Summary
Aquí, describimos el conjunto de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II (Pol II) que requieren sólo ADN sintético corto y oligonucleótidos de ARN y Pol II purificado. Estos complejos son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes al procesamiento co-transcripcional de transcripciones asociadas con el complejo de elongación Pol II.
Abstract
La síntesis de ARNm eucariota es un proceso bioquímico complejo que requiere la transcripción de una plantilla de ADN en un ARN precursor por la enzima multi-subunit ARN polimerasa II y el taponamiento y empalme co-transcripcional del ARN precursor para formar el ARNm maduro. Durante la síntesis de ARNm, el complejo de alargamiento de ARN polimerasa II es un objetivo de regulación por una gran colección de factores de transcripción que controlan su actividad catalítica, así como el tapón, empalme y enzimas de procesamiento de 3'que crean el ARNm maduro. Debido a la complejidad inherente de la síntesis de ARNm, los sistemas experimentales más simples que permiten el aislamiento y la investigación de sus diversas etapas co-transcripcionales tienen gran utilidad.
En este artículo, describimos uno de estos sistemas experimentales simples adecuados para investigar el taponamiento de ARN co-transcripcional. Este sistema se basa en complejos de elongación de ARN polimerasa II definidos ensamblados a partir de burbujas de transcripción artificial y polimerasa purificada. Cuando se inmovilizan a través de ADN biotinilado, estos complejos de alargamiento de ARN polimerasa II proporcionan una herramienta fácilmente manipulable para disuado de taponamiento de ARN co-transcripcional y mecanismos por los cuales el complejo de alargamiento recluta y regula la enzima de tapado durante límite de ARN co-transcripcional. Anticipamos que este sistema podría adaptarse para estudiar el reclutamiento y/o el ensamblaje de proteínas o complejos proteicos con funciones en otras etapas de maduración del ARNm acopladas al complejo de alargamiento de ARN polimerasa II.
Introduction
La síntesis de ARN mensajero eucariota (ARNm) es un elaborado proceso bioquímico que implica la síntesis de un ARN precursor no procesado por ARN polimerasa II y el procesamiento del ARN precursor para producir el ARNm maduro. Los pasos de procesamiento de ARN de tapado, empalme y poliadenilación se llevan a cabo en gran medida de forma co-transcripción. El complejo de alargamiento Pol II sirve como un andamio que recluta y orquesta las actividades de muchas de las enzimas de procesamiento de ARN. En consecuencia, nuestra comprensión última de cómo se generan los ARNm eucariotas maduros dependerá en gran medida del desarrollo de sistemas experimentales que permitan la disección de los mecanismos bioquímicos subyacentes al reclutamiento al complejo de alargamiento y regulación de las enzimas responsables de la limitación co-transcripción, empalme y poliadenilación.
No es de extrañar que el desarrollo de estos sistemas experimentales haya sido difícil. Un impedimento importante ha sido la notable complejidad de la propia transcripción de la Pol II, donde la simple reconstitución de la transcripción basal por Pol II in vitro requiere un conjunto mínimo de cinco factores generales de iniciación de la transcripción: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH 1. Además, la reconstitución de cualquier tipo de transcripción regulada de Pol II in vitro requiere un conjunto aún mayor de factores de transcripción y coreguladores. Por lo tanto, un objetivo importante ha sido desarrollar sistemas experimentales más simples que permitan la reconstitución de complejos de alargamiento activos de Pol II adecuados para la investigación del acoplamiento funcional de la transcripción de Pol II y el procesamiento de ARN.
Uno de esos métodos más sencillos para reconstituir complejos de alargamiento activos de la Pol II ha demostrado ser útil para los estudios estructurales y bioquímicos de alargamiento de la Pol II y, más recientemente, para investigar el procesamiento de ARN co-transcripcional2,3 ,4,5. En este artículo, mostramos cómo los complejos de elongación Pol II preparados a partir de Pol II purificado y las burbujas de transcripción sintética se pueden utilizar eficazmente para investigar los mecanismos subyacentes al taponamiento co-transcripcional de las nacientes transcripciones pol II.
El taponamiento se refiere a la adición covalente de una "tapa" de 5'-guanosina al extremo 5'-trifosfato de las nacientes transcripciones Pol II. El límite es importante para los pasos posteriores de maduración del ARNm, transporte, traducción y otros procesos6,7. La tapa se añade co-transcripcionalmente a las transcripciones de Pol II por una enzima conocida como enzima de taponamiento. En las células de mamíferos, los sitios activos responsables de las actividades de ARN 5'-trifosfatasa yguanylyl transferasa de la enzima de taponamiento están contenidos dentro de un solo polipéptido 8. La enzima de tapado se contrata para el complejo de elongación Pol II a través de interacciones con superficies aún por definir en la carrocería Pol II y el dominio carboxi-terminal Rpb1 (CTD) fosforilado en Ser5 de su heptapéptido repite5. En el complejo de alargamiento, la enzima de tapado cataliza la adición de una tapa de 5'-guanosina una vez que la transcripción naciente alcanza una longitud de al menos 18 nucleótidos y ha surgido del canal de salida del ARN polimerasa. En el primer paso de la reacción de taponamiento, la trifosfatasa hidroliza el ARN 5'-trifosfato para producir un 5'-difosfato. En el segundo paso, GTP es hidrolizado a GMP por la guanylyl transferasa, formando una enzima GMP-capping intermedia. Finalmente, la guanylyl transferasa transfiere GMP al extremo 5'-difosfato de la naciente transcripción para producir la tapa.
Una característica notable de la reacción de tapado es que el taponamiento co-transcripcional (es decir, el taponamiento detranscripciones asociadas con complejos de alargamiento funcional Pol II) es mucho más eficiente que el taponamiento del ARN libre 5,9. Por lo tanto, una pregunta importante en el campo ha sido cómo esta activación dramática de la tapado se logra a través de interacciones de la enzima de tapado con el complejo de elongación Pol II. En este protocolo describimos el ensamblaje de complejos de alargamiento activos de ARN polimerasa II utilizando únicamente ARN polimerasa II purificado y burbujas de transcripción artificial. Estos métodos permiten la creación de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II con transcripciones de longitud y secuencia definidas. En un estudio reciente, utilizamos estos complejos de alargamiento de ARN polimerasa II definidos como modelo para investigar aspectos de los mecanismos de limitación de ARN5. En particular, mostramos que i) el taponamiento del ARN asociado a estos complejos de alargamiento era más de 100 veces más eficiente que el taponamiento del ARN libre y ii) fue estimulado por la fosforilación dependiente de TFIIH del CTD Pol II. El enfoque descrito aquí podría, en principio, adaptarse para generar sustratos para el estudio de otras reacciones de procesamiento de ARN co-transcripcional vinculadas al complejo de alargamiento Pol II.
En la sección 1 de este protocolo, los complejos de alargamiento artificial se crean recocidos de un oligonucleótido de ADN de hilo de plantilla sintética a un oligonucleótido de ARN que es complementario en su extremo 3 a aproximadamente 9 nucleótidos del ADN de la hebra de la plantilla. Pol II se carga entonces en el dúplex DNA:RNA. El complejo de alargamiento se completa mediante la adición de un oligonucleótido de ADN de cadena parcialmente complementario y no-plantilla que se etiqueta con biotina en su extremo 3 (Figura1 y Figura 2A). El oligonucleótido de ARN es ampliado por Pol II en estos complejos de alargamiento para hacer transcripciones radioetiquetas de longitud y secuencia definidas tras la adición de combinaciones apropiadas de nucleótidos radiomarcados. Además, utilizando una combinación de lavados para eliminar nucleótidos no incorporados y la adición adicional de diferentes combinaciones de nucleótidos, se puede "caminar" Pol II a diferentes posiciones a lo largo de la plantilla de ADN y sintetizar ARN de longitudes definidas. El ARN se purifica y se somete a electroforesis en geles de urea-PAGE desnaturalizantes. En la sección 2 del protocolo, los complejos de alargamiento artificial se utilizan para analizar el taponamiento de ARN co-transcripcional. El ejemplo presentado mide el efecto de la fosforilación dependiente de TFIIH del CTD Pol II en el taponamiento del ARN co-transcripcional. En este experimento, medimos el alcance del tapón co-transcripcional en función de la concentración de enzimas de taponamiento (5, 15 y 45 ng por reacción) y el tiempo (1, 2 y 4 min).
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Protocol
1. Montaje de Complejos de Elongación Artificial y Caminar Pol II
- Inmovilizar 1 nmol de ADN no-plantilla oligo que contiene una molécula de biotina de 3' en cuentas magnéticas.
NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar con antelación para prepararse para futuros experimentos. Todas las secuencias de oligo utilizadas en este protocolo se proporcionan en la Tabla1. Los oligos de ARN se sintetizan con 5'-trifosfato modificaciones.- Añadir 200 l de perlas magnéticas (10 mg/ml) a un tubo de unión a proteínas baja de 1,5 ml, y luego colocar en un estante magnético durante 2 minutos.
- Mientras el tubo está en el bastidor magnético, retire el líquido del tubo sin perturbar las perlas. Para lavar las perlas, retire el tubo del bastidor, agregue 1 ml de 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, devuelva el tubo al bastidor y retire la solución de lavado después de 2 minutos.
- Repetir lavados 2 veces más usando 200 sl del mismo tampón.
- Resuspenda los perlas magnéticas en 400 ml de 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, tampón. A continuación, mezcle con 380 sl de H2O y 20 oL de ADN biotintilado de 10 m sin plantilla. Coloque el tubo en un nutator e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar ADN no-plantilla inmovilizado 3 veces con 200 l de 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, y luego 3 veces con 200 mM de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml de albúmina sérica bovina.
- Dejar el tubo durante la noche a 4oC para terminar de bloquear las perlas con BSA.
- Al día siguiente, coloque el tubo en el bastidor magnético, retire y deseche el líquido, y resuspenda las perlas en 200 ml de 20 mM de ALbúmina de suero bovino de 20 mM HEPES-NaOH 7,9, 20% glicerol, 100 mM de KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml de albúmina sérica bovina y transfiera a un nuevo tubo. Para esta plantilla de ADN, la concentración final es de aproximadamente 5 m.
NOTA: El tiempo de incubación y la concentración de oligo deben determinarse empíricamente para cada oligodelamiento de ADN biotinilado. Esta plantilla debe proporcionar suficiente para 200 reacciones, y durar al menos 6 meses cuando se almacena a 4 oC.
- ARN y plantilla de ADN hebra oligonucleótido en una relación molar 2:1 (20 y 10 pmol, respectivamente) para obtener el DNA:RNA dúplex.
- Configure una mezcla de recocido de 10 l como se describe en la Tabla2.
NOTA: 10 l de mezcla de recocido son suficientes para 10 reacciones. La mezcla de recocido se puede escalar según sea necesario si se van a realizar más ensayos. - Realizar las reacciones de recocido en un ciclor térmico utilizando el siguiente programa: 5 min a 45 oC, seguido de 12 ciclos de 2 min cada uno, comenzando a 43 oC y disminuyendo la temperatura 2 oC por ciclo. Inactivo a 4oC.
NOTA: Este es un punto de tiempo flexible. El recocido se termina en 30 minutos, pero se puede dejar a 4 oC durante un período más largo. En el laboratorio, las mezclas de recocido se han dejado sentadas hasta 4 horas sin observar ninguna disminución en la eficiencia de reacción. - Mientras realpara el ARN en el ADN de la cadena de la plantilla, prepare los búferes para los pasos posteriores del protocolo. Los ingredientes necesarios para preparar cada tampón para una sola reacción con cada tampón se enumeran en las Tablas 2 a 8. Amplíe las recetas por un factor de [Y(X+1) + 1] para Wash y (X+1) para todos los demás búferes. X - número de reacciones a preparar; Y - número de pasos de lavado necesarios (mínimo 3).
NOTA: Prepare todos los búferes frescos el día del experimento. No coloque tubos en hielo después de que se haya añadido PVA a los búferes. Añadir Pol II o nucleótidos a los tampones justo antes de usar.
- Configure una mezcla de recocido de 10 l como se describe en la Tabla2.
- Cargue la ARN polimerasa II purificada en el híbrido DNA:RNA.
- Mezclar 1 pmol (1 L) de ADN:ARN dúplex con 13 l de tampón Pol II (de la Tabla3).
- Agregue 0,02 unidades de ARN purificado Pol II (1 l) a la mezcla del paso 1.3.1 y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y revolviendo con la punta de la tubería, sin introducir burbujas. Incubar durante 10 min a 30oC.
NOTA: Los volúmenes dados a partir de ahora son para una sola reacción; escalar según sea necesario para el número de reacciones en el experimento. Arn Pol II purificado a partir del hígado de rata como se describe10 se utiliza en este ejemplo; sin embargo, ARN Pol II purificado de otras fuentes, incluyendo células de mamíferos cultivadas o levadura también se puede utilizar3,4,5,11,12,13.
- Completa el complejo de alargamiento añadiendo ADN biotinilado no-plantilla.
- Añadir 5 pmol (1 L) de ADN no-plantilla inmovilizado oligo a 14 l de tampón de ADN no-plantilla (de la Tabla4), añadir al tubo desde el paso 1.3.2, e incubar durante 10 min a 37 oC.
- Coloque la muestra en un bastidor magnético durante 2 min. Lavar 1x con 30 l de tampón de lavado (de la Tabla7) para eliminar Pol II y oligos no incorporados.
- Generar complejos de alargamiento que contengan ARN 23mers radiomarcados.
- Realizar todas las incubaciones adicionales a 30 oC. Añadir 1 l de 15 m de ATP y 10 ci(1 l) de UTP (32 P) UTP (3.000 Ci/mmol) a 23 ml de búfer de pulsoy y utilizar lo para resuspender los perlas magnéticas lavadas.
PRECAUCION: El material radiactivo es peligroso. Asegúrese de usar el equipo de protección adecuado y de seguir todas las pautas de laboratorio para un uso seguro y la eliminación de material radiactivo.
NOTA: Sustituya el UTP radiomarcado por un UTP de 15 m cuando no se necesite ARN radiomarcado, como para experimentos de manchas occidentales. - Incubar la reacción durante 10 min para permitir la síntesis de 23mers radiomarcados.
- Añadir 1,5 l de solución que contenga 100 m de ATP y 100 m de mezcla UTP a 3,5 l de tampón de persecución, añadir al tubo que contiene complejos de alargamiento premontados e incubar durante 5 minutos para perseguir todas las transcripciones nacientes en 23 mermos.
- Coloque la muestra en un estante magnético durante 2 minutos, retire el sobrenadante, lave una vez con 30 ml de tampón de lavado para eliminar los nucleótidos no incorporados y resuspenda en 30 ml de tampón de lavado.
- Añadir 94 l de mezcla de tope con proteinasa K y glucógeno (Tabla9) para terminar las reacciones o proceder a la sección 1.6 para generar complejos de alargamiento con transcripciones más largas o sección 2 para realizar ensayos de tapado.
- Realizar todas las incubaciones adicionales a 30 oC. Añadir 1 l de 15 m de ATP y 10 ci(1 l) de UTP (32 P) UTP (3.000 Ci/mmol) a 23 ml de búfer de pulsoy y utilizar lo para resuspender los perlas magnéticas lavadas.
- (Opcional) Camina Pol II para hacer 23, 25 y 29 transcripciones de nucleótidos
- Siga el procedimiento descrito en los pasos 1.2.1 a 1.5.4 para preparar complejos de alargamiento que contengan 23 mermos radiomarcados. Escále verticalmente 4 veces para generar 120 s de complejos de alargamiento lavados, que son suficientes complejos para 4 reacciones.
- Etiqueta 3 nuevos tubos "23mer", "25mer" y "29mer". Transfiera 30 l de complejos de alargamiento lavados al tubo "23mer" y agregue 94 ml de mezcla de tope con proteinasa K y glucógeno.
- Coloque el tubo que contiene los 90 l restantes de complejos de alargamiento lavados en el bastidor magnético durante 2 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a colocar las perlas en 90 ml de BTB suplementadas con 1,2 ml cada una de 1,5 mM de ATP y 1,5 mM de CTP. Incubar durante 10 min a 30oC.
- Después de lavar una vez con 90 ol de tampón de lavado y volver a depender en 90 l de tampón de lavado como se describe en el paso 1.5.4, transferir 30 l de complejos de alargamiento al tubo "25mer" y añadir 94 ml de mezcla de tope con proteinasa K y glucógeno.
- Coloque el tubo que contiene los 60 l restantes de complejos de alargamiento en el bastidor magnético durante 2 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 60 ml de BTB suplementadas con 0,8 ml cada una de 1,5 mM de ATP y 1,5 mM de CTP.
- Incubar durante 10 min a 30 oC, lavar una vez con 60 oC de tampón de lavado como en la sección 1.5.5, y resuspender en 60 oC de tampón de lavado.
- Transfiera 30 l de la muestra de 2x al tubo de "29mer" y agregue 94 l de mezcla de tope con proteinasa K y glucógeno o proceda a la sección 2 para realizar ensayos de tapón.
- Proceder a la purificación y análisis del ARN (Sección 3).
2. Uso de complejos de alargamiento artificial para evitar tapones cotranscripcionales
- Generar complejos de alargamiento lavadoques que contengan 23 merdos ampliando el procedimiento descrito en los pasos 1.2.1 a 1.5.5 13 veces. Esto es suficiente para 12 reacciones + 1 extra.
-
Pol II CTD fosforilación
- Coloque el tubo que contiene complejos de alargamiento lavados en el estante magnético durante 2 minutos, retire el sobrenadante y resuspenda las perlas en 377 s de BTB suplementado con 13 ml de 1,5 mM de ATP.
- Prepare dos tubos nuevos, etiquetados +H y -H, respectivamente. Al tubo etiquetado +H añadir 3 'L de 300 ng /'L TFIIH', y al tubo etiquetado -H añadir 9 'L de 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL de albúmina de suero bovino.
NOTA: Por lo general, utilizamos TFIIH purificado a partir de hígado de rata, pero hemos obtenido resultados similares utilizando el valor de 0,6 g/reacción de Cdk7/Cyclin H/MAT1 recombinante disponible comercialmente (CAK, que es el módulo quinasa de TFIIH). Consulte la Tabla de materiales para obtener más información. - Añadir 87 l de los complejos de elongación lavados desde el paso 2.2.1 al tubo etiquetado +H y 270 l de complejos de elongación lavados al tubo etiquetado -H. Incubar 10 min a 30 oC.
- Coloque la muestra en un bastidor magnético durante 2 min. Para eliminar el exceso de nucleótidos y proteínas no unidas, lave los complejos de alargamiento en reacciones +H y -H con 90 o 270 ml de tampón de lavado, respectivamente.
-
Tapón de ARN
- Resuspender los complejos de alargamiento en el tubo etiquetado +H en 87 s de mezcla de tapón (BTB complementado con 50 m GTP (Tabla10). Resuspenda los complejos de alargamiento en el tubo etiquetado -H en 261 ml de mezcla de tapón.
- Preparar 4 nuevos tubos etiquetados 5 ng CE+H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Diluir la enzima capping (CE) en 20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml de albúmina sérica bovina para preparar soluciones que contengan 5 ng CE/L, 15 ng CE/L, o 45 ng CE/L y dispense 3 l de la solución apropiada en cada uno de los 4 tubos.
- Prepare 12 tubos nuevos con 94 l de tampón de parada (2.1.1) añadidos a cada uno.
- Comience cada reacción de taponamiento añadiendo 87 ml de complejo de alargamiento tratado con TFIIH o no a tubos etiquetados que contengan enzima de taponamiento. Incubar a 30oC en un bloque de calor.
- Después de 1, 2 o 4 min, detenga las reacciones transfiriendo 30 ml de cada mezcla de reacción a tubos que contengan 94 ml de tampón de parada. Purifique y analice los productos de reacción como se describe en la sección 3.
3. Purificación y análisis de ARN
- Purificar EL ARN
- Incubar productos de reacción en tampón de parada durante 20 min a temperatura ambiente.
NOTA: Punto de pausa. Las muestras de este tampón se han mantenido hasta 4 horas sin pérdida o degradación del ARN. - Extraer una vez con 124 ol de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (25:24:1) y una vez con cloroformo:alcohol isoamilo (24:1).
PRECAUCION: El fenol es extremadamente tóxico y es rápidamente absorbido por la piel. Use el equipo de protección adecuado.
NOTA: Para maximizar la recuperación del ARN durante la extracción, utilice tubos disponibles comercialmente que contengan un gel de alta densidad, que forma una barrera estable entre las fases acuosas y orgánicas. Consulte Discusión y tabla de materiales. - Transfiera la fase acuosa (capa superior) a nuevos tubos que contengan 12,4 ml de acetato de sodio pH de 3 M 5,2.
- Incubar productos de reacción en tampón de parada durante 20 min a temperatura ambiente.
- Precipitación de etanol
- Añadir 350 s de 100% de etanol y mezclar bien por inversión.
- Incubar durante al menos 10 minutos sobre hielo seco.
NOTA: Punto de pausa. Para mayor comodidad, uno puede detenerse aquí y completar el procedimiento en el día siguiente; sin embargo, es posible proceder directamente al paso 3.3 y ejecutar el gel en el mismo día. El ARN se puede mantener a -80 oC durante un par de días antes del procesamiento posterior, pero no lo deje por tiempos más largos.
- Preparación de muestras de ARN para electroforesis de gel
- Deje que las muestras se desconmuten, mezclen invirtiendo 2-3 veces y centrífuga durante 15 min a 21.000 x g, 4 oC, en una centrífuga de mesa. Mientras tanto, configure la mezcla de gel desnaturalizante (sección 3.4.1).
- Retire cuidadosamente el etanol de las muestras sin perturbar el pellet.
- Añadir 500 s l de 70% de etanol, invertir el tubo un par de veces para lavar el pellet, y luego centrifugar de nuevo a 21.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente o 4 oC.
- Retire tanto etanol como sea posible y haga un giro rápido (5-10 s) de los tubos en una centrífuga de mesa. Luego, con una punta de carga de gel, retire el último volumen restante de etanol.
- Pellet salteado al aire durante 3 min a temperatura ambiente.
- Disolver el ARN añadiendo 4 sl de H2O a la parte superior de cada pellet. Incubar 5 min a temperatura ambiente.
- Añadir 4 l de tinte de ARN 2x (Ver Tabla de Materiales)a la mezcla, y luego vórtice cada tubo durante un par de segundos para resuspender completamente el ARN.
NOTA: Se recomienda el tinte de ARN que contiene formamida en lugar de urea, ya que este último se precipita a bajas temperaturas. - Gire rápidamente los tubos y luego incubarlos a 70 oC durante 10 minutos en un bloque de calor.
-
Almacene los tubos en hielo seco hasta que estén listos para cargarlos en gel.
NOTA: Mantener el ARN en hielo seco permite la flexibilidad para trabajar en otros experimentos mientras el gel se polimeriza. No es necesario recalentar las muestras después de descongelarlas. Sin embargo, el ARN se puede cargar directamente después del calentamiento si el gel está listo para funcionar.
- Preparación del gel Urea-PAGE
- Para mezcla de gel de 40 ml, combinar en un tubo cónico de 50 ml: 16,7 g de urea, 15 ml de solución de bis:acrilamida al 40% (19:1 relación), 4 ml de 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M de borato sódico, 20 mM EDTA) y 8 ml de H2O. Este volumen es suficiente para un gel de tamaño estándar (18 cm de altura x 16 cm de ancho) con espaciadores de 1,0 mm.
PRECAUCION: La acrilamida es extremadamente tóxica. Si bien no hay riesgo de inhalación cuando está en solución, use siempre bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad mientras manipula.
NOTA: Esta mezcla es para la fundición de un gel de 15% de poliacrilamida desnaturalizante, que resuelve fácilmente el ARN entre 15-50 nt. Cambiar la concentración de bis/acrilamida según sea necesario para resolver diferentes transcripciones de ARN de diferentes longitudes. - Coloque el tubo cerrado que contenga una mezcla de gel sobre un nutator hasta que la urea se disuelva por completo.
- Configure una estación de fundición de gel con placas de vidrio, espaciadores de 1 mm y un peine de 15 pocillos.
- Trabajando rápidamente, agregue 40 s de TEMED y 400 l de solución de persulfato de amonio al 10% de solución de persulfato de amonio a la solución de gel y mezcle bien. Con un pipeta de 25 ml, vierta la solución de gel entre las placas, inserte el peine y deje que el gel se polimerice durante al menos 2 h.
NOTA: Si el gel se vierte más de 2 horas antes de su uso, una vez que haya polimerizado cúbralo con una toalla de papel húmeda (dejando el peine en su lugar) y envuelva con una envoltura de plástico para evitar que se seque.
- Para mezcla de gel de 40 ml, combinar en un tubo cónico de 50 ml: 16,7 g de urea, 15 ml de solución de bis:acrilamida al 40% (19:1 relación), 4 ml de 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M de borato sódico, 20 mM EDTA) y 8 ml de H2O. Este volumen es suficiente para un gel de tamaño estándar (18 cm de altura x 16 cm de ancho) con espaciadores de 1,0 mm.
- Electroforesis de ARN de gel desnaturalizador
- Después de la polimerización, transfiera el gel al tanque de carrera y lo ejecute previamente a 20 mA en 1x TBE durante 15-30 min.
- Mientras tanto, descongelar las muestras (si están congeladas), el vórtice y girarlas durante 4 min a 2.000 x g,4 oC.
- Cuando esté listo, apague la fuente de alimentación y enjuague cuidadosamente cada pozo con 1 x TBE con una jeringa.
- Utilice puntas de carga de gel para cargar muestras en el gel.
- Ejecutar gel a una constante de 20-30 mA durante aproximadamente 2 h o hasta que el tinte inferior (xileno cianol FF) llegue a la parte inferior del gel.
- Retire el gel, colóquelo en un pedazo de papel absorbente y envuélvalo con una envoltura de plástico.
- Exponga el gel radiomarcado a un fosforz.
- Escanee el fosforapantalla con un fosforimager y analice la imagen.
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Representative Results
Las figuras 2 y 3 muestran reacciones representativas de resultados utilizadas para generar complejos de alargamiento artificial que contienen transcripciones de diferentes longitudes mediante la extensión o Pol II de diferentes fuentes. La Figura 4 muestra cómo estos complejos de alargamiento se pueden utilizar para analizar el taponamiento de ARN dependiente de la fosforilación CTD co-transcripcional.
La Figura 2A es un diagrama de moléculas de ADN y ARN en complejos de alargamiento artificial. La Figura 2B muestra transcripciones de diferente longitud generadas en las reacciones realizadas exactamente como se describe en el Protocolo 1, en el que los complejos de alargamiento artificial iniciales se prepararon utilizando un ARN sintético oligo de 20 nt (azul oscuro en la Figura 2A ; RNA_20mer, Tabla 1). Puesto que conocemos la longitud inicial del ARN y la secuencia de la plantilla de ADN, podemos determinar que el subconjunto de nucleótidos (ATP, CTP, GTP o UTP) sea necesario para caminar pol II a una posición definida a lo largo de la plantilla. El número de nucleótidos recién sintetizados se añade al tamaño inicial de la imprimación de oligonucleótidos de ARN para determinar la longitud esperada final (tamaño de oligotamaño de ARN + número de nucleótidos añadidos). En presencia de ATP y UTP, Pol II puede agregar 3 nt al oligo ARN de 20 nt para generar complejos de alargamiento que contienen un ARN de 23 mer. Si uno lava ATP y UTP no incorporados y luego agrega ATP y CTP, el oligo de 20 nt se extiende por 2 nt para hacer un 25mer, y si uno luego lava de nuevo los nucleótidos no incorporados y agrega ATP y GTP, la transcripción se extiende un adicional de 4 nt para hacer un 29mer. ce las transcripciones recién generadas corresponden al tamaño de ARN esperado y dado que casi todos los 23mers radiomarcados pueden ser perseguidos cuantitativamente en productos más largos, uno sabe que usando este método (i) el oligo ARN se coloca correctamente en la salida Pol II durante el montaje y ii) los ARN radiomarcados están asociados con complejos de alargamiento de Pol II activos.
La Figura 2C muestra una variación del protocolo, en el que los complejos de alargamiento iniciales se prepararon utilizando la misma plantilla de ADN y oligos de hebra no de plantilla y un oligo DE ARN (RNA_29mer, Tabla 1) que contiene 9 nucleótidos adicionales en su fin de 5', pero por lo demás es idéntico en secuencia al oligo de ARN de 20 nt. Debido a que la longitud del ARN inicial es de 29 nt en este caso, los complejos de alargamiento que contienen transcripciones de 32, 34 meryentos y 38 mer se pueden generar utilizando los mismos pasos de caminar Pol II descritos anteriormente.
Dependiendo del alcance del análisis, este método permite flexibilidad en la fuente de la Pol II. En la Figura 3 comparamos las reacciones utilizando Pol II de diferentes fuentes. En las reacciones mostradas en los primeros 4 carriles, los complejos de elongación artificial se ensamblaron con Pol II endógeno y salvaje purificado a partir de hígado de rata o levadura de fission y caminaron como se describió anteriormente para generar 23 mers o 25mers. La rata y la levadura de físión Pol II utilizadas en estas reacciones fueron purificadas hasta cerca de la homogeneidad utilizando múltiples pasos cromatográficos.
El método también se puede utilizar para generar complejos de elongación artificial que contengan tipo salvaje o mutante Pol II preparado utilizando un método de purificación simple de un solo paso. Los dos últimos carriles de los ensayos de la figura muestran realizados utilizando una forma mutante de Pol II humano que carece del CTD en su subunidad Rpb1, que no es necesaria para la actividad catalítica de Pol II, pero ayuda a acoplar la transcripción al taponamiento del ARN. El Pol II sin CTD utilizado en estos ensayos fue purificado por inmunopurificación anti-FLAG de una línea celular humana que expresa baña bañaba una versión etiquetada con epítopos FLAG de Rpb1. Es importante tener en cuenta que la concentración de Pol II activo variará de una preparación a una preparación. Por lo tanto, es esencial realizar experimentos iniciales en los que la cantidad de Pol II utilizada en las reacciones es variada para determinar la cantidad necesaria para obtener la actividad deseada.
La Figura 4 muestra un ejemplo representativo de un ensayo que compara el límite de transcripciones radioetiquetadas asociadas con complejos de alargamiento artificial que contienen Pol II con un CTD fosforilado o sin fosforilar. Para estos ensayos, se prepararon complejos de alargamiento que contenían 23 transcripciones de nucleótidos con un extremo de 5'-trifosfato como se describe en el protocolo 2.
La incubación de complejos de elongación con enzima de taponamiento conduce a un desplazamiento de movilidad de alrededor de 1 nt, lo que indica la adición de un límite de 5'14,15. Para cuantificar las reacciones de limitación, se determina la eficiencia de limitación, expresada como porcentaje del ARN que está limitado. La eficiencia de taponamiento es la relación entre el ARN tapado y el ARN total, dividido por el límite máximo que se puede obtener. En nuestros ensayos encontramos que el límite máximo obtenido de los oligos de ARN obtenidos de fuentes comerciales es del 85%, probablemente debido a la trifosforilación incompleta del ARN sintético.
En las reacciones mostradas en los primeros 3 carriles, los complejos de alargamiento se incubaron con el factor de transcripción general TFIIH y el cofactor ATP para fosforilar el Pol II CTD antes de tapar. En estas reacciones, se observó un taponamiento casi máximo de 1 min después de la adición de 5 ng de la enzima de taponamiento. Cuando los ensayos se realizaron utilizando complejos de alargamiento que no se incuban con TFIIH y por lo tanto contienen Pol II sin fosforilar, se necesitó casi 10 veces más enzima de taponamiento para observar niveles similares de taponamiento. Los dos últimos carriles de la Figura 4 muestran los productos de reacciones en los que los complejos de alargamiento se incuban con o sin enzima de tapado, en presencia de TFIIH. Es importante destacar que la dependencia de TFIIH de los complejos de alargamiento artificial de limitación co-transcripción demostrados en esta figura es muy similar a la observada en los complejos de alargamiento que habían iniciado la transcripción en un promotor en sistemas enzimáticos más complejos 5.
Figura 1: Montaje de complejos de alargamiento artificial. (A) EL ARN oligo (azul oscuro) de 20 nt se recocido a una hebra de plantilla de ADN (verde) a través de una secuencia complementaria de 9 nt. (B) ARN polimerasa II (Pol II) se mezcla con el ADN recocido: ARN híbrido para posicionar el ARN 3'-end en el sitio catalítico Pol II. (C) Se añade un exceso molar de 3' biotinilado adn no-plantilla (azul claro) a la mezcla de reacción para encerrar y estabilizar aún más el complejo de alargamiento. (D) Los complejos de alargamiento inmovilizados se lavan para eliminar el exceso de oligos y se incuban con combinaciones apropiadas de nucleótidos para permitir que Pol II extienda el oligoARN a la longitud deseada. La porción recién sintetizada del ARN se muestra en amarillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pol II caminando usando oligos de ARN de diferentes longitudes. (A) Diagrama de complejos de alargamiento artificial, mostrando nucleótidos añadidos durante los paseos. El ADN de la hebra y de la hebra de la plantilla no-plantilla se muestran en azul claro y verde, respectivamente. El oligo ARN de 20 nt se muestra en azul oscuro. También se muestran los nucleótidos añadidos durante caminatas sucesivas para generar ARN de 23 mer (naranja), ARN de 25 mer (marrón) y ARN 29mer (magenta). (B) Electroforesis de gel desnaturalizadora que muestra ARN de longitud definida obtenidas después de caminar Pol II utilizando una imprimación de ARN de 20 nt, como se describe en el Protocolo 1. Los nucleótidos añadidos durante cada paso secuencial del protocolo son naranja codificado por color (23mer), marrón (25mer) y magenta (29mer). (C) Pol II caminando a partir de una imprimación de ARN de 29 nt, pero de lo contrario exactamente como se muestra en B. (B y C) muestran partes del mismo gel, pero se separaron con fines ilustrativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Transcripciones sintetizadas por complejos de alargamiento artificial que contienen tipo salvaje o mutante Pol II. Los complejos de alargamiento artificial se ensamblaron utilizando la imprimación de ARN de 20 nt y el Pol II endógeno altamente purificado a partir de hígado de rata o levadura de fisión o FLAG inmunopurificado Pol II que carecían de la Rpb1 de las células de HeLa (F:Rpb1-CTD). El ARN en cada complejo se amplió aún más a 23 nt o 25 nt. Consulte el texto para obtener más información. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Activación dependiente de la fosforilación del taponamiento del ARN co-transcripcional. Los complejos de alargamiento artificial que contienen hígado de rata Pol II y ARN radiomarcado de 23 merdos fueron incubados con ATP y el factor de transcripción general TFIIH o tampón durante 10 minutos para fosforilar el CTD Pol II. Después del lavado, los complejos de alargamiento se incubaron con 5 ng, 15 ng, o 45 ng de enzima de taponamiento de mamíferos durante 1, 2 o 4 minutos. Se resolvieron 23mers tapados y sin tapar en un gel desnaturalizador (arriba, primeros 12 carriles) y el ARN tapado porcentual se cuantificó y se trazó (abajo). Esta parte de la figura se publicó originalmente en la referencia 5, que se publicó como un artículo de acceso abierto bajo una licencia CC-BY. Los dos últimos carriles, que provienen de un experimento separado, ilustran productos de reacciones en los que los complejos de alargamiento fueron incubados con o sin enzima de tapado, en presencia de TFIIH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Secuencia | Comentarios | |
| RNA_20mer | ACUCUCAUGUCUGAUGCUUA | 5' Modificación del trifosfato; PAGE & RP-HPLC purificado |
| RNA_29mer | ACUCUAUGACUCUUCAUGUCUGAUGCUUA | 5' Modificación del trifosfato; PAGE & RP-HPLC purificado |
| TEMPLATE Strand DNA | CTACGGTTAAGCTCACGGTACATTCTGAA TTAAGCATCATCATGG |
Dual PAGE & HPLC purificado |
| ADN de hebra sin plantilla | ATCAGAAATGTACCGAGCTTAACCGTAG | 5' TEG biotinilado; HPLC purificado |
Tabla 1: Oligonucleótidos de ADN y ARN
| Concentración final | Volumen | |
| Tris HCl pH 7.5 | 12 mM* | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1 L |
| 300 mM KCl | 50 mM | 1.67 L |
| 10 M Plantilla De hebra ADN oligo en 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | 1 M | 1 L |
| 10 M DE ARN oligo en 10 mM Tris-HCl pH 7.5 |
2 M | 2 l |
| Agua | 4.33 L | |
| 10 l | ||
| *Todos los Tris-HCl provienen de soluciones de ADN y ARN oligo | ||
Tabla 2: Cóctel para recocido de ADN y ARN oligos
| Buffer Pol II | Concentración final | Volumen/reacción |
| Agua | 4,52 l | |
| 50 mM MgCl2 | 4,67 mM | 1.40 L |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | 23 mM | 1.40 L |
| 300 mM KCl | *27 mM | 1.33 L |
| 50% Glicerol | 3% | 0,9 l |
| 20 mg/ml DeSA | 0,5 mg/ml | 0,38 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 3 L |
| 13 l | ||
| Justo antes de usar buffer add: | ||
| ADN de hilo de plantilla recocido:ARN (de la Tabla 1) | 1 L | |
| ARN Polimerasa II | 1 L | |
| *La concentración final de KCl en la mezcla es de 50 mM, con KCl adicional procedente de Pol II | ||
| Las concentraciones finales de MgCl2 y Tris HCl son de 5 mM y 25 mM respectivamente, | ||
| El MgCl2 y Tris HCl adicionales provienen del producto DNA:RNA recocido. | ||
Tabla 3: Mezcla Pol II
| Búfer de ADN sin plantilla | Concentración final | Volumen/reacción |
| Agua | 4.48 l | |
| 300 mM KCl | *43,33 mM | 2.17 L |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1.50 L |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | 25 mM | 1.50 L |
| 50% Glicerol | 3% | 0,9 l |
| 20 mg/ml de BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 3 L |
| 14 l | ||
| Justo antes de usar buffer add: | ||
| 5 M Biotinylated non-template DNA oligo | 1 L | |
| *La concentración final de KCl en la mezcla es de 50 mM, con KCl adicional procedente de un búfer de oligo de ADN no-plantilla. | ||
Tabla 4: Mezcla de ADN no-plantilla
| Búfer de etiquetado de pulsos | Concentración final | Volumen/reacción |
| Agua | 9,98 l | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 l |
| 50% Glicerol | 3% | 1.5 L |
| 20 mg/ml de BSA | 0,5 mg/ml | 0,63 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,4 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7.9 | *12 mM | 0,3 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,13 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7.9 | 3 mM | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 5 l |
| 23 l | ||
| Justo antes de usar buffer add: | ||
| 15 M de ATP | 0,6 M | 1 L |
| 3,3 M [-32P]UTP | 0,13 m | 1 L |
| *La concentración final de Tris HCl es de 20 mM, con Tris HCl adicional procedente de amortiguador de nucleótidos. | ||
Tabla 5: Mezcla NTP de etiquetado de pulsos
| Búfer de persecución | Concentración final | Volumen/reacción |
| Tris HCl, pH 7.5 | *30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 L |
| Agua | 0,6 l | |
| 50% Glicerol | 3% | 0,3 l |
| 10 mM DTT | 0,5 mM | 0,25 sL |
| 100 mM HEPES-NaOH, pH 7.9 | 3 mM | 0,15 l |
| 20 mg/ml de BSA | 0,5 mg/ml | 0,13 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,08 l |
| 10% PVA | 2% | 1 L |
| 3,5 l | ||
| Justo antes de usar buffer add: | ||
| UTP de 100 m, 100 oM de ATP diluido en 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 | 5 m | 1.5 L |
| *Todos los Tris HCl provienen del tampón de nucleótidos |
Tabla 6: Mezcla Chase NTP
| Concentración final | Volumen/reacción | |
| Agua | 24,21 l | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1,8 l |
| 50% Glicerol | 3% | 1,8 l |
| 20 mg/ml DeSA | 0,5 mg/ml | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7.9 | 20 mM | 0,6 l |
| 10% PVA | 0,2% | 0,6 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7.9 | 3 mM | 0,09 l |
| 30 l |
Tabla 7: Búfer de lavado
| Concentración final | Volumen/reacción | |
| Agua | 14,13 l | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 L |
| 50% Glicerol | 3% | 1,8 l |
| 20 mg/ml DeSA | 0,5 mg/ml | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7.9 | 20 mM | 0,6 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7.9 | 3 mM | 0,09 l |
| 10% PVA | 2% | 6 L |
| 30 l |
Tabla 8: Zona de influencia de transcripción base (BTB)
| Detener búfer | Concentración final | Volumen/reacción |
| Agua | 55,74 l | |
| 1 M Tris HCl, pH 7,5 | 10 mM | 0,6 l |
| 5 M NaCl | 300 mM NaCl | 3,6 l |
| 500 mM EDTA | 0,5 mM EDTA | 0,06 l |
| 10% SDS | 0.2% SDS | 1.2 L |
| 60 l | ||
| Justo antes de usar buffer add: | ||
| 15 mg/ml de glucógeno | 2 l | |
| 20 mg/ml de proteinasa K | 2 l | |
| Agua | 30 l | |
Tabla 9: Detener la mezcla
| Concentración final | Volumen/reacción | |
| Agua | 11,9 l | |
| 300 mM KCl | *53,33 mM | 5.33 L |
| 50% Glicerol | 3% | 1,8 l |
| GTP de 1,5 M diluido en 100 mM Tris HCl, pH 7,5 | 50 M | 1 L |
| 100 unidades/ml Pirofosfatasa inorgánica, levadura | 0,1 unidades/reacción | 1 L |
| 20 mg/ml DeSA | 0,5 mg/ml | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7.9 | 16,67 mM | 0,5 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7.9 | 3 mM | 0,09 l |
| 10% PVA | 2% | 6 L |
| 29 l | ||
| Justo antes de usar buffer add: | ||
| Enzima de taponamiento | 1 L | |
| *La concentración final de KCl en la mezcla es de 60 mM, con KCl adicional procedente de la enzima de tapado y la pirofosfatasa | ||
| La concentración final de Tris HCl es de 20 mM, con Tris HCl adicional procedente de tampón de nucleótidos | ||
Tabla 10: Mezcla de taponamiento
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Discussion
Los estudios que buscan diseccionar eventos acoplados al complejo de elongación Pol II como el procesamiento de ARN y la regulación del alargamiento de la transcripción en sí pueden ser facilitados en gran medida mediante el uso de un sistema enzimático altamente purificado. La configuración de estos sistemas enzimáticos puede ser un desafío. La transcripción dependiente del promotor por parte de la Pol II requiere al menos cinco factores de transcripción generales. Preparar y almacenar estos factores puede llevar meses; por lo tanto, el paso de limitación de velocidad en este proceso es a menudo simplemente preparar el cuadro de factores de transcripción necesarios para reconstituir la transcripción basal en el tubo de ensayo.
En este artículo, describimos una adaptación de los métodospreviamente desarrollados para generar complejos de elongación de transcripción artificial 2,3 utilizando sólo Pol II purificado y ADN sintético y oligonucleótidos de ARN. Los complejos de alargamiento resultantes son transcripcionalmente activos y son adecuados para su uso en la investigación del acoplamiento de la transcripción Pol II y el tapón de ARN5. Es importante tener en cuenta que la transcripción y la limitación del ARN se producen in vivo en el contexto de la cromatina y muchas otras proteínas no presentes en este sistema enzimático definido; por lo tanto, se espera que este sistema recapitule muchas, pero no todas, características de las reacciones que ocurren in vivo. El protocolo que describimos se basa en métodos anteriores mediante la inmovilización de complejos de alargamiento artificial a través de ADN biotinilado unido a cuentas magnéticas, lo que permite al investigador cambiar fácilmente las condiciones de reacción y/o eliminar nucleótidos no incorporados durante diferentes etapas de los ensayos. Es importante destacar que, debido a que la etiqueta utilizada para inmovilizar complejos de elongación está en un extremo de la cadena de ADN no-plantilla en lugar de en la propia Pol II o en la cadena de plantilla, sólo aquellos Pol IIs asociados con complejos de alargamiento completos se conservarán en cuentas.
Debido a que las transcripciones nacientes deben tener un extremo de 5'-trifosfato para ser modificada por la enzima de tapado, los oligonucleótidos arn sintéticos utilizados para los experimentos de taponamiento se compran con 5'-trifosfato termini. Sin embargo, los oligos de ARN no modificados se pueden utilizar para otras aplicaciones, incluidos estudios de otros eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional o las actividades de factores de transcripción que regulan el alargamiento de Pol II. Independientemente de la aplicación aguas abajo, recomendamos ensamblar complejos de elongación con ADN altamente purificado y oligos de ARN. En particular, los oligos de ADN biotinilados deben ser purificados por HPLC, y otros oligos de ADN y ARN deben purificarse mediante electroforesis de gel de poliacrilamida y/o HPLC. Sin embargo, la pureza de las actividades enzimáticas tendrá que determinarse caso por caso y dependerá del alcance de cada experimento.
La adición del oligo ADN biotinilado no-plantilla en el último paso del montaje debe ser, en principio, suficiente para obtener un complejo ternario. Sin embargo, siempre incluimos al menos un paso "caminando" para confirmar que Pol II incorpora el número correcto de nucleótidos: Si el objetivo del experimento es generar sustratos para la confirmación de tapones co-transcripcionales u otros pasos de procesamiento de ARN o seguir Pol II alargamiento, siempre incluimos un ribonucleótido con etiqueta P en el "paseo" inicial para que la transcripción pueda visualizarse y utilizar nucleótidos "fríos" sin etiquetar para pasos posteriores para caminar para que la actividad específica de las transcripciones de diferentes longitudes permanece constante. Aunque el método descrito en este protocolo utiliza nucleótidos con etiqueta P para visualizar transcripciones nacientes, los ensayos basados en fluorescencia se pueden utilizar para medir el etiquetado de ARN cuando no es posible trabajar con materiales radiactivos. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la sensibilidad de tales ensayos es típicamente mucho menor que aquellos que utilizan etiquetas radiactivas, y por lo general requieren mayores cantidades de enzimas.
Un paso clave para experimentos reproducibles es una buena recuperación de ARN durante la extracción de fenol:cloroformo:isoamilo y precipitación de etanol. Hemos encontrado que el uso de tubos de microcentrífuga que contienen geles de alta densidad (ver Tabla de Materiales)para fenol:cloroformo:extracción de isoamilo aumenta la reproducibilidad y el rendimiento del ácido nucleico a partir de este paso. Además, el uso de glucógeno de color (ver Tabla de Materiales)como portador durante la precipitación de etanol hace que sea más fácil ver pequeños pellets de ácido nucleico, lo que hace menos probable que uno pierda inadvertidamente el pellet al aspirarlo durante la eliminación de la sobrenadante de etanol.
Los complejos de alargamiento artificial generados mediante protocolos similares a los que describimos también deben ser útiles para medir las interacciones proteicas-proteínas o ácidos nucleicos entre el complejo de alargamiento Pol II y los factores que regulan la transcripción eventos de alargamiento o procesamiento de ARN vinculados al alargamiento. En este caso, las proteínas que permanecen unidas a complejos de elongación artificial después del lavado son detectadas por hincha occidental o espectrometría de masas; ARN radioetiquetado no es necesario y hacemos todos los pasos de transcripción con sólo nucleótidos "fríos".
Por último, este método podría ser útil para análisis estructurales de complejos de transcripción. De hecho, se han utilizado métodos relacionados en estudios crio-EM con levaduras y enzimas de mamíferos para reconstituir las interacciones enzimáticas-Pol II 13, y las interacciones de la Pol II con otras proteínas o complejos proteicos durante el alargamiento12, pausa16,17, y más recientemente, unido a un nucleosoma18. Una posible complicación para los análisis estructurales de los complejos de transcripción generados con este método es la necesidad de eliminar las cuentas biotinas/magnéticas del complejo; sin embargo, esto se puede resolver mediante la inclusión en oligos de ADN sitios específicos reconocidos por enzimas de restricción o mediante el uso de enlaces de biotina que se cleaved off después del tratamiento de rayos UV19.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a S. Shuman por proporcionar la enzima de tapado de mamíferos cDNA. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención al Instituto Stowers para la Investigación Médica del Fondo de Investigación Médica Helen Nelson de la Greater Kansas City Community Foundation. Se puede acceder a los datos originales subyacentes a este manuscrito desde el repositorio de datos original de Stowers en http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
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