Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Abstract

Pankreas-Islet-Hormone regulieren die Blutzucker-Homöostase. Veränderungen des Blutzuckerspiegels induzieren Schwingungen von zytosolischem Kalzium in Pankreas-Isletzellen, die die Sekretion von drei Haupthormonen auslösen: Insulin (aus den Zellen), Glucagon (Zellen) und Somatostatin (Zellen). Die Zellen, die die Mehrheit der Ischenzellen ausmachen und elektrisch miteinander gekoppelt sind, reagieren auf den Glukosereiz als eine Einheit. Die Erregbarkeit der kleineren Subpopulationen, der Zellen und der Zellen (die etwa 20 % (30 %) ausmachen und 4% (10%) der gesamten Nagetier¹ (Mensch²) Islet Zellzahlen, bzw.) ist weniger vorhersehbar und ist daher von besonderem Interesse.

Calciumsensoren werden in die periphere Zellschicht innerhalb der isolierten Islet abgegeben. Die Insel oder eine Gruppe von Inselchen wird dann immobilisiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Die Wahl des Bildgebungsmodus liegt zwischen höherem Durchsatz (Weitfeld) und besserer räumlicher Auflösung (konfokale). Konventionell wird die konfokale Laserscanning-Mikroskopie für die Abbildung von Gewebe verwendet, da sie die beste Trennung des Signals zwischen den benachbarten Zellen bietet. Ein Weitfeldsystem kann auch genutzt werden, wenn das kontaminierende Signal der dominierenden Population der Zellen minimiert wird.

Sobald die Kalziumdynamik als Reaktion auf spezifische Reize aufgezeichnet wurde, werden die Daten in numerischer Form als Fluoreszenzintensität vs. Zeit ausgedrückt, normalisiert auf die anfängliche Fluoreszenz und Baseline-korrigiert, um die Mitwirkungen der Bleiche der Fluorophor. Änderungen der Spitzenfrequenz oder des Teilbereichs unter der Kurve (pAUC) werden im Vergleich zur Zeit berechnet, um die beobachteten Effekte zu quantifizieren. pAUC ist empfindlicher und recht robuster, während die Spiking-Frequenz mehr Informationen über den Mechanismus der Kalziumerhöhung liefert.

Kleinere Zellsubpopulationen können mit funktionellen Reaktionen auf Markerverbindungen wie Adrenalin und Ghrelin identifiziert werden, die Veränderungen des zytosolischen Kalziums in einer bestimmten Population von Ischenzellen induzieren.

Introduction

Der Zweck der Methode besteht darin, Echtzeitveränderungen in der zytosolischen Kalziumkonzentration ([Ca²⁺]_cyt) in kleineren Subpopulationen von Pankreas-Isletzellen abzubilden. Dies ermöglicht die Aufdeckung der Mechanismen für die Hormonsekretion in diesen Zellen, die Offenlegung von Details über das Cross-Talk zwischen verschiedenen Zelltypen und möglicherweise die Einführung einer Populationsdimension in das gesamte Bild der Islet-Signalisierung.

Inselchen bestehen aus mehreren Zelltypen. Neben den bekannteren Insulin-Sekret-Zellen gibt es mindestens zwei Subpopulationen, die auch bei der Regulierung des Blutzuckers³von entscheidender Bedeutung sind. Zellen (die etwa 17% der Ischenzellen ausmachen) sezernieren Glucagon, wenn der Blutzuckerzufluss zu niedrig wird, was auf die Freisetzung von Glukose aus den Depots in der Leber signalisiert. Übermäßige Glucagon-Spiegel (Hyperglucagonemie) und beeinträchtigte Kontrolle der Glucagon-Freisetzung begleiten (und, technisch gesehen, kann dazu beitragen), den prädiabetischen Zustand der beeinträchtigten Insulinempfindlichkeit⁴. •-Zellen (ca. 2%) Somatostatin als Reaktion auf die Glukoseerhöhung. Dieses allgegenwärtige Peptidhormon ist wahrscheinlich in hohen Konzentrationen in der Nähe von — und -Zellen innerhalb von Inselchen vorhanden, was eine starke G i-Rezeptor-vermittelte Dämpfungswirkung sowohl auf Glucagon als auch auf Insulinsekretion hat.

Die Zellen und Zellen teilen sich einen großen Teil der Glukose-Sensing-Maschinerie mit ihren nahen Linienverwandten, den Zellen. Alle drei Zelltypen sind mit ATP-empfindlichen K^+-Kanälen ausgestattet, aufwendigen Stoffwechselsensoren^5, die das Plasmamembranpotenzial dieser erregbaren Zellen steuern. Gleichzeitig wird die Sekretion von Insulin, Somatostatin und Glucagon durch Glukose unterschiedlich reguliert. Die Abbildung der Ca^2+-Dynamik in den beiden kleineren Subpopulationen von Isletzellen kann somit einen Einblick in den Quertalk zwischen Blutzucker und islet sekretoziellen Output geben.

Frühe Versuche, die Erregbarkeit von Zellen mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie zu überwachen, folgten bald der Bildgebung von Ca²⁺ in einzelnen Zellen. Die Identität der Zellen in diesen Experimenten wurde durch eine posteriori Färbung mit Anti-Glucagon oder Anti-Somatostatin-Antikörpern überprüft. Diese Bemühungen wurden häufig durch die Feststellung behindert, dass sich Die zellissenzellen innerhalb der Islet und als einzelne Zellen sehr unterschiedlich verhalten. Obwohl die Zellen die Hauptwohltäter der Ischenanordnung zu sein scheinen (aufgrund ihrer überwältigenden Mehrheit, die ihrer starken elektrischen Kopplung zugrunde liegt), wurde die Hauptabweichung überraschenderweise in den Zellen gefunden. Innerhalb der intakten Islet werden diese Zellen ständig und dauerhaft bei niedriger Glukose aktiviert, was nur für etwa 7% der einzelnen dispergierten Zellen⁶gilt. Es wird daher angenommen, dass die Berichterstattung über die Aktivität von Zellen innerhalb intakter Inselchen eine nähere Annäherung der In-vivo-Bedingungen darstellt.

Im Allgemeinen gibt es zwei Möglichkeiten, ca^2+-Dynamik speziell aus den Subpopulationen von ‘-Zell oder -Zell zu melden: (i) Ausdrücke eines genetisch codierten Ca^2+-Sensors über einen gewebespezifischen Promotor oder (ii) unter Verwendung von Markerverbindungen. Der elegantere frühere Ansatz fügt den wesentlichen Vorteil der echten 3D-Bildgebung und damit das Studium der Zellverteilung innerhalb der Islet hinzu. Es kann jedoch nicht für intaktes menschliches Isletmaterial angewendet werden. Ein weiteres potenzielles Problem ist die “Leakiness” des Promotors, insbesondere wenn die Transdifferenzierung oder die Reaktion der Zelle auf hohe Glukose vorhanden ist. Der letztgenannte Ansatz kann mit frisch isoliertem Gewebe einschließlich menschlicher Proben oder kultivierter Inselchen verwendet werden. Die Daten werden jedoch ausschließlich aus der peripheren Schicht von Ischenzellen gewonnen, da die Bereitstellung des Farbstoffs/Markermoleküls in tieferen Schichten, ohne die Isletarchitektur zu verändern, eine Herausforderung darstellt. Ein unerwarteter Vorteil des letztgenannten Ansatzes ist die Kompatibilität mit dem Wide-Field-Imaging-Modus, der es ermöglicht, die Experimente auf die gleichzeitige Abbildung von Dutzenden oder Hunderten von Inselchen (d. h. Tausende bis Zehntausende von Zellen) zu skalieren.

Calcium wird in vivo mit genetisch kodierten GCaMP⁷ (oder pericam⁸) Familiensensoren abgebildet, die Varianten von kreisförmig permutiertem grünem Fluoreszenzprotein (GFP) sind, die mit dem Calcium-bindenden Protein-Calmodulin und seiner Zielsequenz, dem M13-Fragment der Myosin-Lichtkettenkinase^7,9, verschmolzen werden. GCaMPs haben hervorragende Signal-Rausch-Verhältnisse im Bereich der nanomolaren Ca²⁺ Konzentrationen und einen hohen 2-Photon-Querschnitt, was sie zu einer idealen Wahl für in vivo Arbeiten^{macht 10,11}. Der schwierige Aspekt des Einsatzes rekombinanter Sensoren ist ihre Abgabe in die Zellen. Die heterologe Expression erfordert die Verwendung eines viralen Vektors und eine mehrstündige Ex-vivo-Kultivierung, was häufig Bedenken hinsichtlich einer möglichen Entdifferenzierung oder Verschlechterung der Zellfunktionen aufwirft. Obwohl Mausmodelle, die bereits entwickelt wurden, um GCaMP auszudrücken, dieses Problem lösen, fügen sie neue Herausforderungen hinzu, indem sie die Vorlaufzeit erheblich erhöhen und die Arbeit auf ein nicht-menschliches Modell beschränken. Eine sehr hohe Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen des intrazellulären pH-Werts ist eine weitere nachteilige Seite der proteinbasierten Sensoren¹², was jedoch weniger ein Problem für die Erfassung oszillatorischer Signale wie Ca²⁺darstellt.

Der Vorteil von trappablen Farbstoffen (wie z.B. grüne fluoreszierende Fluo4) ist, dass sie innerhalb von etwa einer Stunde in frisch isoliertes Gewebe geladen werden können. Wie vorherzusehen ist, haben abfangbare Farbstoffe ein geringeres Signal-Rausch-Verhältnis und (viel) geringere Photostabilität als ihre rekombinanten Pendants. Wir können¹³ Berichte über die Toxizität der abfangbaren Farbstoffe¹⁴nicht bestätigen, jedoch ist eine Farbüberlastung ein häufiges Problem.

Rote rekombinante Ca^2+-Sensoren auf Basis kreisförmiger Permutation haben sich seit 2011¹⁵rasant weiterentwickelt, und die jüngsten Entwicklungen stellen einen starken Wettbewerb zu GCaMPs¹⁶ für die Gewebebildgebung dar, da das rote Licht stärker in die Tiefe eindringt. Kommerziell erhältliche rote, abfangbare Farbstoffe können zuverlässig für die einzellige Bildgebung verwendet werden, können aber auf Gewebeebene nicht gut mit den grünen Analoga konkurrieren.

Es gibt scheinbar kaum eine Auswahl an Bildgebungstechnologie für Experimente im Gewebe, bei denen unkonzentriertes Licht zu einem kritischen Problem wird. Das konfokale System bietet eine akzeptable einzelzellige Auflösung durch Annullierung des nicht fokussierten Lichts mit einem beliebigen Objektiv auf der NA über 0,3 (für den Fall von GCaMP6) oder 0,8 (trappabler Farbstoff). Im technischen Sinne kann ein herkömmliches konfokales Mikroskop zur gleichzeitigen Abbildung von [Ca²⁺]_Cyt aus Hunderten (GCaMP) oder Dutzenden von Inselchen (trappabler Farbstoff) verwendet werden. Die einzige realistische Alternative zum konfokalen Modus bei 3D-Expression des Sensors im Gewebe ist vielleicht die Lichtbogenmikroskopie.

Etwas anders sieht es bei dem Fall aus, wenn der Sensor in der peripheren Zellschicht innerhalb des Ischengewebes ausgedrückt wird. Für helle rekombinante Sensoren, die ein lebendiges intrazelluläres Expressionsmuster aufweisen, kann die Verwendung eines Breitfeld-Bildgebungsmodus mit einem Low-NA-Objektiv eine ausreichende Qualität bieten und den Forscher mit einer erheblichen Zunahme des Sichtbereichs und damit der Durchsatz. Ein Weitfeldsystem bietet eine schlechtere räumliche Auflösung, da das nicht fokussierte Licht nicht aufgehoben wird. Daher ist bildgebendes Gewebe mit hohen NA-Zielen (niedrige Schärfentiefe) weniger informativ, da das einzellige Signal durch benachbarte Zellen stark kontaminiert ist. Die Kontamination ist bei Zielen mit niedriger NA (hohe Schärfentiefe) viel kleiner.

Es gibt jedoch Aufgaben, bei denen ein hoher Durchsatz und/oder eine hohe Abtastrate zu einem entscheidenden Vorteil werden. Die Zellen weisen eine erhebliche Heterogenität auf, was eine Nachfrage nach hohen Stichprobengrößen erzeugt, um den Beitrag der Subpopulationen zu offenbaren. Die Großfeld-Bildgebung ist schnell und empfindlicher, wobei ein industrielles Großfeldsystem Hunderte (GCaMP) oder Dutzende (Fluo4) von Inselchen mit dem gleichen Signal-Rausch-Verhältnis wie die konfokalen Experimente an zehn bzw. einer einzelnen Insel abzeichnet. Dieser Unterschied im Durchsatz macht das Weitfeldsystem vorteilhaft für die populationsbildende Bildgebung mit einer Einzelzellauflösung, die besonders kritisch für kleine Subpopulationen wie die –Zell-Eins sein kann. Ebenso würden Versuche, die elektrische Aktivität von Ca²⁺ spiking¹⁷ zu rekonstruieren, von der höheren Abtastrate profitieren, die von einem Großfeld-Bildgebungsmodus bereitgestellt wird. Zur gleichen Zeit erfordern mehrere “Nischen”-Probleme wie die Aktivität von Bauchspeicheldrüsenzellen bei der Stimulation der dominierenden Subpopulation der Zelle die Verwendung eines konfokalen Systems. Ein Faktor, der die Entscheidung zum konfokalen Modus beeinflusst, ist das Vorhandensein eines erheblichen kontaminierenden Signals aus der Subpopulation der Zelle.

Obwohl die Verwendung von hormonspezifischer Antikörperfärbung zur Überprüfung der Identität der Zellen nach den bildgebenden Experimenten immer noch eine Option ist, können kleinere Zellsubpopulationen mit funktionellen Markerverbindungen wie Adrenalin und Ghrelin identifiziert werden, die nachweislich dieCa^2+-Dynamik in den Zellen¹⁹,²⁰bzw. selektiv stimulieren.

Die Analyse von Zeitraffer-Bildgebungsdaten zielt darauf ab, Informationen über die triviale Pharmakologie hinaus bereitzustellen, wie z. B. Populationsheterogenität, Korrelation und Interaktion verschiedener Signale. Üblicherweise werden bildgebende Daten als Intensität vs. Zeit analysiert und auf die anfängliche Fluoreszenz normalisiert (F/F₀). Aufgrund des Bleichens des Fluorophorsignals oder der Kontamination durch Veränderungen der Autofluoreszenz oder des pH-Wertes (typischerweise induziert durch Millimolar-Glukosespiegel¹²) ist häufig eine Basiskorrektur erforderlich. Ca²⁺ Daten können auf viele verschiedene Arten analysiert werden, aber drei Haupttrends sind, Veränderungen in der Spitzenfrequenz, der Plateaufraktion oder dem Bereich unter der Kurve zu messen, berechnet vs. Zeit. Letzterer Ansatz war von Vorteil, insbesondere bei der Anwendung von stark untersampelten konfokalen Daten. Der Vorteil der pAUC-Metrik ist ihre Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen der Signalfrequenz und Amplitude, während die Berechnung der Frequenz eine beträchtliche Anzahl von Schwingungen²¹erfordert, was mit konventioneller Bildgebung schwer zu erreichen ist. Der begrenzende Faktor der pAUC-Analyse ist seine hohe Empfindlichkeit gegenüber Basisänderungen.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit dem United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986) und den ethischen Richtlinien der Universität Oxford entwickelt. 1. Isolieren Sie Die Pankreasinseln der Maus Bereiten Sie das Kulturmedium und die Isolationslösung vor. Bilden Sie das Kulturmedium: RMPI1640 (siehe Materialtabelle), ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin. Geben Sie d…

Representative Results

Inselchen laden ziemlich gut mit den abfangbaren Farbstoffen (Abbildung 1A), es sei denn, die Lipidzusammensetzung der Membran wurde beeinflusst (z. B. durch chronische Exposition gegenüber Fettsäuren). Der menschliche Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zielt auch auf alle Isletzellen ab (Abbildung 1B). Probleme können auftreten, wenn mehr als ein rekombinanter Sensor in derselben Zelle ausgedrückt wird. Darüber hinaus sind Inse…

Discussion

Das Protokoll besteht aus drei Phasen, die für den Gesamterfolg entscheidend sind. Die erfolgreiche Injektion des Enzyms Liberase in den Gallengang bestimmt nicht nur den quantitativen Erfolg des Isolationsverfahrens, sondern beeinflusst auch die Qualität der isolierten Inselchen. Ungeblähte Pankreata kann dazu führen, dass einige wichtige metabolische Reaktionen in den isolierten Inseln fehlen. Zweitens definiert die Belastung des Farbstoffs/der Expression des Sensors das Signal-Rausch-Verhältnis der Zeitrafferaufz…

Materials

40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum	Sigma-Аldrich	F7524-500ML
Fluo4	ThermoFisher (Life Technologies)	F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector	Vector Biolabs	1910
Hanks' solution	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase	Sigma-Аldrich	5401020001
penicillin/streptomycin	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
RPMI medium	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
Zeiss LSM510-META confocal system	Carl Zeiss