Summary
Ici, nous décrivons l'assemblage des complexes d'allongement de polymérase II d'ARN II (Pol II) exigeant seulement l'ADN synthétique court et les oligonucléotides synthétiques et pol II purifié. Ces complexes sont utiles pour étudier les mécanismes sous-jacents au traitement co-transcriptionnel des transcriptions associées au complexe d'allongement de Pol II.
Abstract
La synthèse eucaryote d'ARNm est un processus biochimique complexe exigeant la transcription d'un modèle d'ADN dans un ARN précurseur par la polymérase D'ARN II d'enzyme multi-subunit et le plafonnement et l'épissage co-transcriptionnels de l'ARN précurseur pour former l'ARNm mûr. Pendant la synthèse de l'ARNm, le complexe d'allongement de la polymérase DE l'ARN II est une cible de régulation par une vaste collection de facteurs de transcription qui contrôlent son activité catalytique, ainsi que les enzymes de plafonnement, d'épissage et de traitement de 3' qui créent l'ARNm mature. En raison de la complexité inhérente de la synthèse de l'ARNm, des systèmes expérimentaux plus simples permettant l'isolement et l'étude de ses différentes étapes de cotranscription ont une grande utilité.
Dans cet article, nous décrivons un tel système expérimental simple approprié pour étudier le plafonnement co-transcriptionnel d'ARN. Ce système repose sur des complexes d'allongement de la polymérase II à ARN défini assemblés à partir de polymérase purifiée et de bulles de transcription artificielles. Lorsqu'ils sont immobilisés par l'ADN biotinylated, ces complexes d'allongement de polymérase II d'ARN fournissent un outil facilement manipulable pour disséquer le plafonnement et les mécanismes co-transcriptionnels d'ARN par lesquels le complexe d'élongation recrute et régule l'enzyme de plafonnement pendant co-transcriptionnel RNA plafonnement. Nous prévoyons que ce système pourrait être adapté pour étudier le recrutement et/ou l'assemblage de protéines ou de complexes protéiques avec des rôles à d'autres étapes de maturation de l'ARNm couplés au complexe d'allongement de la polymérase DE l'ARN II.
Introduction
La synthèse de l'ARN de messager eucaryotique (ARNm) est un processus biochimique élaboré qui implique la synthèse d'un ARN précurseur non traité par la polymérase II d'ARN et le traitement de l'ARN précurseur pour produire l'ARNm mûr. Les étapes de traitement de l'ARN du plafonnement, de l'épissage et de la polyadenylation sont effectuées en grande partie de façon cotranscription. Le complexe d'allongement Pol II sert d'échafaudage qui recrute et orchestre les activités de nombreuses enzymes de traitement de l'ARN. Par conséquent, notre compréhension ultime de la façon dont les ARNm eucaryotes matures sont générées dépendra fortement du développement de systèmes expérimentaux pour permettre la dissection des mécanismes biochimiques sous-jacents au recrutement au complexe d'allongement et la régulation des enzymes responsables du plafonnement, de l'épissage et de la polyadenylation cotranscriptionnel.
Comme on pouvait s'y attendre, le développement de tels systèmes expérimentaux a été difficile. Un obstacle majeur a été la complexité remarquable de la transcription Pol II elle-même où la simple reconstitution de la transcription basale par Pol II in vitro nécessite un ensemble minimum de cinq facteurs d'initiation à la transcription générale: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, et TFIIH 1. En outre, la reconstitution de toute forme de transcription réglementée de Pol II in vitro nécessite un ensemble encore plus grand de facteurs de transcription et de corégulateurs. Ainsi, un objectif majeur a été de développer des systèmes expérimentaux plus simples permettant la reconstitution de complexes d'allongement actifs Pol II adaptés aux investigations du couplage fonctionnel de la transcription de Pol II et du traitement de l'ARN.
Une telle méthode plus simple pour reconstituer les complexes actifs d'allongement de Pol II s'est avérée utile pour des études structurales et biochimiques de pol II allongée et, plus récemment, pour étudier le traitement co-transcriptionnel d'ARN2,3 ,4,5. Dans cet article, nous montrons comment les complexes d'allongement Pol II préparés à partir de Pol II purifiéet et bulles de transcription synthétiques peuvent être utilisés efficacement pour étudier les mécanismes sous-jacents co-transcriptionnel plafonnement des transcriptions naissantes Pol II.
Le plafonnement fait référence à l'ajout covalent d'un « bouchon » de 5'-guanosine à l'extrémité de 5'-triphosphate des transcriptions naissantes de Pol II. Le plafond est important pour les étapes ultérieures de maturation de l'ARNm, le transport, la traduction et d'autres processus6,7. Le bouchon est ajouté co-transcriptionnellement aux transcriptions de Pol II par une enzyme appelée enzyme de plafonnement. Dans les cellules de mammifères, les sites actifs responsables de l'ARN 5'-triphosphatase et guanylyl transferase activités de l'enzyme de plafonnement sont contenus dans un polypeptide unique8. L'enzyme de plafonnement est recrutée au complexe d'allongement Pol II par des interactions avec des surfaces encore à définir sur le corps Pol II et le domaine de carboxy-terminal Rpb1 (CTD) phosphorylé sur Ser5 de son heptapeptide répète5. Dans le complexe d'allongement, l'enzyme de plafonnement catalyse l'ajout d'un bouchon de 5'-guanosine une fois que la transcription naissante atteint une longueur d'au moins 18 nucléotides et a émergé du canal de sortie de l'ARN polymérase. Dans la première étape de la réaction de plafonnement, la triphosphatase hydrolyse l'ARN 5'-triphosphate pour produire un 5'-diphosphate. Dans la deuxième étape, GTP est hydrolysé à GMP par le transfert de guanylyl, formant une enzyme GMP-capping intermédiaire. Enfin, le transfert de guanylyl transfère GMP à l'extrémité 5'-diphosphate de la transcription naissante pour produire le bouchon.
Une caractéristique remarquable de la réaction de plafonnement est que le plafonnement co-transcriptionnel (c.-à-d., plafonnement des transcriptions associées aux complexes fonctionnels d'allongement de Pol II) est beaucoup plus efficace que le plafonnement de l'ARN libre5,9. Ainsi, une question majeure dans le domaine a été de savoir comment cette activation spectaculaire du plafonnement est réalisée par des interactions de l'enzyme de plafonnement avec le complexe d'allongement Pol II. Dans ce protocole nous décrivons l'assemblage des complexes actifs d'allongement de polymérase d'ARN II utilisant seulement la polymérase II purifiée d'ARN et les bulles artificielles de transcription. Ces méthodes permettent la création de complexes d'allongement de la polymérase D'ARN II avec des transcriptions de longueur et de séquence définies. Dans une étude récente, nous avons utilisé ces complexes d'allongement de la polymérase II à ARN défini comme modèle pour étudier les aspects des mécanismes de l'ARN plafonnant5. En particulier, nous avons montré que (i) le plafonnement de l'ARN associé à ces complexes d'allongement était plus de 100 fois plus efficace que le plafonnement de l'ARN libre et (ii) a été stimulé par la phosphorylation TFIIH-dépendante du CTD Pol II. L'approche décrite ici pourrait en principe être adaptée pour générer des substrats pour étudier d'autres réactions de traitement de l'ARN co-transcriptionnel liées au complexe d'allongement de Pol II.
Dans la section 1 de ce protocole, les complexes artificiels d'allongement sont créés en annealing un oligonucléotide synthétique de brin de modèle à un oligonucléotide d'ARN qui est complémentaire à son 3'-extrémité à approximativement 9 nucléotides de l'ADN de brin de modèle. Pol II est ensuite chargé sur le duplex DNA:RNA. Le complexe d'allongement est ensuite complété par l'ajout d'un oligonucléotide d'ADN brin partiellement complémentaire et non-modèle qui est étiqueté avec de la biotine à son 3'-extrémité (figure1 et figure 2A). L'oligonucléotide d'ARN est étendu par Pol II dans ces complexes d'allongement pour faire des transcriptions radiolabeled de longueur et de séquence définies sur l'addition des combinaisons appropriées des nucléotides radiolabeled. En outre, en utilisant une combinaison de lavages pour enlever les nucléotides non incorporés et l'ajout de différentes combinaisons de nucléotides, on peut "marcher" Pol II à différentes positions le long du modèle d'ADN et synthétiser l'ARN de longueurs définies. L'ARN est ensuite purifié et soumis à l'électrophorèse dans la dénaturation des gels urée-PAGE. Dans la section 2 du protocole, des complexes artificiels d'allongement sont utilisés pour analyser le plafonnement de l'ARN cotranscriptionnel. L'exemple présenté mesure l'effet de la phosphorylation TFIIH-dépendante du CTD de Pol II sur le plafonnement co-transcriptionnel d'ARN. Dans cette expérience, nous mesurons l'étendue du plafonnement co-transcriptionnel en fonction du plafonnement de la concentration enzymatique (5, 15 et 45 ng par réaction) et du temps (1, 2 et 4 min).
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Protocol
1. Assemblage de complexes d'allongement artificiel et de marche Pol II
- Immobiliser 1 nmol d'oligo d'ADN non-modèle contenant une molécule de biotine de 3' sur des perles magnétiques.
REMARQUE : Les étapes suivantes peuvent être effectuées à l'avance pour préparer de futures expériences. Toutes les séquences d'oligo utilisées dans ce protocole sont fournies dans le tableau 1. Les oligos d'ARN sont synthétisés avec des modifications de 5'-triphosphate.- Ajouter 200 l de perles magnétiques (10 mg/ml) dans un tube de 1,5 ml de liaison à faible teneur en protéines, puis placer sur un support magnétique pendant 2 min.
- Pendant que le tube est sur le support magnétique, retirez le liquide du tube sans déranger les perles. Pour laver les perles, retirer le tube de la grille, ajouter 1 ml de 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, remettre le tube à la grille, et retirer la solution de lavage après 2 min.
- Répéter les lavages 2 fois de plus à l'aide de 200 l d'un même tampon.
- Resuspendre les perles magnétiques dans 400 'L de 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, tampon. Ensuite, mélangez avec 380 OL de H2O et 20 'L de 10 'M oligo d'ADN biotinylated non-modèle. Placer le tube sur un écrou et couver pendant 30 min à température ambiante.
- Laver l'oligo d'ADN non-modèle immobilisé 3 fois avec 200 l de 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, puis 3 fois avec 200 oL de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycérol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL d'albumine de sérum bovin.
- Laisser le tube pendant la nuit à 4 oC pour finir de bloquer les perles avec bSA.
- Le lendemain, placez le tube dans le support magnétique, retirez et jetez le liquide, et resuspendez les perles dans 200 'L de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycérol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL d'albumine de sérum bovin et transférer dans un nouveau tube. Pour ce modèle d'ADN, la concentration finale est d'environ 5 M.
REMARQUE: Le temps d'incubation et la concentration d'oligo doivent être déterminés empiriquement pour chaque oligo d'ADN biotinylated. Ce modèle devrait fournir suffisamment pour 200 réactions, et durer au moins 6 mois lorsqu'il est stocké à 4 oC.
- Oligos d'oligonucléotide d'ARN anneal et de modèle d'ADN dans un rapport molaire de 2:1 (20 et 10 pmol, respectivement) pour obtenir le duplex d'ADN:ARN.
- Mettre en place un mélange d'annealing de 10 l tel que décrit dans le tableau 2.
REMARQUE : 10 ll de mélange d'annealing sont suffisants pour 10 réactions. Le mélange d'annealing peut être mis à l'échelle au besoin si d'autres essais doivent être effectués. - Effectuer les réactions d'annealing dans un cycleur thermique en utilisant le programme suivant : 5 min à 45 oC, suivi de 12 cycles de 2 min chacun, à partir de 43 oC et diminuant la température de 2 oC par cycle. Indile au 4 oC.
REMARQUE: Il s'agit d'un point de temps flexible. L'annealing est terminé à moins de 30 minutes, mais peut être laissé à 4 oC pendant une plus longue période. En laboratoire, les mélanges d'annealing ont été laissés assis pendant jusqu'à 4 h sans observer aucune diminution de l'efficacité de réaction. - Pendant l'annexion de l'ARN à l'ADN du brin de modèle, préparez des tampons pour les étapes ultérieures du protocole. Les ingrédients nécessaires pour préparer chaque tampon pour une seule réaction avec chaque tampon sont énumérés dans les tableaux 2 à 8. Échelle des recettes par un facteur de [Y(X 1) 1] pour le lavage et (X-1) pour tous les autres tampons. X - nombre de réactions à préparer; Y - nombre d'étapes de lavage nécessaires (minimum 3).
REMARQUE : Préparez tous les tampons frais le jour de l'expérience. Ne placez pas de tubes sur la glace après l'ajout de PVA aux tampons. Ajouter Pol II ou nucléotides dans des tampons juste avant de l'utiliser.
- Mettre en place un mélange d'annealing de 10 l tel que décrit dans le tableau 2.
- Chargez la polymérase d'ARN purifiée II sur l'hybride ADN:ARN.
- Mélanger 1 pmol (1 L) de duplex d'ADN:ARN avec 13 l de tampon Pol II (à partir du tableau 3).
- Ajouter 0,02 unité d'ARN purifié Pol II (1 l) au mélange à partir de l'étape 1.3.1 et mélanger en pipetting doucement de haut en bas et en remuant avec la pointe de pipet, sans introduire de bulles. Incuber pendant 10 min à 30 oC.
REMARQUE: Les volumes donnés à partir de maintenant sont pour une seule réaction; d'accroître le nombre de réactions dans l'expérience. L'ARN Pol II purifié du foie de rat tel que décrit10 est utilisé dans cet exemple ; cependant, l'ARN Pol II purifié à partir d'autres sources, y compris les cellules de mammifères cultivés ou de levure peut également être utilisé3,4,5,11,12,13.
- Complétez le complexe d'allongement par l'ajout de l'ADN non-modèle biotinylated.
- Ajouter 5 pmol (1 L) d'oligo d'ADN non-modèle immobilisé à 14 l de tampon d'ADN non-modèle (à partir du tableau4), ajouter au tube à partir de l'étape 1.3.2, et couver pendant 10 min à 37 oC.
- Placer l'échantillon dans un support magnétique pendant 2 min. Laver 1x avec 30 l de tampon de lavage (à partir du tableau 7) pour enlever les Pol II et les oligos non incorporés.
- Générer des complexes d'allongement contenant de l'ARN radio-étiqueté 23mers.
- Effectuer toutes les autres incubations à 30 oC. Ajouter 1 'L'ATP de 15 'M et 10 'Ci (1 'L) de [-32P] UTP (3 000 Ci/mmol) à 23 'L de tampon pulse et l'utiliser pour resuspendre les perles magnétiques lavées.
MISE EN GARDE: Les matières radioactives sont dangereuses. Assurez-vous de porter l'équipement de protection approprié et de suivre toutes les directives du laboratoire pour une utilisation et une élimination sécuritaires des matières radioactives.
REMARQUE: Remplacer l'UTP radiolabeled par 15 UTP de M quand l'ARN radiolabeled n'est pas nécessaire, comme pour des expériences occidentales de tache. - Incuber la réaction pendant 10 min pour permettre la synthèse des 23mers radio-étiquetés.
- Ajouter 1,5 L de solution contenant 100 M ATP et 100 M de mélange UTP à 3,5 l de tampon de chasse, ajouter au tube contenant des complexes d'allongement préassemblés, et incuber pendant 5 minutes pour chasser toutes les transcriptions naissantes en 23mers.
- Placer l'échantillon dans une grille magnétique pendant 2 min, retirer le supernatant, laver une fois avec 30 l de tampon de lavage pour enlever les nucléotides non incorporés, et resuspendre dans 30 l de tampon de lavage.
- Ajoutez 94 ll de mélange d'arrêt avec la protéase K et le glycogène (tableau 9) pour mettre fin aux réactions ou passez à la section 1.6 pour générer des complexes d'allongement avec des transcriptions plus longues ou la section 2 pour effectuer des essais de plafonnement.
- Effectuer toutes les autres incubations à 30 oC. Ajouter 1 'L'ATP de 15 'M et 10 'Ci (1 'L) de [-32P] UTP (3 000 Ci/mmol) à 23 'L de tampon pulse et l'utiliser pour resuspendre les perles magnétiques lavées.
- (Facultatif) Walk Pol II pour faire 23, 25 et 29 transcriptions de nucléotides
- Suivez la procédure décrite dans les étapes 1.2.1 à 1.5.4 pour préparer des complexes d'allongement contenant des 23mers radio-étiquetés. Échelle jusqu'à 4 fois pour générer 120 L de complexes d'allongement lavés, ce qui est assez complexes pour 4 réactions.
- Étiquette 3 nouveaux tubes "23mer", "25mer" et "29mer". Transférer 30 l de complexes d'allongement lavés dans le tube « 23mer » et ajouter 94 l de mélange d'arrêt avec la protéinase K et le glycogène.
- Placez le tube contenant les 90 l restants de complexes d'allongement lavés dans le support magnétique pendant 2 min, retirez le supernatant et suspendez les perles dans 90 L de BTB complétées par 1,2 L chacune de 1,5 mM ATP et 1,5 mM CTP. Incuber pendant 10 min à 30 oC.
- Après avoir lavé une fois avec 90 l de tampon de lavage et de suspension dans 90 l de tampon de lavage comme décrit à l'étape 1.5.4, transférer 30 'L de complexes d'allongement à "25mer" tube et ajouter 94 'L de mélange d'arrêt avec proteinase K et glycogène.
- Placez le tube contenant les 60 l restants de complexes d'allongement dans le support magnétique pendant 2 min, retirez le supernatant et suspendez les perles dans 60 L de BTB complétées de 0,8 L chacune de 1,5 mM ATP et 1,5 mM de CTP.
- Incuber pendant 10 min à 30 oC, laver une fois avec 60 l de tampon de lavage comme dans la section 1.5.5, et resuspendre dans 60 'L de tampon de lavage.
- Transférer 30 l de l'échantillon 2x au tube "29mer" et ajouter 94 'L de mélange d'arrêt avec la protéase K et le glycogène ou passer à la section 2 pour effectuer des essais de plafonnement.
- Procéder à la purification et à l'analyse de l'ARN (section 3).
2. Utilisation de complexes d'allongement artificiel pour mettre en œ9 cotranscription
- Générer des complexes d'allongement lavés contenant 23mers en augmentant la procédure décrite dans les étapes 1.2.1 à 1.5.5 13 fois. C'est suffisant pour 12 réactions et 1 de plus.
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Phosphorylation CTD Pol II
- Placez le tube contenant des complexes d'allongement lavés dans le support magnétique pendant 2 min, retirez le supernatant et suspendez les perles dans 377 L de BTB complétées par 13 L de 1,5 mM ATP.
- Préparer deux nouveaux tubes, étiquetés respectivement H et -H. Pour le tube étiqueté H ajouter 3 'L de 300 ng/L TFIIH, et à la tube étiquetée -H ajouter 9 'L de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glycérol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.5 mg/mL d'albumine de sérum bovin.
REMARQUE: Nous utilisons généralement TFIIH purifié à partir du foie de rat, mais nous avons obtenu des résultats similaires en utilisant 0,6 g / réaction de la recombinante commercialement disponible Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK, qui est le module kinase de TFIIH). Voir Tableau des matériaux pour plus d'informations. - Ajouter 87 l des complexes d'allongement lavés de l'étape 2.2.1 au tube étiqueté H et 270 oL de complexes d'allongement lavés au tube étiqueté -H. Incubate 10 min à 30 oC.
- Placer l'échantillon dans un support magnétique pendant 2 min. Pour éliminer l'excès de nucléotides et de protéines non liées, lavez les complexes d'allongement dans les réactions H et -H avec 90 l ou 270 l de tampon de lavage, respectivement.
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Plafonnement de l'ARN
- Resuspendre les complexes d'allongement dans le tube étiqueté H en 87 'L de mélange de plafonnement (BTB complété par 50 GTP M (tableau 10). Resuspendre les complexes d'allongement dans le tube étiqueté -H en 261 'L de mélange de plafonnement.
- Préparer 4 nouveaux tubes étiquetés 5 ng CE-H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Diluer l'enzyme de plafonnement (CE) en 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20 % de glycérol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL d'albumine de sérum bovin pour préparer des solutions contenant 5 ng CE/L, 15 ng CE/L, ou 45 ng CE/L et distribuer 3 l de la solution appropriée dans chacun des 4 tubes.
- Préparer 12 nouveaux tubes avec 94 ll de mémoire tampon d'arrêt (2.1.1) ajoutéà à chacun.
- Commencez chaque réaction de plafonnement en ajoutant 87 L de complexe d'allongement traité avec TFIIH ou non à des tubes étiquetés contenant de l'enzyme de plafonnement. Incuber à 30 oC dans un bloc de chaleur.
- Après 1, 2 ou 4 min, arrêtez les réactions en transférant 30 ll de chaque mélange de réaction vers des tubes contenant 94 ll de mémoire tampon d'arrêt. Purifie et analysez les produits de réaction tels que décrits à la section 3.
3. Purification et analyse de l'ARN
- Purifier l'ARN
- Incuber les produits de réaction dans un tampon d'arrêt pendant 20 min à température ambiante.
REMARQUE: Point de pause. Les échantillons dans ce tampon ont été maintenus jusqu'à 4 h sans perte ou dégradation de l'ARN. - Extraire une fois avec 124 ll de phénol:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1) et une fois avec chloroform:isoamyl alcool (24:1).
MISE EN GARDE: Le phénol est extrêmement toxique et est rapidement absorbé par la peau. Portez un équipement de protection approprié.
REMARQUE: Pour maximiser la récupération de l'ARN pendant l'extraction, utilisez des tubes disponibles dans le commerce contenant un gel à haute densité, qui constitue une barrière stable entre les phases aqueuses et organiques. Voir Discussion et Tableau des matériaux. - Transférer la phase aqueuse (couche supérieure) dans de nouveaux tubes contenant 12,4 L de 3 M d'acétate de sodium pH 5,2.
- Incuber les produits de réaction dans un tampon d'arrêt pendant 20 min à température ambiante.
- Précipitations d'éthanol
- Ajouter 350 l d'éthanol à 100 % et bien mélanger par inversion.
- Incuber au moins 10 min sur de la glace sèche.
REMARQUE: Point de pause. Pour plus de commodité, on peut s'arrêter ici et terminer la procédure le lendemain; cependant, il est possible de procéder directement à l'étape 3.3 et d'exécuter le gel le même jour. L'ARN peut être maintenu à -80 oC pendant quelques jours avant la poursuite du traitement, mais ne partez pas plus longtemps.
- Préparation d'échantillons d'ARN pour l'électrophoresis de gel
- Laisser les échantillons décongeler, mélanger en inversant 2-3 fois, et centrifuger pendant 15 min à 21 000 x g, 4 oC, dans une centrifugeuse de table. Pendant ce temps, configurez le mélange de gel dénaturant (section 3.4.1).
- Retirez soigneusement l'éthanol des échantillons sans déranger les granulés.
- Ajouter 500 l à l'éthanol à 70 %, inverser le tube une couple de fois pour laver les granulés, puis centrifuger à nouveau à 21 000 x g pendant 5 min à température ambiante ou à 4 oC.
- Retirer autant d'éthanol que possible et faire une rotation rapide (5-10 s) des tubes dans une centrifugeuse de table. Ensuite, à l'aide d'une pointe de chargement de gel, retirez le dernier volume d'éthanol restant.
- Granulés secs à l'air pendant 3 min à température ambiante.
- Dissoudre l'ARN en ajoutant 4 oL de H2O au sommet de chaque granule. Incuber 5 min à température ambiante.
- Ajouter 4 ll de colorant à ARN 2x (Voir tableau des matériaux)au mélange, puis vortex chaque tube pendant quelques secondes pour resuspendre complètement l'ARN.
REMARQUE: Le colorant d'ARN qui contient le formamide au lieu de l'urée est recommandé, puisque ce dernier précipite à basse température. - Faites tourner rapidement les tubes, puis incuber les tubes à 70 oC pendant 10 min dans un bloc de chaleur.
-
Conserver les tubes sur la glace sèche jusqu'à ce qu'ils soient prêts à charger sur du gel.
REMARQUE : Garder l'ARN sur la glace sèche permet la flexibilité de travailler sur d'autres expériences pendant que le gel est polymérisant. Les échantillons n'ont pas besoin d'être réchauffés après la décongélation. Cependant, l'ARN peut être chargé directement après le chauffage si le gel est prêt à fonctionner.
- Préparation du gel Urea-PAGE
- Pour un mélange de gel de 40 ml, mélanger dans un tube conique de 50 ml : 16,7 g d'urée, 15 ml de 40 % de solution bis:acrylamide (19:1 ratio), 4 mL de 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M de borate de sodium, 20 mM EDTA) et 8 mL de H2O. Ce volume est suffisant pour un gel de taille standard (18 cm de hauteur x 16 cm de largeur) avec des espaceurs de 1,0 mm.
MISE EN GARDE: L'acrylamide est extrêmement toxique. Bien qu'il n'y ait aucun risque d'inhalation lorsqu'il est en solution, portez toujours une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité pendant la manipulation.
REMARQUE: Ce mélange est pour la coulée d'un gel dénaturant 15% de polyacrylamide, qui résout facilement l'ARN entre 15-50 nt. Changer la concentration de bis/acrylamide au besoin pour résoudre différentes transcriptions d'ARN de différentes longueurs. - Placer le tube fermé contenant le mélange de gel sur un nutator jusqu'à ce que l'urée soit complètement dissoute.
- Installez une station de coulée de gel avec des plaques de verre, des minuteries de 1 mm et un peigne de 15 puits.
- En travaillant rapidement, ajoutez 40 L de TEMED et 400 L de solution persulfate d'ammonium de 10 % pour geler la solution et bien mélanger. À l'aide d'une couchette de 25 ml, verser la solution de gel entre les plaques, insérer le peigne et laisser le gel polymériser pendant au moins 2 h.
REMARQUE: Si le gel est versé plus de 2 h avant utilisation, une fois qu'il a polymérisé le couvrir avec un essuie-tout humide (laissant le peigne en place) et envelopper avec une pellicule plastique pour l'empêcher de sécher.
- Pour un mélange de gel de 40 ml, mélanger dans un tube conique de 50 ml : 16,7 g d'urée, 15 ml de 40 % de solution bis:acrylamide (19:1 ratio), 4 mL de 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M de borate de sodium, 20 mM EDTA) et 8 mL de H2O. Ce volume est suffisant pour un gel de taille standard (18 cm de hauteur x 16 cm de largeur) avec des espaceurs de 1,0 mm.
- Électrophorésis d'ARN de gel dénaturant
- Après la polymérisation, transférer le gel au réservoir de fonctionnement et le pré-exécuter à 20 mA en 1x TBE pendant 15-30 min.
- Pendant ce temps, décongeler les échantillons (s'ils sont congelés), les vortex et les faire tourner pendant 4 min à 2 000 x g,4 oC.
- Une fois prêt, éteignez l'alimentation et rincez soigneusement chaque puits à l'aide de 1x TBE à l'aide d'une seringue.
- Utilisez des pointes de chargement de gel pour charger des échantillons sur le gel.
- Exécuter le gel à une constante de 20-30 mA pendant environ 2 h ou jusqu'à ce que le colorant inférieur (xylène cyanol FF) atteigne le fond du gel.
- Retirer le gel, le placer sur un morceau de papier absorbant et l'envelopper d'une pellicule plastique.
- Exposer le gel radiolabeled à un écran de phosphore.
- Scanner l'écran phosphore à l'aide d'un phosphorimager et analyser l'image.
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Representative Results
Les figures 2 et 3 montrent des réactions représentatives des résultats utilisées pour générer des complexes d'allongement artificielcontenant contenant des transcriptions de différentes longueurs en étendant ou Pol II de différentes sources. La figure 4 montre comment ces complexes d'allongement peuvent être utilisés pour déterminer le plafonnement de l'ARN dépendant de la phosphorylation CTLation cotranscription.
Figure 2A est un diagramme de molécules d'ADN et d'ARN dans des complexes d'allongement artificiel. La figure 2B montre des transcriptions de différentes longueurs générées dans les réactions effectuées exactement comme décrit dans le Protocole 1, dans lequel les complexes d'allongement artificiel de départ ont été préparés à l'aide d'un oligo à ARN synthétique de 20 nt (bleu foncé dans la figure 2A ; ARN-20mer, tableau 1). Puisque nous connaissons la longueur de départ de l'ARN et la séquence de modèle d'ADN, nous pouvons déterminer le sous-ensemble de nucléotides —ATP, CTP, GTP, ou UTP-nécessaire pour marcher Pol II à une position définie le long du modèle. Le nombre de nucléotides nouvellement synthétisés est ajouté à la taille de départ de l'amorce d'oligonucléotide d'ARN pour déterminer la longueur prévue finale (taille d'oligo d'ARN - nombre de nucléotides ajoutés). En présence de l'ATP et de l'UTP, Pol II peut ajouter 3 nt à l'oligo à ARN 20 nt pour générer des complexes d'allongement contenant un ARN 23mer. Si l'on lave l'ATP et l'UTP non incorporés et ajoute ensuite ATP et CTP, le 20 nt oligo est prolongé de 2 nt pour faire un 25mer, et si l'on lave à nouveau les nucléotides non incorporés et ajoute ATP et GTP, la transcription est prolongée d'un 4 nt supplémentaire pour faire un 29mer. ce les transcriptions nouvellement générées correspondent à la taille prévue d'ARN et puisque presque tous les 23mers radio-étiquetés peuvent être quantitativement chassés dans des produits plus longs, on sait que l'utilisation de cette méthode (i) l'oligo d'ARN est correctement placé à la sortie de Pol II pendant l'assemblage et (ii) les ARN radio-étiquetés sont associés à des complexes d'allongement Pol II actifs.
La figure 2C montre une variation du protocole, dans laquelle les complexes d'allongement de départ ont été préparés à l'aide du même modèle d'ADN et des oligos brins non-modèles et d'un oligo d'ARN (ARN-29mer, tableau 1) qui contient 9 nucléotides supplémentaires à son 5'-end mais est par ailleurs identique dans l'ordre à l'oligo 20 nt ARN. Puisque la longueur d'ARN de départ est 29 nt dans ce cas, les complexes d'élongation contenant 32mer, 34mer, et 38mer transcriptions peuvent être produites utilisant les mêmes étapes de marche de Pol II décrites ci-dessus.
Selon la portée de l'analyse, cette méthode permet une flexibilité dans la source de Pol II. Dans la figure 3, nous comparons les réactions à l'aide de Pol II provenant de différentes sources. Dans les réactions montrées dans les 4 premières voies, des complexes artificiels d'allongement ont été assemblés avec le type endogène et sauvage Pol II purifié du foie de rat ou de la levure de fission et ont marché comme décrit ci-dessus pour produire 23mers ou 25mers. Le rat et la levure de fission Pol IIs utilisé dans ces réactions ont été purifiés à la quasi-homogénéité en utilisant des étapes chromatographiques multiples.
La méthode peut également être utilisée pour générer des complexes artificiels d'allongement contenant du type sauvage ou mutant Pol II préparé s'appuyant sur une méthode simple de purification en une seule étape. Les deux dernières voies dans le spectacle de figure essais effectués à l'aide d'une forme mutante de Pol II humain qui n'a pas le CTD dans sa sous-unité Rpb1, qui n'est pas nécessaire pour l'activité catalytique Pol II, mais aide à coupler la transcription au plafonnement de l'ARN. Le Pol II sans CTD utilisé dans ces essais a été purifié par l'immuno-purification anti-FLAG à partir d'une lignée cellulaire humaine exprimant une version marquée épitope FLAG de Rpb1. Il est important de noter que la concentration de Pol II actif variera d'une préparation à l'autre. Ainsi, il est essentiel d'effectuer des expériences initiales dans lesquelles la quantité de Pol II utilisée dans les réactions est variée pour déterminer la quantité nécessaire pour obtenir l'activité désirée.
La figure 4 montre un exemple représentatif d'un jeu comparant le plafonnement des transcriptions radiolabeled associées aux complexes artificiels d'allongement contenant Pol II avec un CTD phosphorylé ou non phosphorylé. Pour ces essais, des complexes d'élongation contenant 23 transcriptions de nucléotide avec une extrémité de 5'-triphosphate ont été préparés comme décrit dans le protocole 2.
L'incubation de complexes d'allongement avec enzyme de plafonnement conduit à un changement de mobilité d'environ 1 nt, indiquant l'ajout d'un bouchon de 5'14,15. Pour quantifier les réactions de plafonnement, on détermine l'efficacité du plafonnement, exprimée comme pourcentage de l'ARN qui est plafonné. L'efficacité du plafonnement est le rapport entre l'ARN plafonné et l'ARN total, divisé par le plafonnement maximal obtenu. Dans nos essais, nous constatons que le plafonnement maximal obtenu des oligos d'ARN obtenus à partir de sources commerciales est de 85 %, probablement en raison de la triphosphorylation incomplète de l'ARN synthétique.
Dans les réactions montrées dans les 3 premières voies, les complexes d'allongement ont été incubés avec le facteur de transcription général TFIIH et le cofacteur ATP pour phosphorylateler le Pol II CTD avant le plafonnement. Dans ces réactions, un plafonnement presque maximal a été observé à 1 min après ajout de 5 ng d'enzyme de plafonnement. Lorsque les essais ont été effectués à l'aide de complexes d'allongement qui ne sont pas incubés avec TFIIH et contiennent donc pol II non phosphorylé, il a fallu près de 10 fois plus d'enzymes de plafonnement pour observer des niveaux similaires de plafonnement. Les deux dernières voies de la figure 4 montrent les produits des réactions dans lesquelles des complexes d'allongement ont été incubés avec ou sans enzyme de plafonnement, en présence de TFIIH. Fait important, la dépendance à tFIIH des complexes d'allongement artificiel de plafonnement cotranscription démontrés dans ce chiffre est très similaire à celle observée dans les complexes d'allongement qui avaient initié la transcription chez un promoteur dans des systèmes enzymatiques plus complexes. 5.
Figure 1 : Assemblage de complexes d'allongement artificiels. (A) ARN oligo (bleu foncé) de 20 nt est annealed à un brin de modèle d'ADN (vert) à travers une séquence complémentaire de 9 nt. (B) RNA polymérase II (Pol II) est mélangé avec l'hybride annealed DNA:RNA pour positionner l'ARN 3'-extrémité au site catalytique Pol II. (C) Un excès molaire de 3' biotinylated non-template brin DNA oligo (bleu clair) est ajouté au mélange de réaction pour enfermer et stabiliser davantage le complexe d'allongement. (D) Les complexes d'allongement immobilisés sont lavés pour enlever l'excès d'oligos et incubés avec des combinaisons appropriées de nucléotides pour permettre à Pol II d'étendre l'oligo d'ARN à la longueur désirée. La partie nouvellement synthétisée de l'ARN est montrée en jaune. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Pol II marchant à l'aide d'oligos à ARN de différentes longueurs. (A) Diagramme de complexes artificiels d'allongement, montrant des nucléotides ajoutés pendant les promenades. L'ADN de brin et de brin de modèle non-modèle sont montrés en bleu clair et vert, respectivement. L'oligo de 20 nt RNA est représenté en bleu foncé. On voit également des nucléotides ajoutés lors de promenades successives pour générer 23mer ARN (orange), 25mer ARN (brun) et 29mer ARN (magenta). (B) Électrophoresis de gel dénaturant montrant des ARN de longueur définie obtenue après avoir marché Pol II à l'aide d'une amorce d'ARN de 20 nt, tel que décrit dans le protocole 1. Les nucléotides ajoutés lors de chaque étape de marche séquentielle du protocole sont orange codé en couleur (23mer), brun (25mer) et magenta (29mer). (C) Pol II marche à partir d'une amorce d'ARN 29 nt, mais autrement exactement comme celle montrée dans B. (B et C) montrent des parties du même gel, mais ont été séparés à des fins d'illustration. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Transcriptions synthétisées par des complexes d'allongement artificiels contenant du type sauvage ou mutant Pol II. Des complexes artificiels d'allongement ont été assemblés à l'aide de l'amorce d'ARN 20 nt et de Pol II endogène hautement purifié du foie de rat ou de la levure de fission ou du Pol II immunopurifié FLAG manquant du Rpb1 des cellules de HeLa (F:Rpb1-CTD). L'ARN dans chaque complexe a été étendu à 23 nt ou 25 nt. Voir le texte pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Activation dépendante de la phosphorylation du plafonnement de l'ARN cotranscriptionnel. Des complexes artificiels d'allongement contenant le foie de rat Pol II et l'ARN radiolabeled 23mer ont été incubés avec l'ATP et le facteur de transcription général TFIIH ou tampon pendant 10 min pour phosphorylateler le CTD de Pol II. Après le lavage, les complexes d'allongement ont été incubés avec 5 ng, 15 ng, ou 45 ng d'enzyme de plafonnement des mammifères pendant 1, 2 ou 4 min. Les 23mers plafonnés et non plafonnés ont été résolus dans un gel dénaturant (en haut, les 12 premières voies) et l'ARN plafonné en % a été quantifié et tracé (en bas). Cette partie du chiffre a été initialement publiée dans ref 5, qui a été publié sous forme d'article en libre accès sous licence CC-BY. Les deux dernières voies, issues d'une expérience distincte, illustrent les produits de réactions dans lesquelles des complexes d'allongement ont été incubés avec ou sans enzyme de plafonnement, en présence de TFIIH. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| ordre | Commentaires | |
| ARN 20mer | ACUCUCAUGUCUGAUGCUUU | 5' Modification de triphosphate; PAGE et RP-HPLC purifiés |
| ARN 29mer | ACUCUAUGACUCUUCAUGUCUGAUGCUU | 5' Modification de triphosphate; PAGE et RP-HPLC purifiés |
| Template Strand ADN | CTACGGTTAAGCTCACGGTACTTTTTGAA TTAAGCATCATGG TTAAGCATCATGG |
Dual PAGE et HPLC purifiés |
| ADN Strand non-modèle | ATCAGAAATGTACCGTGAGCTTAACCGTAG | 5' TEG-biotinylated; HPLC purifié |
Tableau 1 : oligonucléotides d'ADN et d'ARN
| Concentration finale | volume | |
| Tris HCl pH 7,5 | 12 mMD | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1 l |
| 300 mM KCl | 50 mM | 1,67 l |
| 10 M Template Strand ADN oligo en 100 mM Tris-HCl pH 7,5 | 1 M | 1 l |
| 10 M d'oligo d'ARN en 10 mM Tris-HCl pH 7,5 |
2 M | 2 l |
| eau | 4,33 l | |
| 10 l | ||
| Tous les Tris-HCl proviennent de solutions d'oligo d'ADN et d'ARN | ||
Tableau 2 : Cocktail pour l'annexion de l'ADN et des oligos à ARN
| Tampon Pol II | Concentration finale | Volume/réaction |
| eau | 4,52 l | |
| 50 mM MgCl2 | 4,67 mM | 1,40 l |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | 23 mM | 1,40 l |
| 300 mM KCl | 27 mM | 1,33 l |
| 50% de glycérol | 3 % | 0,9 l |
| 20 mg/ml de BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mm | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 3 l |
| 13 l | ||
| Juste avant d'utiliser le tampon ajouter: | ||
| Annealed modèle brin ADN:ARN (à partir du tableau 1) | 1 l | |
| ARN Polymériase II | 1 l | |
| La concentration finale de KCl dans le mélange est de 50 mM, avec KCl supplémentaire venant de Pol II | ||
| Les concentrations finales de MgCl2 et de Tris HCl sont respectivement de 5 met et 25 mM, | ||
| Les MgCl2 et Tris HCl supplémentaires proviennent du produit annealed DNA:RNA. | ||
Tableau 3 : Mélange Pol II
| Tampon d'ADN non-modèle | Concentration finale | Volume/réaction |
| eau | 4,48 l | |
| 300 mM KCl | 43,33 mM | 2,17 l |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1,50 l |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | 25 mM | 1,50 l |
| 50% de glycérol | 3 % | 0,9 l |
| 20 mg/mL bSA | 0,5 mg/ml | 0,38 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mm | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 3 l |
| 14 l | ||
| Juste avant d'utiliser le tampon ajouter: | ||
| 5 M Oligo d'ADN non-modèle biotinylated | 1 l | |
| La concentration finale de KCl dans le mélange est de 50 mM, avec KCl supplémentaire provenant du tampon d'oligo d'ADN non-modèle. | ||
Tableau 4 : Mix d'ADN non-modèle
| Tampon d'étiquetage des impulsions | Concentration finale | Volume/réaction |
| eau | 9,98 l | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 ll |
| 50% de glycérol | 3 % | 1,5 l |
| 20 mg/mL bSA | 0,5 mg/ml | 0,63 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,4 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 12 mM | 0,3 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mm | 0,13 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 5 ll |
| 23 l | ||
| Juste avant d'utiliser le tampon ajouter: | ||
| 15 M ATP | 0,6 M | 1 l |
| 3,3 M [-32P]UTP | 0,13 M | 1 l |
| La concentration finale de Tris HCl est de 20mM, avec le HCl de Tris supplémentaire venant du tampon de nucléotide. | ||
Tableau 5 : Mélange NTP d'étiquetage des impulsions
| Mémoire tampon Chase | Concentration finale | Volume/réaction |
| Tris HCl, pH 7,5 | 30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 l |
| eau | 0,6 l | |
| 50% de glycérol | 3 % | 0,3 l |
| 10 mM DTT | 0,5 mm | 0,25 l |
| 100 mM HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,15 l |
| 20 mg/mL bSA | 0,5 mg/ml | 0,13 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 1 l |
| 3,5 l | ||
| Juste avant d'utiliser le tampon ajouter: | ||
| 100 M UTP, 100 M ATP dilué en 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 | 5 M | 1,5 l |
| Tous les Tris HCl provient de tampon nucléotide |
Tableau 6 : Chase NTP mix
| Concentration finale | Volume/réaction | |
| eau | 24,21 l | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1,8 l |
| 50% de glycérol | 3 % | 1,8 l |
| 20 mg/ml de BSA | 0,5 mg/mL | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 l |
| 10% PVA | 0,2 % | 0,6 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mm | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 l |
| 30 l |
Tableau 7 : Tampon de lavage
| Concentration finale | Volume/réaction | |
| eau | 14,13 l | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 l |
| 50% de glycérol | 3 % | 1,8 l |
| 20 mg/ml de BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mm | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 l |
| 10% PVA | 2% | 6 l |
| 30 l |
Tableau 8 : Tampon de transcription de base (BTB)
| Arrêter le tampon | Concentration finale | Volume/réaction |
| eau | 55,74 l | |
| 1 M Tris HCl, pH 7,5 | 10 mM | 0,6 l |
| 5 M NaCl | 300 mM NaCl | 3,6 l |
| 500 mM EDTA | 0,5 mM EDTA | 0,06 l |
| 10% SDS | 0,2 % de SDS | 1,2 l |
| 60 l | ||
| Juste avant d'utiliser le tampon ajouter: | ||
| 15 mg/mL de glycogène | 2 l | |
| 20 mg/mL Protéase K | 2 l | |
| eau | 30 l | |
Tableau 9 : Stop mix
| Concentration finale | Volume/réaction | |
| eau | 11,9 l | |
| 300 mM KCl | 53,33 mM | 5,33 l |
| 50% de glycérol | 3 % | 1,8 l |
| 1,5 M GTP dilué en 100 mM Tris HCl, pH 7,5 | 50 M | 1 l |
| 100 unités/mL Pyrophosphatase inorganique, Levure | 0,1 unités/réaction | 1 l |
| 20 mg/ml de BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 16,67 mM | 0,5 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mm | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 l |
| 10% PVA | 2% | 6 l |
| 29 l | ||
| Juste avant d'utiliser le tampon ajouter: | ||
| Enzymatique de plafonnement | 1 l | |
| La concentration finale de KCl dans le mélange est de 60 mM, avec KCl supplémentaire provenant de l'enzyme de plafonnement et de la pyrophosphatase | ||
| La concentration finale de Tris HCl est de 20 mM, avec le HCl de Tris supplémentaire venant du tampon de nucléotide | ||
Tableau 10 : Mélange de plafonnement
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Discussion
Les études qui cherchent à disséquer les événements couplés au complexe d'allongement de Pol II tels que le traitement de l'ARN et la régulation de l'allongement de transcription lui-même peuvent être grandement facilitées par l'utilisation d'un système enzymatique fortement purifié. La mise en place de tels systèmes enzymatiques peut être difficile. La transcription dépendante du promoteur par Pol II nécessite au moins cinq facteurs de transcription généraux. La préparation et le stockage de ces facteurs peuvent prendre des mois; par conséquent, l'étape de limitation de taux dans ce processus est souvent simplement la préparation du cadre des facteurs de transcription nécessaires pour reconstituer la transcription basale dans le tube à essai.
Dans cet article, nous décrivons une adaptation des méthodes précédemment développées pour produire des complexes artificiels d'allongementdetranscription 2,3 utilisant seulement le Pol II purifié et les oligonucléotides d'ADN et d'ARN synthétiques. Les complexes d'allongement qui en résultent sont d'une activité transcriptionnelle et conviennent à l'étude du couplage de la transcription de Pol II et du plafonnement de l'ARN5. Il est important de noter que la transcription et le plafonnement de l'ARN se produisent in vivo dans le contexte de la chromatine et de nombreuses autres protéines qui ne sont pas présentes dans ce système enzymatique défini; par conséquent, ce système devrait récapituler de nombreuses caractéristiques, mais pas toutes, des réactions qui se produisent in vivo. Le protocole que nous décrivons s'appuie sur les méthodes précédentes en immobilisant les complexes artificiels d'allongement par l'ADN biotinylated lié aux perles magnétiques, permettant au chercheur facilement de changer des conditions de réaction et/ou d'enlever les nucléotides non incorporés différentes étapes des essais. Fait important, parce que l'étiquette utilisée pour immobiliser les complexes d'allongement se trouve à une extrémité du brin d'ADN non-modèle plutôt que sur Pol II lui-même ou sur le brin de modèle, seuls ceux Pol II associés à des complexes d'allongement complets seront conservés sur des perles.
Puisque les transcriptions naissantes doivent avoir une extrémité de 5'-triphosphate afin d'être modifiées en plafonnant l'enzyme, les oligonucléotides synthétiques d'ARN utilisés pour des expériences de plafonnement sont achetés avec le termini de 5'-triphosphate. Cependant, les oligos d'ARN non modifiés peuvent être utilisés pour d'autres applications, y compris des études d'autres événements de traitement de l'ARN co-transcriptionnel ou les activités des facteurs de transcription qui régulent l'allongement de Pol II. Indépendamment de l'application en aval, nous recommandons l'assemblage de complexes d'allongement avec des oligos d'ADN et d'ARN hautement purifiés. En particulier, les oligos biotinylated d'ADN devraient être purifiés par HPLC, et d'autres oligos d'ADN et d'ARN devraient être purifiés par l'électrophores de gel de polyacrylamide et/ou HPLC. Toutefois, la pureté des activités enzymatiques devra être déterminée au cas par cas et dépendra de la portée de chaque expérience.
L'ajout de l'oligo d'ADN biotinylated non-modèle dans la dernière étape de l'assemblage devrait être, en principe, suffisant pour obtenir un complexe ternaire. Cependant, nous incluons toujours au moins une étape de « marche » pour confirmer Pol II incorpore le nombre correct de nucléotides : Si le but de l'expérience est de générer des substrats pour assainer le plafonnement co-transcriptionnel ou d'autres étapes de traitement d'ARN ou de suivre Pol II l'allongement, nous incluons toujours un ribonucléotide 32P-étiqueté dans la « marche » initiale de sorte que la transcription puisse être visualisée et employer les nucléotides « froids » non étiquetés pour des étapes suivantes de sorte que l'activité spécifique des transcriptions de différentes longueurs reste constant. Bien que la méthode décrite dans ce protocole utilise 32nucléotides étiquetés P pour visualiser les transcriptions naissantes, des essais à base de fluorescence peuvent être utilisés pour mesurer l'étiquetage de l'ARN lorsqu'il n'est pas possible de travailler avec des matières radioactives. Cependant, il est important de noter que la sensibilité de tels essais est généralement beaucoup moins que ceux qui utilisent des étiquettes radioactives, et ils nécessitent généralement de plus grandes quantités d'enzymes.
Une étape clé pour les expériences reproductibles est une bonne récupération de l'ARN pendant le phénol:chloroform:extraction d'isoamyl et les précipitations d'éthanol. Nous avons constaté que l'utilisation de tubes de microcentrifuge contenant des gels à haute densité (voir Tableau des matériaux) pour le phénol:chloroform:isoamyl extraction augmente la reproductibilité et le rendement de l'acide nucléique de cette étape. En outre, l'utilisation de glycogène coloré (voir Tableau des matériaux) comme transporteur pendant les précipitations d'éthanol, il est plus facile de voir de petites pastilles d'acide nucléique, ce qui rend moins probable que l'on perd par inadvertance le granule en l'aspirant lors de l'enlèvement de la supernatant d'éthanol.
Les complexes artificiels d'allongement générés à l'aide de protocoles similaires à ceux que nous décrivons devraient également être utiles pour mesurer les interactions protéines-protéines ou acides protéiques-nucléiques entre le complexe d'allongement Pol II et les facteurs qui régulent la transcription événements d'allongement ou de traitement de l'ARN liés à l'allongement. Dans ce cas, les protéines qui restent liées à des complexes artificiels d'allongement après lavage sont détectées par le ballonnement occidental ou la spectrométrie de masse ; l'ARN de radiolabeling n'est pas nécessaire et nous faisons toutes les étapes de transcription avec seulement les nucléotides « froids ».
Enfin, cette méthode pourrait être utile pour les analyses structurelles des complexes de transcription. En effet, des méthodes connexes ont été utilisées dans des études cryo-EM avec des enzymes de levure et de mammifères pour reconstituer les interactions enzyme-Pol II13, et les interactions de Pol II avec d'autres protéines ou complexes protéiques pendant l'allongement12, pause16,17, et plus récemment, lié à un nucléosome18. Une complication possible pour des analyses structurales des complexes de transcription produites utilisant cette méthode est la nécessité d'enlever les perles biotine/magnétiques du complexe ; cependant, ceci peut être résolu en incluant dans les oligos d'ADN des emplacements spécifiques reconnus par des enzymes de restriction ou en utilisant des liaisons de biotine qui sont clivées au loin après traitement de rayon UV19.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions S. Shuman d'avoir fourni l'adncadapage de l'enzyme de plafonnement des mammifères. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention au Stowers Institute for Medical Research du Helen Nelson Medical Research Fund de la Greater Kansas City Community Foundation. Les données originales sous-jacentes à ce manuscrit peuvent être consultées à partir du dépôt de données d'origine Stowers à http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
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