Burada, pankreas adacık hücreleri gibi heterojen hücre popülasyonlarında kalsiyum dinamiğinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için bir protokol saklıyız. Floresan muhabirler adacık içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir, daha sonra hareketsiz hale getirilir ve görüntülenir ve floresan yoğunluğunun dinamiğinin hücre başına analizi yapılır.
Pankreas adacık hormonları kan şekeri homeostazı düzenler. Kan şekerindeki değişiklikler, pankreas adacık hücrelerinde sitosolik kalsiyum salınımlarına neden olur ve bu da üç ana hormonun salgısını tetikler: insülin (β-hücrelerden), glukagon (α-hücrelerden) ve somatostatin (δ-hücreler). β-Adacık hücrelerinin çoğunluğunu oluşturan ve elektriksel olarak birbiriyle birleşen hücreler, glikoz uyarıcısına tek bir varlık olarak yanıt verir. Küçük alt popülasyonların, α-hücrelerin ve δ-hücrelerinin uyarılabilirliği (%20 civarında (%30) ve %4 (%10) toplam kemirgen1 (insan2) adacık hücre numaraları, sırasıyla) daha az tahmin edilebilir ve bu nedenle özel ilgi olduğunu.
Kalsiyum sensörleri izole izalet içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir. Adacık veya bir grup adacık daha sonra hareketsiz hale getirilir ve floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenir. Görüntüleme modunun seçimi daha yüksek iş ortası (geniş alan) ve daha iyi uzamsal çözünürlük (konfokal) arasındadır. Geleneksel olarak, lazer tarama konfokal mikroskopisi görüntüleme dokusu için kullanılır, bu komşu hücreler arasında sinyal in en iyi ayrımı nı sağlar gibi. Β-hücrelerin hakim popülasyonundan gelen kirletici sinyal en aza indirgenmişse, geniş alan sistemi de kullanılabilir.
Belirli uyaranlara yanıt olarak kalsiyum dinamiği kaydedildikten sonra, veriler floresan şiddeti vs zaman olarak sayısal olarak ifade edilir, ilk floresan normalleştirilmiş ve taban çizgisi düzeltilmiş, beyazlatma ile bağlantılı etkileri kaldırmak için florofor. Eğrinin altındaki ani frekanstaki veya kısmi alandaki değişiklikler (pAUC) gözlenen etkileri ölçmek için zamana göre hesaplanır. pAUC daha duyarlı ve oldukça sağlam ise spiking frekans kalsiyum artış mekanizması hakkında daha fazla bilgi sağlar.
Küçük hücre alt popülasyonları, adacık hücrelerinin belirli popülasyonlarında sitosolik kalsiyumda değişikliklere neden olan adrenalin ve ghrelin gibi marker bileşiklerine verilen fonksiyonel yanıtlar kullanılarak tanımlanabilir.
Yöntemin amacı pankreas adacık hücrelerinin küçük alt popülasyonlarında sitosolik kalsiyum konsantrasyonundaki gerçek zamanlı değişiklikleri ([Ca2+]sit)görüntülemektir. Bu, bu hücrelerde hormon salgısını yöneten mekanizmaların ortaya çıkarılmasını, farklı hücre tipleri arasındaki çapraz konuşmanın ayrıntılarının ortaya çıkarılmasını ve potansiyel olarak adacık sinyalinin daha büyük resmine bir popülasyon boyutu getirilmesine olanak sağlar.
Adacıklar çeşitli hücre tiplerinden oluşur. Daha iyi bilinen insülin salgılayan β-hücrelerin yanı sıra, kan şekeri nin düzenlenmesinde de kritik olan en az iki alt popülasyon vardır3. α-Hücreler (adacık hücrelerinin yaklaşık% 17’sini oluşturan) kan şekeri çok düşük aldığında glukagon salgılar, karaciğerdepolarından kan dolaşımına glikoz salınımı sinyalleri. Aşırı glukagon düzeyleri (hiperglukagomi) ve glukagon salınımı eşlik bozulmuş kontrolü (ve, teknik olarak, katkıda bulunabilir) bozulmuş insülin duyarlılığı prediyabetik durum4. δ-Hücreler (%2 civarı) glikoz yüksekliğine yanıt olarak somatostatin salgılar. Bu her yerde bulunan peptit hormonu, hem glukagon hem de insülin salgılanması üzerinde güçlü birG i reseptör aracılı zayıflatıcı etkiye sahip adacıklar içinde α ve β-hücrelerin çevresinde yüksek konsantrasyonlarda mevcut olması muhtemeldir.
α-Hücreler ve δ-hücreler glikoz algılama makinelerinin büyük bir kısmını yakın soy akrabaları, β-hücreleri ile paylaşırlar. Her üç hücre tipi de ATP’ye duyarlı K+ kanalları ile donatılmıştır, bu heyecanlı hücrelerin plazma membran potansiyelini kontrol eden ayrıntılı metabolik sensörler5. Aynı zamanda, insülin salgıları, somatostatin ve glukagon glikoz tarafından farklı düzenlenir. Bu nedenle adacık hücrelerinin iki küçük alt popülasyonundaki Ca2+ dinamiğinin görüntülenmesi, kan şekeri ve adacık salgı çıkışı arasındaki çapraz konuşma hakkında bir fikir verebilir.
Yama-kıskaç elektrofizyolojisi kullanılarak α ve δ-hücrelerinin uyarılabilirliğini izleme ye yönelik ilk girişimler, kısa bir süre sonra tek α- ve δ-hücrelerde Ca2+ görüntülemesi ile takip edildi. Bu deneylerdeki hücrelerin kimliği anti-glukagon veya anti-somatostatin antikorları ile posteriori boyama yoluyla doğrulandı. Bu çabalar, adacık hücrelerinin adacık içinde ve tek hücre olarak çok farklı davrandığının bulunmasıyla sık sık engellenmiştir. Β-hücreler adacık düzenlemesinin ana bağışçıları gibi görünse de (güçlü elektriksel bağlantılarının altında yatan ezici çoğunluk nedeniyle), ana tutarsızlık şaşırtıcı bir şekilde α-hücrelerde bulunmasıydı. Bozulmamış adacık içinde, bu hücreler sürekli ve sürekli düşük glikoz, sadece tek dağılmış α-hücrelerin yaklaşık% 7 için geçerlidir aktive6. Bu nedenle, bozulmamış adacıklar içindeki α ve δ-hücrelerinin aktivitesinin raporlanması, in vivo koşulların daha yakın bir yakını olduğuna inanılmaktadır.
Genel olarak, ca2+ dinamiklerini özellikle α-hücre veya δ-hücre alt popülasyonlarından bildirmenin iki yolu vardır: (i) dokuya özgü bir promotör veya (ii) marker bileşikleri kullanarak genetik olarak kodlanmış bir Ca2+ sensörünü ifade etmek. Daha zarif eski yaklaşım gerçek 3D görüntüleme önemli avantajı ekler ve dolayısıyla adacık içinde hücre dağılımı nın incelenmesi. Ancak bozulmamış insan adacık malzemesi için uygulanamaz. Bir diğer potansiyel endişe, özellikle β-/α-hücre transdifferentiasyonu veya yüksek glikoza α-hücre yanıtı yerinde olduğunda, organizatörün ‘sızıntı’sidir. İkinci yaklaşım insan örnekleri veya kültürlü adacıklar da dahil olmak üzere taze izole doku ile kullanılabilir. Ancak veriler sadece adacık hücrelerinin çevresel katmanından toplanır, çünkü boya/marker molekülünün adacık mimarisini değiştirmeden daha derin katmanlarda teslim edilmesi zordur. İkinci yaklaşımın beklenmeyen bir avantajı, deneylerin onlarca veya yüzlerce adacık (yani binlerce ila on binlerce hücre) eşzamanlı olarak görüntülenmesiiçin ölçeklenmesine olanak tanıyan geniş alan görüntüleme moduyla uyumluluktır.
Kalsiyum, genetik olarak kodlanmış GCaMP7 (veya pericam8)aile sensörleri kullanılarak, kalsiyum bağlayıcı protein calmodulin ve hedef dizisi, miyozin ışık zinciri kimyaz7M13parçası na bağlı dairesel olarak permuted yeşil floresan protein (GFP) varyantları olan canlı olarak görüntülenmiştir 7 ,9. GCaMPs nanomolar Ca2 + konsantrasyonları ve yüksek 2-foton kesit aralığında mükemmel sinyal-gürültü oranları var, hangi onları in vivo iş için ideal bir seçim yapar10,11. Rekombinant sensörler kullanmanın zor yönü hücrelere ulaştırılmasıdır. Heterolog ifade, sık sık hücre fonksiyonlarının potansiyel de-farklılaşması veya bozulması ile ilgili endişeleri yükseltir bir viral vektör ve çok saatlik ex vivo culturing kullanarak gerektirir. GCaMP’nin bu sorunu gidermek üzere önceden tasarlanmış fare modelleri bu sorunu gidermesine rağmen, müşteri adayı süresini önemli ölçüde artırarak ve çalışmayı insan olmayan bir modelle sınırlandırarak yeni zorluklar eklerler. Hücre içi pH değişikliklerine karşı çok yüksek duyarlılık protein bazlı sensörlerin başka bir olumsuztarafıdır 12, ancak, ca2gibi salınım sinyalleri algılama için bir sorun daha az.
Trappable boyalar avantajı (yeşil floresan Fluo4 gibi) onlar yaklaşık bir saat içinde taze izole doku içine yüklenebilir olmasıdır. Tahmin edilebileceği gibi, bısılabilir boyalar, rekombinant karşılıklarına göre daha düşük sinyal-gürültü oranlarına ve (çok) daha düşük fotostabiliteye sahiptir. Biz tuzak boyalar14toksisite13 raporları teyit edemez, ancak, boya aşırı yükleme sık sık bir sorundur.
Dairesel permütasyona dayalı kırmızı rekombinant Ca2+ sensörleri 201115’tenberi hızla gelişmektedir ve en son gelişmeler, kırmızı ışığın daha yüksek penetrasyon derinliği göz önüne alındığında, doku görüntülemesi için16 GCaMPs için güçlü bir rekabet sunar. Ticari olarak mevcut kırmızı trappable boyalar tek hücreli görüntüleme için güvenilir bir şekilde kullanılabilir ancak doku düzeyinde, yeşil analogları ile iyi rekabet edemez.
Odak dışı ışığın kritik bir sorun haline geldiği doku deneyleri için görüntüleme teknolojisinin çok az bir seçenek olduğu ortaya çıkmaktadır. Konfokal sistem, 0,3 (GCaMP6 durumunda) veya 0,8 (trappable boya) üzerinde NA herhangi bir hedef ile odak dışı ışık iptali ile kabul edilebilir tek hücreçözünürlüğü sağlar. Teknik anlamda, geleneksel bir konfokal mikroskop yüzlerce [Ca2 +]cyt eşzamanlı görüntüleme için kullanılabilir (GCaMP) veya adacıklar onlarca (trappable boya). Dokuda sensörün 3Boyutlu ekspresyonu durumunda konfokal modiçin tek gerçekçi alternatif belki de Hafif sac mikroskopidir.
Sensör adacık dokusu içindeki hücrelerin periferik tabakasında ifade edildiğinde durum için işler biraz farklıdır. Canlı hücre içi ifade deseni olan parlak rekombinant sensörler için, düşük NA hedefine sahip geniş alan görüntüleme modu kullanmak yeterli kaliteyi sağlayabilir ve araştırmacıyı görüş alanında önemli bir artışla ödüllendirebilir ve dolayısıyla Verim. Geniş alan lı bir sistem, odak dışı ışık iptal edilmedikçe daha zayıf uzamsal çözünürlük sağlar; bu nedenle, yüksek NA (alan derinliği düşük) hedefleri ile görüntüleme doku daha az bilgilendirici, tek hücreli sinyal büyük ölçüde komşu hücreler tarafından kontamine olduğu gibi. Kontaminasyon düşük NA (yüksek alan derinliği) hedefleri için çok daha küçüktür.
Ancak, yüksek iş ve/veya örnekleme oranının kritik bir avantaj haline geldiği görevler vardır. α- ve δ-hücreler önemli heterojenlik sergilerler, bu da alt popülasyonların katkısını ortaya çıkarmak için yüksek örneklem boyutlarına talep oluşturur. Geniş alan görüntüleme, sırasıyla on veya tek bir adacık üzerinde konfokal deneylerle aynı sinyal-gürültü oranıyla yüzlerce (GCaMP) veya onlarca (Fluo4) adacıkları görüntüleme, endüstriyel ölçekli geniş görüş alanı sistemi ile hızlı ve daha duyarlıdır. Elde edilen bu fark, geniş alan sistemini tek hücreçözünürlüğü ile popülasyonsal görüntüleme için avantajlı hale getirir ve bu da δ-hücre gibi küçük alt popülasyonlar için özellikle kritik olabilir. Aynı şekilde, Ca2+ spiking17’den gelen elektriksel aktiviteyi yeniden yapılandırma girişimleri, geniş alan görüntüleme modunun sağladığı daha yüksek örnekleme hızından yararlanacaktır. Aynı zamanda, hakim β-hücre alt popülasyonunun uyarılması üzerine pankreas α-hücrelerinin aktivitesi gibi çeşitli “niş” sorunlar, bir konfokal sistem kullanımını gerektirir. Konfokal mod doğru karar etkileyen bir faktör β-hücre alt popülasyonundan önemli kirletici sinyal varlığıdır.
Görüntüleme deneylerinden sonra hücrelerin kimliğini doğrulamak için hormona özgü antikor boyama kullanımı hala bir seçenek olmasına rağmen, küçük hücre alt popülasyonları α-18 ve δ-hücreleri19,20, sırasıyla Ca2 + dinamikleri seçici uyarmak için gösterilmiştir adrenalin ve ghrelin gibi fonksiyonel marker bileşikleri kullanılarak tespit edilebilir.
Zaman atlamalı görüntüleme verilerinin analizi, popülasyonal heterojenite, korelasyon ve farklı sinyallerin etkileşimi gibi önemsiz farmakolojinin ötesinde bilgi sağlamayı amaçlamaktadır. Geleneksel olarak, görüntüleme verileri zamana göre yoğunluk olarak analiz edilir ve ilk floresansa normalleşir (F/F0). Florofor sinyalinin beyazlatma veya otofloresan veya pH’daki değişikliklerle kontaminasyon nedeniyle (genellikle milimolar glikoz düzeyleri tarafından indüklenen12)bazal düzeltmeye sık lıkla ihtiyaç vardır. Ca2+ verileri birçok farklı şekilde analiz edilebilir, ancak üç ana eğilim, zamana göre hesaplanan başak frekansı, plato fraksiyonu veya eğrinin altındaki alandaki değişiklikleri ölçmektir. İkinci yaklaşımı, özellikle de yoğun olarak örneklenmiş konfokal verilere uygulamada avantajlı bulduk. pAUC ölçümünün avantajı sinyal frekansı ve genlikteki her iki değişikliğe karşı hassasiyetidir, oysa frekansı hesaplamak önemli sayıda salınım gerektirir21, geleneksel görüntüleme kullanarak elde edilmesi zor. pAUC analizinin sınırlayıcı faktörü temel değişikliklere karşı yüksek duyarlılığıdır.
Protokolün genel başarı için kritik olan üç aşaması vardır. Liberase enziminin safra kanalına başarılı bir şekilde enjekte edilmesi sadece izolasyon işleminin kantitatif başarısını değil, aynı zamanda izole adacıkların kalitesini de etkiler. Uninflated pankreata izole adacıklarda bazı önemli metabolik yanıtların eksikliğine neden olabilir. İkinci olarak, boyanın/sensörün ifadesinin yüklenmesi, zaman atlamalı kaydın sinyal-gürültü oranını tanımlar. Sinyaller aşırı yüklü adac?…
The authors have nothing to disclose.
AH Diabetes UK Doktora Öğrenciliği’ne katıldı, EV OXION-Wellcome Trust Eğitim Programı tarafından desteklendi, AIT Oxford Biyomedikal Araştırma Konseyi doktora sonrası burs düzenledi.
40x/1.3 objective | |||
Axiovert 200 microscope | |||
emission | |||
Excitation | |||
Fetal bovine serum | Sigma-Аldrich | F7524-500ML | |
Fluo4 | ThermoFisher (Life Technologies) | F14201 | |
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
Hanks' solution | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | ||
Liberase | Sigma-Аldrich | 5401020001 | |
penicillin/streptomycin | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
RPMI medium | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |