Summary
Hier beschreiben wir die Montage von RNA-Polymerase II (Pol II) Dehnungskomplexen, die nur kurze synthetische DNA- und RNA-Oligonukleotide und gereinigte Pol II erfordern. Diese Komplexe sind nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die der kotranskriptiellen Verarbeitung von Transkripten im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zugrunde liegen.
Abstract
Die eukaryotische mRNA-Synthese ist ein komplexer biochemischer Prozess, der die Transkription einer DNA-Vorlage in eine Vorläufer-RNA durch das Multi-Subunit-Enzym RNA-Polymerase II und die kotranskriptionale Verkabelung und Spleißung der Vorläufer-RNA zur Bildung der reifen mRNA erfordert. Während der mRNA-Synthese ist der RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplex ein Ziel für die Regulierung durch eine große Sammlung von Transkriptionsfaktoren, die seine katalytische Aktivität steuern, sowie die Verschluss-, Spleiß- und 3'-Verarbeitungsenzyme, die die ausgereifte mRNA erzeugen. Aufgrund der inhärenten Komplexität der mRNA-Synthese haben einfachere experimentelle Systeme, die die Isolierung und Untersuchung ihrer verschiedenen kotranskriptionsbasierten Stadien ermöglichen, einen großen Nutzen.
In diesem Artikel beschreiben wir ein solches einfaches experimentelles System, das für die Untersuchung der co-transkriptionellen RNA-Verkappung geeignet ist. Dieses System stützt sich auf definierte RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe, die aus gereinigten Polymerase- und künstlichen Transkriptionsblasen zusammengesetzt sind. Bei immobilisierter DNA-Deaktivierung bieten diese RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe ein leicht zu manipulierbares Werkzeug zur Sezieren von co-transkriptioniellen RNA-Verschließungen und Mechanismen, mit denen der Dehnungskomplex das Verschlussenzym während der co-transkriptionelle RNA-Verkappung. Wir gehen davon aus, dass dieses System für die Untersuchung der Rekrutierung und/oder Montage von Proteinen oder Proteinkomplexen mit Rollen in anderen Stadien der mRNA-Reifung angepasst werden könnte, die an den Dehnungskomplex der RNA-Polymerase II gekoppelt sind.
Introduction
Die eukaryotische Boten-RNA-Synthese (mRNA) ist ein ausgeklügelter biochemischer Prozess, der die Synthese einer unverarbeiteten Vorläufer-RNA durch RNA-Polymerase II und die Verarbeitung der Vorläufer-RNA umfasst, um die ausgereifte mRNA zu erhalten. Die RNA-Verarbeitungsschritte der Verkappung, Spleißung und Polyadenylierung werden weitgehend ko-transkriptional durchgeführt. Der Dehnungskomplex Pol II dient als Gerüst, das die Aktivitäten vieler RNA-Verarbeitungsenzyme rekrutiert und orchestriert. Folglich wird unser endgültiges Verständnis, wie ausgereifte eukaryotische mRNAs erzeugt werden, in hohem Maße von der Entwicklung experimenteller Systeme abhängen, um die Zerlegung der biochemischen Mechanismen, die der Rekrutierung zugrunde liegen, an den Dehnungskomplex und Regulierung von Enzymen, die für die kotranskriptionelle Verkappung, Spleißung und Polyadenylierung verantwortlich sind.
Es überrascht nicht, dass die Entwicklung solcher experimentellen Systeme schwierig war. Ein großes Hindernis war die bemerkenswerte Komplexität der Pol-II-Transkription selbst, bei der die einfache Rekonstituierung der Basaltranskription durch Pol II in vitro einen Mindestsatz von fünf allgemeinen Transkriptionsinitiationsfaktoren erfordert: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF und TFIIH 1. Darüber hinaus erfordert die Wiederherstellung jeglicher Art von regulierter Pol-II-Transkription in vitro einen noch größeren Satz von Transkriptionsfaktoren und Koregulierungen. Ein wichtiges Ziel war es daher, einfachere experimentelle Systeme zu entwickeln, die die Rekonstitution aktiver Pol-II-Dehnungskomplexe ermöglichen, die für Untersuchungen der funktionellen Kopplung von Pol II Transkription und RNA-Verarbeitung geeignet sind.
Eine derart einfachere Methode zur Rekonstituierung aktiver Pol-II-Dehnungskomplexe hat sich für strukturelle und biochemische Studien zur Dehnung von Pol II und in jüngerer Zeit für die Untersuchung der kotranskriptionellen RNA-Verarbeitung als nützlich erwiesen2,3 ,4,5. In diesem Artikel zeigen wir, wie Pol II Dehnungskomplexe, die aus gereinigten Pol II und synthetischen Transkriptionsblasen hergestellt wurden, effektiv genutzt werden können, um die Mechanismen zu untersuchen, die der kotranskriptionsbasierten Deckelung von aufkeimenden Pol II-Transkripten zugrunde liegen.
Die Deckelung bezieht sich auf die kovalente Zugabe einer 5'-Guanosin-"Kappe" zum 5'-Triphosphat-Ende der entstehenden Pol-II-Transkripte. Die Kappe ist wichtig für nachfolgende Schritte der mRNA Reifung, Transport, Translation und andere Prozesse6,7. Die Kappe wird von einem Enzym, das als Verschlussenzym bezeichnet wird, kotranskriptional zu Pol II-Transkripten hinzugefügt. In Säugetierzellen sind aktive Stellen, die für die RNA 5'-Triphosphatase und guanylyl transferase Aktivitäten des Verschlussenzyms verantwortlich sind, in einem einzigen Polypeptid8enthalten. Das Verschlussenzym wird durch Wechselwirkungen mit noch zu definierten Oberflächen auf dem Pol II-Körper und der Rpb1-Carboxy-Terminal-Domäne (CTD) phosphoryliert auf Ser5 seiner Heptapeptid-Wiederholungen5an den Pol-II-Dehnungskomplex rekrutiert. Im Dehnungskomplex katalysiert das Verschlussenzym die Zugabe einer 5'-Guanosin-Kappe, sobald das entstehende Transkript eine Länge von mindestens 18 Nukleotiden erreicht und aus dem Polymerase-RNA-Ausgangskanal hervorgegangen ist. Im ersten Schritt der Verschlussreaktion hydrolysiert die Triphosphatase die RNA 5'-Triphosphat zu einem 5'-Diphosphat. Im zweiten Schritt wird GTP durch die Guanylyltransferase zu GMP hydrolysiert und bildet ein GMP-Verschlussenzym-Zwischenprodukt. Schließlich überträgt die guanylyl transferase GMP an das 5'-Diphosphat-Ende des entstehenden Transkripts, um die Obergrenze zu erzeugen.
Ein bemerkenswertes Merkmal der Verschlussreaktion ist, dass die kotranskriptionsbezogene Deckelung (d.h. die Deckelung von Transkripten im Zusammenhang mit funktionellen Pol II Dehnungskomplexen) viel effizienter ist als die Deckelung der freien RNA5,9. Eine wichtige Frage auf diesem Gebiet war daher, wie diese dramatische Aktivierung der Deckelung durch Wechselwirkungen des Verschlussenzyms mit dem Pol-II-Dehnungskomplex erreicht wird. In diesem Protokoll beschreiben wir die Montage aktiver RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe unter Verwendung nur gereinigter RNA-Polymerase II und künstlicher Transkriptionsblasen. Diese Methoden ermöglichen die Erstellung von RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexen mit Transkripten definierter Länge und Sequenz. In einer aktuellen Studie haben wir diese definierten RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe als Modell zur Untersuchung von Aspekten der Mechanismen der RNA-Verkappung5verwendet. Insbesondere zeigten wir, dass (i) die Verkappung von RNA im Zusammenhang mit diesen Dehnungskomplexen mehr als 100-fach effizienter war als die Deckelung freier RNA und (ii) durch TFIIH-abhängige Phosphorylierung der Pol II CTD stimuliert wurde. Der hier beschriebene Ansatz könnte grundsätzlich angepasst werden, um Substrate für die Untersuchung anderer kotranskriptionaler RNA-Verarbeitungsreaktionen im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zu erzeugen.
In Abschnitt 1 dieses Protokolls entstehen künstliche Dehnungskomplexe, indem ein synthetisches Schablonen-DNA-Oligonukleotid zu einem RNA-Oligonukleotid glüht, das sich an seinem 3'-Ende zu etwa 9 Nukleotiden der Schablonenstrang-DNA ergänzt. Pol II wird dann auf das DNA:RNA-Duplex geladen. Der Dehnungskomplex wird dann durch Zugabe eines teilweise komplementären, nicht-schablonenfreien DNA-Oligonukleotids ergänzt, das an seinem 3'-Ende mit Biotin beschriftet ist (Abbildung 1 und Abbildung 2A). Das RNA-Oligonukleotid wird durch Pol II in diesen Dehnungskomplexen erweitert, um radioaktiv markierte Transkripte von definierter Länge und Sequenz nach Zugabe geeigneter Kombinationen von radioaktiv markierten Nukleotiden zu erstellen. Darüber hinaus kann man mit einer Kombination von Wässen, um nicht inkorporierte Nukleotide zu entfernen und die weitere Zugabe verschiedener Kombinationen von Nukleotiden, Pol II zu verschiedenen Positionen entlang der DNA-Vorlage "laufen" und RNA von definierten Längen synthetisieren. RNA wird dann gereinigt und in denaturierenden Harnstoff-PAGE-Gelen einer Elektrophorese unterzogen. In Abschnitt 2 des Protokolls werden künstliche Dehnungskomplexe verwendet, um die kotranskriptionelle RNA-Verkappung zu analysieren. Das vorgestellte Beispiel misst die Wirkung der TFIIH-abhängigen Phosphorylierung der Pol II CTD auf die co-transkriptionelle RNA-Verkappung. In diesem Experiment messen wir das Ausmaß der Co-Transkriptionsverkappung in Abhängigkeit von der Verschluss-Enzymkonzentration (5, 15 und 45 ng pro Reaktion) und der Zeit (1, 2 und 4 min).
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Protocol
1. Montage von Künstlichen Dehnungskomplexen und Pol II Walking
- Immobilisieren Sie 1 nmol nicht-template DNA Oligo enthält ein 3' BiotinMolekül auf magnetischen Perlen.
HINWEIS: Die folgenden Schritte können im Voraus durchgeführt werden, um sich auf zukünftige Experimente vorzubereiten. Alle in diesem Protokoll verwendeten Oligosequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt. RNA-Oligos werden mit 5'-Triphosphat-Modifikationen synthetisiert.- Fügen Sie 200 l magnetisch (10 mg/ml) zu einem proteinarmen, proteinarmen 1,5 ml-Rohr hinzu und legen Sie es dann 2 min auf ein magnetisches Rack.
- Während sich das Rohr auf dem magnetischen Rack befindet, entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Rohr, ohne die Perlen zu stören. Um die Perlen zu waschen, entfernen Sie das Rohr aus dem Rack, fügen Sie 1 ml von 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, geben Sie das Rohr an das Rack, und entfernen Sie die Waschlösung nach 2 min.
- Wiederholt wird 2 mal mit 200 L desselben Puffers.
- Magnetische Perlen in 400 l von 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, Puffer wieder aufhängen. Dann mischen Sie mit 380 l H2O und 20 l von 10 'M nicht-Template biotinylierteDNA Oligo. Legen Sie das Rohr auf einen Nutator und inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur.
- Immobilisiertes DNA-Oligo 3 mal mit 200 l von 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl und dann 3 mal mit 200 l von 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% Glycerin, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin.
- Lassen Sie das Rohr über Nacht bei 4 °C, um die Blockierung von Perlen mit BSA zu beenden.
- Legen Sie die Röhre in das Magnetgestell, entfernen und entsorgen Sie die Flüssigkeit, und setzen Sie die Perlen in 200 l von 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% Glycerin, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin auf und übertragen sie in ein neues Rohr. Für diese DNA-Vorlage beträgt die Endkonzentration ca. 5 m.
HINWEIS: Inkubationszeit und Oligokonzentration müssen für jedes biotinylierte DNA-Oligo empirisch bestimmt werden. Diese Vorlage sollte genug für 200 Reaktionen bieten und mindestens 6 Monate dauern, wenn sie bei 4 °C gespeichert werden.
- Anneale RNA und DNA-Schablonenstrangoligotoligos in einem 2:1-Molarenverhältnis (20 bzw. 10 pmol), um die DNA:RNA-Duplex zu erhalten.
- Richten Sie eine 10-L-Glühmischung ein, wie in Tabelle 2beschrieben.
HINWEIS: 10 l Glühmischung sind ausreichend für 10 Reaktionen. Die Glühmischung kann bei Bedarf skaliert werden, wenn weitere Assays durchgeführt werden sollen. - Führen Sie die Glühreaktionen in einem thermischen Cycler mit dem folgenden Programm durch: 5 min bei 45 °C, gefolgt von 12 Zyklen zu je 2 min, beginnend bei 43 °C und Abnehmen der Temperatur 2 °C pro Zyklus. Leerlauf bei 4 °C.
HINWEIS: Dies ist ein flexibler Zeitpunkt. Das Glühen ist innerhalb von 30 min beendet, kann aber bei 4 °C für einen längeren Zeitraum gelassen werden. Im Labor wurden Glühmischungen bis zu 4 h sitzen gelassen, ohne eine Abnahme der Reaktionseffizienz zu beobachten. - Während Sie RNA an die DNA des Schablonenstrangs glühen, bereiten Sie Puffer für spätere Schritte des Protokolls vor. Die Zutaten, die benötigt werden, um jeden Puffer für eine einzelne Reaktion mit jedem Puffer vorzubereiten, sind in den Tabellen 2 bis 8aufgeführt. Skalieren Sie Rezepte für Wash und (X+1) für alle anderen Puffer um den Faktor [Y(X+1) + 1]. X = Anzahl der zu präparierten Reaktionen; Y = Anzahl der erforderlichen Waschschritte (mindestens 3).
HINWEIS: Bereiten Sie alle Puffer am Tag des Experiments frisch vor. Legen Sie Rohre nicht auf Eis, nachdem PVA zu Puffern hinzugefügt wurde. Fügen Sie Pol II oder Nukleotide direkt vor der Verwendung zu Puffern hinzu.
- Richten Sie eine 10-L-Glühmischung ein, wie in Tabelle 2beschrieben.
- Laden Sie gereinigte RNA-Polymerase II auf den DNA:RNA-Hybrid.
- Mischen Sie 1 pmol (1 l) DNA:RNA-Duplex mit 13 l Pol II Puffer (aus Tabelle 3).
- Fügen Sie der Mischung aus Schritt 1.3.1 0,02 Einheiten gereinigter RNA Pol II (1 l) hinzu und mischen Sie sie, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen und mit Pipettenspitze rühren, ohne Blasen einzuschleusen. 10 min bei 30 °C inkubieren.
HINWEIS: Die von nun an gegebenen Mengen sind für eine einzige Reaktion; für die Anzahl der Reaktionen im Experiment nach Bedarf zu skalieren. IN diesem Beispiel wird RNA Pol II, gereinigt aus Rattenleber, wiebeschrieben 10, verwendet; jedoch kann RNA Pol II, gereinigt aus anderen Quellen, einschließlich kultivierter Säugetierzellen oder Hefe, auch3,4,5,11,12,13verwendet werden.
- Vervollständigen Sie den Dehnungskomplex durch Zugabe von biotinylierter Nicht-Template-DNA.
- 5 pmol (1 l) immobilisiertes DNA-Oligo hinzufügen, um 14 L nicht-template DNA-Puffer (aus Tabelle 4), zu Tube aus Schritt 1.3.2 hinzufügen und für 10 min bei 37 °C brüten.
- Legen Sie die Probe in magnetische Rack für 2 min. Waschen Sie 1x mit 30 l Waschpuffer (aus Tabelle 7), um nicht inkorporierte Pol II und Oligos zu entfernen.
- Generieren Sie Dehnungskomplexe, die radioaktiv markierte RNA 23mer enthalten.
- Führen Sie alle weiteren Inkubationen bei 30 °C durch. Fügen Sie 1 l von 15 'M ATP und 10 'Ci (1 'L) von[-32P] UTP (3.000 Ci/mmol) zu 23 'L des Pulspuffers hinzu und verwenden Sie diese, um gewaschene magnetische Perlen wieder aufzuhängen.
ACHTUNG: Radioaktives Material ist gefährlich. Achten Sie darauf, geeignete Schutzausrüstung zu tragen und alle Laborrichtlinien für die sichere Verwendung und Entsorgung von radioaktivem Material zu befolgen.
HINWEIS: Ersetzen Sie radioaktiv markierte UTP durch 15 M UTP, wenn keine radioaktiv markierte RNA benötigt wird, z. B. für Westliche Blotexperimente. - Inkubieren Sie die Reaktion für 10 min, um die Synthese von radioaktiv markierten 23mers zu ermöglichen.
- Fügen Sie 1,5 L der Lösung, die 100 'M ATP und 100 'M UTP-Mischung enthält, zu 3,5 'L Chase-Puffer hinzu, fügen Sie zu Tuben hinzu, die vormontierte Dehnungskomplexe enthalten, und inkubieren Sie für 5 min, um alle aufkeimenden Transkripte in 23mers zu jagen.
- Legen Sie die Probe für 2 min in das Magnetische Rack, entfernen Sie den Überstand, waschen Sie sie einmal mit 30 l Waschpuffer, um nicht inkorporierte Nukleotide zu entfernen, und setzen Sie sie in 30 l Waschpuffer wieder auf.
- Fügen Sie entweder 94 L Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen (Tabelle9) hinzu, um Reaktionen zu beenden, oder fahren Sie mit Abschnitt 1.6 fort, um Dehnungskomplexe mit längeren Transkripten zu erzeugen, oder Abschnitt 2, um Verschlusstests durchzuführen.
- Führen Sie alle weiteren Inkubationen bei 30 °C durch. Fügen Sie 1 l von 15 'M ATP und 10 'Ci (1 'L) von[-32P] UTP (3.000 Ci/mmol) zu 23 'L des Pulspuffers hinzu und verwenden Sie diese, um gewaschene magnetische Perlen wieder aufzuhängen.
- (Optional) Gehen Sie Pol II, um 23, 25 und 29 Nukleotid-Transkripte zu erstellen
- Befolgen Sie das in den Schritten 1.2.1 bis 1.5.4 beschriebene Verfahren, um Dehnungskomplexe mit radioaktiv markierten 23Mern vorzubereiten. Skalieren Sie 4-fach, um 120 L gewaschene Dehnungskomplexe zu erzeugen, was genug Komplexe für 4 Reaktionen ist.
- Etikettieren Sie 3 neue Röhren "23mer", "25mer" und "29mer". Übertragen Sie 30 l gewaschene Dehnungskomplexe auf das "23mer"-Rohr und fügen Sie 94 l Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen hinzu.
- Legen Sie das Rohr mit den restlichen 90 l gewaschenen Dehnungskomplexen 2 min in das magnetische Rack, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Perlen in 90 l BTB, ergänzt mit 1,2 l je 1,5 mM ATP und 1,5 mM CTP, wieder auf. 10 min bei 30 °C inkubieren.
- Nach dem Einmalwaschen mit 90 l Waschpuffer und Wiederaufhängen in 90 l Waschpuffer, wie in Schritt 1.5.4 beschrieben, 30 l Dehnungskomplexe in das "25mer"-Rohr übertragen und 94 l Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen hinzufügen.
- Legen Sie das Rohr mit den restlichen 60 l Dehnungskomplexen 2 min in das magnetische Rack, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Perlen in 60 l BTB, ergänzt mit 0,8 l je 1,5 mM ATP und 1,5 mM CTP, wieder auf.
- 10 min bei 30 °C inkubieren, einmal mit 60 l Waschpuffer wie abschnitt 1.5.5 waschen und in 60 l Waschpuffer wieder aufhängen.
- Übertragen Sie 30 l von der 2x-Probe auf die "29mer"-Röhre und fügen Sie entweder 94 L Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen hinzu oder fahren Sie mit Abschnitt 2 fort, um Verschlusstests durchzuführen.
- Fahren Sie mit der RNA-Reinigung und -Analyse fort (Abschnitt 3).
2. Verwendung von künstlichen Dehnungskomplexen zum Assay Cotranscriptional Capping
- Generieren Sie gewaschene Dehnungskomplexe mit 23Mers, indem Sie das in den Schritten 1.2.1 bis 1.5.5 13-fache beschriebene Verfahren skalieren. Das reicht für 12 Reaktionen + 1 Extra.
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Pol II CTD-Phosphorylierung
- Legen Sie das Rohr mit gewaschenen Dehnungskomplexen für 2 min in das magnetische Rack, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Perlen in 377 l BTB, ergänzt mit 13 l von 1,5 mM ATP, wieder auf.
- Bereiten Sie zwei neue Rohre mit der Bezeichnung +H bzw. -H vor. Zum Rohr mit der Bezeichnung +H 3 l von 300 ng/l TFIIH hinzufügen und auf das Rohr mit der Bezeichnung -H 9 l von 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% Glycerin, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL Rinderserumalbumin hinzufügen.
HINWEIS: Wir verwenden in der Regel TFIIH gereinigt von Rattenleber, aber wir haben ähnliche Ergebnisse mit 0,6 g/Reaktion von kommerziell erhältlichen rekombinanten Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK, das ist das Kinase-Modul von TFIIH). Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien. - Fügen Sie dem mit -H beschrifteten Rohr 87 l der gewaschenen Dehnungskomplexe ab Schritt 2.2.1 in das Mitrohr mit der Bezeichnung +H und 270 l gewaschener Dehnungskomplexe ein.
- Probe 2 min in magnetisches Rack geben. Um überschüssige Nukleotide und ungebundenes Protein zu entfernen, waschen Sie Dehnungskomplexe in +H- und -H-Reaktionen mit 90 l bzw. 270 l Waschpuffer.
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RNA-Verkappung
- Dehnungskomplexe in der Mitschrift +H in 87 l Verschlussmischung (BTB ergänzt durch 50 M GTP (Tabelle 10) wieder aufsetzen Dehnungskomplexe in der Mitschrift -H beschrifteten Röhre in 261 l Verschlussmischung wieder aufhängen.
- Bereiten Sie 4 neue Röhren mit der Bezeichnung 5 ng CE+H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE vor. Verdünnt es in 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% Glycerin, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin zur Herstellung von Lösungen, die 5 ng CE/L, 15 ng CE/L oder 45 ng CE/L enthalten und 3 l der entsprechenden Lösung in jede der 4 Tuben verteilen.
- Bereiten Sie 12 neue Röhren mit jeweils 94 L Stopppuffer (2.1.1) vor.
- Beginnen Sie jede Verschließreaktion, indem Sie 87 L Dehnungskomplex hinzufügen, der mit TFIIH behandelt wird, oder nicht zu beschrifteten Röhrchen, die ein Verschlussenzym enthalten. Bei 30 °C in einem Wärmeblock inkubieren.
- Nach 1, 2 oder 4 min beenden Sie die Reaktionen, indem Sie 30 l jedes Reaktionsgemisches auf Röhren übertragen, die 94 l Stop-Puffer enthalten. Reinigen und analysieren Sie Reaktionsprodukte, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
3. RNA-Reinigung und -Analyse
- REINIGEN Sie RNA
- Inkubieren Sie Reaktionsprodukte im Stop-Puffer für 20 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Pausieren. Proben in diesem Puffer wurden bis zu 4 h ohne Verlust oder Abbau der RNA gepflegt. - Extrakt einmal mit 124 l Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1).
ACHTUNG: Phenol ist extrem giftig und wird schnell von der Haut absorbiert. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung.
HINWEIS: Um die Rückgewinnung von RNA während der Extraktion zu maximieren, verwenden Sie handelsübliche Röhren, die ein Gel mit hoher Dichte enthalten, das eine stabile Barriere zwischen wässrigen und organischen Phasen bildet. Siehe Diskussion und Tabelle der Materialien. - Die wässrige Phase (obere Schicht) in neue Röhrchen mit 12,4 l von 3 M Natriumacetat pH 5,2 übertragen.
- Inkubieren Sie Reaktionsprodukte im Stop-Puffer für 20 min bei Raumtemperatur.
- Ethanol-Fällung
- Fügen Sie 350 l 100% Ethanol hinzu und mischen Sie sie gründlich durch Inversion.
- Mindestens 10 min auf Trockeneis inkubieren.
HINWEIS: Pausieren. Der Einfachheit halber kann man hier anhalten und das Verfahren am nächsten Tag abschließen; Es ist jedoch möglich, direkt mit Schritt 3.3 fortzufahren und das Gel am selben Tag auszuführen. Rna kann vor der Weiterverarbeitung einige Tage bei -80 °C aufbewahrt werden, lässt sie aber nicht länger.
- Vorbereitung von RNA-Proben für die Gelelektrophorese
- Proben auftauen lassen, durch Invertieren 2-3-mal mischen und zentrifugieren 15 min bei 21.000 x g, 4 °C, in einer Tischzentrifuge. In der Zwischenzeit denaturierende Gelmischung einrichten (Abschnitt 3.4.1).
- Entfernen Sie Ethanol vorsichtig aus Proben, ohne Pellet zu stören.
- Fügen Sie 500 l 70% Ethanol hinzu, invertieren Sie das Rohr ein paar Mal, um Pellet zu waschen, und zentrieren Sie dann wieder bei 21.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur oder 4 °C.
- Entfernen Sie so viel Ethanol wie möglich und machen Sie eine schnelle Drehung (5-10 s) der Rohre in einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie dann mit einer Gel-Ladespitze das letzte verbleibende Ethanolvolumen.
- Lufttrockenes Pellet für 3 min bei Raumtemperatur.
- Lösen Sie die RNA auf, indem Sie 4 LH2O an die Oberseite jedes Pellets hinzufügen. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie dem Mix 4 L 2x RNA-Farbstoff (siehe Tabelle derMaterialien) hinzu und wirbeln Sie dann jede Röhre für ein paar Sekunden aus, um die RNA vollständig wieder aufzusetzen.
HINWEIS: Es wird ein RNA-Farbstoff empfohlen, der Formamid anstelle von Harnstoff enthält, da dieser bei niedrigen Temperaturen ausfällt. - Drehen Sie die Rohre schnell und inkubieren Sie sie dann bei 70 °C für 10 min in einem Wärmeblock.
-
Rohre auf Trockeneis lagern, bis sie bereit sind, auf Gel zu laden.
HINWEIS: Das Halten von RNA auf Trockeneis ermöglicht die Flexibilität, an anderen Experimenten zu arbeiten, während das Gel polymerisiert. Proben müssen nach dem Auftauen nicht wieder erhitzt werden. Die RNA kann jedoch direkt nach dem Erhitzen geladen werden, wenn das Gel betriebsbereit ist.
- Zubereitung von Harnstoff-PAGE-Gel
- Für 40 ml Gelmischung in einem 50 ml konischen Rohr kombinieren: 16,7 g Harnstoff, 15 ml 40% bis:Acrylamidlösung (19:1 Verhältnis), 4 ml 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M Natriumborat, 20 ml EDTA) und 8 ml H2O. Dieses Volumen reicht für ein Standard-Gel (18 cm Höhe x 16 cm Breite) mit 1,0 mm Abstandshaltern.
ACHTUNG: Acrylamid ist extrem giftig. Während es kein Inhalationsrisiko gibt, wenn es in lösungsweise ist, tragen Sie immer Labormantel, Handschuhe und Schutzbrille während der Handhabung.
HINWEIS: Diese Mischung ist für das Gießen eines denaturierenden 15% Polyacrylamid-Gels, das RNA leicht zwischen 15-50 nt auflöst. Ändern Sie die Konzentration von Bis/Acrylamid bei Bedarf, um verschiedene RNA-Transkripte unterschiedlicher Länge aufzulösen. - Geschlossene Röhre mit Gelmischung auf einen Nutator legen, bis Harnstoff vollständig gelöst ist.
- Einrichtung einer Gelgießstation mit Glasplatten, 1 mm Abstandshaltern und einem 15-Well-Kamm.
- Wenn Sie schnell arbeiten, fügen Sie 40 L TEMED und 400 L 10% Ammoniumpersulfatlösung hinzu, um die Lösung zu gelen und gut zu mischen. Mit einer 25 ml Pipette, gießen Gel-Lösung zwischen den Platten, fügen Sie Kamm, und lassen Sie das Gel für mindestens 2 h polymerisieren.
HINWEIS: Wenn das Gel vor Gebrauch mehr als 2 h gegossen wird, nachdem es polymerisiert hat, bedecken Sie es mit feuchtem Papiertuch (den Kamm an Ort und Stelle lassen) und wickeln Sie es mit Plastikfolie, um zu verhindern, dass es austrocknet.
- Für 40 ml Gelmischung in einem 50 ml konischen Rohr kombinieren: 16,7 g Harnstoff, 15 ml 40% bis:Acrylamidlösung (19:1 Verhältnis), 4 ml 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M Natriumborat, 20 ml EDTA) und 8 ml H2O. Dieses Volumen reicht für ein Standard-Gel (18 cm Höhe x 16 cm Breite) mit 1,0 mm Abstandshaltern.
- Denaturing Gel RNA Elektrophorese
- Nach der Polymerisation das Gel in den laufenden Tank geben und bei 20 mA in 1x TBE für 15-30 min vorführen.
- In der Zwischenzeit Proben (falls gefroren), Wirbel, auftauen und 4 min bei 2.000 x g, 4 °C drehen.
- Wenn Sie bereit sind, schalten Sie das Netzteil aus und spülen Sie jeden Brunnen vorsichtig mit 1x TBE mit einer Spritze ab.
- Verwenden Sie Gel-Ladespitzen, um Proben auf das Gel zu laden.
- Führen Sie Gel bei einer konstanten 20-30 mA für ca. 2 h oder bis niedriger Farbstoff (Xylol cyanol FF) den Boden des Gels erreicht.
- Entfernen Sie das Gel, legen Sie es auf ein Stück saugfähiges Papier und wickeln Sie es mit Plastikfolie.
- Setzen Sie das radioaktiv markierte Gel einem Phosphorscreen aus.
- Scannen Sie phosphorscreen mit einem Phosphorimager und analysieren Sie das Bild.
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Representative Results
Die Abbildungen 2 und 3 zeigen repräsentative Ergebnisreaktionen, die zur Erzeugung künstlicher Dehnungskomplexe verwendet werden, die Transkripte unterschiedlicher Länge enthalten, indem sie sich erweitern oder Pol II aus verschiedenen Quellen beziehen. Abbildung 4 zeigt, wie diese Dehnungskomplexe verwendet werden können, um die co-transkriptionelle CTD-Phosphorylierungsabhängige RNA-Verkappung zu assay.
Abbildung 2A ist ein Diagramm von DNA- und RNA-Molekülen in künstlichen Dehnungskomplexen. Abbildung 2B zeigt Transkripte unterschiedlicher Länge, die in Reaktionen erzeugt wurden, die genau wie in Protokoll 1 beschrieben durchgeführt wurden, in denen die beginnenden künstlichen Dehnungskomplexe mit einem synthetischen RNA-Oligo von 20 nt hergestellt wurden (dunkelblau in Abbildung 2A ; RNA_20mer, Tabelle 1). Da wir die beginnende RNA-Länge und die DNA-Vorlagensequenz kennen, können wir die Teilmenge der Nukleotide – ATP, CTP, GTP oder UTP – bestimmen, die erforderlich ist, um Pol II an eine definierte Position entlang der Vorlage zu gehen. Die Anzahl der neu synthetisierten Nukleotide wird der Ausgangsgröße des RNA-Oligonukleotidgrundes hinzugefügt, um die endgültige erwartete Länge zu bestimmen (RNA-Oligogröße + Anzahl der hinzugefügten Nukleotide). In Gegenwart von ATP und UTP kann Pol II dem 20 nt RNA-Oligo 3 nt hinzufügen, um Dehnungskomplexe zu erzeugen, die eine 23mer-RNA enthalten. Wenn man atP und UTP ohne eigene Inkorporz wegwärt und dann ATP und CTP hinzufügt, wird das 20 nt Oligo um 2 nt erweitert, um einen 25mer zu machen, und wenn man dann wieder nicht inkorporierte Nukleotide wegwärt und ATP und GTP hinzufügt, wird das Transkript um weitere 4 nt erweitert, um einen 29mer zu machen. Sin Die neu generierten Transkripte entsprechen der erwarteten RNA-Größe und da fast alle radioaktiv markierten 23Mers quantitativ in längere Produkte gejagt werden können, weiß man, dass mit dieser Methode (i) das RNA-Oligo am Pol-II-Ausgang korrekt positioniert ist. und (ii) radioaktiv markierte RNAs sind aktiven Pol II Dehnungskomplexen zugeordnet.
Abbildung 2C zeigt eine Variation des Protokolls, in der die Beginnendenllängenkomplexe mit derselben DNA-Vorlage und Nicht-Template-Strangoligos und einem RNA-Oligo (RNA_29mer, Tabelle 1) hergestellt wurden, das weitere 9 Nukleotide seine 5'-Ende, ist aber ansonsten in der Reihenfolge mit dem 20 nt RNA Oligo identisch. Da die Beginnende RNA-Länge in diesem Fall 29 nt beträgt, können Dehnungskomplexe mit 32mer-, 34mer- und 38mer-Transkripten mit den oben beschriebenen Pol II-Schritten erzeugt werden.
Je nach Analyseumfang ermöglicht diese Methode Flexibilität in der Quelle von Pol II. In Abbildung 3 vergleichen wir Reaktionen mit Pol II aus verschiedenen Quellen. In den reaktionen, die in den ersten 4 Bahnen gezeigt wurden, wurden künstliche Dehnungskomplexe mit endogenen, wilden Typ Pol II aus Rattenleber oder Spalthefe gereinigt und ging wie oben beschrieben, um 23mers oder 25mers zu erzeugen. Die in diesen Reaktionen verwendeten Ratten- und Spalthefe-IIs wurden mit mehreren chromatographischen Schritten auf nahezu Homogenität gereinigt.
Die Methode kann auch verwendet werden, um künstliche Dehnungskomplexe zu erzeugen, die Wildtyp oder Mutanten Pol II enthalten, die mit einer einfachen, einstufigen Reinigungsmethode hergestellt werden. Die letzten beiden Bahnen in der Abbildung zeigen Assays, die mit einer mutierten Form des menschlichen Pol II durchgeführt wurden, der die CTD in ihrer Rpb1-Untereinheit fehlt, die für die katalytische Aktivität von Pol II nicht erforderlich ist, aber hilft, die Transkription mit der RNA-Kappung zu koppeln. Die CTD-lose Pol II, die in diesen Tests verwendet wurde, wurde durch Anti-FLAG-Immunreinigung aus einer menschlichen Zelllinie gereinigt, die ein FLAG-Epitop mit tags Rpb1 ausdrückte. Es ist wichtig zu beachten, dass die Konzentration des aktiven Pol II von Vorbereitung zu Vorbereitung variieren wird. Daher ist es wichtig, erste Experimente durchzuführen, bei denen die Menge an Pol II, die in Reaktionen verwendet wird, variiert wird, um die Menge zu bestimmen, die benötigt wird, um die gewünschte Aktivität zu erhalten.
Abbildung 4 zeigt ein repräsentatives Beispiel für einen Assay, der die Deckelung von radioaktiv markierten Transkripten im Zusammenhang mit künstlichen Dehnungskomplexen, die Pol II enthalten, mit einer phosphorylierten oder nichtphosphorylierten CTD vergleicht. Für diese Assays wurden Dehnungskomplexe mit 23 Nukleotid-Transkripten mit einem 5'-Triphosphat-Ende wie in Protokoll 2 beschrieben erstellt.
Die Inkubation von Dehnungskomplexen mit Verschlussenzym führt zu einer Mobilitätsverschiebung um 1 nt, was auf die Zugabe einer 5' Obergrenze14,15hinweist. Um Die Verschlussreaktionen zu quantitieren, bestimmt man die Kappungseffizienz, ausgedrückt als Prozent der gekrönten RNA. Die Kappungseffizienz ist das Verhältnis von begrenzter RNA zur gesamten RNA, geteilt durch die maximal erhältliche Verkappung. In unseren Assays finden wir die maximal erhältliche Verkappung von RNA-Oligos, die aus kommerziellen Quellen gewonnen werden, bei 85 %, wahrscheinlich aufgrund einer unvollständigen Triphosphorylierung synthetischer RNA.
In den reaktionen, die in den ersten 3 Bahnen gezeigt wurden, wurden Dehnungskomplexe mit dem allgemeinen Transkriptionsfaktor TFIIH und dem Co-Faktor ATP inkubiert, um die Pol II CTD vor der Deckelung zu phosphorylieren. Bei diesen Reaktionen wurde eine nahezu maximale Deckelung von 1 min nach Zugabe von 5 ng Verschlussenzym beobachtet. Wenn Assays mit Dehnungskomplexen durchgeführt wurden, die nicht mit TFIIH inkubiert werden und daher nicht phosphorylierte Pol II enthalten, dauerte es fast zehnmal so viel Verschlussenzym, um ähnliche Kappungsniveaus zu beobachten. Die letzten beiden Bahnen von Abbildung 4 zeigen die Produkte von Reaktionen, in denen Dehnungskomplexe in Gegenwart von TFIIH mit oder ohne Verschlussenzym inkubiert wurden. Wichtig ist, dass die in dieser Abbildung nachgewiesene TFIIH-Abhängigkeit von ko-transkriptionsverschließeten künstlichen Dehnungskomplexen sehr ähnlich ist wie bei Dehnungskomplexen, die die Transkription an einem Promotor in komplexeren Enzymsystemen initiiert hatten. 5.
Abbildung 1: Montage künstlicher Dehnungskomplexe. (A) RNA-Oligo (dunkelblau) von 20 nt wird durch eine komplementäre Sequenz von 9 nt. (B) RNA-Polymerase II (Pol II) mit dem geglühten DNA:RNA-Hybrid englütiert, um das RNA-3'-Ende an der Pol II-Katalytik-Site zu positionieren. (C) Dem Reaktionsmix wird ein molarer Überschuss von 3' biotinylierten Nicht-Schablonen-Strang-DNA-Oligo (hellblau) hinzugefügt, um den Dehnungskomplex einzuschließen und weiter zu stabilisieren. (D) Immobilisierte Dehnungskomplexe werden gewaschen, um überschüssige Oligos zu entfernen, und mit geeigneten Kombinationen von Nukleotiden inkubiert, um Pol II zu ermöglichen, das RNA-Oligo auf die gewünschte Länge zu verlängern. Der neu synthetisierte Teil der RNA ist gelb dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Pol II gehen mit RNA-Oligos unterschiedlicher Länge. (A) Diagramm der künstlichen Dehnungskomplexe, die Nukleotide zeigen, die während Spaziergängen hinzugefügt wurden. Nicht-Template-Strang und Schablonenstrang-DNA werden in hellblau bzw. grün dargestellt. Das 20 nt RNA Oligo ist in dunkelblau dargestellt. Gezeigt werden auch Nukleotide, die bei aufeinanderfolgenden Wanderungen zur Erzeugung von 23mer RNA (orange), 25mer RNA (braun) und 29mer RNA (Magenta) hinzugefügt werden. (B) Deaturing Gel Elektrophorese zeigt RNAs von definierter Länge erhalten nach dem Gehen Pol II mit einem 20 nt RNA-Primer, wie in Protokoll 1 beschrieben. Nukleotide, die bei jedem sequenziellen Schritt des Protokolls hinzugefügt werden, sind orange (23mer), braun (25mer) und magenta (29mer) farbkodiert. (C) Pol II walking beginnend mit einem 29 nt RNA Primer, aber sonst genau wie in B. (B und C) gezeigt zeigen Teile des gleichen Gels, wurden aber zur Veranschaulichung getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Transkripte, die durch künstliche Dehnungskomplexe synthetisiert werden, die wilden Typ oder mutierten Pol II enthalten. Künstliche Dehnungskomplexe wurden mit dem 20 nt RNA Primer und dem hochgereinigten endogenen Pol II aus Rattenleber oder Spalthefe oder FLAG-immunrifiziertem Pol II ohne rpb1 aus HeLa-Zellen (F:Rpb1-CTD) zusammengesetzt. Die RNA in jedem Komplex wurde auf 23 nt oder 25 nt erweitert. Weitere Informationen finden Sie im Text. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Phosphorylierungsabhängige Aktivierung der kotranskriptionellen RNA-Verkappung. Künstliche Dehnungskomplexe, die Rattenleber Pol II und radioaktiv markierte 23mer-RNA enthalten, wurden mit ATP und dem allgemeinen Transkriptionsfaktor TFIIH oder Puffer für 10 min inkubiert, um die Pol II CTD zu phosphorylieren. Nach dem Waschen wurden Dehnungskomplexe mit 5 ng, 15 ng oder 45 ng Säugetierverschlussenzym für 1, 2 oder 4 min inkubiert. Capped und uncapped 23mers wurden in einem denaturierenden Gel aufgelöst (oben, erste 12 Bahnen) und die % gekappte RNA wurde quantifiziert und geplottet (unten). Dieser Teil der Abbildung wurde ursprünglich in Ref. 5veröffentlicht, das als Open-Access-Artikel unter einer CC-BY-Lizenz veröffentlicht wurde. Die letzten beiden Bahnen, die aus einem separaten Experiment stammen, veranschaulichen Produkte von Reaktionen, in denen Dehnungskomplexe in Gegenwart von TFIIH mit oder ohne Verschlussenzym inkubiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| folge | Kommentare | |
| RNA_20mer | ACUCUCAUGUCUGAUGCUUA | 5' Triphosphat-Modifikation; PAGE & RP-HPLC gereinigt |
| RNA_29mer | ACUCUAUGACUUCUCUCAUGCUCUCUCuCuUA | 5' Triphosphat-Modifikation; PAGE & RP-HPLC gereinigt |
| Template Strang DNA | CTACGGTTAAGCTCTGGTACATTTCTGAA TTAAGCATCATGG |
Dual PAGE & HPLC gereinigt |
| Nicht-Template Strang DNA | ATCAGAAATGTACCGTCTTAACCGTAG | 5' TEG-biotinylatiert; HPLC gereinigt |
Tabelle 1: DNA- und RNA-Oligonukleotide
| Endgültige Konzentration | Volumen | |
| Tris HCl pH 7,5 | 12 mM* | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1 L |
| 300 mM KCl | 50 mM | 1,67 l |
| 10 M Template Strang DNA Oligo in 100 mM Tris-HCl pH 7,5 | 1 M | 1 L |
| 10-M-RNA-Oligo in 10 mM Tris-HCl pH 7,5 |
2 M | 2 l |
| wasser | 4,33 l | |
| 10 l | ||
| *Alle Tris-HCl stammen aus DNA- und RNA-Oligolösungen | ||
Tabelle 2: Cocktail zum Glühen von DNA- und RNA-Oligos
| Pol II-Puffer | Endgültige Konzentration | Volumen/Reaktion |
| wasser | 4,52 l | |
| 50 mM MgCl2 | 4,67 mM | 1,40 l |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | 23 mM | 1,40 l |
| 300 mM KCl | *27 mM | 1,33 l |
| 50% Glycerin | 3% | 0,9 l |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 3 l |
| 13 l | ||
| Unmittelbar vor der Verwendung von Buffer Add: | ||
| Geglühter Schablonenstrang DNA:RNA (aus Tabelle 1) | 1 L | |
| RNA-Polymerase II | 1 L | |
| *Die endgültige KCl-Konzentration in der Mischung beträgt 50 mM, wobei zusätzliche KCl von Pol II kommt | ||
| Die Konzentrationen mgCl2 und Tris HCl betragen 5 mM bzw. 25 mM, | ||
| Die zusätzlichen MgCl2 und Tris HCl stammen aus geglühten DNA:RNA-Produkten. | ||
Tabelle 3: Pol II-Mischung
| Nicht-Vorlagen-DNA-Puffer | Endgültige Konzentration | Volumen/Reaktion |
| wasser | 4,48 l | |
| 300 mM KCl | *43,33 mM | 2,17 l |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1,50 l |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | 25 mM | 1,50 l |
| 50% Glycerin | 3% | 0,9 l |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 3 l |
| 14 l | ||
| Unmittelbar vor der Verwendung von Buffer Add: | ||
| 5 M Biotinyliertes DNA-Oligo | 1 L | |
| *Die endgültige KCl-Konzentration in der Mischung beträgt 50 mM, wobei zusätzliche KCl aus nicht-template DNA-Oligopuffer. | ||
Tabelle 4: Dna-Mix ohne Vorlage
| Impulsbeschriftungspuffer | Endgültige Konzentration | Volumen/Reaktion |
| wasser | 9,98 l | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 l |
| 50% Glycerin | 3% | 1,5 l |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,63 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,4 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | *12 mM | 0,3 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,13 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 5 l |
| 23 l | ||
| Unmittelbar vor der Verwendung von Buffer Add: | ||
| 15 M ATP | 0,6 m | 1 L |
| 3,3 m [--32P]UTP | 0,13 m | 1 L |
| *Final Tris HCl Konzentration ist 20mM, mit zusätzlichen Tris HCl aus Nukleotid-Puffer kommen. | ||
Tabelle 5: Pulsbeschriftung NTP-Mix
| Chase-Puffer | Endgültige Konzentration | Volumen/Reaktion |
| Tris HCl, pH 7,5 | *30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 L |
| wasser | 0,6 l | |
| 50% Glycerin | 3% | 0,3 l |
| 10 mM DTT | 0,5 mM | 0,25 l |
| 100 mM HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,15 l |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,13 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 1 L |
| 3,5 l | ||
| Unmittelbar vor der Verwendung von Buffer Add: | ||
| 100 m UTP, 100 m ATP verdünnt in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 | 5 m | 1,5 l |
| *Alle Tris HCl kommt aus Nukleotid-Puffer |
Tabelle 6: Chase NTP-Mix
| Endgültige Konzentration | Volumen/Reaktion | |
| wasser | 24,21 l | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1,8 l |
| 50% Glycerin | 3% | 1,8 l |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 l |
| 10% PVA | 0,2% | 0,6 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 l |
| 30 l |
Tabelle 7: Waschpuffer
| Endgültige Konzentration | Volumen/Reaktion | |
| wasser | 14,13 l | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 l |
| 50% Glycerin | 3% | 1,8 l |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 l |
| 10% PVA | 2% | 6 l |
| 30 l |
Tabelle 8: Basis-Transkriptionspuffer (BTB)
| Stop-Puffer | Endgültige Konzentration | Volumen/Reaktion |
| wasser | 55,74 l | |
| 1 M Tris HCl, pH 7,5 | 10 mM | 0,6 l |
| 5 M NaCl | 300 mM NaCl | 3,6 l |
| 500 mMED | 0,5 mM EDTA | 0,06 l |
| 10% SDS | 0,2% SDS | 1,2 l |
| 60 l | ||
| Unmittelbar vor der Verwendung von Buffer Add: | ||
| 15 mg/ml Glykogen | 2 l | |
| 20 mg/mL Proteinase K | 2 l | |
| wasser | 30 l | |
Tabelle 9: Stop-Mix
| Endgültige Konzentration | Volumen/Reaktion | |
| wasser | 11,9 l | |
| 300 mM KCl | *53,33 mM | 5,33 l |
| 50% Glycerin | 3% | 1,8 l |
| 1,5 m GTP verdünnt in 100 mM Tris HCl, pH 7,5 | 50 m | 1 L |
| 100 Einheiten/ml Anorganische Pyrophosphatase, Hefe | 0,1 Einheiten/Reaktion | 1 L |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 16,67 mM | 0,5 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 l |
| 10% PVA | 2% | 6 l |
| 29 l | ||
| Unmittelbar vor der Verwendung von Buffer Add: | ||
| Verschlussenzym | 1 L | |
| *Die endgültige KCl-Konzentration in der Mischung beträgt 60 mM, wobei zusätzliche KCl aus Verschlussenzym und Pyrophosphatase kommt | ||
| "Letzte Tris HCl-Konzentration beträgt 20 mM, mit zusätzlichem Tris HCl aus Nukleotidpuffer | ||
Tabelle 10: Verschlussmischung
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Discussion
Studien, die Ereignisse, die mit dem Pol II-Dehnungskomplex gekoppelt sind, wie die RNA-Verarbeitung und die Regulation der Transkriptdehnung selbst, sezieren sollen, können durch den Einsatz eines hochgereinigten Enzymsystems erheblich erleichtert werden. Der Aufbau solcher Enzymsysteme kann eine Herausforderung sein. Die durch den Veranstalter abhängige Transkription durch Pol II erfordert mindestens fünf allgemeine Transkriptionsfaktoren. Die Vorbereitung und Lagerung dieser Faktoren kann Monate dauern; Daher ist der tempobegrenzende Schritt in diesem Prozess oft einfach die Vorbereitung des Kaders von Transkriptionsfaktoren, die erforderlich sind, um die Basaltranskription im Reagenzglas zu rekonstruieren.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Anpassung von zuvor entwickelten Methoden zur Erzeugung künstlicher Transkriptionsdehnungskomplexe2,3 mit nur gereinigtem Pol II und synthetischer DNA und RNA-Oligonukleotiden. Die resultierenden Dehnungskomplexe sind transkriptional aktiv und eignen sich für die Untersuchung der Kopplung von Pol II Transkription und RNA-Verkappung5. Es ist wichtig zu beachten, dass Transkription und RNA-Verkappung in vivo im Kontext von Chromatin und vielen anderen Proteinen auftreten, die in diesem definierten Enzymsystem nicht vorhanden sind; Daher wird erwartet, dass dieses System viele, aber nicht alle Merkmale von Reaktionen, die in vivo auftreten, rekapitulieren wird. Das Protokoll, das wir beschreiben, baut auf früheren Methoden auf, indem künstliche Dehnungskomplexe durch biotinylierte DNA, die an magnetische Perlen gebunden ist, immobilisieren, so dass der Forscher leicht Reaktionsbedingungen ändern und/oder nicht inkorporierte Nukleotide entfernen kann. in verschiedenen Phasen der Assays. Wichtig ist, dass das Tag, das zur Immobilisierung von Dehnungskomplexen verwendet wird, sich an einem Ende des nicht-schablonenförmigen DNA-Strangs befindet und nicht auf Pol II selbst oder auf dem Vorlagenstrang, sondern nur die Pol IIs, die mit vollständigen Dehnungskomplexen verbunden sind, auf Perlen beibehalten werden.
Da aufkommende Transkripte ein 5'-Triphosphat-Ende haben müssen, um durch Verschlussenzym modifiziert zu werden, werden die synthetischen RNA-Oligonukleotide, die für Verschlussexperimente verwendet werden, mit 5'-Triphosphat-Termini gekauft. Jedoch können unveränderte RNA-Oligos für andere Anwendungen verwendet werden, einschließlich Studien anderer kotranskriptionaler RNA-Verarbeitungsereignisse oder der Aktivitäten von Transkriptionsfaktoren, die die Pol-II-Dehnung regulieren. Unabhängig von der nachgeschalteten Anwendung empfehlen wir die Zusammenstellung von Dehnungskomplexen mit stark gereinigten DNA- und RNA-Oligos. Insbesondere sollten biotinylierte DNA-Oligos durch HPLC gereinigt und andere DNA- und RNA-Oligos durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und/oder HPLC gereinigt werden. Die Reinheit der enzymatischen Aktivitäten muss jedoch von Fall zu Fall bestimmt werden und hängt vom Umfang jedes Experiments ab.
Das Hinzufügen des nicht-schablonenbiotinylierten DNA-Oligos im letzten Schritt der Montage sollte grundsätzlich ausreichen, um einen ternären Komplex zu erhalten. Wir schließen jedoch immer mindestens einen "Walking"-Schritt ein, um zu bestätigen, dass Pol II die richtige Anzahl von Nukleotiden enthält: Wenn das Ziel des Experiments darin besteht, Substrate für die A-Transkriptions-Kappung oder andere RNA-Verarbeitungsschritte zu erzeugen oder Pol II zu folgen Dehnung, fügen wir immer ein 32P-markiertes Ribonukleotid in den anfänglichen "Spaziergang" ein, so dass das Transkript visualisiert werden kann und unbeschriftete "kalte" Nukleotide für nachfolgende Gehschritte verwenden kann, so dass die spezifische Aktivität von Transkripten unterschiedlicher Länge bleibt konstant. Obwohl die in diesem Protokoll beschriebene Methode 32P-markierte Nukleotide verwendet, um aufkommende Transkripte zu visualisieren, können fluoreszenzbasierte Assays verwendet werden, um die RNA-Kennzeichnung zu messen, wenn es nicht möglich ist, mit radioaktiven Materialien zu arbeiten. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Empfindlichkeit solcher Tests in der Regel viel geringer ist als bei solchen, die radioaktive Etiketten verwenden, und sie erfordern in der Regel größere Mengen an Enzym.
Ein wichtiger Schritt für reproduzierbare Experimente ist eine gute RNA-Rückgewinnung bei Phenol:Chloroform:Isoamylextraktion und Ethanolfällung. Wir haben herausgefunden, dass die Verwendung von Mikrozentrifugenröhrchen, die Hochdichtegele enthalten (siehe Materialtabelle),für Phenol:chloroform:isoamyl extraktion die Reproduzierbarkeit und Ausbeute von Nukleinsäure aus diesem Schritt erhöht. Darüber hinaus erleichtert die Verwendung von farbigem Glykogen (siehe Materialtabelle) als Träger während der Ethanolfällung das Sehen kleiner Nukleinsäurepellets, wodurch es weniger wahrscheinlich ist, dass man versehentlich das Pellet verliert, indem man es während der Entfernung der Ethanol-Überstand.
Künstliche Dehnungskomplexe, die mit Protokollen erzeugt werden, die denen ähneln, die wir beschreiben, sollten auch für die Messung von Protein-Protein- oder Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen zwischen dem Pol-II-Dehnungskomplex und Faktoren, die die Transkription regulieren, nützlich sein. Dehnungs- oder RNA-Verarbeitungsereignisse im Zusammenhang mit der Dehnung. In diesem Fall werden Proteine, die nach dem Waschen an künstliche Dehnungskomplexe gebunden bleiben, durch westliche Slotting oder Massenspektrometrie nachgewiesen; Radiolabeling RNA ist nicht notwendig und wir machen alle Transkriptionsschritte mit nur "kalten" Nukleotiden.
Schließlich könnte diese Methode für strukturelle Analysen von Transkriptionskomplexen von Nutzen sein. Tatsächlich wurden verwandte Methoden in Kryo-EM-Studien mit Hefe- und Säugetierenzymen zur Rekonstituierung von Verschlussenzym-Pol-II-Wechselwirkungen13und Wechselwirkungen von Pol II mit anderen Proteinen oder Proteinkomplexen während der Dehnung12, pausieren16,17, und zuletzt, gebunden an ein Nukleosom18. Eine mögliche Komplikation für strukturelle Analysen von Transkriptionskomplexen, die mit dieser Methode erzeugt werden, ist die Notwendigkeit, die Biotin/Magnetperlen aus dem Komplex zu entfernen; Dies kann jedoch gelöst werden, indem in DNA-Oligos spezifische Stellen, die durch Restriktionsenzyme erkannt werden, oder durch die Verwendung von Biotin-Linkern, die nach der UV-Strahlenbehandlung abspaltet werden19.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken S. Shuman für die Bereitstellung des Säugetier-Verschlussenzyms cDNA. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Stipendium des Helen Nelson Medical Research Fund der Greater Kansas City Community Foundation an das Stowers Institute for Medical Research unterstützt. Originaldaten, die diesem Manuskript zugrunde liegen, können über das Stowers Original Data Repository unter http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 abgerufen werden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
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