Hier presenteren we een protocol voor het efficiënt combineren van seriële Block face en gerichte Ion Beam Scanning elektronenmicroscopie om een interessegebied te targeten. Dit maakt efficiënt zoeken mogelijk, in drie dimensies, en het lokaliseren van zeldzame gebeurtenissen in een groot gezichtsveld.
Dit protocol zorgt voor een efficiënte en effectieve beeldvorming van cel-of weefselmonsters in drie dimensies op het resolutie niveau van elektronenmicroscopie. Voor vele jaren is Elektron microscopie (EM) een inherent tweedimensionale techniek gebleven. Met de komst van seriële scanning elektronen microscoop beeldvormingstechnieken (volume EM), met behulp van ofwel een geïntegreerde microtoom of gerichte Ion Beam te snijden vervolgens weergave ingesloten weefsels, de derde dimensie wordt gemakkelijk toegankelijk. Seriële blok gezicht Scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM) maakt gebruik van een ultramicrotome ingesloten in de SEM kamer. Het heeft de mogelijkheid om grote specimens (1.000 μm x 1.000 μm) te hanteren en grote beeld velden te bekijken bij kleine X-, Y-pixelgrootte, maar is beperkt in de Z-dimensie door het diamantmes. Gerichte Ion Beam SEM (FIB-SEM) is niet beperkt in 3D-resolutie, (isotrope voxels van ≤ 5 nm zijn haalbaar), maar het gezichtsveld is veel beperkter. Dit protocol demonstreert een workflow voor het combineren van de twee technieken om individuele interessegebieden (ROIs) in een groot veld te vinden en vervolgens het daaropvolgende gerichte volume te Imaging bij hoge isotrope Voxel-resolutie. Het voorbereiden van vaste cellen of weefsels is veeleisender voor volume EM-technieken vanwege het extra contrast dat nodig is voor een efficiënte signaal generatie in SEM-beeldvorming. Dergelijke protocollen zijn tijdrovend en arbeidsintensief. Dit protocol omvat ook de verwerking van microgolf-geassisteerde weefsels die de penetratie van reagentia vergemakkelijkt, waardoor de tijd die nodig is voor het verwerkings Protocol van dagen tot uren afneemt.
Dit protocol beschrijft een workflow voor de efficiënte targeting van drie-dimensionale elektronenmicroscopie (EM) met hoge resolutie en een specifieke regio van belang (ROI). Sinds het begin in de jaren 1930 is EM een in wezen tweedimensionale techniek geweest. De eerste gepubliceerde beelden waren van hele weefsels of cellen, maar dat gaf snel plaats aan secties die met de hand werden gesneden met behulp van een ultramicrotome en afbeelding gemaakt met behulp van een transmissie-elektronen microscoop (TEM). TEM produceert micro grafieken met zeer hoge resolutie, waarbij zelfs de kleinste cellulaire structuren duidelijk kunnen worden onderscheiden. Echter, de dunheid van de sectie die nodig is voor het weefsel te worden afbeelding gemaakt door de elektronenstraal maakte informatie in de Z-dimensie minimaal. Omdat cellen driedimensionale structuren zijn, moesten interacties tussen celstructuren en celoppervlakken worden afgeleid uit beperkte gegevens. Dit bracht het potentieel voor verkeerde interpretatie naar voren, vooral in structuren die complex waren. Sommige microscopisten slaagden erin om nauwkeurigere 3D-structuren te verkrijgen door seriële-snij cellen en weefsels en ze vervolgens nauwgezet te reconstrueren van individuele TEM-afbeeldingen1. Dit was een zeer arbeidsintensieve proces en vóór de opkomst van digitale beeldvorming en computer rendering waren de resultaten ook moeilijk te visualiseren. In de afgelopen jaren zijn er twee technieken geïntroduceerd die collectief bekend zijn geworden als volume elektronenmicroscopie (volume EM)2 die em in drie dimensies toegankelijk hebben gemaakt voor meer laboratoria.
Het idee om een stapel beelden van een ingebed blok in een elektronen microscoop te verkrijgen, kan worden teruggevoerd naar 1981 toen Steve Leighton en Alan Kuzirian een miniatuur microtoom bouwden en het in de kamer van een scanning elektronen microscoop3 (SBF-SEM) plaatsten . Dit prototype werd uiteindelijk 23 jaar later gekopieerd en verbeterd door denk en Horstmann4 en vervolgens gecommercialiseerd. Op ongeveer dezelfde tijd werden biologische wetenschappers zich bewust van een andere technologie die voornamelijk werd gebruikt in de materiaalwetenschap, de gerichte ionen straal. Deze techniek maakt gebruik van een ionen straal van een of andere soort (gallium, plasma) om een zeer kleine hoeveelheid Oppervlaktemateriaal uit een monster (FIB-SEM)5te verwijderen. Beide technieken gebruiken snijden, gevolgd door beeldvorming die een reeks afbeeldingen biedt die kunnen worden gecombineerd in een X, Y, Z, stack. Beide technieken bieden 3D-informatie, maar op verschillende resolutie schalen. SBF-SEM wordt beperkt door de fysische eigenschappen van het diamantmes tot segmenten die niet dunner zijn dan 50 nm voor lange seriële beeldvormings runs; de steekproef blokgrootte die kan worden verdeeld is echter groot, tot 1 mm x 1 mm x 1 mm. door het grote digitale acquisitie formaat van de achterzijde verspreide elektron detector (32k x 32k pixels) die een signaal van het blok gezicht ontvangt , kunnen beeld pixel groottes zo klein zijn als 1 nm. Dit resulteert in niet-isotrope voxels waarbij de X-, Y-afmeting vaak kleiner is dan de Z. Vanwege de precisie van de ionen straal heeft FIB-SEM de mogelijkheid om beelden te verzamelen met isotrope voxels ≤ 5 nm. Echter, de totale oppervlakte die kan worden afbeelding gemaakt is vrij klein. Een overzichtstabel met verschillende voorbeelden en volumes die met de twee technieken zijn afgebeeld, is eerder gepubliceerd3.
Weefsel voorbereiding voor volume EM is moeilijker dan voor standaard TEM of SEM, omdat monsters moeten worden gekleurd om adequate signaal vorming in de SEM te bieden. vaak moeten de kleuringen niet alleen worden geoptimaliseerd voor het specifieke weefseltype, maar ook voor het toevoegen van contrast met bepaalde cellulaire structuren om identificatie en reconstructie gemakkelijker te maken. Het protocol dat hier wordt gebruikt, is gebaseerd op de NCMIR-norm6. Extra kleuring betekent meestal extra protocol stappen. Dus voor volume EM moeten standaardprotocollen worden uitgebreid om voldoende tijd te hebben voor het binnendringen van reagentia in het monster. Door de magnetron ondersteunde verwerking kan de tijd die nodig is voor kleuring van uren tot minuten verminderen en maakt volume EM monstervoorbereiding efficiënter7. Deze methode is van toepassing op alle cel-en weefsel typen8 en op onderzoeksvragen waarbij de inhomogeniteit van het weefsel bemonstering van een specifiek gebied noodzakelijk maakt9.
Zodra een Data stack wordt verkregen kan het worden uitgelijnd en de structuren van belang gesegmenteerd uit de rest van de gegevens en gemodelleerd in 3D. Hoewel de automatisering van beeldvorming veel segmenten van weefsel heeft gemaakt beeld verwerving relatief eenvoudig, het proces van het digitaal reconstrueren en visualiseren van de gegevens is een tijdrovende taak. Software voor dit doel is nog niet geïntegreerd of volledig geautomatiseerd. Omdat veel van het vroege werk met behulp van volume EM gericht was op de neurowetenschappen, zijn de technieken voor het vlekken en digitaal segmenteren van structuren zoals axonen vrij ver gevorderd in vergelijking met andere cellen en organellen. Terwijl de literatuur op andere niet-neuronale weefsels snel groeit, niet-lineaire of onregelmatige structuren vereisen meer handmatige invoer.
Het gebruik van zowel SBF-SEM als FIB-SEM is een nuttige benadering voor targeting en imaging specifieke, niet-homogene weefselstructuren met hoge resolutie in 3D. Combineren dat met microgolf geassisteerde weefsel verwerking die sterk vermindert de tijd die nodig is voor monstervoorbereiding. Samen maakt deze workflow het genereren van hoge-resolutie isotrope Voxel beeld sets van fijne constructies een efficiënt en sneller proces.
Volume elektronenmicroscopie is uitdagender en tijdrovend dan conventionele SEM of TEM. Vanwege de noodzaak om weefsels of cellen en bloc te vlekken, moeten de verwerkingsstappen lang genoeg zijn om de penetratie van reagentia in het monster te garanderen. Het gebruik van microgolfenergie om penetratie te vergemakkelijken zorgt voor kortere, efficiëntere verwerking en verbetert de kleuring. Omdat de voorbereiding voor EM veel strenger is dan bij lichte microscopie moeten alle oplossingen en reagentia strikt gecontroleerd worden op kwaliteit. Veranderingen in pH, toniciteit, het gebruik van onzuivere reagentia en de introductie van verontreinigingen als gevolg van slechte techniek kunnen allemaal schadelijke effecten hebben op het uiteindelijke beeld.
Voor volume EM zijn ook afzonderlijke protocollen op maat vereist voor elk verschillend sample type. Zoogdier weefsels van verschillende types: planten, enkelvoudige cellen zoals gist, trypanosomes, C. elegans, etc., hebben allemaal hun eigen variaties nodig om optimale resultaten te behalen. Fixatie en kleuring moeten zodanig zijn ontworpen dat de structurele integriteit behouden blijft en het monster zo dicht mogelijk bij zijn in vivo morfologie wordt bewaard. Fixatie van weefsels op fysiologische temperatuur, pH en toniciteit is van cruciaal belang voor het maken van het monster als leven-zoals het kan zijn. Hogedruk bevriezing (HPF) van monsters kan helpen om een meer levens achtige situatie te behouden, (of misschien gewoon verschillende artefacten opleveren), maar voor andere dan cellen en zeer dunne weefsels zal HPF falen als glasachtig ijs alleen in kleine hoeveelheden kan worden gegenereerd. Daarom is voor veel vragen chemische fixatie de enige optie. Het maakt niet uit of de fixatie HPF of chemisch is, in een EM-experiment moeten de structurele resultaten zorgvuldig worden vergeleken met vergelijkbare resultaten van Live-cel-of weefsel beeldvorming om te zien of ze consistent zijn. De kleuring moet ook worden geoptimaliseerd, rekening houdend met de specifieke vraag die moet worden beantwoord en het protocol dat zal worden gebruikt voor de visualisatie van de digitale beelden.
Het hebben van zowel een SBF-SEM en FIB systeem in de nabijheid is een groot voordeel in vele experimenten. Het grote gezichtsveld en de hoge X, Y-resolutie van SBF-SEM maakt het vinden van individuele structuren/cellen/gebeurtenissen ongecompliceerd en biedt een algemene ruimtelijke oriëntatie van cellen in weefsels. Bovendien is het vermogen om beeldvorming door middel van een monster in Z toe te staan zeer krachtig; echter, reconstructies die fijne geometrische Details vereisen kunnen mislukken of artefacten produceren met behulp van deze techniek als gevolg van de niet-isotrope voxels die het genereert. De FIB wordt beperkt door de fysica van het proces naar een kleiner beeldvormings veld, maar de 3D-resolutie is voldoende voor zeer nauwkeurige reconstructies. Het combineren van de twee technieken is eenvoudig, omdat monsters van SBF-SEM naar FIB kunnen worden verplaatst zonder verdere verwerking of voorbereiding. We erkennen dat het gebruik van de SBF-SEM voor het zoeken door een steekproef om een bepaald gebied te vinden een zeer dure toepassing is van een veel beter instrument. De mogelijkheid om de nieuwe blockface onmiddellijk te zien en te bepalen of de ROI is bereikt, is echter een groot voordeel. Bovendien kunnen de alternatieven voor het gebruik van seriële semi-dunne (0,5 μm) LM-secties kleine constructies verwijderen voordat ze worden gedetecteerd, en een blok inspecteren met behulp van enkele TEM-secties die moeten worden afgesneden, op een raster worden geplaatst en vervolgens in een even duur TEM worden bekeken, is niet zo efficiënt als de gepresenteerde methode.
Omdat er veel Programma’s bestaan om de gegevens te segmenteren en te renderen en de behoeften van een bepaalde structuur mogelijk niet het best door één toepassing worden bediend, kan geen standaardworkflow worden voorgesteld. Sommige eenvoudige structuren kunnen worden gesegmenteerd met een drempelwaarde-algoritme als ze binnen zeer smalle grijs schaalwaarden vallen. Neuronale structuren kunnen worden semi-automatisch gesegmenteerd met behulp van een programma zoals Ilastik11 maar het zal minder nuttig zijn op meer willekeurige of complexe gevormde ORGANELLEN zoals er. Microscopie afbeeldings browser is een zeer flexibel programma dat volume EM-gegevens kan uitlijnen, segmenteren en renderen, maar aanzienlijke gebruikersinteractie vereist12. Als algemene regel geldt dat de hoeveelheid tijd die nodig is om de resultaten digitaal te visualiseren, de tijd voor het voorbereiden van het monster en de beeldvorming aanzienlijk overschrijdt.
Volume EM-technieken hebben de derde dimensie opengesteld voor Ultrastructurele analyse. Andere methoden voor het verkrijgen van 3D EM hebben beperkingen in hun volume (TEM tomografie), of hun efficiëntie (seriële sectie TEM). Hoewel voor het grootste deel volume EM-technieken te complex en kostbaar zijn om in afzonderlijke laboratoria te worden geïmplementeerd, is het aantal gedeelde kern faciliteiten dat hen aanbiedt, gegroeid en is het aantal voorbeeld typen dat met succes is gefotografeerd, snel toegenomen. Voor mensen met een specifieke vraag en een bepaald weefsel is het waarschijnlijk dat iemand in staat is om advies en instructies te geven over de voorbereiding en beeldvorming. Volume EM-apparatuur kan worden verbeterd met de capaciteit voor het verwerken van grotere monsters in de SBF-SEM en de mogelijkheid van het frezen van grotere ROIs met de FIB. Software die in staat is om de structuren van belang op een meer geautomatiseerde manier te segmenteren zal het proces van het analyseren van de gegevens aanzienlijk vereenvoudigen en verbeteringen in de computer snelheid zal de tijd die nodig is om dit te doen verminderen. Ondanks de huidige beperkingen is volume EM nog steeds een handig hulpmiddel en combineert SBF-SEM en FIB-SEM een efficiënte workflow voor het identificeren van zeldzame gebeurtenissen en het weergeven van afbeeldingen met een hoge resolutie.
The authors have nothing to disclose.
De apparatuur voor volume EM werd geleverd door een genereuze subsidie van de Vlaamse overheid.
3View 2XP | Gatan | NA | In chamber ultramicrotome for SBFI |
Cacodylate buffer 0.2M solution | EM Sciences | 11652 | |
Conductive epoxy resin (circuit works) | RS components | 496-265 | |
Diatome Histo 4.0mm diamond knife | EM Sciences | 40-HIS | |
Digitizing tablet | Wacom | DTV-1200W | No longer available |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Flat Embedding Mold | EM Sciences | 70900 | |
Gluteraldehyde 25% solution | EM Sciences | 16220 | |
High MW Weight Tannic Acid | EM Sciences | 21700 | |
Lead Citrate | Sigma-Aldrich | 22861 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Osmium Tetroxide 4% solution | EM Sciences | 19170 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pelco Biowave Pro + | Ted Pella | 36700 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P3289 | |
Quorum Q150T ES sputter coater | Quorum Technologies | 27645 | |
Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome | NA | NA | No longer available |
Sodium Cacodylate 0.2M | EM Sciences | 11653 | |
Spurrs Resin kit | EM Sciences | 14300 | |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 |