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Artículo de método

Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional

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DOI:

10.3791/59497

⸱

13 de mayo de 2019

 ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Kansas University Medical Center

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos el conjunto de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II (Pol II) que requieren sólo ADN sintético corto y oligonucleótidos de ARN y Pol II purificado. Estos complejos son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes al procesamiento co-transcripcional de transcripciones asociadas con el complejo de elongación Pol II.

Resumen

La síntesis de ARNm eucariota es un proceso bioquímico complejo que requiere la transcripción de una plantilla de ADN en un ARN precursor por la enzima multi-subunit ARN polimerasa II y el taponamiento y empalme co-transcripcional del ARN precursor para formar el ARNm maduro. Durante la síntesis de ARNm, el complejo de alargamiento de ARN polimerasa II es un objetivo de regulación por una gran colección de factores de transcripción que controlan su actividad catalítica, así como el tapón, empalme y enzimas de procesamiento de 3'que crean el ARNm maduro. Debido a la complejidad inherente de la síntesis de ARNm, los sistemas experimentales más simples que permiten el aislamiento y la investigación de sus diversas etapas co-transcripcionales tienen gran utilidad.

En este artículo, describimos uno de estos sistemas experimentales simples adecuados para investigar el taponamiento de ARN co-transcripcional. Este sistema se basa en complejos de elongación de ARN polimerasa II definidos ensamblados a partir de burbujas de transcripción artificial y polimerasa purificada. Cuando se inmovilizan a través de ADN biotinilado, estos complejos de alargamiento de ARN polimerasa II proporcionan una herramienta fácilmente manipulable para disuado de taponamiento de ARN co-transcripcional y mecanismos por los cuales el complejo de alargamiento recluta y regula la enzima de tapado durante límite de ARN co-transcripcional. Anticipamos que este sistema podría adaptarse para estudiar el reclutamiento y/o el ensamblaje de proteínas o complejos proteicos con funciones en otras etapas de maduración del ARNm acopladas al complejo de alargamiento de ARN polimerasa II.

Introducción

La síntesis de ARN mensajero eucariota (ARNm) es un elaborado proceso bioquímico que implica la síntesis de un ARN precursor no procesado por ARN polimerasa II y el procesamiento del ARN precursor para producir el ARNm maduro. Los pasos de procesamiento de ARN de tapado, empalme y poliadenilación se llevan a cabo en gran medida de forma co-transcripción. El complejo de alargamiento Pol II sirve como un andamio que recluta y orquesta las actividades de muchas de las enzimas de procesamiento de ARN. En consecuencia, nuestra comprensión última de cómo se generan los ARNm eucariotas maduros dependerá en gran medida del desarrollo de sistemas experimentales que permitan la disección de los mecanismos bioquímicos subyacentes al reclutamiento al complejo de alargamiento y regulación de las enzimas responsables de la limitación co-transcripción, empalme y poliadenilación.

No es de extrañar que el desarrollo de estos sistemas experimentales haya sido difícil. Un impedimento importante ha sido la notable complejidad de la propia transcripción de la Pol II, donde la simple reconstitución de la transcripción basal por Pol II in vitro requiere un conjunto mínimo de cinco factores generales de iniciación de la transcripción: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH 1. Además, la reconstitución de cualquier tipo de transcripción regulada de Pol II in vitro requiere un conjunto aún mayor de factores de transcripción y coreguladores. Por lo tanto, un objetivo importante ha sido desarrollar sistemas experimentales más simples que permitan la reconstitución de complejos de alargamiento activos de Pol II adecuados para la investigación del acoplamiento funcional de la transcripción de Pol II y el procesamiento de ARN.

Uno de esos métodos más sencillos para reconstituir complejos de alargamiento activos de la Pol II ha demostrado ser útil para los estudios estructurales y bioquímicos de alargamiento de la Pol II y, más recientemente, para investigar el procesamiento de ARN co-transcripcional2,3 ,4,5. En este artículo, mostramos cómo los complejos de elongación Pol II preparados a partir de Pol II purificado y las burbujas de transcripción sintética se pueden utilizar eficazmente para investigar los mecanismos subyacentes al taponamiento co-transcripcional de las nacientes transcripciones pol II.

El taponamiento se refiere a la adición covalente de una "tapa" de 5'-guanosina al extremo 5'-trifosfato de las nacientes transcripciones Pol II. El límite es importante para los pasos posteriores de maduración del ARNm, transporte, traducción y otros procesos6,7. La tapa se añade co-transcripcionalmente a las transcripciones de Pol II por una enzima conocida como enzima de taponamiento. En las células de mamíferos, los sitios activos responsables de las actividades de ARN 5'-trifosfatasa yguanylyl transferasa de la enzima de taponamiento están contenidos dentro de un solo polipéptido 8. La enzima de tapado se contrata para el complejo de elongación Pol II a través de interacciones con superficies aún por definir en la carrocería Pol II y el dominio carboxi-terminal Rpb1 (CTD) fosforilado en Ser5 de su heptapéptido repite5. En el complejo de alargamiento, la enzima de tapado cataliza la adición de una tapa de 5'-guanosina una vez que la transcripción naciente alcanza una longitud de al menos 18 nucleótidos y ha surgido del canal de salida del ARN polimerasa. En el primer paso de la reacción de taponamiento, la trifosfatasa hidroliza el ARN 5'-trifosfato para producir un 5'-difosfato. En el segundo paso, GTP es hidrolizado a GMP por la guanylyl transferasa, formando una enzima GMP-capping intermedia. Finalmente, la guanylyl transferasa transfiere GMP al extremo 5'-difosfato de la naciente transcripción para producir la tapa.

Una característica notable de la reacción de tapado es que el taponamiento co-transcripcional (es decir, el taponamiento detranscripciones asociadas con complejos de alargamiento funcional Pol II) es mucho más eficiente que el taponamiento del ARN libre 5,9. Por lo tanto, una pregunta importante en el campo ha sido cómo esta activación dramática de la tapado se logra a través de interacciones de la enzima de tapado con el complejo de elongación Pol II. En este protocolo describimos el ensamblaje de complejos de alargamiento activos de ARN polimerasa II utilizando únicamente ARN polimerasa II purificado y burbujas de transcripción artificial. Estos métodos permiten la creación de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II con transcripciones de longitud y secuencia definidas. En un estudio reciente, utilizamos estos complejos de alargamiento de ARN polimerasa II definidos como modelo para investigar aspectos de los mecanismos de limitación de ARN5. En particular, mostramos que i) el taponamiento del ARN asociado a estos complejos de alargamiento era más de 100 veces más eficiente que el taponamiento del ARN libre y ii) fue estimulado por la fosforilación dependiente de TFIIH del CTD Pol II. El enfoque descrito aquí podría, en principio, adaptarse para generar sustratos para el estudio de otras reacciones de procesamiento de ARN co-transcripcional vinculadas al complejo de alargamiento Pol II.

En la sección 1 de este protocolo, los complejos de alargamiento artificial se crean recocidos de un oligonucleótido de ADN de hilo de plantilla sintética a un oligonucleótido de ARN que es complementario en su extremo 3 a aproximadamente 9 nucleótidos del ADN de la hebra de la plantilla. Pol II se carga entonces en el dúplex DNA:RNA. El complejo de alargamiento se completa mediante la adición de un oligonucleótido de ADN de cadena parcialmente complementario y no-plantilla que se etiqueta con biotina en su extremo 3 (Figura1 y Figura 2A). El oligonucleótido de ARN es ampliado por Pol II en estos complejos de alargamiento para hacer transcripciones radioetiquetas de longitud y secuencia definidas tras la adición de combinaciones apropiadas de nucleótidos radiomarcados. Además, utilizando una combinación de lavados para eliminar nucleótidos no incorporados y la adición adicional de diferentes combinaciones de nucleótidos, se puede "caminar" Pol II a diferentes posiciones a lo largo de la plantilla de ADN y sintetizar ARN de longitudes definidas. El ARN se purifica y se somete a electroforesis en geles de urea-PAGE desnaturalizantes. En la sección 2 del protocolo, los complejos de alargamiento artificial se utilizan para analizar el taponamiento de ARN co-transcripcional. El ejemplo presentado mide el efecto de la fosforilación dependiente de TFIIH del CTD Pol II en el taponamiento del ARN co-transcripcional. En este experimento, medimos el alcance del tapón co-transcripcional en función de la concentración de enzimas de taponamiento (5, 15 y 45 ng por reacción) y el tiempo (1, 2 y 4 min).

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Protocolo

1. Montaje de Complejos de Elongación Artificial y Caminar Pol II

  1. Inmovilizar 1 nmol de ADN no-plantilla oligo que contiene una molécula de biotina de 3' en cuentas magnéticas.
    NOTA:     Los siguientes pasos se pueden realizar con antelación para prepararse para futuros experimentos. Todas las secuencias de oligo utilizadas en este protocolo se proporcionan en la Tabla1. Los oligos de ARN se sintetizan con 5'-trifosfato modificaciones.
    1. Añadir 200 l de perlas magnéticas (10 mg/ml) a un tubo de unión a proteínas baja de 1,5 ml, y luego colocar en un estante magnético durante 2 minutos.
    2. Mientras el tubo está en el bastidor magnético, retire el líquido del tubo sin perturbar las perlas. Para lavar las perlas, retire el tubo del bastidor, agregue 1 ml de 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, devuelva el tubo al bastidor y retire la solución de lavado después de 2 minutos.
    3. Repetir lavados 2 veces más usando 200 sl del mismo tampón.
    4. Resuspenda los perlas magnéticas en 400 ml de 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, tampón. A continuación, mezcle con 380 sl de H2O y 20 oL de ADN biotintilado de 10 m sin plantilla. Coloque el tubo en un nutator e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    5. Lavar ADN no-plantilla inmovilizado 3 veces con 200 l de 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, y luego 3 veces con 200 mM de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml de albúmina sérica bovina.
    6. Dejar el tubo durante la noche a 4oC para terminar de bloquear las perlas con BSA.
    7. Al día siguiente, coloque el tubo en el bastidor magnético, retire y deseche el líquido, y resuspenda las perlas en 200 ml de 20 mM de ALbúmina de suero bovino de 20 mM HEPES-NaOH 7,9, 20% glicerol, 100 mM de KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml de albúmina sérica bovina y transfiera a un nuevo tubo. Para esta plantilla de ADN, la concentración final es de aproximadamente 5 m.
      NOTA: El tiempo de incubación y la concentración de oligo deben determinarse empíricamente para cada oligodelamiento de ADN biotinilado. Esta plantilla debe proporcionar suficiente para 200 reacciones, y durar al menos 6 meses cuando se almacena a 4 oC.
  2. ARN y plantilla de ADN hebra oligonucleótido en una relación molar 2:1 (20 y 10 pmol, respectivamente) para obtener el DNA:RNA dúplex.
    1. Configure una mezcla de recocido de 10 l como se describe en la Tabla2.
      NOTA: 10 l de mezcla de recocido son suficientes para 10 reacciones. La mezcla de recocido se puede escalar según sea necesario si se van a realizar más ensayos.
    2. Realizar las reacciones de recocido en un ciclor térmico utilizando el siguiente programa: 5 min a 45 oC, seguido de 12 ciclos de 2 min cada uno, comenzando a 43 oC y disminuyendo la temperatura 2 oC por ciclo. Inactivo a 4oC.
      NOTA: Este es un punto de tiempo flexible. El recocido se termina en 30 minutos, pero se puede dejar a 4 oC durante un período más largo. En el laboratorio, las mezclas de recocido se han dejado sentadas hasta 4 horas sin observar ninguna disminución en la eficiencia de reacción.
    3. Mientras realpara el ARN en el ADN de la cadena de la plantilla, prepare los búferes para los pasos posteriores del protocolo. Los ingredientes necesarios para preparar cada tampón para una sola reacción con cada tampón se enumeran en las Tablas 2 a 8. Amplíe las recetas por un factor de [Y(X+1) + 1] para Wash y (X+1) para todos los demás búferes. X - número de reacciones a preparar; Y - número de pasos de lavado necesarios (mínimo 3).
      NOTA: Prepare todos los búferes frescos el día del experimento. No coloque tubos en hielo después de que se haya añadido PVA a los búferes. Añadir Pol II o nucleótidos a los tampones justo antes de usar.
  3. Cargue la ARN polimerasa II purificada en el híbrido DNA:RNA.
    1. Mezclar 1 pmol (1 L) de ADN:ARN dúplex con 13 l de tampón Pol II (de la Tabla3).
    2. Agregue 0,02 unidades de ARN purificado Pol II (1 l) a la mezcla del paso 1.3.1 y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y revolviendo con la punta de la tubería, sin introducir burbujas. Incubar durante 10 min a 30oC.
      NOTA: Los volúmenes dados a partir de ahora son para una sola reacción; escalar según sea necesario para el número de reacciones en el experimento. Arn Pol II purificado a partir del hígado de rata como se describe10 se utiliza en este ejemplo; sin embargo, ARN Pol II purificado de otras fuentes, incluyendo células de mamíferos cultivadas o levadura también se puede utilizar3,4,5,11,12,13.
  4. Completa el complejo de alargamiento añadiendo ADN biotinilado no-plantilla.
    1. Añadir 5 pmol (1 L) de ADN no-plantilla inmovilizado oligo a 14 l de tampón de ADN no-plantilla (de la Tabla4), añadir al tubo desde el paso 1.3.2, e incubar durante 10 min a 37 oC.
    2. Coloque la muestra en un bastidor magnético durante 2 min. Lavar 1x con 30 l de tampón de lavado (de la Tabla7) para eliminar Pol II y oligos no incorporados.
  5. Generar complejos de alargamiento que contengan ARN 23mers radiomarcados.
    1. Realizar todas las incubaciones adicionales a 30 oC. Añadir 1 l de 15 m de ATP y 10 ci(1 l) de UTP (32 P) UTP (3.000 Ci/mmol) a 23 ml de búfer de pulsoy y utilizar lo para resuspender los perlas magnéticas lavadas.
      PRECAUCION: El material radiactivo es peligroso. Asegúrese de usar el equipo de protección adecuado y de seguir todas las pautas de laboratorio para un uso seguro y la eliminación de material radiactivo.
      NOTA: Sustituya el UTP radiomarcado por un UTP de 15 m cuando no se necesite ARN radiomarcado, como para experimentos de manchas occidentales.
    2. Incubar la reacción durante 10 min para permitir la síntesis de 23mers radiomarcados.
    3. Añadir 1,5 l de solución que contenga 100 m de ATP y 100 m de mezcla UTP a 3,5 l de tampón de persecución, añadir al tubo que contiene complejos de alargamiento premontados e incubar durante 5 minutos para perseguir todas las transcripciones nacientes en 23 mermos.
    4. Coloque la muestra en un estante magnético durante 2 minutos, retire el sobrenadante, lave una vez con 30 ml de tampón de lavado para eliminar los nucleótidos no incorporados y resuspenda en 30 ml de tampón de lavado.
    5. Añadir 94 l de mezcla de tope con proteinasa K y glucógeno (Tabla9) para terminar las reacciones o proceder a la sección 1.6 para generar complejos de alargamiento con transcripciones más largas o sección 2 para realizar ensayos de tapado.
  6. (Opcional) Camina Pol II para hacer 23, 25 y 29 transcripciones de nucleótidos
    1. Siga el procedimiento descrito en los pasos 1.2.1 a 1.5.4 para preparar complejos de alargamiento que contengan 23 mermos radiomarcados. Escále verticalmente 4 veces para generar 120 s de complejos de alargamiento lavados, que son suficientes complejos para 4 reacciones.
    2. Etiqueta 3 nuevos tubos "23mer", "25mer" y "29mer". Transfiera 30 l de complejos de alargamiento lavados al tubo "23mer" y agregue 94 ml de mezcla de tope con proteinasa K y glucógeno.
    3. Coloque el tubo que contiene los 90 l restantes de complejos de alargamiento lavados en el bastidor magnético durante 2 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a colocar las perlas en 90 ml de BTB suplementadas con 1,2 ml cada una de 1,5 mM de ATP y 1,5 mM de CTP. Incubar durante 10 min a 30oC.
    4. Después de lavar una vez con 90 ol de tampón de lavado y volver a depender en 90 l de tampón de lavado como se describe en el paso 1.5.4, transferir 30 l de complejos de alargamiento al tubo "25mer" y añadir 94 ml de mezcla de tope con proteinasa K y glucógeno.
    5. Coloque el tubo que contiene los 60 l restantes de complejos de alargamiento en el bastidor magnético durante 2 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 60 ml de BTB suplementadas con 0,8 ml cada una de 1,5 mM de ATP y 1,5 mM de CTP.
    6. Incubar durante 10 min a 30 oC, lavar una vez con 60 oC de tampón de lavado como en la sección 1.5.5, y resuspender en 60 oC de tampón de lavado.
    7. Transfiera 30 l de la muestra de 2x al tubo de "29mer" y agregue 94 l de mezcla de tope con proteinasa K y glucógeno o proceda a la sección 2 para realizar ensayos de tapón.
    8. Proceder a la purificación y análisis del ARN (Sección 3).

2. Uso de complejos de alargamiento artificial para evitar tapones cotranscripcionales

  1. Generar complejos de alargamiento lavadoques que contengan 23 merdos ampliando el procedimiento descrito en los pasos 1.2.1 a 1.5.5 13 veces. Esto es suficiente para 12 reacciones + 1 extra.
  2. Pol II CTD fosforilación
    1. Coloque el tubo que contiene complejos de alargamiento lavados en el estante magnético durante 2 minutos, retire el sobrenadante y resuspenda las perlas en 377 s de BTB suplementado con 13 ml de 1,5 mM de ATP.
    2. Prepare dos tubos nuevos, etiquetados +H y -H, respectivamente. Al tubo etiquetado +H añadir 3 'L de 300 ng /'L TFIIH', y al tubo etiquetado -H añadir 9 'L de 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL de albúmina de suero bovino.
      NOTA: Por lo general, utilizamos TFIIH purificado a partir de hígado de rata, pero hemos obtenido resultados similares utilizando el valor de 0,6 g/reacción de Cdk7/Cyclin H/MAT1 recombinante disponible comercialmente (CAK, que es el módulo quinasa de TFIIH). Consulte la Tabla de materiales para obtener más información.
    3. Añadir 87 l de los complejos de elongación lavados desde el paso 2.2.1 al tubo etiquetado +H y 270 l de complejos de elongación lavados al tubo etiquetado -H. Incubar 10 min a 30 oC.
    4. Coloque la muestra en un bastidor magnético durante 2 min. Para eliminar el exceso de nucleótidos y proteínas no unidas, lave los complejos de alargamiento en reacciones +H y -H con 90 o 270 ml de tampón de lavado, respectivamente.
  3. Tapón de ARN
    1. Resuspender los complejos de alargamiento en el tubo etiquetado +H en 87 s de mezcla de tapón (BTB complementado con 50 m GTP (Tabla10). Resuspenda los complejos de alargamiento en el tubo etiquetado -H en 261 ml de mezcla de tapón.
    2. Preparar 4 nuevos tubos etiquetados 5 ng CE+H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Diluir la enzima capping (CE) en 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml de albúmina sérica bovina para preparar soluciones que contengan 5 ng CE/L, 15 ng CE/L, o 45 ng CE/L y dispense 3 l de la solución apropiada en cada uno de los 4 tubos.
    3. Prepare 12 tubos nuevos con 94 l de tampón de parada (2.1.1) añadidos a cada uno.
    4. Comience cada reacción de taponamiento añadiendo 87 ml de complejo de alargamiento tratado con TFIIH o no a tubos etiquetados que contengan enzima de taponamiento. Incubar a 30oC en un bloque de calor.
    5. Después de 1, 2 o 4 min, detenga las reacciones transfiriendo 30 ml de cada mezcla de reacción a tubos que contengan 94 ml de tampón de parada. Purifique y analice los productos de reacción como se describe en la sección 3.

3. Purificación y análisis de ARN

  1. Purificar EL ARN
    1. Incubar productos de reacción en tampón de parada durante 20 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Punto de pausa. Las muestras de este tampón se han mantenido hasta 4 horas sin pérdida o degradación del ARN.
    2. Extraer una vez con 124 ol de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (25:24:1) y una vez con cloroformo:alcohol isoamilo (24:1).
      PRECAUCION: El fenol es extremadamente tóxico y es rápidamente absorbido por la piel. Use el equipo de protección adecuado.
      NOTA: Para maximizar la recuperación del ARN durante la extracción, utilice tubos disponibles comercialmente que contengan un gel de alta densidad, que forma una barrera estable entre las fases acuosas y orgánicas. Consulte Discusión y tabla de materiales.
    3. Transfiera la fase acuosa (capa superior) a nuevos tubos que contengan 12,4 ml de acetato de sodio pH de 3 M 5,2.
  2. Precipitación de etanol
    1. Añadir 350 s de 100% de etanol y mezclar bien por inversión.
    2. Incubar durante al menos 10 minutos sobre hielo seco.
      NOTA: Punto de pausa. Para mayor comodidad, uno puede detenerse aquí y completar el procedimiento en el día siguiente; sin embargo, es posible proceder directamente al paso 3.3 y ejecutar el gel en el mismo día. El ARN se puede mantener a -80 oC durante un par de días antes del procesamiento posterior, pero no lo deje por tiempos más largos.
  3. Preparación de muestras de ARN para electroforesis de gel
    1. Deje que las muestras se desconmuten, mezclen invirtiendo 2-3 veces y centrífuga durante 15 min a 21.000 x g, 4 oC, en una centrífuga de mesa. Mientras tanto, configure la mezcla de gel desnaturalizante (sección 3.4.1).
    2. Retire cuidadosamente el etanol de las muestras sin perturbar el pellet.
    3. Añadir 500 s l de 70% de etanol, invertir el tubo un par de veces para lavar el pellet, y luego centrifugar de nuevo a 21.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente o 4 oC.
    4. Retire tanto etanol como sea posible y haga un giro rápido (5-10 s) de los tubos en una centrífuga de mesa. Luego, con una punta de carga de gel, retire el último volumen restante de etanol.
    5. Pellet salteado al aire durante 3 min a temperatura ambiente.
    6. Disolver el ARN añadiendo 4 sl de H2O a la parte superior de cada pellet. Incubar 5 min a temperatura ambiente.
    7. Añadir 4 l de tinte de ARN 2x (Ver Tabla de Materiales)a la mezcla, y luego vórtice cada tubo durante un par de segundos para resuspender completamente el ARN.
      NOTA: Se recomienda el tinte de ARN que contiene formamida en lugar de urea, ya que este último se precipita a bajas temperaturas.
    8. Gire rápidamente los tubos y luego incubarlos a 70 oC durante 10 minutos en un bloque de calor.
    9. Almacene los tubos en hielo seco hasta que estén listos para cargarlos en gel.
      NOTA:       Mantener el ARN en hielo seco permite la flexibilidad para trabajar en otros experimentos mientras el gel se polimeriza. No es necesario recalentar las muestras después de descongelarlas. Sin embargo, el ARN se puede cargar directamente después del calentamiento si el gel está listo para funcionar.
  4. Preparación del gel Urea-PAGE
    1. Para mezcla de gel de 40 ml, combinar en un tubo cónico de 50 ml: 16,7 g de urea, 15 ml de solución de bis:acrilamida al 40% (19:1 relación), 4 ml de 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M de borato sódico, 20 mM EDTA) y 8 ml de H2O. Este volumen es suficiente para un gel de tamaño estándar (18 cm de altura x 16 cm de ancho) con espaciadores de 1,0 mm.
      PRECAUCION: La acrilamida es extremadamente tóxica. Si bien no hay riesgo de inhalación cuando está en solución, use siempre bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad mientras manipula.
      NOTA: Esta mezcla es para la fundición de un gel de 15% de poliacrilamida desnaturalizante, que resuelve fácilmente el ARN entre 15-50 nt. Cambiar la concentración de bis/acrilamida según sea necesario para resolver diferentes transcripciones de ARN de diferentes longitudes.
    2. Coloque el tubo cerrado que contenga una mezcla de gel sobre un nutator hasta que la urea se disuelva por completo.
    3. Configure una estación de fundición de gel con placas de vidrio, espaciadores de 1 mm y un peine de 15 pocillos.
    4. Trabajando rápidamente, agregue 40 s de TEMED y 400 l de solución de persulfato de amonio al 10% de solución de persulfato de amonio a la solución de gel y mezcle bien. Con un pipeta de 25 ml, vierta la solución de gel entre las placas, inserte el peine y deje que el gel se polimerice durante al menos 2 h.
      NOTA: Si el gel se vierte más de 2 horas antes de su uso, una vez que haya polimerizado cúbralo con una toalla de papel húmeda (dejando el peine en su lugar) y envuelva con una envoltura de plástico para evitar que se seque.
  5. Electroforesis de ARN de gel desnaturalizador
    1. Después de la polimerización, transfiera el gel al tanque de carrera y lo ejecute previamente a 20 mA en 1x TBE durante 15-30 min.
    2. Mientras tanto, descongelar las muestras (si están congeladas), el vórtice y girarlas durante 4 min a 2.000 x g,4 oC.
    3. Cuando esté listo, apague la fuente de alimentación y enjuague cuidadosamente cada pozo con 1 x TBE con una jeringa.
    4. Utilice puntas de carga de gel para cargar muestras en el gel.
    5. Ejecutar gel a una constante de 20-30 mA durante aproximadamente 2 h o hasta que el tinte inferior (xileno cianol FF) llegue a la parte inferior del gel.
  6. Retire el gel, colóquelo en un pedazo de papel absorbente y envuélvalo con una envoltura de plástico.
  7. Exponga el gel radiomarcado a un fosforz.
  8. Escanee el fosforapantalla con un fosforimager y analice la imagen.

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Resultados

Las figuras 2 y 3 muestran reacciones representativas de resultados utilizadas para generar complejos de alargamiento artificial que contienen transcripciones de diferentes longitudes mediante la extensión o Pol II de diferentes fuentes. La Figura 4 muestra cómo estos complejos de alargamiento se pueden utilizar para analizar el taponamiento de ARN dependiente de la fosforilación CTD co-transcripcional.

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Discusión

Los estudios que buscan diseccionar eventos acoplados al complejo de elongación Pol II como el procesamiento de ARN y la regulación del alargamiento de la transcripción en sí pueden ser facilitados en gran medida mediante el uso de un sistema enzimático altamente purificado. La configuración de estos sistemas enzimáticos puede ser un desafío. La transcripción dependiente del promotor por parte de la Pol II requiere al menos cinco factores de transcripción generales. Preparar y almacenar estos factores puede llevar meses;...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a S. Shuman por proporcionar la enzima de tapado de mamíferos cDNA. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención al Instituto Stowers para la Investigación Médica del Fondo de Investigación Médica Helen Nelson de la Greater Kansas City Community Foundation.  Se puede acceder a los datos originales subyacentes a este manuscrito desde el repositorio de datos original de Stowers en http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCiPerkin ElmerNEG007H001MCPara el radiomarcaje de ARN
2x Tinte de carga de ARNNew England BiolabsB0363SMuy recomendable. Para la preparación de ARN durante la carga de gel
40% Bis:Solución de acrilamidaBiorad1610144
Albúmina sérica bovina (20 mg/mL)New England BiolabsB9000S
Cdk7/Ciclina H/MAT1 (complejo CAK) Proteína, activa, 10 y micro; gMillipore Sigma14-476Se utiliza para fosforilar Pol II CTD
ADN oligonucleótidosIDTConsulte la Tabla 8 para conocer las especificaciones de pureza
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies Invitrogen65001También hemos utilizado Dynabeads M-280 estreptavidina sin problema, pero preferimos las perlas de MyOne Streptavidin porque sedimentan más lentamente
GlycoBlue Coprecipitant (15  mg/mL)Life Technologies InvitrogenAM9516Muy recomendable. Tintes de ácido nucleico pellet azul haciendo que las reacciones sean mucho más fáciles de manejar
Hoefer SE600 estándar sistema de electroforesis vertical de doble enfriamiento con espaciadores de 1 mm y peine de 15 pocillosHoeferSE600-15-1.5
MaXtract tubos de alta densidad (1.5 mL)Qiagen129046Muy recomendable. Contiene un gel de alta densidad que forma una barrera estable entre las fases acuosa y orgánica; mejora el rendimiento de ARN durante las extracciones
La solución de proteinasa K (20  mg/mL)Life Technologies Invitrogen25530049
ARN oligonucleótidosTrilinkConsulte la Tabla 8 para obtener más detalles
Levadura Pirofosfatasa inorgánica (100 unidades/mL)New England BiolabsNEBM2403SSolo se requiere durante las reacciones de taponado

Referencias

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