यहाँ, हम कुशलतापूर्वक सीरियल ब्लॉक चेहरे और ध्यान केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संयोजन के लिए ब्याज के एक क्षेत्र को लक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यह तीन आयामों में कुशल खोज की अनुमति देता है, और दृश्य के एक बड़े क्षेत्र में दुर्लभ घटनाओं का पता लगाने.
इस प्रोटोकॉल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संकल्प स्तर पर तीन आयामों में सेल या ऊतक के नमूने के कुशल और प्रभावी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. कई वर्षों के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) एक स्वाभाविक दो आयामी तकनीक बनी हुई है. सीरियल स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप इमेजिंग तकनीक (मात्रा EM) के आगमन के साथ, या तो एक एकीकृत microtome या ध्यान केंद्रित आयन बीम का उपयोग करने के लिए टुकड़ा तो एम्बेडेड ऊतकों को देखने, तीसरे आयाम आसानी से सुलभ हो जाता है. सीरियल ब्लॉक चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBF-SEM) SEM कक्ष में संलग्न एक ultramicrotome का उपयोग करता है. यह बड़े नमूनों को संभालने की क्षमता है (1,000 डिग्री x 1,000 $m) और छवि छोटे एक्स, वाई पिक्सेल आकार पर देखने के बड़े क्षेत्रों, लेकिन हीरे चाकू द्वारा जेड आयाम में सीमित है. केंद्रित आयन बीम SEM (FIB-SEM) 3 डी संकल्प में सीमित नहीं है, (5 एनएम के isotropic voxels प्राप्त कर रहे हैं), लेकिन देखने के क्षेत्र में बहुत अधिक सीमित है. इस प्रोटोकॉल एक बड़े क्षेत्र में ब्याज (ROIs) के अलग-अलग क्षेत्रों को खोजने के लिए अनुमति देने के लिए दो तकनीकों के संयोजन के लिए एक कार्यप्रवाह को दर्शाता है और फिर उच्च isotropic voxel संकल्प पर बाद में लक्षित मात्रा इमेजिंग. स्थिर कोशिकाओं या ऊतकों की तैयारी SEM इमेजिंग में कुशल संकेत पीढ़ी के लिए आवश्यक अतिरिक्त विषम के कारण मात्रा EM तकनीकों के लिए अधिक मांग है. इस तरह के प्रोटोकॉल समय लेने और श्रम गहन हैं. इस प्रोटोकॉल में माइक्रोवेव सहायता प्राप्त ऊतक प्रसंस्करण अभिकर्मकों के प्रवेश को सुविधाजनक बनाने को भी शामिल किया गया है, जो प्रसंस्करण प्रोटोकॉल के लिए दिन से घंटों के लिए आवश्यक समय को कम करता है।
यह प्रोटोकॉल रुचि के किसी विशिष्ट क्षेत्र (ROI) के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन, त्रि-आयामी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के कुशल लक्ष्यीकरण के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है. 1930 के दशक में अपनी शुरुआत के बाद से, EM एक अनिवार्य रूप से दो आयामी तकनीक किया गया है. पहले प्रकाशित छवियों पूरे ऊतकों या कोशिकाओं के थे, लेकिन है कि जल्द ही वर्गों है कि हाथ से एक ultramicrotome का उपयोग कर काट रहे थे और एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) का उपयोग कर छवि के लिए रास्ता दे दिया. TEM बहुत उच्च संकल्प micrographs जहां भी सेलुलर संरचनाओं की छोटी स्पष्ट रूप से स्पष्ट कर रहे हैं पैदा करता है. तथापि, ऊतक के लिए आवश्यक अनुभाग की पतलापन इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा छवि किए जाने के लिए $ आयाम न्यूनतम में जानकारी बनाई. चूँकि कोशिकाएँ त्रि-आयामी संरचना होती हैं, इसलिए सेल संरचनाओं और कोशिका सतहों के बीच होने वाली क्रियाओं को सीमित डेटा से अनुमान लगाया जाना था। इसने गलत व्याख्या की क्षमता को बढ़ाया, विशेष रूप से उन संरचनाओं में जो जटिल थे। कुछ microscopists धारावाहिक अनुभाग कोशिकाओं और ऊतकों द्वारा और अधिक सटीक 3 डी संरचनाओं को प्राप्त करने में कामयाब रहे और फिर परिश्रम से उन्हें व्यक्तिगत TEM छवियों1से पुनर्निर्माण. यह एक बहुत ही श्रम गहन प्रक्रिया थी और डिजिटल इमेजिंग और कंप्यूटर प्रतिपादन परिणाम के आगमन से पहले भी कल्पना करना मुश्किल था. हाल के वर्षों में दो तकनीकों जो सामूहिक मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मात्रा EM)2 है कि तीन आयामों में EM अधिक प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बना दिया है के रूप में जाना जाता है शुरू किया गया है.
एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के अंदर एक एम्बेडेड ब्लॉक से छवियों के एक ढेर प्राप्त करने का विचार 1981 को वापस पता लगाया जा सकता है जब स्टीव Leighton और एलन Kuzirian एक लघु microtome का निर्माण किया और यह एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के कक्ष में रखा3 (SBF-SEM) . इस प्रोटोटाइप अंततः नकल की और सुधार किया गया था 23 साल बाद Denk और Horstmann4 द्वारा और बाद में commercialized. मोटे तौर पर एक ही समय में जैविक वैज्ञानिकों सामग्री विज्ञान में मुख्य रूप से इस्तेमाल किया एक और तकनीक के बारे में पता बन गया, ध्यान केंद्रित आयन बीम. इस तकनीक के एक नमूने से सतह सामग्री की एक बहुत छोटी राशि को दूर करने केलिए किसी तरह (गैलियम, प्लाज्मा) के एक आयन बीम का उपयोग करता है (एफआईबी-SEM) 5. दोनों तकनीकों इमेजिंग छवियों जो एक एक्स, वाई, जेड, ढेर में जोड़ा जा सकता है की एक श्रृंखला प्रदान करने के बाद अनुभागीकरण रोजगार. दोनों तकनीकों 3 डी जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन अलग संकल्प तराजू पर. SBF-SEM लंबे सीरियल इमेजिंग रन के लिए कोई पतली से अधिक 50 एनएम स्लाइस करने के लिए हीरे चाकू के भौतिक गुणों द्वारा सीमित है; हालांकि नमूना ब्लॉक आकार है कि अनुभाग किया जा सकता है बड़ा है, अप करने के लिए 1 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी. वापस बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के बड़े डिजिटल अधिग्रहण प्रारूप के कारण (32k x 32k पिक्सल) कि ब्लॉक चेहरे से एक संकेत प्राप्त करता है , छवि पिक्सेल आकार के रूप में 1 एनएम के रूप में छोटा हो सकता है. यह गैर-isotropic voxels में परिणाम है जहाँ एक्स,Y आयाम अक्सर $ से छोटा है. आयन बीम की शुद्धता की वजह से, FIB-SEM isotropic voxels के साथ छवियों को इकट्ठा करने की क्षमता है $ 5 एनएम. हालांकि, कुल क्षेत्र है कि छवि की जा सकती है काफी छोटा है. दो तकनीकों के साथ छवि किए गए विभिन्न नमूनों और मात्राओं का सारांश तालिका पहले3प्रकाशित किया जा चुका है।
मात्रा EM के लिए ऊतक तैयारी मानक TEM या SEM के लिए की तुलना में अधिक कठिन है क्योंकि नमूने SEM में पर्याप्त संकेत पीढ़ी प्रदान करने के लिए दाग होना चाहिए. अक्सर, sstainings न केवल विशेष ऊतक प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी जोड़ने के लिए पहचान और पुनर्निर्माण को आसान बनाने के लिए कुछ सेलुलर संरचनाओं के विपरीत। यहाँ प्रयुक्त प्रोटोकॉल एनसीएमआईआर मानक6पर आधारित है। अतिरिक्त धुंधला आमतौर पर अतिरिक्त प्रोटोकॉल कदम का मतलब है. इस प्रकार मात्रा EM के लिए, मानक प्रोटोकॉल नमूने घुसना करने के लिए अभिकर्मकों के लिए पर्याप्त समय सुनिश्चित करने के लिए बढ़ाया जा करने के लिए की जरूरत है. माइक्रोवेव सहायता प्राप्त प्रसंस्करण घंटे से मिनट के लिए धुंधला करने के लिए आवश्यक समय को कम कर सकते हैं और मात्रा EM नमूना तैयारी अधिक कुशल7बनाता है. यह विधि सभी कोशिकाओं और ऊतकों के प्रकारों पर लागू होती हैऔर अनुसंधान प्रश्नों पर लागू होती है जहां ऊतक की असमांगता किसी विशिष्ट क्षेत्र के नमूने को आवश्यक9बनाती है .
एक बार एक डेटा स्टैक प्राप्त किया जाता है यह गठबंधन किया जा सकता है और ब्याज की संरचनाओं डेटा के बाकी हिस्सों से विभाजित और 3 डी में मॉडलिंग की. हालांकि ऊतक के कई स्लाइस इमेजिंग के स्वचालन छवि अधिग्रहण अपेक्षाकृत सरल बना दिया है, डिजिटल पुनर्निर्माण और डेटा visualizing की प्रक्रिया एक समय लेने वाली काम है. इस उद्देश्य के लिए सॉफ्टवेयर अभी तक एकीकृत और न ही पूरी तरह से स्वचालित नहीं है. मात्रा EM का उपयोग कर जल्दी काम के बहुत से तंत्रिका विज्ञान की ओर निर्देशित किया गया था के बाद से, इस तरह के axons के रूप में दाग और डिजिटल रूप से खंडित संरचनाओं के लिए तकनीक काफी दूर अन्य कोशिकाओं और organelles की तुलना में उन्नत है. जबकि अन्य गैर-न्यूरोनल ऊतकों पर साहित्य तेजी से बढ़ रहा है, nonlinear या अनियमित संरचनाओं और अधिक मैनुअल इनपुट की आवश्यकता है.
दोनों SBF-SEM और FIB-SEM का उपयोग लक्ष्यीकरण और 3 डी में उच्च संकल्प पर विशिष्ट, nonhomogeneous, ऊतक संरचनाओं इमेजिंग के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है. संयोजन है कि माइक्रोवेव के साथ सहायता प्रदान की ऊतक प्रसंस्करण है कि काफी समय नमूना तैयार करने के लिए आवश्यक कम हो जाती है. एक साथ इस कार्यप्रवाह ठीक संरचनाओं के उच्च संकल्प isotropic voxel छवि डेटासेट एक कुशल और अधिक तेजी से प्रक्रिया पैदा कर देगा.
वॉल्यूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पारंपरिक SEM या TEM की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली है। क्योंकि ऊतकों या कोशिकाओं एन ब्लॉक दाग की जरूरत है, प्रसंस्करण कदम काफी लंबे समय के लिए नमूना भर में अभिकर्मकों के प्रवेश सुनिश्चित होना चाहिए. माइक्रोवेव ऊर्जा का उपयोग प्रवेश की सुविधा के लिए कम, अधिक कुशल प्रसंस्करण के लिए बनाता है और धुंधला सुधार. क्योंकि EM के लिए तैयारी प्रकाश माइक्रोस्कोपी सभी समाधानऔर अभिकर्मकों के लिए की तुलना में अधिक कठोर है गुणवत्ता कड़ाई से नियंत्रित किया जाना चाहिए. पीएच, टॉनिसिटी, अशुद्ध अभिकर्मकों के उपयोग, और खराब तकनीक के कारण contaminants की शुरूआत में परिवर्तन सभी अंतिम छवि पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है.
वॉल्यूम EM भी प्रत्येक भिन्न नमूना प्रकार के लिए अलग-अलग अनुरूप प्रोटोकॉल की आवश्यकता है। विभिन्न प्रकार के स्तन के ऊतक: पौधे, एकल कोशिकाएं जैसे खमीर, ट्रिपेनोसोम, सी एलिगनआदि, सभी को इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए अपनी विविधताओं की आवश्यकता होती है। फिक्सिंग और धुंधला संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने और संभव के रूप में विवो आकृति विज्ञान में इसके करीब के रूप में नमूना रखने के लिए इतनी के रूप में डिजाइन किया जाना चाहिए। शारीरिक तापमान, पीएच और टॉनिकता पर ऊतकों का निर्धारण जीवन की तरह के रूप में नमूना बनाने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में यह हो सकता है. उच्च दबाव ठंड (HPF) नमूनों की एक और अधिक जीवन की तरह स्थिति को बनाए रखने में मदद कर सकते हैं, (या शायद सिर्फ अलग कलाकृतियों उपज), लेकिन कोशिकाओं और बहुत पतली ऊतकों HPF के रूप में विफल हो जाएगा के अलावा अन्य के लिए केवल छोटे संस्करणों में उत्पन्न किया जा सकता है. इसलिए कई सवालों के लिए रासायनिक निर्धारण ही एकमात्र विकल्प है. कोई फर्क नहीं पड़ता अगर निर्धारण HPF या रासायनिक है, किसी भी EM प्रयोग में संरचनात्मक परिणाम ध्यान से लाइव सेल या ऊतक इमेजिंग से इसी तरह के परिणामों की तुलना में अगर वे संगत कर रहे हैं देखने की जरूरत है. दाग भी अनुकूलित किया जाना चाहिए, जबकि विशिष्ट सवाल है कि जवाब दिया जा करने की जरूरत है और प्रोटोकॉल है कि डिजिटल छवियों के दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जाएगा पर विचार.
दोनों एक SBF-SEM और निकट निकटता में FIB प्रणाली होने के कई प्रयोगों में एक महान लाभ है. देखने के बड़े क्षेत्र और उच्च एक्स, SBF-SEM के वाई संकल्प व्यक्तिगत संरचनाओं / कोशिकाओं / घटनाओं सरल खोजने बनाता है और ऊतकों में कोशिकाओं की एक समग्र स्थानिक अभिविन्यास प्रदान करता है. इसके अलावा, $ में एक नमूना के माध्यम से इमेजिंग की अनुमति देने की क्षमता बहुत शक्तिशाली है; हालांकि, पुनर्निर्माण है कि ठीक ज्यामितीय विस्तार की आवश्यकता विफल या गैर-isotropic voxels यह उत्पन्न करता है के कारण इस तकनीक का उपयोग कर कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं. FIB एक छोटे इमेजिंग क्षेत्र के लिए प्रक्रिया के भौतिकी द्वारा सीमित है, लेकिन इसके 3 डी संकल्प बहुत सटीक पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त है. दो तकनीकों के संयोजन के रूप में नमूने आगे प्रसंस्करण या तैयारी के बिना FIB करने के लिए SBF-SEM से स्थानांतरित कर सकते हैं सरल है. हम स्वीकार करते हैं कि एक विशेष क्षेत्र को खोजने के लिए एक नमूना के माध्यम से खोज के लिए SBF-SEM का उपयोग कर एक बहुत अधिक सक्षम उपकरण का एक बहुत महंगा उपयोग है. हालांकि, तुरंत नए blockface देखने और ROI तक पहुँच गया है कि क्या यह निर्धारित करने की क्षमता एक बड़ा लाभ है। इसके अतिरिक्त, सीरियल अर्द्ध-thin (0.5 डिग्री) LM वर्गों का उपयोग करने के विकल्प छोटे संरचनाओं को दूर कर सकते हैं इससे पहले कि वे पता लगाया है, और एक एकल TEM वर्गों जो काट दिया जाना है का उपयोग कर एक ब्लॉक का निरीक्षण, एक ग्रिड पर डाल दिया और फिर एक समान रूप से महंगा TEM में देखा के रूप में नहीं है प्रस्तुत विधि के रूप में कुशल.
चूँकि कई प्रोग्राम डेटा को सेगमेंट और रेंडर करने के लिए मौजूद हैं, और किसी दिए गए संरचना की आवश्यकताओं को किसी एकल अनुप्रयोग द्वारा श्रेष्ठ रूप से कार्य नहीं किया जा सकता है, इसलिए कोई मानक वर्कफ़्लो प्रस्तावित नहीं किया जा सकता. कुछ सरल संरचनाएँ एक दहलीज एल्गोरिथ्म के साथ विभाजित किया जा सकता है अगर वे बहुत संकीर्ण ग्रे पैमाने मूल्यों के भीतर आते हैं. न्यूरोनल संरचनाओं अर्द्ध स्वचालित रूप से इस तरह के Ilastik11 के रूप में एक कार्यक्रम का उपयोग कर विभाजित किया जा सकता है, लेकिन यह इस तरह के ईआर के रूप में अधिक यादृच्छिक या जटिल आकार organelles पर कम उपयोगी हो जाएगा। माइक्रोस्कोपी छवि ब्राउज़र एक बहुत लचीला प्रोग्राम है जो वॉल्यूम EM डेटा को संरेखित, सेगमेंट और रेंडर कर सकता है, लेकिन इसके लिए महत्वपूर्ण उपयोगकर्ता इंटरैक्शन12की आवश्यकता होती है। एक सामान्य नियम के रूप में परिणामों को डिजिटल रूप से विज़ुअलाइज़ करने के लिए आवश्यक समय बहुत नमूना और इमेजिंग तैयार करने के लिए समय से अधिक हो जाएगा।
वॉल्यूम EM तकनीक ultrastructural विश्लेषण करने के लिए तीसरे आयाम खोल दिया है. 3 D EM प्राप्त करने की अन्य विधियों में उनके वॉल्यूम (TEM टोमोग्राफी), या उनकी दक्षता (सीरियल अनुभाग TEM) की सीमाएँ हैं। हालांकि सबसे अधिक भाग मात्रा EM तकनीक के लिए भी जटिल और महंगा करने के लिए व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं में लागू किया जा रहे हैं, साझा कोर उन्हें पेशकश सुविधाओं की संख्या बढ़ रही है और नमूना प्रकार की संख्या सफलतापूर्वक छवि तेजी से बढ़ गया है. एक विशिष्ट प्रश्न और एक विशेष ऊतक के साथ उन लोगों के लिए यह संभावना है कि किसी को सलाह और इसकी तैयारी और इमेजिंग पर निर्देश की पेशकश करने में सक्षम हो जाएगा. वॉल्यूम EM उपकरण SBF-SEM में बड़े नमूने और एफआईबी के साथ बड़ा ROIs मिलिंग की क्षमता को संभालने की क्षमता शामिल करने के लिए सुधार किया जा सकता है। सॉफ्टवेयर है जो एक और अधिक स्वचालित तरीके से ब्याज की संरचनाओं को विभाजित करने में सक्षम है काफी डेटा का विश्लेषण करने की प्रक्रिया को सरल और कंप्यूटिंग गति में सुधार ऐसा करने के लिए आवश्यक समय कम हो जाएगा. अपनी वर्तमान सीमाओं के बावजूद, मात्रा EM अभी भी एक उपयोगी उपकरण है और SBF-SEM और FIB-SEM के संयोजन दुर्लभ घटनाओं की पहचान करने और उन्हें उच्च संकल्प पर इमेजिंग के लिए एक कुशल कार्यप्रवाह प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
मात्रा EM के लिए उपकरण Flanders की सरकार से एक उदार अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी.
3View 2XP | Gatan | NA | In chamber ultramicrotome for SBFI |
Cacodylate buffer 0.2M solution | EM Sciences | 11652 | |
Conductive epoxy resin (circuit works) | RS components | 496-265 | |
Diatome Histo 4.0mm diamond knife | EM Sciences | 40-HIS | |
Digitizing tablet | Wacom | DTV-1200W | No longer available |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Flat Embedding Mold | EM Sciences | 70900 | |
Gluteraldehyde 25% solution | EM Sciences | 16220 | |
High MW Weight Tannic Acid | EM Sciences | 21700 | |
Lead Citrate | Sigma-Aldrich | 22861 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Osmium Tetroxide 4% solution | EM Sciences | 19170 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pelco Biowave Pro + | Ted Pella | 36700 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P3289 | |
Quorum Q150T ES sputter coater | Quorum Technologies | 27645 | |
Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome | NA | NA | No longer available |
Sodium Cacodylate 0.2M | EM Sciences | 11653 | |
Spurrs Resin kit | EM Sciences | 14300 | |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 |