Summary
هنا، ونحن نصف الجمعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني (بول الثاني) المجمعات استطالة تتطلب فقط الحمض النووي الاصطناعية قصيرة وoligonucleotides الحمض النووي الريبي وتنقية بول الثاني. وهذه المجمعات مفيدة لدراسة الآليات التي تقوم عليها المعالجة المشتركة للنسخ من النصوص المرتبطة بمجمع استطالة بولس الثاني.
Abstract
Eukaryotic mRNA التوليف هو عملية كيميائية حيوية معقدة تتطلب نسخ من قالب الحمض النووي الريبي في الحمض النووي الريبي السلائف من قبل متعددة subunit إنزيم RNA بولميراز الثاني وco-transcriptional السد والربط من الحمض النووي الريبي السلائف لتشكيل mRNA ناضجة. أثناء توليف mRNA، فإن مجمع استطالة الميرنا ً الثاني هو هدف للتنظيم من خلال مجموعة كبيرة من عوامل النسخ التي تتحكم في نشاطه الحفاز، فضلاً عن الأنزيمات المتوجة، والربط، و3'-المعالجة التي تخلق الميرنا الناضجة. وبسبب التعقيد المتأصل في توليف الحمض النووي الريبي، فإن النظم التجريبية الأبسط التي تمكن من العزلة والتحقيق في مختلف مراحلها النسخية المشتركة لها فائدة كبيرة.
في هذه المقالة، ونحن نصف واحد من هذا النظام التجريبي بسيطة مناسبة للتحقيق في تغطية RNA النسخ المشترك. يعتمد هذا النظام على مركبات استطالة RNA Polymerase II المحددة التي تم تجميعها من البلمرة النقية وفقاعات النسخ الاصطناعية. عندما شلت عن طريق الحمض النووي biotinylated، هذه المجمعات الانياطي الحمض النووي الريبي الثاني توفر أداة يمكن المناوية بسهولة لتشريح الحمض النووي الريبي النسخي المشترك السد والآليات التي المجندين مجمع استطالة وينظم الانزيم السد خلال [ك-كّوأيشنل] [رنا] يغطّي. ونحن نتوقع أن يتم تكييف هذا النظام لدراسة التوظيف و / أو تجميع البروتينات أو مجمعات البروتين مع أدوار في مراحل أخرى من نضج mRNA إلى جانب مجمع استطالة الحمض النووي الريبي الثاني.
Introduction
Eukaryotic رسول RNA (mRNA) التوليف هو عملية كيميائية حيوية معقدة التي تنطوي على توليف الحمض النووي الريبي السلائف غير المجهزة من قبل الحمض النووي الريبي البليمرالثاني وتجهيز الحمض النووي الريبي السلائف لإنتاج mRNA ناضجة. يتم تنفيذ خطوات معالجة RNA من السد، الربط، وpolyadenyly إلى حد كبير co-transcriptionally. يعمل مجمع استطالة Pol II كسقالة تقوم بتجنيد وتنسيق أنشطة العديد من إنزيمات معالجة الحمض النووي الريبي. وبالتالي، فإن فهمنا النهائي لكيفية توليد mRNAs eukaryotic ناضجة سوف تعتمد بشكل كبير على تطوير النظم التجريبية للسماح تشريح الآليات البيوكيميائية الكامنة وراء التوظيف في مجمع استطالة و تنظيم الإنزيمات المسؤولة عن الجمع بين النسخ، الربط، وpolyadenylation.
وليس من المستغرب أن يكون تطوير هذه النظم التجريبية صعبا. وكان أحد العوائق الرئيسية هو التعقيد الملحوظ للنسخ السياسي الثاني نفسه حيث يتطلب ببساطة إعادة تشكيل النسخ القاعدي من قبل بولس الثاني في المختبر مجموعة دنيا من خمسة عوامل بدء النسخ العامة: TFIIB، TFIID، TFIIE، TFIIF، وTFIIH 1- وعلاوة على ذلك، فإن إعادة تشكيل أي نوع من النسخ الخاضع للتنظيم في المختبر يتطلب مجموعة أكبر من عوامل النسخ والجهات التنظيمية المشتركة. وهكذا، كان أحد الأهداف الرئيسية هو تطوير نظم تجريبية أبسط تسمح بإعادة تشكيل مجمعات استطالة Pol II النشطة المناسبة للتحقيقات في الاقتران الوظيفي للنسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي.
وقد ثبت أن إحدى هذه الطرق الأبسط لإعادة تشكيل مجمعات استطالة Pol II النشطة مفيدة للدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية للفترة التي تمد فيها Pol II، وفي الآونة الأخيرة، للتحقيق في معالجة الحمض النووي الريبي النسخي المشترك2و3 ،4،5. في هذه المقالة، نبين كيف يمكن استخدام مجمعات استطالة Pol II المعدة من الفقاعات المنقّدة من Pol II والنسخ الاصطناعية بشكل فعال للتحقيق في الآليات الكامنة وراء وضع حد أقصى للنسخ المشترك لنصوص بولس الثانية الوليدة.
يشير الحد الأقصى إلى إضافة "غطاء" 5'-guanosine إلى نهاية 5'-ثلاثي الفوسفات من النصوص الوليدة Pol II. الحد الأقصى مهم للخطوات اللاحقة من النضج mRNA، والنقل، والترجمة، وغيرها من العمليات6،7. يتم إضافة الغطاء بشكل مشترك إلى نسخ بول الثاني بواسطة إنزيم يشار إليه باسم إنزيم السد. في خلايا الثدييات ، يتم احتواء المواقع النشطة المسؤولة عن أنشطة RNA 5'-triphosphatase وguanylyl transferase من إنزيم السد داخل ببتيد واحد8. يتم تجنيد إنزيم السد إلى مجمع استطالة بول الثاني من خلال التفاعلات مع الأسطح التي لم يتم تعريفها بعد على الجسم بول الثاني والمجال Rpb1 كاربوكسي المحطة الطرفية (CTD) فوسفوريلاتيد على Ser5 من البعيبتيدات5. في مجمع استطالة، يحفز إنزيم السد إضافة غطاء 5'-guanosine بمجرد أن يصل النص الوليد إلى طول لا يقل عن 18 نيوكليوتيدات وخرج من قناة خروج الحمض النووي الريبي البوليمر. في الخطوة الأولى من رد الفعل السد، وtriphosphatase تحلل الحمض النووي الريبي 5'-ثلاثي الفوسفات لإنتاج 5'-ثنائي الفوسفات. في الخطوة الثانية، يتم تحلل GTP إلى GMP بواسطة transferase guanylyl، وتشكيل إنزيم GMP-السد المتوسطة. وأخيراً، ينقل guanylyl transferase GMP إلى نهاية 5'-ثنائي الفوسفات من النص الوليد لإنتاج الغطاء.
وهناك سمة ملحوظة من رد الفعل متوجا هو أن تغطية النسخ المشترك (أي، وضع حد أقصى للنصوص المرتبطة بمجمعات استطالة Pol II الوظيفية) هو أكثر كفاءة بكثير من الحد الأقصى من RNAالحرة 5،9. وهكذا، كان السؤال الرئيسي في هذا المجال كيف يتم تحقيق هذا التنشيط الدرامي للتغطية من خلال تفاعلات إنزيم السد مع مجمع استطالة Pol II. في هذا البروتوكول نصف التجمع من المجمعات الاتطالية RNA الثاني النشط باستخدام فقط تنقية RNA بولميراز الثاني وفقاعات النسخ الاصطناعي. تسمح هذه الطرق بإنشاء مجمعات استطالة RNA polymerase II مع نصوص ذات طول وتسلسل محددين. في دراسة حديثة، استخدمنا هذه المجمعات الميرليمرة الثانية تعريف الحمض النووي الريبي كنموذج للتحقيق في جوانب آليات RNA متوجا5. وعلى وجه الخصوص، أظهرنا أن '1' الحد الأقصى لRNA المرتبط بهذه المجمعات الاستطالة كان أكثر من 100 أضعاف أكثر كفاءة من الحد الأقصى للRNA الحرة و '2' تم تحفيزه من قبل الفسفور المعتمد على TFIIH من CTD Pol II. ويمكن من حيث المبدأ تكييف النهج الموصوف هنا لتوليد ركائز لدراسة ردود الفعل الأخرى لمعالجة الحمض النووي الريبي المشترك المرتبطة بمجمع استطالة Pol II.
في القسم 1 من هذا البروتوكول، يتم إنشاء مجمعات استطالة اصطناعية عن طريق صلب قالب اصطناعي حبلا الحمض النووي oligonucleotide إلى oligonucleotide RNA التي هي مكملة في 3'-نهاية إلى ما يقرب من 9 النيوكليوتيدات من الحمض النووي حبلا قالب. ثم يتم تحميل Pol II على الحمض النووي: RNA دوبلكس. ثم يتم الانتهاء من مجمع استطالة بإضافة تكميلية جزئيا، غير قالب حبلا الحمض النووي oligonucleotide التي وصفت مع البيوتين في 3'-نهاية (الشكل1 والشكل 2A). يتم توسيع oligonucleotide RNA من قبل بول الثاني في هذه المجمعات استطالة لجعل النصوص ذات العلامات الراديوية من طول محدد وتسلسل على إضافة تركيبات مناسبة من النيوكليوتيدات ذات العلامات الراديوية. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام مزيج من الإذاج لإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة وإضافة أخرى من تركيبات مختلفة من النيوكليوتيدات، يمكن للمرء أن "يمشي" Pol II إلى مواقف مختلفة على طول قالب الحمض النووي وتوليف الحمض النووي الريبي من أطوال محددة. ثم يتم تنقية الحمض النووي الريبي وإخضاعه للكتروفوريس في المواد الهلامية اليوريا PAGE denaturing. في القسم 2 من البروتوكول، يتم استخدام مجمعات استطالة اصطناعية لتحليل تغطية الحمض النووي الريبي النسخي المشترك. وقدم المثال تدابير تأثير الفسفورية المعتمدة على TFIIH من CTD Pol II على الرنا النسخي المشترك السد. في هذه التجربة، نقوم بقياس مدى الكبة النسخية المشتركة كدالة لتركيز إنزيم السد (5 و15 و45 نانوغرام لكل رد فعل) والوقت (1 و2 و4 دقيقة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الجمعية من مجمعات استطالة الاصطناعية وبولس الثاني المشي
- تعطيل 1 نمول من القلة الحمض النووي غير قالب تحتوي على جزيء البيوتين 3 'على الخرز المغناطيسي.
ملاحظة: يمكن إجراء الخطوات التالية مسبقاً للتحضير للتجارب المستقبلية. وترد في الجدول 1جميع تسلسلات القلة المستخدمة في هذا البروتوكول. يتم تصنيع oligos RNA مع تعديلات 5'-ثلاثي الفوسفات.- إضافة 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي (10 ملغ / مل) إلى أنبوب منخفض البروتين 1.5 مل، ثم وضع على رف مغناطيسي لمدة 2 دقيقة.
- في حين أن الأنبوب على الرف المغناطيسي، وإزالة السائل من الأنبوب دون إزعاج الخرز. لغسل الخرز، وإزالة الأنبوب من الرف، إضافة 1 مل من 5 mM تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 0.5 mM EDTA، 1 M NaCl، والعودة الأنبوب إلى الرف، وإزالة محلول الغسيل بعد 2 دقيقة.
- كرر الإذابة مرتين إضافيتين باستخدام 200 ميكرولتر لنفس المخزن المؤقت.
- إعادة تعليق الخرز المغناطيسي في 400 درجة مئوية من 10 MM تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 1 MM EDTA، 2 M NaCl، العازلة. ثم مزيج مع 380 درجة مئوية من H2O و 20 درجة مئوية من 10 μM غير قالب biotinylated الحمض النووي oligo. وضع الأنبوب على nutator وحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل غير قالب الحمض النووي oligo 3 مرات مع 200 ميكرولتر من 5 MM تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 7.5، 0.5 mM EDTA، 1 M NaCl، ثم 3 مرات مع 200 ميكرولتر من 20 مل HEPES-NaOH PH 7.9، 20٪ الجلسرين، 100 مل كيلوكلة، 1 mM EDTA، 0.5 ملغ / مل ألبوم مصل البقر.
- ترك أنبوب بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لإنهاء حجب الخرز مع BSA.
- في اليوم التالي، وضع الأنبوب في الرف المغناطيسي، وإزالة وتجاهل السائل، وإعادة تعليق الخرز في 200 ميكرولتر من 20 م همه-هيدروكسيد الصوديوم pH 7.9، 20٪ الجلسرين، 100 مل ككل، 1 MM EDTA، 0.5 ملغ / مل الزلال المصل البقري ونقل إلى أنبوب جديد. بالنسبة لقالب الحمض النووي هذا، التركيز النهائي هو حوالي 5 ميكرومتر.
ملاحظة: وقت الحضانة وتركيز القلة تحتاج إلى تحديد تجريبي لكل oligo الحمض النووي biotinylated. يجب أن يوفر هذا القالب ما يكفي لـ 200 رد فعل، ويستمر لمدة 6 أشهر على الأقل عند تخزينها عند 4 درجة مئوية.
- الحمض النووي الريبي الصلب والحمض النووي قالب حبلا oligonucleotide oligos في نسبة الأضراس 2:1 (20 و 10 pmol، على التوالي) للحصول على الحمض النووي: RNA دوبلكس.
- إعداد مزيج صلب 10 ميكرولتر كما هو موضح في الجدول 2.
ملاحظة: 10 ميكرولتر من مزيج الصلب كافية ل10 ردود الفعل. ويمكن توسيع نطاق مزيج الصلب حسب الحاجة إذا كان من المقرر إجراء المزيد من الاختبارات. - أداء ردود الفعل الصلب في دورة الحرارية باستخدام البرنامج التالي: 5 دقيقة في 45 درجة مئوية، تليها 12 دورات من 2 دقيقة لكل منهما، بدءا من 43 درجة مئوية وخفض درجة الحرارة 2 درجة مئوية لكل دورة. الخمول عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه نقطة زمنية مرنة. يتم الانتهاء من الصلب في غضون ~ 30 دقيقة ولكن يمكن أن تترك في 4 درجة مئوية لفترة أطول. في المختبر، وقد تركت مخاليط الصلب الجلوس لمدة تصل إلى 4 ساعة دون ملاحظة أي انخفاض في كفاءة رد الفعل. - أثناء صلب الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي حبلا قالب، وإعداد المخازن المؤقتة للخطوات اللاحقة من البروتوكول. يتم سرد المكونات المطلوبة لإعداد كل مخزن مؤقت لرد فعل واحد مع كل مخزن مؤقت في الجداول من 2 إلى 8. قم بتوسيع نطاق الوصفات بعامل [Y(X+1) + 1] لـ Wash و (X+1) لكافة المخازن المؤقتة الأخرى. X = عدد ردود الفعل التي يتعين إعدادها؛ Y = عدد خطوات الغسيل المطلوبة (الحد الأدنى 3).
ملاحظة: تحضير كافة المخازن المؤقتة طازجة في يوم التجربة. لا تضع أنابيب على الجليد بعد إضافة PVA إلى المخازن المؤقتة. إضافة Pol II أو النيوكليوتيدات إلى المخازن المؤقتة مباشرة قبل استخدام.
- إعداد مزيج صلب 10 ميكرولتر كما هو موضح في الجدول 2.
- تحميل تنقية RNA بولميراز الثاني على الحمض النووي: RNA الهجين.
- مزيج 1 pmol (1 μL) من الحمض النووي: RNA دوبلكس مع 13 ميكرولتر من المنطقة العازلة Pol II (من الجدول3).
- إضافة ~ 0.02 وحدة من الحمض النووي الريبي النقي بول الثاني (1 درجة مئوية) إلى الخليط من الخطوة 1.3.1 ومزيج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا والتحريك مع طرف pipet، دون إدخال فقاعات. حضانة لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية.
ملاحظة: حجوم يعطى من هنا فوق لواحدة ردّ فعل; توسيع نطاق حسب الحاجة لعدد ردود الفعل في التجربة. الحمض النووي الريبي Pol II تنقية من كبد الفئران كما هو موضح10 يستخدم في هذا المثال; ومع ذلك، RNA Pol II تنقية من مصادر أخرى، بمافي ذلك الخلايا الثدييات المستزرعة أو الخميرة يمكن أيضا أن تستخدم 3،4،5،11،12،13.
- إكمال مجمع استطالة عن طريق إضافة الحمض النووي غير قالب biotinylated.
- إضافة 5 pmol (1 μL) من القلة الحمض النووي غير القالب المعطلة إلى 14 μL من المخزن المؤقت للحمض النووي غير القالب (من الجدول4)، إضافة إلى أنبوب من الخطوة 1.3.2، وحضانة لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- ضع العينة في رف مغناطيسي لمدة دقيقتين.
- توليد مجمعات استطالة تحتوي على RNA 23mers المسمى لاسلكيا.
- قم بإجراء جميع الاحتضانات الأخرى عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. إضافة 1 ميكرولتر من 15 ميكرومتر ATP و 10 μCi (1 μL) من [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol) إلى 23 ميكرولتر من النبض العازلة واستخدام هذا لإعادة تعليق الخرز المغناطيسي المغسول.
تحذير: المواد المشعة خطرة. تأكد من ارتداء معدات الحماية المناسبة واتباع جميع المبادئ التوجيهية للمختبر للاستخدام الآمن للمواد المشعة والتخلص منها.
ملاحظة: استبدال UTP المسمى لاسلكيا مع 15 μM UTP عندما لا تكون هناك حاجة إلى RNA ذات العلامات الراديوية، مثل تجارب اللطخة الغربية. - احتضان رد الفعل لمدة 10 دقيقة للسماح بتوليف 23mers المسمى لاسلكيا.
- إضافة 1.5 ميكرولتر من الحل الذي يحتوي على 100 ميكرومتر ATP و 100 م UTP مزيج إلى 3.5 ميكرولتر من العازلة مطاردة، إضافة إلى أنبوب يحتوي على مجمعات استطالة تجميعها مسبقا، وحضانة لمدة 5 دقائق لمطاردة جميع النصوص الوليدة في 23mers.
- ضع العينة في رف مغناطيسي لمدة دقيقتين، وإزالة supernatant، وغسل مرة واحدة مع 30 ميكرولتر من العازلة غسل لإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة، وإعادة تعليق في 30 درجة مئوية من العازلة غسل.
- إما إضافة 94 ميكرولتر من مزيج التوقف معبروتيناز K والجليكوجين (الجدول 9) لإنهاء ردود الفعل أو المضي قدما إلى القسم 1.6 لتوليد مجمعات استطالة مع نصوص أطول أو القسم 2 لأداء الاختبارات متوجا.
- قم بإجراء جميع الاحتضانات الأخرى عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. إضافة 1 ميكرولتر من 15 ميكرومتر ATP و 10 μCi (1 μL) من [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol) إلى 23 ميكرولتر من النبض العازلة واستخدام هذا لإعادة تعليق الخرز المغناطيسي المغسول.
- (اختياري) المشي بول الثاني لجعل 23، 25، و 29 النصوص النيوكليوتيد
- اتبع الإجراء الموضح في الخطوات 1-2-1 إلى 1-5-4 لإعداد مجمعات استطالة تحتوي على 23 مركبة تحمل علامة راديوية. توسيع نطاق 4 أضعاف لتوليد 120 درجة مئوية من المجمعات استطالة غسلها، وهو ما يكفي من المجمعات ل4 ردود الفعل.
- تسمية 3 أنابيب جديدة "23mer"، "25mer" و "29mer". نقل 30 درجة مئوية من المجمعات استطالة غسلها إلى أنبوب "23mer" وإضافة 94 درجة مئوية من مزيج التوقف مع proteinase K والجليكوجين.
- وضع الأنبوب الذي يحتوي على 90 ميكرولتر المتبقية من المجمعات استطالة غسلها في الرف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة، وإزالة supernatant، وإعادة تعليق الخرز في 90 ميكرولتر من BTB تستكمل مع 1.2 ميكرولتر كل من ATP 1.5 mM و 1.5 mM CTP. حضانة لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية.
- بعد غسل مرة واحدة مع 90 درجة مئوية من العازلة غسل وإعادة تعليق في 90 درجة مئوية من العازلة غسل كما هو موضح في الخطوة 1.5.4، نقل 30 ميكرولتر من المجمعات استطالة إلى أنبوب "25mer" وإضافة 94 ميكرولتر من وقف مزيج مع بروتيناز K والجليكوجين.
- وضع الأنبوب الذي يحتوي على 60 ميكرولتر المتبقية من المجمعات استطالة في الرف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة، وإزالة supernatant، وإعادة تعليق الخرز في 60 ميكرولتر من BTB تستكمل مع 0.8 ميكرولتر كل من ATP 1.5 mM و 1.5 mM CTP.
- الحضانة لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية، وغسل مرة واحدة مع 60 درجة مئوية من العازلة غسل كما هو الحال في القسم 1.5.5، وإعادة تعليق في 60 درجة مئوية من العازلة غسل.
- نقل 30 ميكرولتر من عينة 2X إلى أنبوب "29mer" وإما إضافة 94 ميكرولتر من مزيج التوقف مع proteinase K والجليكوجين أو المضي قدما إلى القسم 2 لإجراء الاختبارات السد.
- انتقل إلى تنقية وتحليل الحمض النووي الريبي (القسم 3).
2. استخدام مجمعات استطالة الاصطناعية لAssay Cotranscriptional السد
- توليد مجمعات استطالة مغسولة تحتوي على 23 مركبة عن طريق رفع مستوى الإجراء الموضح في الخطوات 1.2.1 إلى 1.5.5 13 أضعاف. هذا يكفي ل12 ردود الفعل + 1 اضافية.
-
بول II CTD الفسفور
- وضع أنبوب يحتوي على مجمعات استطالة غسلها في الرف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة، وإزالة supernatant، وإعادة تعليق الخرز في 377 ميكرولتر من BTB تستكمل مع 13 ميكرولتر من ATP 1.5 mM.
- إعداد اثنين من أنابيب جديدة، المسمى +H و -H، على التوالي. إلى أنبوب المسمى + H إضافة 3 ميكرولتر من ~ 300 نانوغرام / ميكرولتر TFIIH، وإلى أنبوب المسمى -H إضافة 9 ميكرولتر من 20 م همه-هيدروكسيد الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.9، 20٪ الجلسرين، 100 مل ككل، 1 mM EDTA، 0.5 ملغ / مل المصل البقري الألبومين.
ملاحظة: نحن عادة ما نستخدم TFIIH تنقية من كبد الفئران، ولكن حصلنا على نتائج مماثلة باستخدام ~ 0.6 ميكروغرام / رد فعل من Cdk7 / Cyclin H / MAT1 المتاحة تجاريا (CAK، وهو وحدة كيناز من TFIIH). انظر جدول المواد للحصول على معلومات. - إضافة 87 درجة مئوية من مجمعات استطالة غسلها من الخطوة 2.2.1 إلى أنبوب المسمى +H و 270 درجة مئوية من مجمعات استطالة غسلها إلى الأنبوب المسمى -H. الحضانة 10 دقيقة في 30 درجة مئوية.
- وضع عينة في رف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. لإزالة النيوكليوتيدات الزائدة والبروتين غير المنضم، اغسل مجمعات استطالة في +H و -H مع تفاعلات 90 أو 270 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت، على التوالي.
-
RNA السد
- إعادة تعليق مجمعات استطالة في أنبوب المسمى +H في 87 ميكرولتر من مزيج السد (BTB تستكمل مع 50 μM GTP (الجدول10). إعادة تعليق المجمعات استطالة في أنبوب المسمى -H في 261 درجة مئوية من مزيج السد.
- إعداد 4 أنابيب جديدة المسمى 5 نانوغرام CE + H، 5 نانوغرام م، 15 نانوغرام م، 45 نانوغرام م. تمييع الانزيم السد (CE) إلى 20 m HEPES-NaOH درجة الحموضة 7.9، 20٪ الجلسرين، 100 مل ككل، 1 MM EDTA، 0.5 ملغ / مل الزلال المصل البقري لإعداد الحلول التي تحتوي على 5 نانوغرام CE / ميكرول، 15 نانوغرام CE / ميكرولتر، أو 45 نانوغرام CE / μL والاستغناء عن 3 ميكرولتر من الحل المناسب في كل من الأنابيب 4.
- إعداد 12 أنابيب جديدة مع 94 درجة مئوية من العازلة وقف (2.1.1) تضاف إلى كل.
- بدء كل رد فعل متوجا عن طريق إضافة 87 درجة مئوية من مجمع استطالة تعامل مع TFIIH أو لا إلى أنابيب المسمى التي تحتوي على إنزيم السد. حضانة في 30 درجة مئوية في كتلة الحرارة.
- بعد 1، 2، أو 4 دقائق، وقف ردود الفعل عن طريق نقل 30 درجة مئوية من كل خليط التفاعل إلى أنابيب تحتوي على 94 ميكرولتر من وقف العازلة. تنقية وتحليل منتجات رد الفعل كما هو موضح في القسم 3.
3. رنا رنا وتطهيرها
- تنقية الحمض النووي الريبي
- احتضان منتجات رد الفعل في وقف العازلة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: التوقف عن الإيقاف. تم الاحتفاظ بالعينات في هذا المخزن المؤقت لمدة تصل إلى 4 ساعة دون فقدان أو تدهور الحمض النووي الريبي. - استخراج مرة واحدة مع 124 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول isoamyl (25:24: 1) ومرة واحدة مع الكلوروفورم: كحول isoamyl (24: 1).
تحذير: الفينول سام للغاية ويتم امتصاصه بسرعة من قبل الجلد. ارتداء معدات الحماية المناسبة.
ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من استعادة الحمض النووي الريبي أثناء الاستخراج، استخدم الأنابيب المتاحة تجارياً التي تحتوي على هلام عالي الكثافة، والذي يشكل حاجزاً مستقراً بين المراحل المائية والعضوية. انظر المناقشة وجدول المواد. - نقل المرحلة المائية (الطبقة العليا) إلى أنابيب جديدة تحتوي على 12.4 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم درجة الحموضة 5.2.
- احتضان منتجات رد الفعل في وقف العازلة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- هطول الأمطار الإيثانول
- إضافة 350 درجة مئوية من الإيثانول 100٪ ومزيج تماما عن طريق الانعكاس.
- الحضانة لمدة 10 دقائق على الأقل على الجليد الجاف.
ملاحظة: التوقف عن الإيقاف. للراحة، يمكن للمرء أن يتوقف هنا وإكمال الإجراء في اليوم التالي. ومع ذلك، فمن الممكن المضي قدما مباشرة إلى الخطوة 3.3 وتشغيل هلام في نفس اليوم. يمكن الاحتفاظ بالحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية لبضعة أيام قبل المزيد من المعالجة، ولكن لا تترك لفترات أطول.
- إعداد عينات الحمض النووي الريبي للهلام الكهربائي
- السماح للعينات للذوبان، ومزيج عن طريق عكس 2-3 مرات، والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 21،000 × ز، 4 درجة مئوية، في جهاز طرد مركزي منضدية. وفي الوقت نفسه، إعداد مزيج هلام denaturing (القسم 3.4.1).
- إزالة الإيثانول بعناية من العينات دون بيليه مزعجة.
- إضافة 500 درجة مئوية من الإيثانول 70٪، أنبوب عكس بضع مرات لغسل بيليه، ثم الطرد المركزي مرة أخرى في 21،000 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجة مئوية.
- إزالة أكبر قدر ممكن من الإيثانول والقيام تدور سريعة (5-10 ق) من الأنابيب في جهاز الطرد المركزي أعلى الجدول. ثم، مع طرف تحميل هلام، وإزالة آخر حجم المتبقية من الإيثانول.
- الهواء الجاف بيليه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- حل الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 4 ميكرولتر من H2O إلى الجزء العلوي من كل بيليه. حضانة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 4 μL من صبغ RNA 2X (انظر جدولالمواد) إلى المزيج، ومن ثم دوامة كل أنبوب لبضع ثوان لإعادة تعليق تماما RNA.
ملاحظة: ينصح بصبغ الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على الفورماميد بدلا من اليوريا، لأن هذا الأخير يعجل في درجات حرارة منخفضة. - سريع تدور الأنابيب، ومن ثم احتضانها في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في كتلة الحرارة.
-
تخزين أنابيب على الجليد الجاف حتى تكون جاهزة لتحميل على هلام.
ملاحظة: الحفاظ على الحمض النووي الريبي على الجليد الجاف يسمح المرونة للعمل على تجارب أخرى في حين أن هلام هو البلمرة. العينات لا تحتاج إلى إعادة تسخينها بعد ذوبان. ومع ذلك، يمكن تحميل الحمض النووي الريبي مباشرة بعد التدفئة إذا كان الجل على استعداد لتشغيل.
- تحضير جل اليوريا-بيج
- لمزيج هلام 40 مل، والجمع بين في أنبوب مخروطي 50 مل: 16.7 غرام من اليوريا، 15 مل من 40٪ مكررا: محلول أكريلاميد (19:1 نسبة)، 4 مل من 10X TBE (1 M Tris-HCl، 1 M بورات الصوديوم، 20 M M EDTA)، و 8 مل من H2O. هذا الحجم يكفي لهلام حجم قياسي واحد (18 سم الارتفاع × 16 سم العرض) مع 1.0 مم الفواصل.
تحذير: الأكريلاميد سام للغاية. في حين لا يوجد خطر استنشاق عندما يكون في الحل، وارتداء دائما معطف المختبر، والقفازات، ونظارات السلامة أثناء التعامل مع.
ملاحظة: هذا الخليط هو لصب هلام بولياكريلاميد 15٪ denaturing، الذي يحل بسهولة RNA بين 15-50 nt. تغيير تركيز مكررا / أكريلاميد حسب الحاجة لحل مختلف النصوص RNA من أطوال مختلفة. - ضع أنبوب مغلق يحتوي على مزيج جل على مُنقّب حتى يذوب اليوريا بالكامل.
- إعداد محطة صب هلام مع لوحات زجاجية، 1 ملم الفواصل ومشط 15 جيدا.
- تعمل بسرعة، إضافة 40 درجة مئوية من TEMED و 400 ميكرولتر من 10٪ محلول كبريتات الأمونيوم إلى حل هلام ومزيج جيدا. باستخدام الأنابيب 25 مل، صب حل هلام بين لوحات، إدراج مشط، والسماح للهلام لبوليمر لمدة 2 ساعة على الأقل.
ملاحظة: إذا سكب الجل أكثر من 2 ساعة قبل الاستخدام، بمجرد أن يكون بلمرة تغطيه مع منشفة ورقية رطبة (ترك المشط في مكانه) والتفاف مع التفاف من البلاستيك لمنعه من التجفيف.
- لمزيج هلام 40 مل، والجمع بين في أنبوب مخروطي 50 مل: 16.7 غرام من اليوريا، 15 مل من 40٪ مكررا: محلول أكريلاميد (19:1 نسبة)، 4 مل من 10X TBE (1 M Tris-HCl، 1 M بورات الصوديوم، 20 M M EDTA)، و 8 مل من H2O. هذا الحجم يكفي لهلام حجم قياسي واحد (18 سم الارتفاع × 16 سم العرض) مع 1.0 مم الفواصل.
- ديناتوريينغ جل RNA الكهربائي
- بعد البلمرة، نقل هلام لتشغيل خزان والتشغيل المسبق في 20 مأ في 1X TBE لمدة 15-30 دقيقة.
- وفي الوقت نفسه، تذوب عينات (إذا المجمدة)، دوامة، وتدور لهم لمدة 4 دقائق في 2000 × ز، 4 درجة مئوية.
- عندما تكون جاهزة، إيقاف إمدادات الطاقة، وشطف بعناية كل بئر مع 1X TBE باستخدام حقنة.
- استخدام نصائح تحميل هلام لتحميل العينات على هلام.
- تشغيل هلام في ثابت 20-30 مالا لحوالي 2 ساعة أو حتى أقل صبغ (إكسيلين سيانول FF) يصل إلى الجزء السفلي من هلام.
- إزالة الجل، وضعه على قطعة من الورق ماصة، والتفاف مع التفاف من البلاستيك.
- عرض هلام مسمى لاسلكيا إلى الفوسفور.
- مسح الفوسفور باستخدام الفوسفورمج وتحليل الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكلان 2 و3 ردود فعل نتيجة تمثيلية تستخدم لتوليد مجمعات استطالة اصطناعية تحتوي على نسخ من أطوال مختلفة عن طريق تمديد أو النص الثاني من مصادر مختلفة. يصور الشكل 4 كيف يمكن استخدام هذه المجمعات استطالة لفحص co-transcriptional CTD الفسفور تعتمد RNA السد.
الشكل 2A هو رسم تخطيطي لجزيئات الحمض النووي والحمض النووي الريبي في مجمعات استطالة اصطناعية. ويبين الشكل 2باء النصوص ذات الطول المختلف الناتجة عن ردود الفعل التي أجريت بالضبط كما هو موضح في البروتوكول 1، الذي أُعدت فيه مجمعات استطالة اصطناعية تبدأ باستخدام القلة الاصطناعية من الحمض النووي الريبي التي تبلغ 20 طناً من الأرض (الأزرق الداكن في الشكل 2ألف) ; RNA_20mer، الجدول1). بما أننا نعرف طول الحمض النووي الريبي وتسلسل قالب الحمض النووي الريبي، يمكننا تحديد المجموعة الفرعية من النيوكليوتيدات — ATP أو CTP أو GTP أو UTP — الضرورية للسير بـ Pol II إلى موضع محدد على طول القالب. يتم إضافة عدد من النيوكليوتيدات توليفها حديثا إلى حجم البداية من التمهيدي oligonucleotide RNA لتحديد الطول المتوقع النهائي (RNA حجم oligo + عدد من النيوكليوتيدات المضافة). في وجود ATP وUTP، يمكن للبول الثاني إضافة 3 NT إلى 20 NT RNA oligo لتوليد مجمعات استطالة تحتوي على RNA 23mer. إذا كان واحد يغص بعيدا ATP غير مدمجة وUTP ثم يضيف ATP وCTP، يتم تمديد 20 nt oligo من قبل 2 NT لجعل 25mer، وإذا كان واحد ثم مرة أخرى يغص بعيدا النيوكليوتيدات غير المدمجة ويضيف ATP وGTP، يتم تمديد النص 4 NT إضافية لجعل 29mer. Sins ce النصوص التي تم إنشاؤها حديثا تتوافق مع حجم الحمض النووي الريبي المتوقع وبما أن ما يقرب من جميع 23mers المسمى لاسلكيا يمكن مطاردة كميا في منتجات أطول، واحد يعرف أن استخدام هذه الطريقة (ط) يتم وضع القلة RNA بشكل صحيح في خروج بول الثاني ترتبط القناة أثناء التجميع و(2) RNAs ذات العلامات الراديوية بمجمعات استطالة Pol II النشطة.
ويبين الشكل 2C تباينا ً في البروتوكول، حيث تم إعداد مجمعات استطالة البداية باستخدام نفس قالب الحمض النووي وoligos حبلا غير قالب وoligo RNA (RNA_29mer، الجدول1) الذي يحتوي على 9 نيوكليوتيدات إضافية في له 5'-نهاية ولكن خلاف ذلك متطابقة في تسلسل إلى 20 NT RNA oligo. لأن طول RNA البداية هو 29 nt في هذه الحالة، يمكن إنشاء مجمعات استطالة تحتوي على 32mer و 34mer و 38mer النصوص باستخدام نفس خطوات المشي Pol II الموضحة أعلاه.
وهذه الطريقة، حسب نطاق التحليل، تتيح المرونة في مصدر السياسة الثانية. في الشكل 3 نقارن ردود الفعل باستخدام Pol II من مصادر مختلفة. في ردود الفعل التي تظهر في الممرات الأربعة الأولى، تم تجميع مجمعات استطالة اصطناعية مع الذاتية، نوع البرية Pol II تنقية من كبد الفئران أو الخميرة الانشطارية ومشى كما هو موضح أعلاه لتوليد 23mers أو 25mers. تم تنقية الفئران والخميرة الانشطارية Pol IIs المستخدمة في هذه ردود الفعل إلى شبه التجانس باستخدام خطوات كروماتوغرافية متعددة.
ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتوليد مجمعات استطالة اصطناعية تحتوي على نوع البرية أو متحولة Pol II أعدت باستخدام بسيطة، طريقة تنقية خطوة واحدة. آخر اثنين من الممرات في الشكل تظهر الاختبارات التي أجريت باستخدام شكل متحولة من Pol الثاني الإنسان الذي يفتقر إلى CTD في الوحدة الفرعية Rpb1، وهو ليس مطلوبا للنشاط الحفاز Pol II ولكن يساعد على الزوجين النسخ إلى RNA السد. تم تنقية POL II CTD أقل المستخدمة في هذه الاختبارات عن طريق المضادة للفلاج تنقية المناعة من خط الخلية البشرية التي تعبر عن إصدار العلم epitope الموسومة من Rpb1. ومن المهم ملاحظة أن تركيز العنصر السياسي الثاني النشط سيختلف من إعداد إلى إعداد. وبالتالي، من الضروري إجراء تجارب أولية تختلف فيها كمية التعليقات من الفئة "بولس الثاني" لتحديد الكمية اللازمة للحصول على النشاط المرغوب فيه.
ويبين الشكل 4 مثالاً تمثيلياً لعلامة تقارن بين وضع حد أقصى للنصوص المُصنَّعة بعلامات راديوية مرتبطة بمجمعات استطالة اصطناعية تحتوي على بولس الثاني إما بالتصوير المقطعي المحوسب الفوسفوري أو غير الفوسفوري. وبالنسبة لهذه الاختبارات، تم إعداد مجمعات استطالة تحتوي على 23 نسخة من النيوكليوتيدات مع نهاية ثلاثية الفوسفات 5'-كما هو موضح في البروتوكول 2.
حضانة المجمعات استطالة مع أنزيم السد يؤدي إلى تحول التنقل من حوالي 1 NT، مما يشير إلى إضافة 5 'سقف14،15. لكمية ردود الفعل السد، واحد يحدد كفاءة السد، وأعرب عن نسبة مئوية من الحمض النووي الريبي الذي توج. الحد الأقصى للكفاءة هو نسبة RNA متوج إلى إجمالي RNA، مقسوما على الحد الأقصى للتغطية التي يمكن الحصول عليها. في مقالاتنا نجد الحد الأقصى يمكن الحصول عليها من oligos RNA التي تم الحصول عليها من المصادر التجارية هو ~ 85٪، على الأرجح بسبب triphosphorylation غير مكتملة من الحمض النووي الريبي الاصطناعية.
في ردود الفعل التي تظهر في الممرات الثلاثة الأولى، تم احتضان مجمعات الاستطالة مع عامل النسخ العام TFIIH وATP العامل المشارك لالفوسفور في CTD Pol II قبل وضع حد أقصى. في هذه التفاعلات، لوحظ قرب الحدالقصوى ~ 1 دقيقة بعد إضافة 5 نانوغرام من إنزيم السد. عندما أجريت الاختبارات باستخدام مجمعات استطالة التي لا تحتضن مع TFIIH وبالتالي تحتوي على بول الثاني غير الفوسفوري، استغرق ما يقرب من 10 أضعاف إنزيم السد لمراقبة مستويات مماثلة من السد. ويبين المساران الأخيران من الشكل 4 نواتج ردود الفعل التي احتضنت فيها مجمعات الاستطالة بإنزيم أو بدون هجال، في وجود TFIIH. والأهم من ذلك، أن الاعتماد على TFIIH من المجمعات الاستطالة الاصطناعية المتوجة النسخية المشتركة التي تظهر في هذا الرقم يشبه إلى حد كبير تلك التي لوحظت في مجمعات استطالة التي بدأت النسخ في المروج في أنظمة إنزيم أكثر تعقيدا 5.
الشكل 1: تجميع مجمعات الاستطالة الاصطناعية. (أ) يتم صلب OLIGO RNA (الأزرق الداكن) من 20 nt إلى حبلا قالب الحمض النووي (الأخضر) من خلال تسلسل تكميلي من 9 nt. (B) يتم خلط الحمض النووي الريبي بولميراز الثاني (بول الثاني) مع الحمض النووي الصلب: RNA الهجين لوضع RNA 3'-نهاية في موقع الحفاز بول الثاني. (C) يتم إضافة فائض الأضراس من 3 'biotinylated غير قالب حبلا الحمض النووي oligo (الأزرق الفاتح) إلى مزيج رد الفعل لأرفق والمزيد من استقرار مجمع استطالة. (D) يتم غسل مجمعات استطالة معطلة لإزالة القلة الزائدة وحضانة مع مجموعات مناسبة من النيوكليوتيدات للسماح للبول الثاني لتوسيع oligo RNA إلى الطول المطلوب. يظهر الجزء التوليفي حديثًا من الحمض النووي الريبي باللون الأصفر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بول الثاني المشي باستخدام oligos RNA من أطوال مختلفة. (أ) رسم تخطيطي لمجمعات استطالة اصطناعية، تظهر النيوكليوتيدات المضافة أثناء المشي. يتم عرض غير قالب حبلا والقالب حبلا الحمض النووي في الضوء الأزرق والأخضر، على التوالي. يظهر الـ 20 nt RNA oligo باللون الأزرق الداكن. كما تظهر النيوكليوتيدات المضافة خلال المشي المتعاقبة لتوليد 23mer RNA (البرتقال)، 25mer RNA (البني)، و29mer RNA (أرجواني). (ب) الكهروفوريس جل Denaturing تظهر RNAs من طول محدد التي تم الحصول عليها بعد المشي Pol II باستخدام 20 NT RNA التمهيدي، كما هو موضح في البروتوكول 1. النيوكليوتيدات المضافة خلال كل خطوة المشي المتسلسلة من البروتوكول هي اللون البرتقالي مشفرة (23mer)، البني (25mer)، والأرجواني (29mer). (C) Pol II المشي بدءا من 29 NT RNA التمهيدي، ولكن خلاف ذلك بالضبط كما هو مبين في B. (B و C) تظهر أجزاء من هلام نفسه ولكن تم فصلها لأغراض التوضيح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النصوص التي تم تصنيعها بواسطة مجمعات استطالة اصطناعية تحتوي على نوع البرية أو متحولة Pol II. تم تجميع مجمعات استطالة اصطناعية باستخدام التمهيدي 20 RNA NT وتنقية عالية Pol الذاتية من كبد الفئران أو الخميرة الانشطارية أو علم المناعية Pol II تفتقر إلى Rpb1 من خلايا HeLa (F:Rpb1 Δ-Ctd). [رنا] في كلّ مركبة كان أبعد مدّدت إلى 23 [نت] أو 25 [نت]. راجع النص للحصول على التفاصيل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تفعيل الفسفورية المعتمدة على الرنا النسخي المتوج. تم احتضان مجمعات استطالة اصطناعية تحتوي على كبد الفئران Pol II وRNA 23mer المسمى لاسلكيا مع ATP وعامل النسخ العام TFIIH أو العازلة لمدة 10 دقائق لالفوسفورتي البول الثاني CTD. بعد الغسيل، تم احتضان مجمعات استطالة مع 5 نانوغرام، 15 نانوغرام، أو 45 نانوغرام من إنزيم الثدييات السد لمدة 1، 2 أو 4 دقيقة. تم نشر هذا الجزء من الرقم في الأصل في المرجع 5، الذي تم نشره كمقالة الوصول المفتوح تحت ترخيص CC-BY. ويوضح الممران الأخيران، اللذين يأتيان من تجربة منفصلة، نواتج ردود الفعل التي احتضنت فيها مجمعات الاستطالة مع أو بدون أنزيم متوج، في وجود TFIIH. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تسلسل | تعليقات | |
| RNA_20mer | في هذا الـ401 | 5' تعديل ثلاثي الفوسفات؛ الصفحة وRP-HPLC تنقية |
| محمد الدوسري | ACUCUAUGACUCUCUCUCUCUGUGUUU | 5' تعديل ثلاثي الفوسفات؛ الصفحة وRP-HPLC تنقية |
| قالب ستراند الحمض النووي | CTACGGTTACACGGTACATTTGTGAA تاغكاتكاتغ |
مزدوج الصفحة وHPLC تنقية |
| غير قالب ستراند الحمض النووي | ATCAGAATGTGTGTCTTACGTAG | 5' TEG-biotinylated؛ HPLC تنقية |
الجدول 1: الحمض النووي والحمض النووي الريبي oligonucleotides
| التركيز النهائي | حجم | |
| تريس حمض الهيدروكلوريك الحموضة 7.5 | 12 مليون متر مربع* | |
| 50 مليون متر مربع2 | 5 مليون متر مربع | 1 ميكرولتر |
| 300 مليون متر مربع | 50 مليون متر مربع | 1.67 ميكرولتر |
| 10 μM قالب ستراند الحمض النووي oligo في 100 mM تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 7.5 | 1 ميكرومتر | 1 ميكرولتر |
| 10 ميكرومتر RNA oligo في 10 mTris-HCl درجة الحموضة 7.5 |
2 ميكرومتر | 2 ميكرولتر |
| المياه | 4.33 ميكرولتر | |
| 10 ميكرولتر | ||
| * جميع Tris-HCl يأتي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي oligo الحلول | ||
الجدول 2: كوكتيل للحمض النووي الصلب وoligos RNA
| المخزن المؤقت للشرطة الثانية | التركيز النهائي | حجم / رد فعل |
| المياه | 4.52 ميكرولتر | |
| 50 مليون متر مربع2 | ^4.67 مليون متر | 1.40 ميكرولتر |
| 250 mM Tris HCl, pH 7.5 | ^23 مليون متر مربع | 1.40 ميكرولتر |
| 300 مليون متر مربع | * 27 مليون متر مربع | 1.33 ميكرولتر |
| 50% غليسيرول | 3 في المائة | 0.9 ميكرولتر |
| 20 ملغم/مل من BSA | 0.5 ملغ / مل | 0.38 ميكرولتر |
| 100 mM DTT | 0.5 مليون متر مربع | 0.08 ميكرولتر |
| 10٪ PVA | 2 في المائة | 3 ميكرولتر |
| 13 ميكرولتر | ||
| الحق قبل استخدام المخزن المؤقت إضافة: | ||
| صلب قالب حبلا الحمض النووي: RNA (من الجدول 1) | 1 ميكرولتر | |
| الحمض النووي الريبي للبوليميراز الثاني | 1 ميكرولتر | |
| * تركيز KCl النهائي في هذا المزيج هو ~ 50 mM، مع KCl إضافية قادمة من بول الثاني | ||
| ^التركيزات النهائية لـ MgCl2 وTris HCl هي 5 mM و 25 mM على التوالي، | ||
| يأتي ال [مغكل] إضافيّة2 و [تريس] [هكل] من صلب [دنا]: [رنا] منتوج. | ||
الجدول 3: مزيج السياسة الثانية
| المخزن المؤقت للحمض النووي غير القالب | التركيز النهائي | حجم / رد فعل |
| المياه | 4.48 ميكرولتر | |
| 300 مليون متر مربع | *43.33 مليون متر مربع | 2.17 ميكرولتر |
| 50 مليون متر مربع2 | 5 مليون متر مربع | 1.50 ميكرولتر |
| 250 mM Tris HCl, pH 7.5 | 25 مليون متر مربع | 1.50 ميكرولتر |
| 50% غليسيرول | 3 في المائة | 0.9 ميكرولتر |
| 20 ملغم/مل BSA | 0.5 ملغ / مل | 0.38 ميكرولتر |
| 100 mM DTT | 0.5 مليون متر مربع | 0.08 ميكرولتر |
| 10٪ PVA | 2 في المائة | 3 ميكرولتر |
| 14 ميكرولتر | ||
| الحق قبل استخدام المخزن المؤقت إضافة: | ||
| 5 μM Biotinylated غير قالب الحمض النووي oligo | 1 ميكرولتر | |
| * تركيز KCl النهائي في هذا المزيج هو 50 mM، مع KCl إضافية قادمة من غير قالب الحمض النووي القلة العازلة. | ||
الجدول 4: مزيج الحمض النووي غير القالبي
| المخزن المؤقت لوضع العلامات على النبض | التركيز النهائي | حجم / رد فعل |
| المياه | 9.98 ميكرولتر | |
| 300 مليون متر مربع | 60 مليون متر مربع | 5 ميكرولتر |
| 50% غليسيرول | 3 في المائة | 1.5 ميكرولتر |
| 20 ملغم/مل BSA | 0.5 ملغ / مل | 0.63 ميكرولتر |
| 500 مليون متر مربع2 | 8 مليون متر مربع | 0.4 ميكرولتر |
| 1 M تريس حمض الهيدروكلوريك، الحموضة 7.9 | * 12 مليون متر مربع | 0.3 ميكرولتر |
| 100 mM DTT | 0.5 مليون متر مربع | 0.13 ميكرولتر |
| 1 م هيبس-هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.9 | 3 مليون متر مربع | 0.08 ميكرولتر |
| 10٪ PVA | 2 في المائة | 5 ميكرولتر |
| 23 ميكرولتر | ||
| الحق قبل استخدام المخزن المؤقت إضافة: | ||
| 15 ميكرو متر ATP | 0.6 ميكرومتر | 1 ميكرولتر |
| 3.3 ميكرومتر [α-32P] UTP | 0.13 درجة مئوية | 1 ميكرولتر |
| * تركيز حمض الهيدروكلوريك تريس النهائي هو 20mM، مع حمض الهيدروكلوريك تريس إضافية قادمة من المخزن المؤقت النيوكليوتيد. | ||
الجدول 5: مزيج NTP وضع العلامات النبضية
| مطاردة العازلة | التركيز النهائي | حجم / رد فعل |
| Tris HCl, الحموضة 7.5 | * 30 مليون متر مربع | |
| 300 مليون متر مربع | 60 مليون متر مربع | 1 ميكرولتر |
| المياه | 0.6 ميكرولتر | |
| 50% غليسيرول | 3 في المائة | 0.3 ميكرولتر |
| 10 mM DTT | 0.5 مليون متر مربع | 0.25 ميكرولتر |
| 100 m HEPES-NaOH, pH 7.9 | 3 مليون متر مربع | 0.15 ميكرولتر |
| 20 ملغم/مل BSA | 0.5 ملغ / مل | 0.13 ميكرولتر |
| 500 مليون متر مربع2 | 8 مليون متر مربع | 0.08 ميكرولتر |
| 10٪ PVA | 2 في المائة | 1 ميكرولتر |
| 3.5 ميكرولتر | ||
| الحق قبل استخدام المخزن المؤقت إضافة: | ||
| 100 μM UTP, 100 μM ATP المخفف ة في 100 mM Tris-HCl, درجة الحموضة 7.5 | 5 ميكرومتر | 1.5 ميكرولتر |
| * جميع تريس حمض الهيدروكلوريك يأتي من العازلة النيوكليوتيد |
الجدول 6: مطاردة NTP مزيج
| التركيز النهائي | حجم / رد فعل | |
| المياه | 24.21 درجة مئوية | |
| 1 مليون كيلو كل | 60 مليون متر مربع | 1.8 ميكرولتر |
| 50% غليسيرول | 3 في المائة | 1.8 ميكرولتر |
| 20 ملغم/مل من BSA | 0.5 مغ/مل | 0.75 ميكرولتر |
| 1 M تريس حمض الهيدروكلوريك، الحموضة 7.9 | 20 مليون متر مربع | 0.6 ميكرولتر |
| 10٪ PVA | 0.2 في المائة | 0.6 ميكرولتر |
| 100 mM DTT | 0.5 مليون متر مربع | 0.15 ميكرولتر |
| 1 م هيبس-هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.9 | 3 مليون متر مربع | 0.09 ميكرولتر |
| 30 ميكرولتر |
الجدول 7: مخزن الغسيل المؤقت
| التركيز النهائي | حجم / رد فعل | |
| المياه | 14.13 درجة مئوية | |
| 300 مليون متر مربع | 60 مليون متر مربع | 6 ميكرولتر |
| 50% غليسيرول | 3 في المائة | 1.8 ميكرولتر |
| 20 ملغم/مل من BSA | 0.5 ملغ / مل | 0.75 ميكرولتر |
| 1 M تريس حمض الهيدروكلوريك، الحموضة 7.9 | 20 مليون متر مربع | 0.6 ميكرولتر |
| 500 مليون متر مربع2 | 8 مليون متر مربع | 0.48 ميكرولتر |
| 100 mM DTT | 0.5 مليون متر مربع | 0.15 ميكرولتر |
| 1 م هيبس-هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.9 | 3 مليون متر مربع | 0.09 ميكرولتر |
| 10٪ PVA | 2 في المائة | 6 ميكرولتر |
| 30 ميكرولتر |
الجدول 8: المخزن المؤقت للنسخ الأساسي (BTB)
| إيقاف المخزن المؤقت | التركيز النهائي | حجم / رد فعل |
| المياه | 55.74 ميكرولتر | |
| 1 M تريس حمض الهيدروكلوريك، الحموضة 7.5 | 10 مليون متر مربع | 0.6 ميكرولتر |
| 5 M NaCl | 300 مليون متر مربع | 3.6 ميكرولتر |
| 500 مليون متر مربع EDTA | 0.5 مليون درهم EDTA | 0.06 ميكرولتر |
| 10% SDS | 0.2% SDS | 1.2 ميكرولتر |
| 60 ميكرولتر | ||
| الحق قبل استخدام المخزن المؤقت إضافة: | ||
| 15 مغ/مل جليكوجين | 2 ميكرولتر | |
| 20 ملغم/مل بروتيناز ك | 2 ميكرولتر | |
| المياه | 30 ميكرولتر | |
الجدول 9: وقف المزيج
| التركيز النهائي | حجم / رد فعل | |
| المياه | 11.9 ميكرولتر | |
| 300 مليون متر مربع | *53.33 مليون متر مربع | 5.33 ميكرولتر |
| 50% غليسيرول | 3 في المائة | 1.8 ميكرولتر |
| 1.5 μM GTP المخففة في 100 mM تريس حمض الهيدروكلوريك، درجة الحموضة 7.5 | 50 درجة مئوية | 1 ميكرولتر |
| 100 وحدة / مل بيروفوسفاتياس غير العضوية، الخميرة | 0.1 وحدات / رد فعل | 1 ميكرولتر |
| 20 ملغم/مل من BSA | 0.5 ملغ / مل | 0.75 ميكرولتر |
| 1 M تريس حمض الهيدروكلوريك، الحموضة 7.9 | ^16.67 mM | 0.5 ميكرولتر |
| 500 مليون متر مربع2 | 8 مليون متر مربع | 0.48 ميكرولتر |
| 100 mM DTT | 0.5 مليون متر مربع | 0.15 ميكرولتر |
| 1 م هيبس-هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.9 | 3 مليون متر مربع | 0.09 ميكرولتر |
| 10٪ PVA | 2 في المائة | 6 ميكرولتر |
| 29 ميكرولتر | ||
| الحق قبل استخدام المخزن المؤقت إضافة: | ||
| الأنزيم السد | 1 ميكرولتر | |
| * تركيز ككل النهائي في هذا المزيج هو ~ 60 mM، مع KCl إضافية قادمة من أنزيم السد وpyrophosphatase | ||
| ^ نهائيّة [تريس] [هكل] تركيز 20 [م], مع إضافيّة [تريس] [هكل] يأتي من [نوكليوتيد] مخزن فلح | ||
الجدول 10: مزيج السد
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تسهيل الدراسات التي تسعى إلى تشريح الأحداث إلى جانب مجمع استطالة Pol II مثل معالجة الحمض النووي الريبي وتنظيم استطالة النص نفسه إلى حد كبير باستخدام نظام إنزيم عالي النقاء. إنشاء مثل هذه النظم الإنزيم يمكن أن يكون تحديا. ويتطلب النسخ المعتمد على المروج من قبل الشرطة الثانية خمسة عوامل عامة على الأقل للنسخ. وقد يستغرق إعداد هذه العوامل وتخزينها شهوراً؛ وبالتالي، فإن الخطوة التي تحد من معدل في هذه العملية هي في كثير من الأحيان ببساطة إعداد كادر من عوامل النسخ اللازمة لإعادة تشكيل النسخ القاعدية في أنبوب الاختبار.
في هذه المقالة، ونحن نصف التكيف من الأساليب التي وضعت سابقا لتوليد المجمعات استطالة النسخ الاصطناعي2،3 باستخدام فقط تنقية بول الثاني والحمض النووي الاصطناعية وoligonucleotides الحمض النووي الريبي. المجمعات استطالة الناتجة نشطة بشكل نسخوى ومناسبة للاستخدام في التحقيق في اقتران النسخ بول الثاني وRNA متوجا5. من المهم أن نلاحظ أن النسخ وRNA السد تحدث في الجسم الحي في سياق الكروماتين والعديد من البروتينات الأخرى غير موجودة في هذا النظام الإنزيم المحدد; وبالتالي، من المتوقع أن يلخص هذا النظام العديد من، ولكن ليس كل، ملامح ردود الفعل التي تحدث في الجسم الحي. يعتمد البروتوكول الذي نصفه على الأساليب السابقة من خلال شل مجمعات الاستطالة الاصطناعية من خلال الحمض النووي الحيوي المرتبط بالخرز المغناطيسي، مما يسمح للباحث بسهولة بتغيير ظروف التفاعل و/أو إزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة خلال مراحل مختلفة من الاختبارات. الأهم من ذلك، لأن العلامة المستخدمة لشل المجمعات استطالة على نهاية واحدة من حبلا غير قالب من الحمض النووي بدلا من على بول الثاني نفسه أو على حبلا قالب، فقط تلك Pol IIs المرتبطة بمجمعات استطالة كاملة سيتم الاحتفاظ بها على الخرز.
لأن النصوص الوليدة يجب أن يكون لها نهاية 5'-ثلاثي الفوسفات من أجل تعديلها عن طريق تغطية إنزيم، يتم شراء oligonucleotides الحمض النووي الريبي الاصطناعية المستخدمة في التجارب متوجا مع 5'-ثلاثي الفوسفات تيرميني. ومع ذلك، يمكن استخدام القلة RNA غير المعدلة لتطبيقات أخرى، بما في ذلك دراسات غيرها من الأحداث معالجة الحمض النووي الريبي النسخي أو أنشطة عوامل النسخ التي تنظم استطالة Pol II. بغض النظر عن تطبيق المصب، نوصي بتجميع مجمعات استطالة مع الحمض النووي النقي للغاية وoligos RNA. على وجه الخصوص، ينبغي تنقية oligos الحمض النووي biotinylated من قبل HPLC، وينبغي تنقية الحمض النووي الأخرى وoligos RNA بواسطة الكهربائي هلام polyacrylamide و / أو HPLC. غير أنه سيتعين تحديد نقاء الأنشطة الأنزيمية على أساس كل حالة على حدة، وسيتوقف ذلك على نطاق كل تجربة.
إضافة القلة الحمض النووي biotinylated غير قالب في الخطوة الأخيرة من التجمع ينبغي أن تكون كافية، من حيث المبدأ، للحصول على مجمع ثلاثي. ومع ذلك، فإننا دائما ً ما ندرج خطوة "مشي" واحدة على الأقل لتأكيد أن السياسة الثانية تتضمن العدد الصحيح من النيوكليوتيدات: إذا كان الهدف من التجربة هو توليد ركائز لـ "الحد الأقصى للنسخ المشترك" أو خطوات معالجة الحمض النووي الريبي الأخرى أو اتباع السياسة الثانية استطالة، ونحن دائما تشمل 32P-المسمى ribonucleotide في "المشي" الأولية بحيث يمكن تصور النص واستخدام النيوكليوتيدات "الباردة" غير المسماة لخطوات المشي اللاحقة حتى النشاط المحدد من النصوص من أطوال مختلفة يبقى ثابتا. على الرغم من أن الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول تستخدم 32نيوكليوتيدات تحمل علامة P لتصور النصوص الوليدة، إلا أنه يمكن استخدام الاختبارات المستندة إلى الفلورة لقياس وضع علامات الحمض النووي الريبي عندما لا يكون من الممكن العمل مع المواد المشعة. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن حساسية مثل هذه الاختبارات عادة ما تكون أقل بكثير من تلك التي تستخدم التسميات المشعة، وأنها عادة ما تتطلب كميات أكبر من الإنزيم.
خطوة رئيسية للتجارب استنساخ هو استرداد الحمض النووي الريبي جيدة خلال الفينول: الكلوروفورم: استخراج isoamyl وهطول الأمطار الإيثانول. لقد وجدنا أن استخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على المواد الهلامية عالية الكثافة (انظر جدولالمواد) للفينول: الكلوروفورم: استخراج isoamyl يزيد من استنساخ وغلة حمض نووي من هذه الخطوة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الجليكوجين الملون (انظر جدولالمواد) كناقل أثناء هطول الأمطار الإيثانول يجعل من الأسهل أن نرى الكريات حمض نووي صغير، مما يجعل من الأقل احتمالا أن يفقد المرء عن غير قصد بيليه عن طريق aspirating ذلك أثناء إزالة إيثانول خارق.
كما ينبغي أن تكون مجمعات استطالة اصطناعية يتم إنشاؤها باستخدام بروتوكولات مماثلة لتلك التي نصفها مفيدة لقياس تفاعلات البروتين أو البروتين والحمض النووي بين مركب استطالة Pol II والعوامل التي تنظم النص استطالة أو RNA معالجة الأحداث المرتبطة استطالة. في هذه الحالة، يتم الكشف عن البروتينات التي لا تزال مرتبطة بمجمعات استطالة اصطناعية بعد الغسيل عن طريق النشاف الغربي أو قياس الطيف الكتلي. تسمية الراديو RNA ليست ضرورية ونحن نفعل جميع خطوات النسخ مع النيوكليوتيدات "الباردة" فقط.
وأخيراً، يمكن أن تكون هذه الطريقة ممكنة الاستخدام في التحليلات الهيكلية لمجمعات النسخ. في الواقع، وقد استخدمت الأساليب ذات الصلة في دراسات التبريد EM مع الخميرة والثدييات الإنزيمات لإعادة تشكيل تغطية التفاعلات إنزيم-بول الثاني13، وتفاعلات بول الثاني مع البروتينات الأخرى أو مجمعات البروتين خلال استطالة12، التوقف16،17، ومؤخرا ، ملزمة للنيوكليوسوم18. ومن المضاعفات المحتملة للتحليلات الهيكلية لمجمعات النسخ التي يتم إنشاؤها باستخدام هذه الطريقة الحاجة إلى إزالة الخرز البيوتين/المغناطيسي من المجمع؛ ومع ذلك، يمكن حل هذا عن طريق تضمين في الحمض النووي oligos مواقع محددة معترف بها من قبل الإنزيمات تقييد أو باستخدام رابط البيوتين التي يتم شق قبالة بعد العلاج الأشعة فوق البنفسجية19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر س. شومان على توفير الانزيم اتلاف الثدييات cDNA. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا بمنحة لمعهد أبراج للبحوث الطبية من صندوق هيلين نيلسون للبحوث الطبية في مؤسسة مجتمع مدينة كانساس الكبرى. يمكن الوصول إلى البيانات الأصلية التي تستند إليها هذه المخطوطة من مستودع البيانات الأصلية في Stowers في http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D.
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
