块面扫描电子显微镜(SBF-SEM)使用塞姆室中封闭的超微体。它能够处理大型试样(1,000 μm x 1,000 μm)和以小 X、Y 像素大小拍摄大视场,但在 Z 尺寸时被金刚石刀限制。聚焦式水龙束SEM(FIB-SEM)不受3D分辨率的限制(±5nm的各向异性体素是可以实现的),但视野更为有限。该协议演示了将两种技术相结合的工作流,以允许在大型字段中查找感兴趣的单个区域 (ROI),然后以高同种体素分辨率成像后续目标体积。由于 SEM 成像中高效生成信号所需的额外对比度,因此对容量 EM 技术的准备要求更高。此类协议既耗时又耗费人力。该协议还集成了微波辅助组织处理,促进试剂的渗透,从而将处理协议所需的时间从几天缩短到数小时。
该协议描述了一个工作流程,用于将高分辨率、三维电子显微镜 (EM) 有效地定位到特定感兴趣的区域 (ROI)。自 20 世纪 30 年代开始以来,EM 基本上是一种二维技术。首次公布的图像是整个组织或细胞的,但很快便让位于使用超微细胞手工切割的部分,并使用透射电子显微镜(TEM)成像。TEM 产生非常高分辨率的显微图,即使最小的细胞结构也清晰可见。然而,电子束成像组织所需的部分的薄度使得Z维度中的信息变得微乎其微。由于细胞是三维结构,细胞结构和细胞表面之间的相互作用必须从有限的数据中推断出来。这就增加了误解的可能性,特别是在复杂的结构中。一些显微镜通过序列分割细胞和组织获得了更准确的3D结构,然后从单个TEM图像1中艰难地重建它们。这是一个非常劳动密集型的过程,在数字成像和计算机渲染出现之前,结果也难以想象。近年来,已经引进了两种技术,它们统称为体积电子显微镜(体积EM)2,使三维的EM能够被更多的实验室访问。
从电子显微镜内的嵌入式模块中获取一叠图像的想法可以追溯到1981年,当时史蒂夫·莱顿和艾伦·库兹里安建造了一个微型微原子,并将其放置在扫描电子显微镜3(SBF-SEM)的腔室中。.23年后,登克和霍斯特曼4最终复制并改进了该原型,随后商业化。几乎在同一时间,生物科学家意识到另一种主要用于材料科学的技术,聚焦的子束。这种技术使用某种(氧化铝、等离子体)的电束从样品(FIB-SEM)5中去除非常少量的表面材料。这两种技术都采用切片术,然后是成像,可提供一系列可组合成 X、Y、Z 和堆栈的图像。这两种技术都提供 3D 信息,但分辨率不同。SBF-SEM 受金刚石刀的物理特性限制,可切割不超过 50 nm 的长串行成像运行;然而,可分割的样品块尺寸很大,高达1毫米x1毫米x1毫米。 由于后散射电子探测器(32k x 32k像素)的数字采集格式很大,因此从块面接收信号,图像像素大小可以小到 1 nm。这将导致非各向异性体素,其中 X,Y 尺寸通常小于 Z。由于孔束的精度,FIB-SEM 能够收集各向异性体素 +5 nm 的图像。但是,可以成像的总面积相当小。之前已发布使用这两种技术成像的各种示例和卷的摘要表。
体积EM的组织制备比标准TEM或SEM更难,因为样品必须染色才能在SEM中提供足够的信号生成。 通常,染色不仅需要针对特定的组织类型进行优化,还需要针对添加与某些细胞结构形成对比,使识别和重建更加容易。此处使用的协议基于 NCMIR 标准6。附加染色通常意味着额外的协议步骤。因此,对于体积EM,需要扩展标准协议,以确保试剂有足够的时间穿透样品。微波辅助处理可以将染色所需的时间从数小时缩短到几分钟,并使量EM样品制备更高效7。该方法适用于所有细胞和组织类型8,并研究组织不均匀性使特定区域取样所必需的问题9。
获得数据堆栈后,可以对齐,并将感兴趣的结构从其余数据分割,并在 3D 中建模。尽管成像许多组织切片的自动化使图像采集相对简单,但数据数字化重建和可视化的过程是一项耗时的任务。用于此目的的软件尚未集成或完全自动化。由于使用体积EM的早期工作大部分都针对神经科学,因此与其他细胞和细胞器相比,对斧头等结构进行染色和数字分段的技术相当先进。虽然关于其他非神经元组织的文献增长迅速,非线性或不规则结构需要更多的手动输入。
使用 SBF-SEM 和 FIB-SEM 是一种有用的方法,用于以高分辨率在 3D 中定位和成像特定的、非均匀的组织结构。结合微波辅助组织处理,大大减少了样品制备所需的时间。此工作流将使生成精细结构的高分辨率各向异性体素图像数据集成为一个高效和快速的过程。
体积电子显微镜比传统的SEM或TEM更具挑战性和耗时。由于需要将组织或细胞染色,处理步骤必须足够长,以确保试剂在整个样品中渗透。使用微波能量促进渗透,可缩短处理时间,提高处理效率,并改善染色。因为EM的制备比光显微镜的制备要严格得多,所有溶液和试剂都必须严格质量控制。pH、可恢复性、不纯试剂的使用以及由于技术落后而引入污染物的变化,都可能对最终图像产生有害影响。
卷 EM 还需要针对每种不同样本类型定制协议。不同类型的哺乳动物组织:植物、单细胞如酵母、锥体、C. elegans等,都需要它们自己的变异来达到最佳效果。固定和染色的设计必须保持结构完整性,并保持样品尽可能接近其体内形态。在生理温度、pH值和耐食性下固定组织对于使样品尽可能栩栩如生至关重要。样品的高压冷冻(HPF)可能有助于保持更逼生的情况(或可能只是产生不同的伪影),但对于细胞和非常薄的组织HPF将失败,因为冰冰只能产生小体积。因此,对于许多问题,化学固定是唯一的选择。无论固定是 HPF 还是化学,在任何 EM 实验中,结构结果都需要与活细胞或组织成像的类似结果进行仔细比较,以查看它们是否一致。在考虑需要回答的具体问题和用于数字图像可视化的协议时,还必须优化染色。
在许多实验中,将 SBF-SEM 和 FIB 系统都靠近是一个很大的优势。SBF-SEM 的大视野和高 X、Y 分辨率使查找单个结构/细胞/事件变得简单明了,并提供了组织中细胞的整体空间方向。此外,它允许通过Z中的样品进行成像的能力非常强大;但是,由于它生成的非各向异性体素,需要精细几何细节的重建可能会失败或使用此技术产生伪影。FIB 受过程物理特性的限制,但其 3D 分辨率足以进行非常精确的重建。结合这两种技术非常简单,因为样品无需进一步处理或准备即可从 SBF-SEM 移动到 FIB。我们承认,使用 SBF-SEM 搜索样本以查找特定区域是使用功能更精的一种工具的非常昂贵。但是,能够立即查看新的块面并确定是否达到了 ROI 是一个很大的优势。此外,使用串行半薄 (0.5 μm) LM 截面的替代方法可以在检测到小结构之前将其移除,并使用必须切割的单 TEM 截面检查块,将其放在网格上,然后在同样昂贵的 TEM 中查看,这与高效的方法。
由于存在许多程序来对数据进行分段和呈现,并且单个应用程序可能无法最好地满足给定结构的需求,因此无法提出标准工作流。如果某些简单结构属于非常狭窄的灰度值,则可以使用阈值算法进行分割。神经元结构可以使用 Ilastik11等程序半自动分段,但它在更随机或复杂形状的细胞器(如 ER)上用处较少。显微镜图像浏览器是一个非常灵活的程序,可以对齐,分段和渲染卷EM数据,但需要大量的用户交互12。一般来说,数字可视化结果所需的时间将大大超过准备样本和成像的时间。
卷 EM 技术为超结构分析开辟了第三个维度。获得 3D EM 的其他方法在体积(TEM 断层扫描)或效率(串行部分 TEM)方面有限制。尽管大部分数量 EM 技术过于复杂且成本高昂,无法在单个实验室中实施,但提供这些技术的共享核心设施数量一直在增长,成功成像的样本类型数量也迅速增加。对于那些有一个特定问题和一个特定的组织,它很可能有人将能够提供建议和说明,其准备和成像。可以改进容量 EM 设备,以包括处理 SBF-SEM 中较大样品的能力,以及使用 FIB 铣削较大 ROIs 的能力。能够以更自动化的方式分段感兴趣的结构的软件将大大简化数据分析的过程,而计算速度的改进将缩短这样做所需的时间。尽管存在当前的限制,卷 EM 仍然是一个有用的工具,将 SBF-SEM 和 FIB-SEM 相结合提供了一个高效的工作流,用于识别罕见事件并以高分辨率成像它们。
The authors have nothing to disclose.
用于量EM的设备由佛兰德斯政府慷慨赠款提供。
3View 2XP | Gatan | NA | In chamber ultramicrotome for SBFI |
Cacodylate buffer 0.2M solution | EM Sciences | 11652 | |
Conductive epoxy resin (circuit works) | RS components | 496-265 | |
Diatome Histo 4.0mm diamond knife | EM Sciences | 40-HIS | |
Digitizing tablet | Wacom | DTV-1200W | No longer available |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Flat Embedding Mold | EM Sciences | 70900 | |
Gluteraldehyde 25% solution | EM Sciences | 16220 | |
High MW Weight Tannic Acid | EM Sciences | 21700 | |
Lead Citrate | Sigma-Aldrich | 22861 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Osmium Tetroxide 4% solution | EM Sciences | 19170 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pelco Biowave Pro + | Ted Pella | 36700 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P3289 | |
Quorum Q150T ES sputter coater | Quorum Technologies | 27645 | |
Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome | NA | NA | No longer available |
Sodium Cacodylate 0.2M | EM Sciences | 11653 | |
Spurrs Resin kit | EM Sciences | 14300 | |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 |