Summary
Burada, sadece kısa sentetik DNA ve RNA oligonükleotides ve arıtılmış pol II gerektiren RNA polimeraz II (pol II) uzama kompleklerinin montajını tarif ediyoruz. Bu kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ile ilişkili transkriptlerin Co-transcriptional işleme temel mekanizmaları eğitim için yararlıdır.
Abstract
Ökaryotik mRNA sentezi, bir DNA şablonunun, Multi-subunit enzim RNA polimeraz II ve Co-transcriptional kapatma ve preürosi RNA 'nın olgun mRNA 'yı oluşturacak şekilde birleştirilmesini gerektiren karmaşık bir biyokimyasal süreçtir. MRNA sentezi sırasında, RNA polimeraz II uzama kompleksi, katalitik aktivitesini kontrol eden büyük bir transkripsiyon faktörleri koleksiyonu ve olgun mRNA 'yı yaratan 3 ' işleme enzimleri ile düzenleme yapmak için bir hedeftir. MRNA sentezinin içsel karmaşıklığı nedeniyle, yalıtım ve çeşitli ortak transkripsiyon aşamalarında araştırma sağlayan basit deneysel sistemler büyük bir yarar vardır.
Bu yazıda, ortak transcriptional RNA kapatma soruşturması için uygun bir basit deneysel sistem açıklanmaktadır. Bu sistem, saflaştırılmış polimeraz ve yapay transkripsiyon kabarcıklarının montajında tanımlanan RNA polimeraz II uzama kompleksine dayanır. Biyotinlenmiş DNA ile immobilize zaman, bu RNA polimeraz II uzama kompleksleri bir kolayca manipülasyon ortak transcriptional RNA kapatma ve mekanizmalar tarafından uzama kompleksi acemi ve düzenler sırasında enzimi sırasında sabitleme bir araç sağlar RNA 'nın ortak transkripsiyon. Bu sistemin, RNA polimeraz II uzama kompleksine bağlanmış olan mRNA olgunlaşma diğer aşamalarında roller ile protein veya protein kompleksler istihdam ve/veya montaj eğitim için adapte olabilir tahmin.
Introduction
Ökaryotik haberci RNA (mRNA) sentezini RNA polimeraz II ve olgun mRNA verim için ön RNA işleme tarafından işlenmemiş bir ön-RNA sentezini içeren ayrıntılı bir biyokimyasal süreçtir. Capping, splicing ve Poliadenilasyon RNA işleme adımları büyük ölçüde ortak transkripsiyonlama gerçekleştirilir. Pol II uzama kompleksi, RNA işleme enzimlerinin çoğunun faaliyetlerini yapan ve düzenleyen bir iskele olarak hizmet vermektedir. Sonuç olarak, Olgun ökaryotik mrb 'ların nasıl üretilmesine ilişkin en son anlayışımız, işe temel alan biyokimyasal mekanizmaların uzama kompleksine atılmasına izin vermek için deneysel sistemlerin gelişmesine ağır bir şekilde dayanacak ve Co-transcriptional kapatma, birleştirme ve polyadenilasyon sorumlu enzimlerin düzenlenmesi.
Şaşırtıcı değil, bu tür deneysel sistemlerin geliştirilmesi zor olmuştur. Büyük bir engel sadece pol II in vitro tarafından bazal transkripsiyon reconstituting beş genel transkripsiyon başlatma faktörleri en az bir dizi gerektirir pol II transkripsiyon kendisi olağanüstü karmaşıklığı olmuştur: TGı, TFııD, TGı, TFııF ve TFııH 1. dahası, her türlü DÜZENLENMIŞ pol II transkripsiyon içinde vitro reconstituting transkripsiyon faktörleri ve coregulators daha büyük bir dizi gerektirir. Böylece, önemli bir amaç, Pol II transkripsiyon ve RNA işleme fonksiyonel bağlantı incelemeleri için uygun aktif pol II uzama kompleksler reanayasa sağlayan basit deneysel sistemler geliştirmek olmuştur.
Aktif pol II uzama kompleksler reconstituting için böyle basit bir yöntem, uzun pol II ve daha Geçenlerde, Co-transcriptional RNA işleme araştırmak için yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için yararlı olduğunu kanıtladı2,3 ,4,5. Bu yazıda, nasıl pol II uzama kompleksleri saflaştırılmış pol II ve sentetik transkripsiyon kabarcıkları hazırlanan gösterir nasıl etkili mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir Co-transcriptional, nazcent pol II transkripsiyonlarını üst altta yatan.
Capping, 5 '-guanosin "Cap" ' in 5 '-trifosfat sonuna kadar bulunan pol II transkriptlerinin kovalent ilavesi anlamına gelir. Cap, mRNA olgunlaşma, taşıma, çeviri ve diğer süreçler6,7sonraki adımlar için önemlidir. Kap, enzimin tıkanması olarak adlandırılan bir enzim tarafından pol II transkriptleri için ortak transcrip, eklenir. Mammalin hücrelerinde, kapatma enziminin RNA 5 '-trifosfataz ve Guanil transferaz faaliyetlerinden sorumlu aktif siteler tek bir polipeptid8içinde yer alır. Kapatma enzim pol II vücut ve Rpb1 karboky-terminal alanı (CTD) Ser5 heptapeptid tekrarlar üzerinde fosforylated yüzeyler üzerinde henüz tanımlanmalıdır ile etkileşimler ile yan II uzama kompleksi için işe5. Uzama kompleksinde, en az 18 nükleotib uzunluğuna ulaştığında ve polimeraz RNA çıkış kanalından ortaya çıkan bir kez, 5 '-guanozin kapağının ilavesi ile katlanma enzimi katalizler. Kapatma reaksiyonu ilk adımda, trifosfataz 5 '-difosfat verim RNA 5 '-trifosfat hidrolize. İkinci adımda, GTP, Guanil transferase tarafından GMP 'ye hidrolize edilir ve bir GMP-capping enzim orta oluşturur. Son olarak, Guanil transferaz, GMP 'yi 5 '-difosfat sonuna kadar aktarıyor ve kapağı üretecektir.
Kapatma reaksiyonunun dikkat çekici bir özelliği, Co-transcriptional (örn., fonksiyonel pol II uzama kompleksler ile ilişkili transkripsiyon), serbest RNA5,9' dan çok daha etkilidir. Böylece, alandaki önemli bir soru, Pol II uzama kompleksi ile kapatma enziminin etkileşimleri yoluyla nasıl bu dramatik etkinleştirme işlemi elde edilmiştir. Bu protokolde, sadece arıtılmış RNA polimeraz II ve yapay transkripsiyon kabarcıkları kullanılarak aktif RNA polimeraz II uzama kompleklerinin montajı açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tanımlanan uzunluk ve sıralı transkriptler ile RNA polimeraz II uzama kompleksleri oluşturulması sağlar. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, RNA kaplama5mekanizmalarının yönlerini araştırmak için bir model olarak bu tanımlanan RNA polimeraz II uzama kompleksini kullandık. Özellikle, biz (i) RNA bu uzama kompleksleri ile ilişkili üst 100-kat daha fazla ücretsiz RNA ve (ii), Pol II CTD TFIıH bağımlı fosforilasyon tarafından uyarılmış daha verimli olduğunu gösterdi. Burada açıklanan yaklaşım, Pol II uzama kompleksine bağlı diğer ortak transcriptional RNA işleme reaksiyonları okumak için substratlar oluşturmak için uyarlanabilir.
Bu protokolün Bölüm 1 ' de, yapay uzama kompleksleri, sentetik bir şablon Strand DNA oligonükleotid bir RNA oligonükleotid tavlama tarafından oluşturulan 3 '-End yaklaşık 9 nükleotid şablon Strand DNA. Pol II daha sonra DNA üzerine yüklenir: RNA dubleks. Uzama kompleksi daha sonra, 3 ' End (Şekil 1 ve Şekil 2a) ile biotin ile etiketlenmiş kısmen tamamlayıcı, şablon içermeyen, DNA oligonükleotit ilavesi ile tamamlanır. RNA oligonükleotit, radyoaktif nükleotidler uygun kombinasyonları ilavesi üzerine tanımlanan uzunluk ve dizi radyoaktif transkriptler yapmak için bu uzama kompleksler pol II tarafından uzatılır. Buna ek olarak, uncorporated nükleotidler ve nükleotid farklı kombinasyonları daha da ilavesi kaldırmak için yıkımların bir kombinasyonu kullanarak, bir "pol II DNA şablonu boyunca farklı pozisyonlara yürüyebilir ve tanımlanan uzunlukları RNA sentezlemek. RNA daha sonra arıtılır ve denatüre üre-sayfa jeller içinde Elektroforez maruz. Protokolün Bölüm 2 ' de, yapay uzama kompleksleri, eş transkripsiyon RNA 'nı analiz etmek için kullanılır. Bu örnek, Pol II CTD 'nin TFIıH bağımlıdır fosforilasyonu ile birlikte transcriptional RNA 'nın tıkanması üzerindeki etkisini ölçer. Bu deneyde, enzim konsantrasyonunun (5, 15 ve 45 ng reaksiyon başına) ve zaman (1, 2 ve 4 dk) olarak bir fonksiyon olarak ortak transcriptional kapak kapsamını ölçüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. yapay uzama kompleksleri ve Pol II yürüyüş montajı
- Manyetik boncuk üzerinde 3 ' biotin molekül içeren olmayan şablon DNA oligo 1 nmol immobilize.
Not: aşağıdaki adımlar gelecekteki deneyler için hazırlamak için önceden yapılabilir. Bu protokolde kullanılan tüm oligo dizileri Tablo 1' de sağlanır. RNA oligos 5 '-trifosfat modifikasyonlarla sentezlenmiş durumdadır.- 200 μL manyetik boncuk (10 mg/mL) düşük protein bağlayıcı 1,5 mL tüp ekleyin ve sonra 2 dakika için bir manyetik raf yerleştirin.
- Tüp manyetik raf üzerinde iken, boncuklar rahatsız etmeden tüpten sıvı çıkarın. Boncuklar yıkamak için, rafa tüp kaldırmak, eklemek 1 mL 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, raf için tüp iade ve 2 dakika sonra yıkama solüsyonu çıkarın.
- Aynı arabelleğin 200 μL kullanarak 2 kez daha tekrar yıkanıyor.
- 400 μL 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, tampon içinde resuspend manyetik boncuk. Sonra 380 μL H2O ve 20 μl 10 μM şablon olmayan biyotinlenmiş DNA oligo ile karıştırın. Tüpü bir fındığa yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın.
- 5 mM Tris-HCl pH 7,5 200 μL ile yıkama immobilize olmayan şablon DNA oligo 3 kez, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, ve sonra 3 kez 200 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9,% 20 gliserol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL Sığır serum albümin.
- BSA ile engelleme boncuk bitirmek için 4 °C gece tüp bırakın.
- Ertesi gün, manyetik rafa tüp yerleştirin, kaldırmak ve sıvı atmak, ve pelletini boncuk 200 μL 20 mm HEPES-NaOH pH 7,9, 20% gliserol, 100 mm KCL, 1 mm EDTA, 0,5 mg/ml Sığır serum albümin ve yeni bir tüp transfer. Bu DNA şablonu için son konsantrasyon yaklaşık 5 μM ' dir.
Not: İnkübasyon süresi ve oligo konsantrasyonu her biyotinlenmiş DNA oligo için ampirik olarak belirlenmelidir. Bu şablon 200 reaksiyon için yeterli sağlamalıdır ve 4 °C ' de saklanırken en az 6 ay sürecek.
- Anneal RNA ve DNA şablonu bir 2:1 molar oranı (sırasıyla 20 ve 10 pmol), DNA elde etmek için oligonükleotide oligos: RNA dubleks.
- Tablo 2' de açıklandığı gibi 10 μL tavlama karışımı ayarlayın.
Not: 10 μL tavlama karışımı 10 reaksiyon için yeterlidir. Daha fazla bilgi gerçekleştirilirse, tavlama karışımı gerektiği gibi ölçeklendirilebilir. - Aşağıdaki programı kullanarak bir termal bisikletçinde tavlama reaksiyonları gerçekleştirin: 45 °C ' de 5 dakika, her biri 43 °C ' den başlayarak 12 döngüden sonra, her döngü için 2 °C sıcaklık azalması. 4 °C ' de boşta.
Not: Bu esnek bir zaman noktasıdır. Tavlama ~ 30 dakika içinde biter ancak daha uzun bir süre için 4 °C ' de bırakılabilirler. Laboratuvarda, tavlama karışımları, reaksiyon verimliliğinde herhangi bir azalma gözlemlemeden 4 saate kadar oturarak bırakılmıştır. - RNA 'nın şablona DNA 'yı tavlama sırasında, protokolün daha sonraki adımlarında arabellekleri hazırlayın. Her tampon ile tek bir reaksiyon için her arabellek hazırlamak için gerekli malzemeler 2 ila 8 tablolarda listelenir. Diğer tüm arabellekler için yıkama ve (X + 1) için [Y (X + 1) + 1] faktörüyle tarifleri ölçeklendirin. X = hazırlanacak reaksiyon sayısı; Y = gerekli yıkama adımlarının sayısı (en az 3).
Not: tüm arabellekleri deneme günü taze hazırlayın. PVA tamponlara eklendikten sonra tüpleri buzda yerleştirmeyin. Kullanmadan önce arabelleğine pol II veya nükleotidler ekleyin.
- Tablo 2' de açıklandığı gibi 10 μL tavlama karışımı ayarlayın.
- DNA: RNA melez üzerine saflaştırılmış RNA polimeraz II yükleyin.
- Mix 1 pmol (1 μL) DNA: 13 μL pol II tampon ile RNA Dubleks ( Tablo 3).
- Adım 1.3.1 ' den gelen karışımına ~ 0,02 adet saf RNA pol II (1 μL) ekleyin ve kabarcıkları tanıtmadan, pipet ucu ile hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın. 30 °C ' de 10 dakika boyunca inkübe.
Not: Burada verilen birimler tek bir reaksiyon içindir; denemede reaksiyon sayısı için gerektiği kadar ölçeklendirin. RNA pol II, bu örnekte10 kullanılır olarak açıklanan sıçan karaciğerinden arındırılmış; Ancak, diğer kaynaklardan arındırılmış RNA pol II, kültürlü mammalin hücreleri veya Maya da dahil olmak üzere3,4,5,11,12,13de kullanılabilir.
- Biyotinlenmiş olmayan şablon DNA ilavesi ile uzama kompleksi tamamlayın.
- 5 pmol ekleyin (1 μL) immobilize olmayan şablon DNA oligo için 14 μL şablon olmayan DNA tamponu ( Tablo 4), adım 1.3.2 tüp ekleyin ve 37 °c ' de 10 dakika boyunca inküye.
- Numuneyi manyetik rafa 2 dk. yıkayın 1x ile 30 μL yıkama tamponu ( Tablo 7' den), Uncorporated pol II ve oligos 'u çıkarın.
- Radyoaktif RNA 23mers içeren uzama kompleksleri oluşturun.
- 30 °C ' de diğer tüm inküler gerçekleştirin. 1 μL 15 μM ATP ve 10 μcı (1 μL) [α-32P] UTP (3.000 ci/mmol) için 23 μL Pulse tampon ekleyin ve bunu kullanarak yıkanmış manyetik boncuklar yeniden pelletini.
Dikkat: Radyoaktif malzeme tehlikelidir. Uygun koruyucu ekipman giydiğinizden ve Radyoaktif malzemenin güvenli kullanım ve bertaraf edilmesi için tüm Laboratuvar yönergelerine uytığınızdan emin olun.
Not: Radyoaktif UTP 'i, Batı leke deneyleri gibi radyoaktif RNA gerekli olmadığında 15 μM UTP ile değiştirin. - Radyoaktif 23mers sentezini sağlamak için 10 dakika reaksiyonu inküye.
- 100 μM ATP ve 100 μM UTP karışımı içeren 1,5 μL çözelti eklemek için 3,5 μL kovalamaca tamponu, önceden monte edilmiş uzama kompleksleri içeren tüpe ekleyin ve tüm nazcent transkriptleri 23mers 'a kovalamak için 5 dakika boyunca inküye yapın.
- Numuneyi 2 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin, supernatant 'ı çıkarın, bir kez 30 μL yıkama tamponu ile yıkayın ve 30 μL yıkama tamponunun içinde pelletini yapın.
- Veya reaksiyonları sonlandırmak için proteinaz K ve glikojen (Tablo 9) ile stop Mix 94 μL ekleyin ya da uzun transkriptler veya bölüm 2 ile uzama kompleksler oluşturmak için Bölüm 1,6 devam etmek için yol gösterimini gerçekleştirmek için.
- 30 °C ' de diğer tüm inküler gerçekleştirin. 1 μL 15 μM ATP ve 10 μcı (1 μL) [α-32P] UTP (3.000 ci/mmol) için 23 μL Pulse tampon ekleyin ve bunu kullanarak yıkanmış manyetik boncuklar yeniden pelletini.
- Isteğe bağlı 23, 25 ve 29 nükreotid transkriptleri yapmak için pol II Walk
- Adım 1.2.1 ile 1.5.4 arasında açıklanan prosedürü izleyin radyoaktif 23mers içeren uzama kompleksleri hazırlamak için. 4 tepki için yeterli kompleksleri olan yıkanmış uzama kompleksler 120 μL oluşturmak için 4 kat ölçeklendirin.
- Etiket 3 yeni tüpler "23mer", "25mer" ve "29mer". 30 μL yıkanmış uzama kompleksini "23mer" tüpüne aktarın ve 94 μL 'ye proteinaz K ve glikojen ile stop karışımı ekleyin.
- Manyetik rafa kalan 90 μL yıkanmış uzama kompleksleri içeren tüpü 2 dakika boyunca yerleştirin, supernatant 'ı çıkarın, ve 90 μL 'de, 1,5 mm ATP ve 1,5 mm CTP her biri 1,2 μL ile tamamlayıcı olarak pelletini boncuk. 30 °C ' de 10 dakika boyunca inkübe.
- Bir kez 90 μL yıkama tamponu ile yıkadıktan sonra, adım 1.5.4 açıklandığı gibi 90 μL yıkama tamponunun içinde resuspending, 30 μL 'lik uzama kompleksini "25mer" tüpüne aktarın ve 94 μL 'yi proteinaz K ve glikojen ile durdur karışımı ekleyin.
- Manyetik rafa kalan 60 μL uzama kompleksini içeren tüpü 2 dakika boyunca yerleştirin, supernatant 'ı çıkarın, ve 60 μL 'de, 1,5 mm ATP ve 1,5 mm CTP her biri 0,8 μL ile tamamlayıcı olarak pelletini boncuk.
- 30 °c ' de 10 dakika boyunca kulyarım, 60 μL yıkama tampon ile bir kez 1.5.5 bölüm olarak yıkayın ve 60 μL yıkama tamponunun içinde pelletini.
- 30 μL 'yi 2x örnekten "29mer" tüpüne aktarın ve 94 μL 'ye proteinaz K ve glikojen ile stop karışımı ekleyin ya da Bölüm 2 ' ye geçin.
- RNA arıtma ve analizine devam edin (Bölüm 3).
2. test Cotranscriptional capping için yapay uzama kompleksleri kullanma
- 1.2.1 ile 1.5.5 13 kat arasında açıklanan prosedürü ölçeklendirerek 23mers içeren yıkanmış uzama kompleksleri oluşturun. Bu 12 reaksiyon için yeterlidir + 1 ekstra.
-
Pol II CTD fosforilasyon
- 2 dakika boyunca manyetik rafa yıkanmış uzama kompleksler içeren tüp yerleştirin, supernatant çıkarmak, ve pelletini boncuk 377 μL 1,5 mm ATP 13 μL ile tamamlayıcı.
- Sırasıyla + H ve-H etiketli iki yeni Tüp hazırlayın. Etiketli tüp + H eklemek 3 μL ~ 300 ng/μL TFIıH, ve etiketli tüp-H 9 μL eklemek 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% gliserol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL Sığır serum albumin.
Not: Biz genellikle TFııH sıçan karaciğerinden arındırılmış kullanmak, ama biz benzer sonuçlar elde ettik ~ 0,6 μg/ticari-mevcut rekombinant Cdk7/siklin H/MAT1 reaksiyon (CAK, TFııH gelen kinaz modülü). Bilgi için malzeme tablosunu görün. - Adım 2.2.1 ' den yıkanan uzama kompleklerinin 87 μL 'i + H etiketli tüpe ve 270 μL 'ye yıkanmış uzama kompleksini etiketli tüpe ekleyin-H. 30 °C ' de 10 dak.
- 2 dakika için manyetik rafa örnek yerleştirin. Aşırı nükleotidler ve ilişkisiz proteini kaldırmak için, sırasıyla 90 μL veya 270 μL yıkama tamponunu içeren + H ve-H reaksiyonlarında uzama kompleksini yıkayın.
-
RNA kapatma
- 87 μL 'de + H etiketli tüpteki resuspend uzama kompleksleri (50 μM GTP (Tablo 10) ile desteklenen BTB. Resuspend uzama kompleksler-H etiketli tüp içinde 261 μL kapak karışımı.
- Hazırlamak 4 yeni tüpler etiketli 5 NG CE + H, 5 NG CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Seyreltik kapatma enzim (CE) içine 20 mm HEPES-NaOH pH 7,9,% 20 gliserol, 100 mm KCL, 1 mm EDTA, 0,5 mg/ml Sığır serum albümin 5 NG CE/μL, 15 ng CE/μL veya 45 ng CE/μL içeren çözümler hazırlamak ve 4 tüpün her birinin içine uygun çözeltinin 3 μL 'ini dağıtılması.
- Her biri için 94 μL stop Buffer (2.1.1) ile 12 yeni Tüp hazırlayın.
- Her bir kapak reaksiyonu, TFııH ile tedavi edilen 87 μL veya etiketlenmemiş borular ile kaplama enzimini ekleyerek başlatın. Bir ısı bloğunda 30 °C ' de inküye yapın.
- 1, 2 veya 4 dk sonra, 94 μL stop tampon içeren tüplere her reaksiyon karışımı 30 μL aktararak reaksiyonları durdurun. Reaksiyon ürünlerini Bölüm 3 ' te açıklandığı gibi arındırın ve analiz edin.
3. RNA arıtma ve Analizi
- RNA 'yi arındırın
- Stop arabelleğindeki reaksiyon ürünlerini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kulyın.
Not: Nokta duraklatma. Bu arabellekteki numuneler RNA 'nın kaybı veya bozulması olmadan 4 saate kadar korunur. - 124 μL fenol ile bir kez ayıklayın: kloroform: isoamill alkol (25:24:1) ve bir kez kloroform: isoamill alkol (24:1).
Dikkat: Phenol son derece toksik ve hızla cilt tarafından emilir. Uygun koruyucu ekipman giyin.
Not: Ekstraksiyon sırasında RNA 'nın kurtarılmasını en üst düzeye çıkarmak için, sulu ve organik fazlar arasında istikrarlı bir bariyer oluşturan yüksek yoğunluklu jel içeren ticari olarak kullanılabilen tüpleri kullanın. Bkz. tartışma ve malzeme tablosu. - 3 M sodyum asetat pH 5,2 12,4 μL içeren yeni tüpler için sulu faz (üst katman) aktarın.
- Stop arabelleğindeki reaksiyon ürünlerini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kulyın.
- Etanol yağış
- 100% etanol 350 μL ekleyin ve inversion tarafından iyice karıştırın.
- Kuru buzda en az 10 dakika boyunca inküye yapın.
Not: Nokta duraklatma. Kolaylık sağlamak için, biri burada durabilir ve ertesi gün prosedürü tamamlayın; Ancak, doğrudan adım 3,3 devam etmek ve aynı gün jel çalıştırmak mümkündür. RNA, daha fazla işlemden önce birkaç gün boyunca-80 °C ' de tutulabilir, ancak daha uzun süre bırakmayın.
- Jel elektroforezi için RNA örneklerinin hazırlanması
- Numunelerin çözülmesine izin verin, 2-3 kez ters çevirme ile karıştırın ve 21.000 x g, 4 °c ' de 15 dakika santrifüjte bir masa Santrifüjü. Bu arada, denatüre jel karışımı (Bölüm 3.4.1) ayarlayın.
- Dikkatle örneklerden rahatsız edici Pellet olmadan etanol kaldırın.
- 70% etanol 500 μL Ekle, Pelet yıkamak için birkaç kez tüp ters çevir, ve sonra yeniden Santrifüjü 21.000 x g 5 dakika ya oda sıcaklığında ya da 4 °c.
- Mümkün olduğunca çok etanol çıkarın ve bir masa üstü santrifüjte tüpler hızlı bir spin (5-10 s) yapmak. Daha sonra, bir jel yükleme ucu ile, etanol kalan son hacmi çıkarın.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca hava kuru Pelet.
- Her bir pelenin üstüne 4 μL H2O ekleyerek RNA 'nın çözülmesini sağlar. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe.
- Mix 'e 4 μL 2x RNA boya ( malzeme tablosunabakın) ekleyin ve sonra her tüpün tam olarak pelletini RNA 'ya birkaç saniye boyunca girdap yapın.
Not: Iken düşük sıcaklıklarda çökelir çünkü üre yerine Formamid içeren RNA boya tavsiye edilir. - Tüpleri hızlı Döndür ve sonra 70 °C ' de bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca inküye edin.
-
Jel üzerinde yük hazır olana kadar kuru buz üzerinde depolar tüpler.
Not: RNA 'nın kuru buzda tutulması, jel polimerizasyon sırasında diğer deneyler üzerinde çalışma esnekliği sağlar. Numunelerin çözülme sonrası yeniden ısıtılması gerekmez. Ancak, RNA jel çalışmaya hazır ise Isıtma sonra doğrudan yüklenebilir.
- Üre-sayfa jeli hazırlama
- 40 mL jel karışımı için, 50 mL konik tüpte birleştirin: 16,7 g Urea, 15 mL 40% bis: akrilamid çözeltisi (19:1 oranı), 4 mL 10X TBE (1 M Tris-HCl, 1 M sodyum borate, 20 mM EDTA) ve 8 mL H2O. Bu hacim 1,0 mm Spacers ile bir standart boy jel (18 cm yükseklik x 16 cm genişlik) için yeterlidir.
Dikkat: Akrilamid son derece zehirlidir. Solüsyonda inhalasyon riski olmadığında, her zaman işleme sırasında laboratuvar ceket, eldiven ve güvenlik gözlükleri giyin.
Not: Bu karışım bir denatüre% 15 Poliakrilamid jel döküm için, hangi kolayca RNA arasında giderir 15-50 NT. farklı uzunluklarda farklı RNA transkriptleri çözmek için gerekli bis/akrilamid konsantrasyonunu değiştirin. - Üre tamamen çözülene kadar bir nutator üzerinde jel karışımı içeren kapalı tüp yerleştirin.
- Cam plakaları, 1 mm mesafe tutucular ve 15 kuyu tarak ile jel döküm istasyonu ayarlayın.
- Hızlı çalışma, Ekle 40 μL TEMED ve 400 μL% 10 amonyum Persülfat solüsyonu jel çözeltisi ve karışımı iyi. 25 mL pipet kullanarak, plakalar arasında jel çözeltisi dökün, tarak ve jel polimerize en az 2 h için izin verin.
Not: Eğer jel kullanmadan önce 2 saat daha dökülür ise, bir kez o polimerize nemli kağıt havlu ile kapak (yerinde tarak bırakarak) ve plastik şal ile sarma kuruma önlemek için.
- 40 mL jel karışımı için, 50 mL konik tüpte birleştirin: 16,7 g Urea, 15 mL 40% bis: akrilamid çözeltisi (19:1 oranı), 4 mL 10X TBE (1 M Tris-HCl, 1 M sodyum borate, 20 mM EDTA) ve 8 mL H2O. Bu hacim 1,0 mm Spacers ile bir standart boy jel (18 cm yükseklik x 16 cm genişlik) için yeterlidir.
- Denaturing jel RNA elektroforezi
- Polimerizasyon sonrası jeli çalışan tankına aktarın ve 15-30 dk için 1x TBE 'de 20 mA 'da önceden çalıştırın.
- Bu arada, numune (dondurulmuş ise), Vortex ve 4 dk 2.000 x g, 4 °c ' de döndürün.
- Hazır olduğunda, güç kaynağını kapatın ve her iyi 1x TBE ile bir şırınga kullanarak dikkatlice durulayın.
- Numuneleri jel üzerine yüklemek için jel yükleme ipuçlarını kullanın.
- Yaklaşık 2 saat ya da alt boya (Xylene cyanol FF) kadar jel altına ulaşıncaya kadar bir sabit 20-30 mA jel çalıştırın.
- Jel çıkarın, bir parça emici kağıt üzerine yerleştirin ve plastik wrap ile sarın.
- Radyoaktif jel bir fosfora maruz.
- Phosphorımager kullanarak tarama fosforör ve görüntü analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rakamlar 2 ve 3 farklı kaynaklardan uzanan veya pol II genişleterek değişik uzunluklarda transkriptler içeren yapay uzama kompleksleri oluşturmak için kullanılan temsili sonuç reaksiyonları gösterir. Şekil 4 bu uzama kompleksleri, eş TRANSKRIPSIYON CTD phosphorylation bağımlı RNA kapatma tahlil için nasıl kullanılabilirler gösterir.
Şekil 2a yapay uzama KOMPLEKLERINDE DNA ve RNA moleküllerinin bir şemasına sahiptir. Şekil 2B , başlangıç yapay uzama kompleksler 20 NT sentetik RNA oligo ( Şekil 2a koyu mavi) kullanılarak hazırlanmış olan protokol 1 ' de açıklandığı gibi tam olarak gerçekleştirilen reaksiyonlara oluşturulan farklı uzunlukta transkriptler gösterir ; RNA_20mer, Tablo 1). Biz başlangıç RNA uzunluğu ve DNA şablon dizisi biliyorum beri, biz nükleotidler alt kümesini belirleyebilirsiniz-ATP, CTP, GTP, veya UTP-şablon boyunca tanımlanmış bir konuma pol II yürümek için gerekli. Yeni sentezlenmiş nükleotid sayısı, son beklenen uzunluğu belirlemek için RNA oligonükleotit astar başlangıç boyutuna eklenir (RNA oligo büyüklüğü + eklenen nükleotidler sayısı). ATP ve UTP varlığında, Pol II, 23mer RNA içeren uzama kompleksler oluşturmak için 20 NT RNA oligo 3 NT ekleyebilirsiniz. Eğer bir uzak uncorporated ATP ve UTP temizler ve sonra ATP ve CTP ekler, 20 NT oligo bir 25mer yapmak için 2 NT tarafından uzatılır, ve eğer bir sonra tekrar uzak unıncorporated nükleotidler temizler ve ATP ve GTP ekler, transkript bir 29mer yapmak için ek 4 NT uzatılır. günah CE yeni oluşturulan transkriptler beklenen RNA boyutuna karşılık gelir ve neredeyse tüm radyoaktif 23mers nicel daha uzun ürünlere kovalanmış olabilir, bir bu yöntemi kullanarak bilir (i) RNA oligo doğru pol II çıkışta konumlandırılmış Kanal ve (ii) radyoaktif Rnas aktif pol II uzama kompleksler ile ilişkilidir.
Şekil 2C , başlangıç uzama kompleksler aynı DNA şablonu ve olmayan-şablon Strand OLIGOS ve RNA oligo (RNA_29mer, Tablo 1) kullanılarak hazırlanmış olduğu protokolün bir varyasyonu gösterir, ek bir 9 nükleotid içeren onun 5 '-End ama aksi takdirde 20 NT RNA oligo sırayla aynıdır. Bu durumda başlangıç RNA uzunluğu 29 NT olduğundan, 32mer, 34mer ve 38mer transkriptler içeren uzama kompleksleri yukarıda açıklanan aynı pol II yürüyüş adımları kullanılarak oluşturulabilir.
Analiz kapsamına bağlı olarak, bu yöntem pol II kaynağında esneklik sağlar. Şekil 3 ' te, farklı kaynaklardan pol II kullanarak reaksiyonları karşılaştırın. İlk 4 şeritte gösterilen reaksiyonlarda, yapay uzama kompleksleri endojen ile monte edildi, vahşi tip pol II ya sıçan karaciğer veya fisyon Maya arındırılmış ve 23mers veya 25mers oluşturmak için yukarıda açıklandığı gibi yürüdü. Bu reaksiyonlarda kullanılan sıçan ve fisyon Maya pol IIS, birden fazla kromatografik basamakları kullanarak homojenliği yakın bir şekilde temizleşmiş.
Yöntem, basit, tek adımlı bir arıtma yöntemi kullanılarak hazırlanan vahşi tip veya Mutant pol II içeren yapay uzama kompleksler oluşturmak için de kullanılabilir. Şekil gösterinin son iki şeritleri, Pol II katalizör aktivitesi için gerekli değildir, ancak RNA 'ya çift transkripsiyon için yardımcı olur onun Rpb1 subunit, CTD yoksun insan pol II bir mutant formu kullanılarak gerçekleştirilen gösteriyor. Bu konuda kullanılan CTD-Less pol II, Rpb1 ' in bayrak epitopu etiketli versiyonunu ifade eden bir insan hücresi hattından Anti-Flag immüno-arıtma tarafından arındırıldı. Aktif pol II konsantrasyonunun preparasyona hazırlıktan değişebileceğini dikkate almak önemlidir. Böylece, reaksiyonlarda kullanılan pol II miktarının istenilen faaliyeti elde etmek için gereken tutarı belirlemek için çeşitli olduğu ilk deneyler yapmak esastır.
Şekil 4 , fosforik veya fosforlu CTD ile pol II içeren yapay uzama kompleksleri ile ilişkili radyoaktif transkriptlerin eşleme karşılaştırma bir tahlil bir temsili örnek gösterir. Bu açıklarda, 5 '-trifosfat sonu ile 23 nükle transkripti içeren uzama kompleksleri protokol 2 ' de açıklandığı şekilde hazırlanmıştır.
Uzama komplekslerinin kuluçkalı enzimleri, 5 ' kap14, 15' in ilavesini gösteren 1 NT civarında bir hareketlilik vardiyasında yol açar. Saplama reaksiyonları quantitate için, bir kapak verimliliği belirler, bir RNA yüzdesi olarak ifade. Kapak verimliliği, toplam RNA 'ya, maksimum elde edilebilir bölme bölünmesiyle bölünmüş RNA 'ya oranıdır. Bize göre, ticari kaynaklardan elde edilen RNA oligos 'un en fazla alınabilir şekilde birikmesi, sentetik RNA 'nın tamamlanmamış trifosforilasyonu nedeniyle muhtemelen% 85 ' dir.
İlk 3 şeritte gösterilen reaksiyonlarda, uzama kompleksler genel transkripsiyon faktörü TFııH ve Co-Factor ATP ile pol II CTD 'nin kaplama öncesinde fosforylate ile kuluçkunda bulunuyordu. Bu reaksiyonlarda, yakın maksimal kapak gözlemlendi ~ 1 dk ek sonra 5 NG enzim kapatma. Ne zaman TFııH ile kuluçta değildir ve bu nedenle unphosphorylated pol II içeren uzama kompleksleri kullanılarak gerçekleştirilen zaman, yaklaşık 10 kez çok kapak benzer seviyeleri gözlemlemek için enzim olarak aldı. Şekil 4 ' ün son iki şeridi, tfııh varlığında, uzama kompleksleri ile ya da enzimi olmadan inkübe edilen reaksiyonların ürünlerini gösterir. Daha da önemlisi, bu figürde gösterilen Co-transcriptional kapatma yapay uzama kompleksinin tfiih-bağımlılığı, daha karmaşık enzim sistemlerinde bir organizatör olarak transkripsiyon Başlatan uzama kompleksleri gözlenen çok benzer 5' i yapın.
Resim 1: yapay uzama kompleksleri montajı. (A) RNA oligo (koyu mavi) 20 NT bir DNA şablonu Strand (yeşil) bir tamamlayıcı dizi ile tavlanmış 9 NT. (B) RNA polimeraz II (pol II) tavlanmış DNA ile karıştırılır: RNA hibrid RNA 3 '-End pol II katalitik sitede konumlandırmak için. (C) 3 ' biyotinlenmiş olmayan-şablon Strand DNA oligo (açık mavi) bir molar fazlalığına reaksiyon karışımı içine eklenir ve daha fazla uzama kompleksi stabilize. (D) immobilize uzama kompleksler aşırı oligos kaldırmak için yıkanır ve uygun nükleotid kombinasyonları ile Inkübasyon pol II Istenen uzunlukta RNA oligo uzatmak için izin verir. RNA 'nın yeni sentezlenmiş kısmı sarı renkte gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: farklı uzunlukları RNA oligos kullanarak pol II yürüyüş. (A) yürüyüş sırasında eklenen nükleotidler gösteren yapay uzama kompleksleri diyagramı. Olmayan şablon Strand ve şablon Strand DNA açık mavi ve yeşil, sırasıyla gösterilir. 20 NT RNA oligo koyu mavi renkte gösterilir. Ayrıca gösterilen nükleotidler 23mer RNA (turuncu), 25mer RNA (kahverengi) ve 29mer RNA (macenta) oluşturmak için ardışık yürüyüşler sırasında eklendi. (B) protokol 1 ' de açıklandığı gibi, 20 NT RNA astar kullanarak pol II 'den sonra elde edilen tanımlanan uzunluğun Rnas 'ı gösteren denaturing jel elektroforez. Protokol her sıralı yürüyüş aşamasında eklenen nükleotidler renk kodlu turuncu (23mer), kahverengi (25mer), ve Magenta (29mer). (C) pol II yürüyüş bir 29 NT RNA astar ile başlayarak, ancak tam olarak b. (b ve C) gösterildiği gibi aynı jel parçaları göstermek ama Illustration amaçları için ayrılmış. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: vahşi tip veya Mutant pol II içeren suni uzama kompleksler tarafından sentezlenen transkriptler. Yapay uzama kompleksler 20 NT RNA primer ve son derece saflaştırılmış endojen pol II ile sıçan karaciğeri veya fisyon Maya veya bayrak immünopurified pol II hela hücrelerinden Rpb1 eksik (F: Rpb1-δctd) kullanılarak monte edildi. Her kompleksin RNA 'sı 23 NT veya 25 NT 'ye uzatıldı. Ayrıntılar için metne bakın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: fosforilasyon-eş transkripsiyon RNA 'nın bağımlı aktivasyonu. Sıçan karaciğer pol II ve radyoaktif 23mer RNA içeren suni uzama kompleksleri ATP ve genel transkripsiyon faktörü tfııh veya tampon 10 dakika için pol II CTD fosforylate ile kuluçkılı edildi. Yıkandıktan sonra, uzama kompleksleri 5 ng, 15 ng veya 45 ng, 1, 2 veya 4 dk için mammalin kapatma enzimi ile inkübe edildi. capped ve kapatılmamış 23mers bir denatüre jel (üst, ilk 12 şerit) çözüldü ve% capped RNA nicelik ve çizilen (alt). Figürün bu kısmı ilk olarak bir CC-BY lisansı altında açık erişim makalesi olarak yayımlanan ref 5' de yayımlandı. Ayrı bir deneyden gelen son iki şerit, TFııH varlığını, uzama kompleksleri ile ya da enzimi olmadan kuluçkılı olduğu reaksiyonlar ürünleri göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Sıra | Yorum | |
| RNA_20mer | ACUCUCAUGUCUAKURCUUA | 5 ' trifosfat modifikasyon; SAYFA & RP-HPLC temizleşmiş |
| RNA_29mer | ACUCUAUGACUCUUCAUGUCUGAUGCUUA | 5 ' trifosfat modifikasyon; SAYFA & RP-HPLC temizleşmiş |
| Şablon Strand DNA | (CTACGGTTAAGCTCACGGTACATTTCTGAA) TTAAGCATCATGG |
Çift sayfa & HPLC temizleşmiş |
| Şablon olmayan Strand DNA 'Sı | (ATCAGAAATGTACCGTGAGCTTAACCGTAG) | 5 ' TEG-biotinylated; HPLC temizleşmiş |
Tablo 1: DNA ve RNA oligonükleotides
| Son konsantrasyon | Birim | |
| Tris HCl pH 7,5 | 12 mM * | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM 'Lik | 1 μL |
| 300 mM KCl | 50 mM | 1,67 (μL) |
| 100 mM Tris-HCl pH 7,5 içinde 10 μM Template Strand DNA oligo | 1 μM cinsinden | 1 μL |
| 10 μM RNA oligo 10 mM Tris-HCl pH 7,5 |
2 μM ' si | 2 μL |
| Su | 4,33 (μL) | |
| 10 μL | ||
| * Tüm Tris-HCl DNA ve RNA oligo çözümlerinden geliyor | ||
Tablo 2: DNA ve RNA oligos tavlama için kokteyl
| Pol II tampon | Son konsantrasyon | Hacim/reaksiyon |
| Su | 4,52 (μL) | |
| 50 mM MgCl2 | ^ 4,67 mM | 1,40 (μL) |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | ^ 23 mM | 1,40 (μL) |
| 300 mM KCl | * 27 mM | 1,33 (μL) |
| 50% gliserol | 3 | 0,9 (μL) |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 (μL) |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 (μL) |
| % 10 PVA | 2 | 3 μL |
| 13 μL | ||
| Arabellek ekleme kullanmadan önce sağ: | ||
| Tavlanmış şablon Strand DNA: RNA (Tablo 1 ' den) | 1 μL | |
| RNA polimeraz II | 1 μL | |
| * Mix son KCl konsantrasyon ~ 50 mM, ek KCl pol II gelen ile | ||
| ^ Final MgCl2 ve Tris HCL konsantrasyonları sırasıyla 5 mm ve 25 mm, | ||
| Ek MgCl2 ve Tris HCL gelir TAVLANMıŞ DNA: RNA ürün. | ||
Tablo 3: Pol II karışımı
| Şablon olmayan DNA arabelleği | Son konsantrasyon | Hacim/reaksiyon |
| Su | 4,48 (μL) | |
| 300 mM KCl | * 43,33 mM | 2,17 (μL) |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM 'Lik | 1,50 (μL) |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | 25mm | 1,50 (μL) |
| 50% gliserol | 3 | 0,9 (μL) |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 (μL) |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 (μL) |
| % 10 PVA | 2 | 3 μL |
| 14 μL | ||
| Arabellek ekleme kullanmadan önce sağ: | ||
| 5 μM Biotinylated olmayan şablon DNA oligo | 1 μL | |
| * Mix son KCl konsantrasyonu 50 mM, ek KCl olmayan şablon DNA oligo tampon gelen ile. | ||
Tablo 4: şablon olmayan DNA karışımı
| Pulse etiketleme tampon | Son konsantrasyon | Hacim/reaksiyon |
| Su | 9,98 (μL) | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 μL |
| 50% gliserol | 3 | 1,5 (μL) |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,63 (μL) |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM 'Lik | 0,4 (μL) |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | * 12 mM | 0,3 (μL) |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,13 (μL) |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM 'Lik | 0,08 (μL) |
| % 10 PVA | 2 | 5 μL |
| 23 μL | ||
| Arabellek ekleme kullanmadan önce sağ: | ||
| 15 μM ATP | 0,6 μM | 1 μL |
| 3,3 μM [α-32P] UTP | 0,13 μM | 1 μL |
| * Final Tris HCl konsantrasyonu, ek Tris HCl nükstrotit tampondan gelen 20mM 'dir. | ||
Tablo 5: darbe etiketleme NTP karışımı
| Tampon kovalamaca | Son konsantrasyon | Hacim/reaksiyon |
| Tris HCl, pH 7,5 | * 30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 μL |
| Su | 0,6 (μL) | |
| 50% gliserol | 3 | 0,3 (μL) |
| 10 mM DTT | 0,5 mM | 0,25 (μL) |
| 100 mM HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM 'Lik | 0,15 (μL) |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,13 (μL) |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM 'Lik | 0,08 (μL) |
| % 10 PVA | 2 | 1 μL |
| 3,5 (μL) | ||
| Arabellek ekleme kullanmadan önce sağ: | ||
| 100 μM UTP, 100 μM ATP, 100 mM Tris-HCl 'de seyreltilmiş, pH 7,5 | 5 μM cinsinden | 1,5 (μL) |
| * Tüm Tris HCl nüktiotid tampon geliyor |
Tablo 6: Chase NTP karışımı
| Son konsantrasyon | Hacim/reaksiyon | |
| Su | 24,21 (μL) | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1,8 (μL) |
| 50% gliserol | 3 | 1,8 (μL) |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/mL | 0,75 (μL) |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM 'Lik | 0,6 (μL) |
| % 10 PVA | 0,2% | 0,6 (μL) |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 (μL) |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM 'Lik | 0,09 (μL) |
| 30 μL |
Tablo 7: yıkama tamponu
| Son konsantrasyon | Hacim/reaksiyon | |
| Su | 14,13 (μL) | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 μL |
| 50% gliserol | 3 | 1,8 (μL) |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 (μL) |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM 'Lik | 0,6 (μL) |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM 'Lik | 0,48 (μL) |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 (μL) |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM 'Lik | 0,09 (μL) |
| % 10 PVA | 2 | 6 μL |
| 30 μL |
Tablo 8: temel transkripsiyon arabelleği (BTB)
| Durdurma arabelleği | Son konsantrasyon | Hacim/reaksiyon |
| Su | 55,74 (μL) | |
| 1 M Tris HCl, pH 7,5 | 10 mM 'Lik | 0,6 (μL) |
| 5 M NaCl | 300 mM NaCl | 3,6 (μL) |
| 500 mM EDTA | 0,5 mM EDTA | 0,06 (μL) |
| % 10 SDS | 0,2% SDS | 1,2 (μL) |
| 60 (μL) | ||
| Arabellek ekleme kullanmadan önce sağ: | ||
| 15 mg/mL glycogen | 2 μL | |
| 20 mg/mL proteinaz K | 2 μL | |
| Su | 30 μL | |
Tablo 9: karışımı durdur
| Son konsantrasyon | Hacim/reaksiyon | |
| Su | 11,9 (μL) | |
| 300 mM KCl | * 53,33 mM | 5,33 (μL) |
| 50% gliserol | 3 | 1,8 (μL) |
| 1,5 μM GTP 100 mM Tris HCl 'de seyreltilmiş, pH 7,5 | 50 μM | 1 μL |
| 100 birimler/mL Inorganik Pyrofosfataz, Maya | 0,1 birimler/reaksiyon | 1 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 (μL) |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | ^ 16,67 mM | 0,5 (μL) |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM 'Lik | 0,48 (μL) |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 (μL) |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM 'Lik | 0,09 (μL) |
| % 10 PVA | 2 | 6 μL |
| 29 μL | ||
| Arabellek ekleme kullanmadan önce sağ: | ||
| Capping enzim | 1 μL | |
| * Karışımı son KCL konsantrasyon ~ 60 mm, ek KCL enzim ve pirofosfataz kapatma gelen ile | ||
| ^ Final Tris HCl konsantrasyon 20 mM, ek Tris HCl nükfotid tampon gelen ile | ||
Tablo 10: karışımı kapatma
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA işleme ve transkript uzaması düzenlemesi gibi pol II uzama kompleksine birleşen olayları incelemek isteyen çalışmalar, yüksek derecede arıtılmış bir enzim sisteminin kullanımı ile büyük ölçüde kolaylaştırılabilir. Bu tür enzim sistemlerini kurmak zor olabilir. Pol II tarafından organizöre bağımlı transkripsiyon en az beş genel transkripsiyon faktörü gerektirir. Bu faktörlerin hazırlanması ve stoklama ay sürebilir; Bu nedenle, bu süreçte oran sınırlayıcı adım genellikle sadece test tüpünde bazal transkripsiyon yeniden oluşturmak için gerekli transkripsiyon faktörleri kadrounu hazırlar.
Bu yazıda, sadece arıtılmış pol II ve sentetik DNA ve RNA oligonucleotides kullanarak yapay transkripsiyon uzama kompleksleri2,3 ' ü oluşturmak için daha önce geliştirilen yöntemlerin bir adaptasyonunu tarif ediyoruz. Elde edilen uzama kompleksleri transcrip, aktif ve Pol II transkripsiyon ve RNA kapak5bağlantı araştırırken kullanılmak üzere uygundur. Bu tanımlanan enzim sisteminde mevcut olmayan kromatin ve diğer birçok proteinler bağlamında transkripsiyon ve RNA kapsamının içinde vivo olarak gerçekleşmesini dikkate almak önemlidir; Bu nedenle, bu sistemin birçok özetlemek bekleniyor, ama hepsi değil, in vivo meydana tepkiler özellikleri. Biz tarif protokol manyetik boncuklar bağlı biyotinlenmiş DNA ile yapay uzama kompleksleri immobilizing tarafından önceki yöntemlerle inşa, araştırmacı kolayca reaksiyon koşullarını değiştirmek ve/veya uncorporated nükleotidler kaldırmak için izin farklı aşamaları sırasında. Önemli, çünkü etiket uzama kompleksleri hareketsiz için kullanılan bir ucunda DNA olmayan-şablon iplikçik yerine pol II kendisi veya şablon Strand üzerinde, sadece bu Pol IIS tam uzama kompleksleri ile ilişkili boncuklar üzerinde muhafaza edilecektir.
Çünkü bir 5 '-trifosfat sonuna kadar kullanılan transkriptler için bir enzim tarafından değiştirilmek üzere, sentetik RNA oligonükleotidler deneme için kullanılır 5 '-trifosfat Termini ile satın alınır. Ancak, değiştirilmemiş RNA oligos diğer ortak transcriptional RNA işleme olayların çalışmaları veya pol II uzaması düzenleyen transkripsiyon faktörleri faaliyetleri de dahil olmak üzere diğer uygulamalar için kullanılabilir. Aşağı akım uygulama ne olursa olsun, yüksek derecede arıtılmış DNA ve RNA oligos ile uzama kompleksler montajı öneririz. Özellikle, biyotinlenmiş DNA oligos HPLC tarafından arındırılmalıdır, ve diğer DNA ve RNA oligos Poliakrilamid jel elektroforez ve/veya HPLC tarafından arındırılmalıdır. Enzimatik faaliyetlerin saflık, ancak, bir vaka-by-olgu temelinde belirlenecek ve her deneme kapsamına bağlı olacaktır.
Montajın son adımda şablon olmayan biyotinlenmiş DNA oligo ekleme, prensip olarak, Üçlü bir kompleks elde etmek için yeterli olmalıdır. Ancak, her zaman en az bir "yürüyüş" pol II nükleotidler doğru sayıda içerir onaylamak için adım içerir: Eğer deney amacı ortak transcriptional kapak veya diğer RNA işleme adımları veya pol II takip etmek için substratlar oluşturmak için uzama, biz her zaman bir 32P-ilk "yürüyüş" olarak etiketli ribonükleotid dahil böylece transkripti görüntülenebilir ve etiketlenmemiş "soğuk" nükleotidler daha sonraki yürüyüş adımları için farklı uzunluklarda transkript belirli aktivite sabit kalır. Bu protokolde açıklanan yöntem, 32P-etiketli nükleotidler kullanır, ancak nükleer transkriptleri görselleştirmek için, floresan bazlı nitelikler, radyoaktif malzemelerle çalışmak mümkün olmadığında RNA etiketlerini ölçmek için kullanılabilir. Ancak, bu tür bir duyarlılığın genellikle çok radyoaktif etiketleri kullanarak daha az olduğunu dikkat etmek önemlidir, ve genellikle daha büyük miktarlarda enzim gerektirir.
Tekrarlanabilir deneyler için önemli bir adım Phenol sırasında iyi RNA kurtarma: kloroform: isoamill ekstraksiyon ve etanol yağış. Biz yüksek yoğunluklu jelleri içeren mikrosantrifüjlü tüpler kullanarak bulduk ( malzeme tablosunabakın) fenol için: kloroform: isoamill ekstraksiyon bu adımda nüklik asit yeniden üretilebilirliği ve verim artar. Buna ek olarak, renkli glikojen kullanımı ( malzeme tablosunabakın) etanol yağış sırasında taşıyıcı olarak küçük nüklenik asit peletlerini görmek kolaylaştırır, daha az bir yanlışlıkla kaldırılması sırasında duman çekiş tarafından Pelet kaybeder olası hale etanol supernatant.
Tarif ettiğimiz benzer protokoller kullanılarak oluşturulan yapay uzama kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ve transkripti düzenleyen faktörler arasındaki protein-protein veya protein-nüklik asit etkileşimlerini ölçmek için de yararlı olmalıdır uzamaya bağlı uzama veya RNA işleme olayları. Bu durumda, yıkamadan sonra yapay uzama kompleksine bağlı kalan proteinler Batı blosit veya kütle spektrometresi tarafından algılanır; radiolabeling RNA gerekli değildir ve biz sadece "soğuk" nükleotidler ile tüm transkripsiyon adımlarını yapmak.
Son olarak, bu yöntem transkripsiyon kompleksler yapısal analizler için kullanım olabilir. Nitekim, ilgili yöntemler mantar ve memelinin enzimleri ile Cryo-EM çalışmalarında kullanılmıştır enzim-pol II etkileşimlerini yeniden oluşturmak için13, ve uzama sırasında diğer proteinler veya protein kompleksler Ile pol II etkileşimleri12, 16,17, ve en son, bir nükposome18bağlı duraklatmayla. Bu yöntem kullanılarak oluşturulan transkripsiyon kompleksinin yapısal analizleri için olası bir komplikasyon, kompleksin biotin/manyetik boncukların kaldırılması gerekir; Ancak, bu çözülebilir DNA oligos belirli sitelerde kısıtlama enzimleri tarafından tanınan veya UV ışını tedavisi sonra kapalı parçalanabilen biotin linkers kullanarak19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz meme kapatma enzim cDNA sağlayan S. Shuman teşekkür ederiz. Bu çalışma, büyük Kansas City Community Foundation 'da Helen Nelson Tıp Araştırma Fonu 'ndan yapılan Stowers Tıp Araştırmaları Enstitüsü 'ne hibe tarafından kısmen destekleniyordu. Bu yazıda temel alınan orijinal veriler http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 adresinde bulunan Stowers Original veri deposundan erişilebilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
