Summary
Qui, descriviamo l'assemblaggio di complessi di allungamento della polimerasi RNA II (Pol II) che richiedono solo brevi oligonucleotidi di DNA sintetico e RNA e Pol II purificati. Questi complessi sono utili per studiare i meccanismi alla base dell'elaborazione co-trascrizione delle trascrizioni associate al complesso di allungamento di Pol II.
Abstract
La sintesi dell'mRNA eucariotico è un complesso processo biochimico che richiede la trascrizione di un modello di DNA in un RNA precursore da parte dell'enzima multi-subunità RNA polymerase II e il capping e giunzione co-trascrizione dell'RNA precursore per formare l'mRNA maturo. Durante la sintesi dell'mRNA, il complesso di allungamento dell'RNA polimerasi II è un obiettivo per la regolazione da parte di una vasta raccolta di fattori di trascrizione che controllano la sua attività catalitica, così come il capping, lo splicing e 3'enzimi che elaborano l'mRNA maturo. A causa della complessità intrinseca della sintesi dell'mRNA, sistemi sperimentali più semplici che consentono l'isolamento e l'indagine delle sue varie fasi co-trascrizioni hanno una grande utilità.
In questo articolo, descriviamo uno di questi semplici sistemi sperimentali adatti per studiare il capping dell'RNA co-trascrizione. Questo sistema si basa su complessi di allungamento definiti per la polimerasi II, assemblati da polimerasi purificate e bolle di trascrizione artificiale. Quando immobilizzati tramite DNA biotinylato, questi complessi di allungamento dell'RNA polimerasi II forniscono uno strumento facilmente manipolabile per distrusire il capping dell'RNA co-trascrizione e i meccanismi con cui il complesso di allungamento recluta e regola l'enzima di capping durante il ceforo co-trascrizione dell'RNA. Prevediamo che questo sistema potrebbe essere adattato per studiare il reclutamento e/o l'assemblaggio di proteine o complessi proteici con ruoli in altre fasi della maturazione dell'mRNA accoppiato al complesso di allungamento della polimerasi II.
Introduction
La sintesi dell'RNA del messaggero eucaico (mRNA) è un processo biochimico elaborato che comporta la sintesi di un RNA precursore non elaborato mediante polimerasi RNA II e l'elaborazione dell'RNA precursore per produrre l'mRNA maturo. Le fasi di lavorazione dell'RNA di capping, splicing e poliadenilazione vengono eseguite in gran parte co-trascrizione. Il complesso di allungamento di Pol II funge da scaffold che recluta e orchestra le attività di molti degli enzimi di elaborazione dell'RNA. Di conseguenza, la nostra comprensione finale di come vengono generati mRNA eucarici maturi dipenderà fortemente dallo sviluppo di sistemi sperimentali per consentire la dissezione dei meccanismi biochimici alla base del reclutamento nel complesso di allungamento e regolazione degli enzimi responsabili del capping co-trascrizione, giunzione e poliadenilazione.
Non sorprende che lo sviluppo di tali sistemi sperimentali sia stato difficile. Un grande impedimento è stata la notevole complessità della trascrizione di Pol II in cui la semplice riaffermazione basale di Pol II in vitro richiede un insieme minimo di cinque fattori generali di inizio trascrizione: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIFi e TFIIH 1. Inoltre, la ricostituzione di qualsiasi tipo di trascrizione regolamentata di Pol II in vitro richiede una serie ancora più ampia di fattori di trascrizione e coregolatori. Pertanto, uno degli obiettivi principali è stato quello di sviluppare sistemi sperimentali più semplici che consentissero la ricostituzione di complessi di allungamento Attivi Di Pol II adatti per le indagini sull'accoppiamento funzionale della trascrizione di Pol II e sull'elaborazione dell'RNA.
Uno di questi metodi più semplici per la ristorazione dei complessi di allungamento attivi di Pol II si è dimostrato utile per studi strutturali e biochimici di allungamento di Pol II e, più recentemente, per studiare l'elaborazione co-trascanante dell'RNA di Pol II2,3 ,4,5. In questo articolo, mostriamo come i complessi di allungamento di Pol II preparati da Pol II purificati e bolle di trascrizione sintetica possono essere utilizzati in modo efficace per studiare i meccanismi alla base del limite co-trascrizione delle trascrizioni nascenti di Pol II.
Il capping si riferisce all'aggiunta covalente di un "cap" da 5'-guanosina alla fine di 5'-triposfato delle neofite trascrizioni di Pol II. Il tappo è importante per i passaggi successivi di maturazione dell'mRNA, trasporto, traduzione e altri processi6,7. Il tappo viene aggiunto co-transcriptionally alle trascrizioni di Pol II da un enzima indicato come enzima capping. Nelle cellule dei mammiferi, i siti attivi responsabili delle attività di transferase RNA 5'-triphosphatase e guanylyl dell'enzima capping sono contenuti all'interno di un singolo polipeptide8. L'enzima di tappatura viene reclutato nel complesso di allungamento di Pol II attraverso interazioni con superfici ancora da definire sulla carrozzeria Pol II e sul fosforo di dominio carboxy-terminale Rpb1 (CTD) sul Ser5 delle sue ripetizioni di eptapeptide5. Nel complesso di allungamento, l'enzima cadentizza l'aggiunta di un cappuccio da 5'-guanosina una volta che la trascrizione nascente raggiunge una lunghezza di almeno 18 nucleotidi ed è emersa dal canale di uscita dell'RNA polimerasi. Nella prima fase della reazione di tappatura, il tripfolo idrofolosa l'RNA 5'-trifosfato per produrre un difosfato 5'. Nella seconda fase, GTP è idrolyzed a GMP dal goanylyl transferase, formando un enzima GMP-capping intermedio. Infine, il trasferimentogu guanylyl trasferisce GMP all'estremità 5'-diphosphate della trascrizione nascente per produrre il tappo.
Una caratteristica notevole della reazione di tappatura è che il limite co-trascrizione (cioè il limite delle trascrizioni associate ai complessi di allungamento funzionale Pol II) è molto più efficiente del limite di RNA libero5,9. Così, una domanda importante nel campo è stata come questa drammatica attivazione del capping si ottiene attraverso le interazioni dell'enzima capping con il complesso di allungamento Di Pol II. In questo protocollo descriviamo l'assemblaggio di complessi di allungamento active RNA polimerasi II utilizzando solo bolle di polimerasi di RNA purificate II e di trascrizione artificiale. Questi metodi consentono la creazione di complessi di allungamento della polimerasi iI dell'RNA con trascrizioni di lunghezza e sequenza definite. In uno studio recente, abbiamo usato questi complessi di allungamento dell'RNA Polymerasi II definiti come modello per studiare gli aspetti dei meccanismi dell'RNA capping5. In particolare, abbiamo dimostrato che il (i) tappatura dell'RNA associato a questi complessi di allungamento era più di 100 volte più efficiente del limite di RNA libero e (ii) è stato stimolato dal fosforolazione dipendente da TFIIH della Pol II CTD. L'approccio qui descritto potrebbe in linea di principio essere adattato per generare substrati per studiare altre reazioni di elaborazione dell'RNA co-trascrizione legate al complesso di allungamento di Pol II.
Nella Sezione 1 di questo protocollo, i complessi di allungamento artificiale vengono creati annealing un modello sintetico filamento DNA oligonucleotide a un oligonucleotide RNA che è complementare alla sua fine 3'-end a circa 9 nucleotidi del DNA filante modello. Pol II viene quindi caricato sul DNA:RNA duplex. Il complesso di allungamento viene quindi completato con l'aggiunta di un DNA filato parzialmente complementare, non modello, oligonucleotide che è etichettato con biotina alla sua fine 3'-fine (Figura 1 e Figura 2A). L'oligonucleotide dell'RNA viene esteso da Pol II in questi complessi di allungamento per creare trascrizioni radioetichettate di lunghezza e sequenza definite dopo l'aggiunta di combinazioni appropriate di nucleotidi radioetichettati. Inoltre, utilizzando una combinazione di lavatoi per rimuovere i nucleotidi non incorporati e l'ulteriore aggiunta di diverse combinazioni di nucleotidi, si può "camminare" Pol II in diverse posizioni lungo il modello di DNA e sintetizzare RNA di lunghezze definite. L'RNA viene quindi purificato e sottoposto a elettroforesi nei gel di denatura urea-PAGE. Nella Sezione 2 del protocollo, i complessi di allungamento artificiale vengono utilizzati per analizzare il capping dell'RNA co-trascrizione. L'esempio presentato misura l'effetto del fosfororylazione dipendente da TFIIH del CTD Pol II sul limite dell'RNA co-trascrizione. In questo esperimento, misuriamo l'estensione del tappo co-trascrizione in funzione della concentrazione di enzimi capping (5, 15 e 45 ng per reazione) e il tempo (1, 2 e 4 min).
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Protocol
1. Assemblaggio di complessi di allungamento artificiale e Pol II Walking
- Immobilizza 1 nmol di oligo di DNA non modello contenente una molecola di biotina 3' su perline magnetiche.
NOTA: i seguenti passaggi possono essere eseguiti in anticipo per prepararsi per esperimenti futuri. Tutte le sequenze di oligo utilizzate in questo protocollo sono riportate nella Tabella 1. Gli olighi dell'RNA sono sintetizzati con modifiche di 5'-tripofosfato.- Aggiungere 200 l di perline magnetiche (10 mg/mL) a un tubo di legame a bassa proteina da 1,5 mL, quindi posizionare su un rack magnetico per 2 min.
- Mentre il tubo è sul rack magnetico, rimuovere il liquido dal tubo senza disturbare le perline. Per lavare le perline, rimuovere il tubo dal rack, aggiungere 1 mL di 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, restituire il tubo al rack e rimuovere la soluzione di lavaggio dopo 2 min.
- Ripetere i lavamenti altre 2 volte usando 200 l dello stesso buffer.
- Risospendere perline magnetiche in 400 -L di 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, buffer. Quindi mescolare con 380 L di H2O e 20 L di 10 M di oligo di DNA biotinylato non modello. Posizionare il tubo su un nodolo e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
- Lavare oligo DNA non modello immobilizzato 3 volte con 200 luna di 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, e poi 3 volte con 200 -L di 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% gliceolo, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL albumina di siero bovino.
- Lasciare il tubo per una notte a 4 gradi centigradi per finire di bloccare le perline con BSA.
- Il giorno successivo, posizionare il tubo nella griglia magnetica, rimuovere e scartare il liquido, e reidire perline in 200 -L di 20 m HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerolo, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL di albume di siero bovino e trasferire in un nuovo tubo. Per questo modello di DNA, la concentrazione finale è di circa 5 M.
NOT: Il tempo di incubazione e la concentrazione dell'oligo devono essere determinati empiricamente per ogni oligo di DNA biotinylato. Questo modello dovrebbe fornire abbastanza per 200 reazioni, e durare almeno 6 mesi quando conservato a 4 gradi centigradi.
- L'RNA anale e il modello di DNA filano oligonucleotide oligogos in un rapporto molare 2:1 (20 e 10 pmol, rispettivamente) per ottenere il DNA:RNA duplex.
- Impostare una miscela di annessione di 10 L, come descritto nella tabella 2.
NOTA: 10 - L di miscela di annealing sono sufficienti per 10 reazioni. Il mix di annessione può essere aumentato in base alle esigenze se si vogliono eseguire più saggi. - Eseguire le reazioni di annealing in un ciclore termico utilizzando il seguente programma: 5 min a 45 gradi centigradi, seguito da 12 cicli di 2 min ciascuno, a partire da 43 gradi centigradi e diminuendo la temperatura di 2 gradi centigradi per ciclo. Inattivo a 4 gradi centigradi.
NOT: Questo è un timepoint flessibile. L'annealing è terminato entro 30 minuti, ma può essere lasciato a 4 gradi centigradi per un periodo più lungo. In laboratorio, miscele di annessione sono state lasciate sedute fino a 4 h senza osservare alcuna diminuzione dell'efficienza di reazione. - Mentre annealing RNA al modello filatura DNA, preparare i buffer per le fasi successive del protocollo. Gli ingredienti necessari per preparare ogni buffer per una singola reazione ad ogni buffer sono elencati nelle tabelle da 2 a 8. Scalare le ricette di un fattore di [Y (X)1) - 1] per Lavaggio e (X-1) per tutti gli altri buffer. X - numero di reazioni da preparare; Y: numero di passaggi di lavaggio necessari (minimo 3).
NOTA: Preparare tutti i buffer freschi il giorno dell'esperimento. Non posizionare tubi sul ghiaccio dopo che PVA è stato aggiunto ai tamponi. Aggiungere Pol II o nucleotidi ai buffer subito prima dell'uso.
- Impostare una miscela di annessione di 10 L, come descritto nella tabella 2.
- Caricare la polimerasi di RNA purificata II sul DNA:RNA ibrido.
- Mescolare 1 pmol (1 l) di DNA:RNA duplex con 13 : L di tampone Pol II (dalla tabella 3).
- Aggiungete alla miscela 0,02 unità di RNA Pol II purificate alla miscela dal punto 1.3.1 e mescolate pipettando delicatamente su e giù e mescolando con la punta del pipet, senza introdurre bolle. Incubare per 10 min a 30 gradi centigradi.
NOT: I volumi dati da qui in su sono per una singola reazione; aumentare in base alle esigenze il numero di reazioni nell'esperimento. RNA Pol II purificato dal fegato di ratto come descritto10 è usato in questo esempio; tuttavia, L'RNA Pol II purificato da altre fonti, comprese le cellule di mammiferi coltivati o lievito può essere utilizzato anche3,4,5,11,12,13.
- Completa il complesso di allungamento aggiungendo DNA biotinylated non modello.
- Aggiungete le 17.00 (1:L) di oligo dna non modello immobilizzato a 14 - L di buffer di DNA non modello (dalla tabella 4), aggiungere al tubo dal passo 1.3.2, e incubare per 10 min a 37 .
- Collocare il campione in cremario magnetico per 2 min.
- Generare complessi di allungamento contenenti RNA 23merradio radioetichettati.
- Eseguire tutte le ulteriori incubazioni a 30 gradi centigradi. Aggiungete 1 -L di 15 ATP e 10 -Ci (1 OL) di [z-32P] UTP (3.000 Ci/mmol) a 23 litri di buffer a impulsi e usatelo per risospendere le perle magnetiche lavate.
ATTENZIONE: Il materiale radioattivo è pericoloso. Assicurarsi di indossare attrezzature protettive adeguate e di seguire tutte le linee guida di laboratorio per l'uso sicuro e lo smaltimento di materiale radioattivo.
NOT: Sostituire l'UTP radioetichettato con 15 M UTP quando non è necessario l'RNA radioetichettato, ad esempio per gli esperimenti western blot. - Incubare la reazione per 10 min per consentire la sintesi di 23 mercanti radioetichettati.
- Aggiungete 1,5 l di soluzione contenente 100 -M ATP e 100 m UTP a 3,5 -L di tampone di inseguimento, aggiungete al tubo contenente complessi di allungamento preassemblati e incubate per 5 min per inseguire tutte le trascrizioni nascenti in 23 meri.
- Mettere il campione in cremamagnetica per 2 min, rimuovere il supernatante, lavare una volta con 30 gradi di tampone di lavaggio per rimuovere i nucleotidi non incorporati e risospendere in 30 gradi di lavaggio tampone.
- Aggiungere 94 lofisci mix con proteinasi K e glicogeno (Tabella 9) per terminare le reazioni o procedere alla sezione 1.6 per generare complessi di allungamento con trascrizioni più lunghe o sezione 2 per eseguire saggi di capping.
- Eseguire tutte le ulteriori incubazioni a 30 gradi centigradi. Aggiungete 1 -L di 15 ATP e 10 -Ci (1 OL) di [z-32P] UTP (3.000 Ci/mmol) a 23 litri di buffer a impulsi e usatelo per risospendere le perle magnetiche lavate.
- (Facoltativo) Cammina Pol II per fare trascrizioni di 23, 25 e 29 nucleotidi
- Seguire la procedura descritta nei passaggi da 1.2.1 a 1.5.4 per preparare complessi di allungamento contenenti 23 merimer radioetichettati. Scalabilità verticale di 4 volte per generare 120 l di complessi di allungamento lavati, che è abbastanza complessi per 4 reazioni.
- Etichetta 3 nuovi tubi "23mer", "25mer" e "29mer". Trasferire 30 - L di complessi di allungamento lavati al tubo "23mer" e aggiungere 94 - L di stop mix con proteinasi K e glicogeno.
- Posizionare il tubo contenente i restanti 90 oL di complessi di allungamento lavati nel rack magnetico per 2 min, rimuovere il supernatante e risospendere le perline in 90 gradi di BTB integrati con 1,2 xL ciascuno di 1,5 m ATP e 1,5 mM CTP. Incubare per 10 min a 30 gradi centigradi.
- Dopo il lavaggio una volta con 90 , di tampone di lavaggio e la riassoluzione in 90 - L di tampone di lavaggio, come descritto al punto 1.5.4, trasferire 30 l di complessi di allungamento al tubo "25mer" e aggiungere 94 l of stop mix con proteinasi K e glicogeno.
- Posizionare il tubo contenente i restanti 60 gradi di complessi di allungamento nel rack magnetico per 2 min, rimuovere il supernatante e risospendere nuovamente le perline in 60 gradi di BTB integrati con 0,8 litri ciascuno di 1,5 m ATP e 1,5 mM CTP.
- Incubare per 10 min a 30 gradi centigradi, lavare una volta con 60 o L di lavaggio tampone come nella sezione 1.5.5, e risospendere nuovamente in 60 .
- Trasferire 30 l da 2x campione al tubo "29mer" e aggiungere 94 l of stop mix con proteinasi K e glicogeno o procedere alla sezione 2 per eseguire i saggi di tappatura.
- Procedere alla purificazione e all'analisi dell'RNA (Sezione 3).
2. Utilizzo di complessi di allungamento artificiale per la analisi del capping cotranscriptional
- Generare complessi di allungamento lavati contenenti 23meri aumentando la procedura descritta nei passaggi da 1.2.1 a 1.5.5 13 volte. Questo è sufficiente per 12 reazioni e 1 extra.
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Fosforo CTD Pol II
- Posizionare il tubo contenente i complessi di allungamento lavati nel rack magnetico per 2 min, rimuovere il supernatante e respendere le perline in 377: L di BTB integrati con 13 ATP di 1,5 mM.
- Preparare due nuovi tubi, etichettati rispettivamente con le etichette H e -H. Al tubo etichettato come H aggiungere 3 -L di 300 ng/L TFIIH, e al tubo etichettato -H aggiungere 9 l di 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL album di sierazione bovina.
NOT: In genere usiamo TFIIH purificato dal fegato di ratto, ma abbiamo ottenuto risultati simili utilizzando 0,6 dollari/reazione del ricombinante disponibile in commercio Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK, che è il modulo della chinasi di TFIIH). Per informazioni, vedere Tabella dei materiali. - Aggiungere al tubo etichettato -H. Incubare 10 min al tubo etichettato H e 270 -L di complessi di allungamento lavati al tubo etichettato -H. Incubare 10 min a 30 .
- Mettere il campione in cremamagnetica per 2 min. Per rimuovere i nucleotidi in eccesso e le proteine non legate, lavare i complessi di allungamento nelle reazioni di H e -H, rispettivamente con 90 o 270 l di tampone di lavaggio.
-
Capping DELL'RNA
- Risospendere i complessi di allungamento nel tubo etichettato come H in 87 , l of capping mix (BTB integrato con 50 - M GTP (Tabella 10). Risospendere i complessi di allungamento nel tubo etichettato -H in 261 - L di miscela di capping.
- Preparare 4 nuovi tubi etichettati 5 ng CE- H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Enzima didelitivo (CE) in 20 m HEPES-NaOH pH 7.9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL albumin a siero bovino per preparare soluzioni contenenti 5 ng CE / , 15 ng CE / , o 45 ng CE / E dierogare 3 - L della soluzione appropriata in ciascuno dei 4 tubi.
- Preparare 12 nuovi tubi con 94 loff di stop buffer (2.1.1) aggiunti ad ciascuno.
- Iniziare ogni reazione di tappatura aggiungendo 87 - L di complesso di allungamento trattato con TFIIH o non a tubi etichettati contenenti enzima di tappatura. Incubare a 30 gradi centigradi in un blocco di calore.
- Dopo 1, 2 o 4 min, fermare le reazioni trasferendo 30 gradi di ogni miscela di reazione a tubi contenenti 94 l di stop buffer. Purificare e analizzare i prodotti di reazione come descritto nella sezione 3.
3. Purificazione e analisi dell'RNA
- Purificare l'RNA
- Incubare i prodotti di reazione nel buffer di stop per 20 min a temperatura ambiente.
NOT: Punto di pausa. I campioni in questo buffer sono stati mantenuti fino a 4 h senza perdita o degradazione dell'RNA. - Estrarre una volta con 124 - L of phenol:chloroformifor:isoamyl alcool (25:24:1) e una volta con cloroformio:isoamyl alcool (24:1).
ATTENZIONE: Il fenolo è estremamente tossico e viene rapidamente assorbito dalla pelle. Indossare attrezzature protettive adeguate.
NOT: Per massimizzare il recupero dell'RNA durante l'estrazione, utilizzare tubi disponibili in commercio contenenti un gel ad alta densità, che forma una barriera stabile tra fasi acquose e organiche. Consultate Discussione e Tabella deimateriali. - Trasferire la fase acquosa (strato superiore) in nuovi tubi contenenti 12,4 - L di 3 M di acetato di sodio pH 5.2.
- Incubare i prodotti di reazione nel buffer di stop per 20 min a temperatura ambiente.
- Precipitazioni etanolo
- Aggiungere 350 l di 100% etanolo e mescolare accuratamente per inversione.
- Incubare per almeno 10 min sul ghiaccio secco.
NOT: Punto di pausa. Per comodità, ci si può fermare qui e completare la procedura il giorno successivo; tuttavia, è possibile procedere direttamente al passaggio 3.3 ed eseguire il gel nello stesso giorno. L'RNA può essere mantenuto a -80 gradi centigradi per un paio di giorni prima di ulteriori elaborazioni, ma non lasciare per tempi più lunghi.
- Preparazione di campioni di RNA per l'elettroforesi gel
- Lasciare scongelare i campioni, mescolare invertendo 2-3 volte e centrifugare per 15 min a 21.000 x g, 4 gradi centigradi, in una centrifuga da tavolo. Nel frattempo, impostare il mix di gel di denatura (sezione 3.4.1).
- Rimuovere con attenzione l'etanolo dai campioni senza disturbare il pellet.
- Aggiungere 500 lof il7% di etanolo, invertire il tubo un paio di volte per lavare il pellet, quindi centrificare di nuovo a 21.000 x g per 5 min a temperatura ambiente o 4 gradi centigradi.
- Rimuovere il maggior numero possibile di etanolo e fare una rotazione rapida (5-10 s) dei tubi in una centrifuga superiore del tavolo. Quindi, con una punta di carico gel, rimuovere l'ultimo volume rimanente di etanolo.
- Pellet asciutto all'aria per 3 min a temperatura ambiente.
- Sciogliere l'RNA aggiungendo 4 L di H2O nella parte superiore di ogni pellet. Incubare 5 min a temperatura ambiente.
- Aggiungete al mix 4 -L di 2x coloranti RNA (Vedi tabella deimateriali), quindi vortice ogni tubo per un paio di secondi per rimettere in sospensione completamente l'RNA.
NOT: Si raccomanda un tintura di RNA che contiene formamide al posto di urea, poiché quest'ultimo precipita a basse temperature. - Rotazione rapida dei tubi, quindi incubarli a 70 gradi centigradi per 10 minuti in un blocco di calore.
-
Conservare i tubi sul ghiaccio secco fino a quando non sono pronti per il caricamento su gel.
NOTA: Mantenere l'RNA sul ghiaccio secco consente la flessibilità di lavorare su altri esperimenti mentre il gel è polimerizzante. I campioni non devono essere riscaldati dopo lo scongelamento. Tuttavia, l'RNA può essere caricato direttamente dopo il riscaldamento se il gel è pronto per l'esecuzione.
- Preparazione gel Urea-PAGE
- Per miscela di gel da 40 mL, unire in un tubo conico da 50 mL: 16,7 g di urea, 15 mL di 40% soluzione bis:acrylamide (rapporto 19:1), 4 mL di 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M di sodio, 20 mM EDTA) e 8 mL di H2O. Questo volume è sufficiente per un gel di dimensioni standard (18 cm di altezza x 16 cm di larghezza) con distanziali di 1,0 mm.
ATTENZIONE: L'acrilammide è estremamente tossica. Mentre non c'è alcun rischio di inalazione quando è in soluzione, indossare sempre camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza durante la manipolazione.
NOT: Questa miscela è per la fusione di un gel di denacritismo 15%, che risolve prontamente l'RNA tra 15-50 nt. Modificare la concentrazione di bis/acrilammide in base alle esigenze per risolvere diverse trascrizioni dell'RNA di diverse lunghezze. - Posizionare il tubo chiuso contenente miscela di gel su un nutatore fino a quando l'urea non è completamente disciolta.
- Impostare una stazione di fusione gel con lastre di vetro, distanziali da 1 mm e un pettine di 15 pozzetti.
- Lavorando rapidamente, aggiungere 40 l di TEMED e 400 luna di 10% soluzione persulficato di ammonio per la soluzione gel e mescolare bene. Utilizzando un tubo da 25 mL, versare la soluzione di gel tra le piastre, inserire il pettine e lasciare che il gel sia polimerizzato per almeno 2 h.
NOT: Se il gel viene versato più di 2 h prima dell'uso, una volta che ha coperto polimerizzato con tovagliolo di carta umido (lasciando il pettine in posizione) e avvolgere con pellicola trasparente per evitare che si secchi.
- Per miscela di gel da 40 mL, unire in un tubo conico da 50 mL: 16,7 g di urea, 15 mL di 40% soluzione bis:acrylamide (rapporto 19:1), 4 mL di 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M di sodio, 20 mM EDTA) e 8 mL di H2O. Questo volume è sufficiente per un gel di dimensioni standard (18 cm di altezza x 16 cm di larghezza) con distanziali di 1,0 mm.
- Denatura gel RNA elettroforesi
- Dopo la polimerizzazione, trasferire il gel al serbatoio in funzione e pre-eseguirlo a 20 mA in 1x TBE per 15-30 min.
- Nel frattempo, scongelare i campioni (se congelati), vortice, e ruotarli per 4 min a 2.000 x g, 4 gradi centigradi.
- Quando è pronto, spegnere l'alimentatore e risciacquare con attenzione ogni pozzo con 1x TBE utilizzando una siringa.
- Utilizzare punte per il caricamento del gel per caricare campioni sul gel.
- Eseguire gel a una costante 20-30 mA per circa 2 h o fino a quando il colorante inferiore (xylene cyanol FF) raggiunge il fondo del gel.
- Rimuovere il gel, posizionarlo su un pezzo di carta assorbente e avvolgere con pellicola trasparente.
- Esporre il gel etichettato con radioetichetta su uno screening fosforo.
- Scansiona il fosforo usando un fosforoeimmagine e analizza l'immagine.
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Representative Results
Le figure 2 e 3 mostrano reazioni ai risultati rappresentativi utilizzate per generare complessi di allungamento artificiale contenenti trascrizioni di diverse lunghezze estendendo o Pol II da fonti diverse. La figura 4 illustra come questi complessi di allungamento possono essere utilizzati per analisi del numero co-trascrizione del fosforylazione del fosfolo dipendente dalla CTD.
La figura 2A è un diagramma di molecole di DNA e RNA nei complessi di allungamento artificiale. La figura 2B mostra le trascrizioni di lunghezza diversa generate nelle reazioni eseguite esattamente come descritto nel Protocollo 1, in cui i complessi di allungamento artificiale iniziali sono stati preparati utilizzando un oligo RNA sintetico di 20 nt (blu scuro nella figura 2A ; RNA_20mer, Tabella 1). Poiché conosciamo la lunghezza iniziale dell'RNA e la sequenza del modello di DNA, possiamo determinare il sottoinsieme di nucleotidi (ATP, CTP, GTP o UTP) necessari per camminare Pol II in una posizione definita lungo il modello. Il numero di nucleotidi appena sintetizzati viene aggiunto alla dimensione iniziale del primer dell'RNA oligonucleotide per determinare la lunghezza prevista finale (RNA oligo size - numero di nucleotidi aggiunti). In presenza di ATP e UTP, Pol II può aggiungere 3 nt all'oligo di 20 nt RNA per generare complessi di allungamento contenenti un RNA da 23 meri. Se uno si lava via ATP non incorporati e UTP e poi aggiunge ATP e CTP, l'oligo 20 nt viene esteso di 2 nt per fare un 25mer, e se poi di nuovo lava via nucleotidi non incorporati e aggiunge ATP e GTP, la trascrizione viene estesa un ulteriore 4 nt per fare un 29mer. ce le trascrizioni appena generate corrispondono alla dimensione prevista dell'RNA e poiché quasi tutti i 23merradio radioetichettati possono essere inseguiti quantitativamente in prodotti più lunghi, si sa che utilizzando questo metodo (i) l'oligo dell'RNA è posizionato correttamente all'uscita di Pol II durante l'assemblaggio e (ii) gli RNA radioetichettati sono associati a complessi di allungamento Pol II attivi.
La figura 2C mostra una variazione del protocollo, in cui i complessi di allungamento iniziali sono stati preparati utilizzando lo stesso modello di DNA e oligo filamento non modello e un oligo di RNA (RNA_29mer, Tabella 1) che contiene altri 9 nucleotidi a il suo 5'-end ma è altrimenti identico in sequenza al 20 nt RNA oligo. Poiché la lunghezza iniziale dell'RNA è di 29 nt in questo caso, i complessi di allungamento contenenti trascrizioni a 32, 34 meri e 38 mire possono essere generati utilizzando gli stessi passaggi di Pol II descritti in precedenza.
A seconda dell'ambito di analisi, questo metodo consente flessibilità nella fonte di Pol II. Nella Figura 3 confrontiamo le reazioni utilizzando Pol II da fonti diverse. Nelle reazioni mostrate nelle prime 4 corsie, i complessi di allungamento artificiale sono stati assemblati con endogeni di tipo selvaggio Pol II purificati dal fegato di ratto o dal lievito di fissione e camminato come descritto sopra per generare 23 merchi o 25mer. Il ratto e il lievito di fissione Pol II utilizzati in queste reazioni sono stati purificati a quasi omogeneità utilizzando più passaggi cromatografici.
Il metodo può essere utilizzato anche per generare complessi di allungamento artificiale contenenti tipo selvaggio o mutante Pol II preparati utilizzando un metodo di purificazione semplice in un solo passaggio. Le ultime due corsie della figura mostrano i saggi eseguiti utilizzando una forma mutante di Pol II umana che manca della CTD nella sua sottounità Rpb1, che non è necessaria per l'attività catalitica di Pol II, ma aiuta ad accoppiare la trascrizione al rientro dell'RNA. Il Pol II senza CTD usato in questi saggi è stato purificato dall'immuno-purificazione anti-FLAG da una linea cellulare umana che esprime una versione con etichetta dell'epitopo FLAG di Rpb1. È importante notare che la concentrazione di Pol II attivi varierà dalla preparazione alla preparazione. Pertanto, è essenziale eseguire esperimenti iniziali in cui la quantità di Pol II utilizzata nelle reazioni è variata per determinare la quantità necessaria per ottenere l'attività desiderata.
La figura 4 mostra un esempio rappresentativo di un test che confronta il limite delle trascrizioni radioetichettate associate a complessi di allungamento artificiale contenenti Pol II con una CTD fosforillato o senza fosforo. Per questi saggi, sono stati preparati complessi di allungamento contenenti 23 trascrizioni nucleotidicon una fine di 5' triposphate sono stati preparati come descritto nel protocollo 2.
L'incubazione di complessi di allungamento con enzima di tappatura porta a uno spostamento di mobilità di circa 1 nt, indicando l'aggiunta di un tappo 5'14,15. Per quantificare le reazioni di capping, si determina l'efficienza del capping, espressa come percentuale di RNA con tappo. L'efficienza di cablazione è il rapporto tra l'RNA con limite all'RNA totale, diviso per il limite massimo ottenibile. Nei nostri analisi troviamo che il massimo capping ottenibile di oligos DI RNA ottenuto da fonti commerciali è di 85%, probabilmente a causa di triposforolatura incompleta di RNA sintetico.
Nelle reazioni mostrate nelle prime 3 corsie, i complessi di allungamento sono stati incubati con il fattore di trascrizione generale TFIIH e il co-fattore ATP per fosforifero il CTD Pol II prima di tappatura. In queste reazioni, vicino massimale capping è stato osservato 1 min dopo l'aggiunta di 5 ng di enzima capping. Quando i saggi sono stati eseguiti utilizzando complessi di allungamento che non sono incubati con TFIIH e quindi contengono Pol II senza forosforilate, ci sono voluti quasi 10 volte tanto enzima di capping per osservare livelli simili di capping. Le ultime due corsie della figura 4 mostrano i prodotti delle reazioni in cui i complessi di allungamento sono stati incubati con o senza enzima di tappatura, in presenza di TFIIH. È importante sottolineare che la dipendenza da TFIIH dei complessi di allungamento artificiale del capping co-trascrizione dimostrato in questa figura è molto simile a quella osservata nei complessi di allungamento che avevano avviato la trascrizione a un promotore in sistemi enzimatici più complessi 5.
Figura 1: Assemblaggio di complessi di allungamento artificiale. (A) L'oligo dell'RNA (blu scuro) di 20 nt è annesso a un filamento modello di DNA (verde) attraverso una sequenza complementare di 9 nt. (B) L'RNA polimerasi II (Pol II) viene mescolato con l'ibrido DNA:RNA annesso per posizionare l'RNA a 3'fine nell'edificio catalitico di Pol II. (C) Un eccesso molare di 3' biotinylated non-template filamento DNA oligo (azzurro) viene aggiunto al mix di reazione per racchiudere e stabilizzare ulteriormente il complesso di allungamento. (D) I complessi di allungamento immobilizzati vengono lavati per rimuovere gli olighi in eccesso e incubati con appropriate combinazioni di nucleotidi per consentire a Pol II di estendere l'oligo DELL'RNA alla lunghezza desiderata. La porzione appena sintetizzata dell'RNA è mostrata in giallo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Pol II cammina usando oligos di RNA di diverse lunghezze. (A) Diagramma dei complessi di allungamento artificiale, che mostra i nucleotidi aggiunti durante le passeggiate. Il DNA del filamento e del modello non modello sono mostrati rispettivamente in azzurro e verde. L'oligo a 20 nt RNA è mostrato in blu scuro. Sono mostrati anche i nucleotidi aggiunti durante le passeggiate successive per generare RNA 23mer (arancione), 25mer RNA (marrone) e 29mer RNA (magenta). (B) Denatura elettroforesi gel che mostra RNA di lunghezza definita ottenuti dopo aver camminato Pol II utilizzando un primer 20 nt DI RNA, come descritto nel Protocollo 1. I nucleotidi aggiunti durante ogni fase di camminata sequenziale del protocollo sono arancio codificato a colori (23mer), marrone (25mer) e magenta (29mer). (C) Pol II camminando a partire da un primer di 29 nt RNA, ma per il resto esattamente come mostrato in B. (B e C) mostrano parti dello stesso gel, ma sono stati separati per scopi illustrativi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Trascrizioni sintetizzate da complessi di allungamento artificiale contenenti tipo selvaggio o Pol II mutante. I complessi di allungamento artificiale sono stati assemblati utilizzando il primer di 20 nt RNA e Pol II endogeno altamente purificato dal fegato di ratto o dal lievito di fissione o dal FLAG immunopurificato Pol II privo del Rpb1 dalle cellule HeLa (F:Pb1-CTD). L'RNA in ogni complesso è stato ulteriormente esteso a 23 nt o 25 nt. Vedere il testo per i dettagli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Attivazione dipendente dal fosforo del capping dell'RNA co-trascrizione. I complessi di allungamento artificiale contenenti epatica pol II e RNA 23mer radioetichettato sono stati incubati con ATP e il fattore di trascrizione generale TFIIH o buffer per 10 min per fosforilo il CTD Pol II. Dopo il lavaggio, i complessi di allungamento sono stati incubati con 5 ng, 15 ng, o 45 ng di enzima capping mammifero per 1, 2 o 4 min. Capped e uncapped 23mers sono stati risolti in un gel di denatura (superiore, primi 12 corsie) e l'RNA con tappo % è stato quantificato e tracciato (in basso). Questa parte della figura è stata originariamente pubblicata in ref 5, che è stato pubblicato come articolo ad accesso aperto sotto una licenza CC-BY. Le ultime due corsie, che provengono da un esperimento separato, illustrano prodotti di reazioni in cui i complessi di allungamento sono stati incubati con o senza schiacciamento dell'enzima, in presenza di TFIIH. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| sequenza | Commenti | |
| RNA_20mer | ACUCUCAUGUGAUGCUA | 5' Modifica Triposfato; PAGE & RP-HPLC purificato |
| RNA_29mer | ACUCUAUGCuUCAUUCAUCUSGAUGCUUA | 5' Modifica Triposfato; PAGE & RP-HPLC purificato |
| Modello Strand DNA | CTACGGTTAAGCTCGGATTCTGAA TTAAGCATGG |
Doppia PAGINA e HPLC purificato |
| DNA Strand non modello | ATCAGAAATGTACCGTGAGGAACCGTAG | 5' BIOtinylato TEG; HPLC purificato |
Tabella 1: OLIgonucleotidi di DNA e RNA
| Concentrazione finale | volume | |
| Tris HCl pH 7.5 | 12 mM | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1 ll |
| 300 mM KCl | 50mm | 1,67 l |
| 10 - Modello Strand DNA oligo in 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | 1 M | 1 ll |
| 10 - Oligo RNA in 10 mM Tris-HCl pH 7.5 |
2 M | 2 ll |
| acqua | 4,33 -L | |
| 10 ll | ||
| Tutti i Tris-HCl provengono da soluzioni di oligo di DNA e RNA | ||
Tabella 2: Cocktail per annealing DNA e OLIgos di RNA
| Buffer Pol II | Concentrazione finale | Volume/reazione |
| acqua | 4,52 l | |
| 50 mM MgCl2 | 4,67 mM | 1,40 lL |
| 250 mM Tris HCl, pH 7.5 | 23 mM | 1,40 lL |
| 300 mM KCl | 27 mM | 1,33 lL |
| 50% Glicerolo | 3% | 0,9 l |
| 20 mg/ml di BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 L |
| 10% PVA | 2% | 3 l l |
| 13 l | ||
| Subito prima di utilizzare buffer add: | ||
| Modello annesso filamento DNA:RNA (dalla tabella 1) | 1 ll | |
| RNA Polimerasi II | 1 ll | |
| La concentrazione finale di KCl nel mix è di 50 mM, con ML aggiuntivo proveniente da Pol II | ||
| Le concentrazioni di MgCl2 e Tris HCl sono rispettivamente di 5 mM e 25 mM, | ||
| Le aggiuntive MgCl2 e Tris HCl provengono da un prodotto ANNEaled DNA:RNA. | ||
Tabella 3: Pol II mix
| Buffer DNA non basato su modello | Concentrazione finale | Volume/reazione |
| acqua | 4,48 l | |
| 300 mM KCl | 43,33 mM | 2,17 -L |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM | 1,50 l |
| 250 mM Tris HCl, pH 7.5 | 25 mM | 1,50 l |
| 50% Glicerolo | 3% | 0,9 l |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,08 L |
| 10% PVA | 2% | 3 l l |
| 14 l l | ||
| Subito prima di utilizzare buffer add: | ||
| 5 oligo di DNA non modello biotinylato di M | 1 ll | |
| La concentrazione finale di KCl nel mix è di 50 mM, con un ulteriore KCl proveniente da buffer oligo di DNA non modello. | ||
Tabella 4: Mix di DNA non modello
| Buffer di etichettatura a impulsi | Concentrazione finale | Volume/reazione |
| acqua | 9,98 ll | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 ll |
| 50% Glicerolo | 3% | 1,5 ll |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,63 l l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,4 l l |
| 1 M Tris HCl, pH 7.9 | 12 mM | 0,3 L |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,13 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,08 L |
| 10% PVA | 2% | 5 ll |
| 23 ll | ||
| Subito prima di utilizzare buffer add: | ||
| 15 ATP | 0,6 M | 1 ll |
| 3.3 -M [z-32P]UTP | 0,13 M | 1 ll |
| La concentrazione finale di Tris HCl è di 20 mMM, con ulteriori Tris HCl provenienti da buffer nucleotide. | ||
Tabella 5: Etichettatura a impulsi Miscela NTP
| Buffer di chase | Concentrazione finale | Volume/reazione |
| Tris HCl, pH 7,5 | 30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 ll |
| acqua | 0,6 l | |
| 50% Glicerolo | 3% | 0,3 L |
| 10 mM DTT | 0,5 mM | 0,25 l |
| 100 m HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,15 l |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,13 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,08 L |
| 10% PVA | 2% | 1 ll |
| 3,5 ll | ||
| Subito prima di utilizzare buffer add: | ||
| 100 - M UTP, 100 ATP diluito in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 | 5 M | 1,5 ll |
| Tutti i Tris HCl provengono dal buffer dei nucleotidi |
Tabella 6: Chase NTP mix
| Concentrazione finale | Volume/reazione | |
| acqua | 24.21 -LL | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1,8 l L |
| 50% Glicerolo | 3% | 1,8 l L |
| 20 mg/ml di BSA | 0,5 mg/mL | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7.9 | 20 mM | 0,6 l |
| 10% PVA | 0,2% | 0,6 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 - L |
| 30 l |
Tabella 7: Buffer di lavaggio
| Concentrazione finale | Volume/reazione | |
| acqua | 14,13 L | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 ll |
| 50% Glicerolo | 3% | 1,8 l L |
| 20 mg/ml di BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7.9 | 20 mM | 0,6 l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 - L |
| 10% PVA | 2% | 6 ll |
| 30 ll |
Tabella 8: Buffer di trascrizione di base (BTB)Table 8: Base Transcription Buffer (BTB)
| Buffer di arresto | Concentrazione finale | Volume/reazione |
| acqua | 55,74 ll | |
| 1 M Tris HCl, pH 7.5 | 10 mM | 0,6 l |
| 5 M NaCl | 300 mM NaCl | 3,6 l l |
| 500 mM EDTA | 0,5 mED | 0,06 l |
| 10% SDS | 0,2% SDS | 1,2 lL |
| 60 ll | ||
| Subito prima di utilizzare buffer add: | ||
| 15 mg/mL di glicogeno | 2 ll | |
| Proteinasi da 20 mg/mL K | 2 ll | |
| acqua | 30 ll | |
Tabella 9: Stop mix
| Concentrazione finale | Volume/reazione | |
| acqua | 11,9 ll | |
| 300 mM KCl | 53,33 mM | 5,33 -L |
| 50% Glicerolo | 3% | 1,8 l L |
| 1,5 mGTP diluito in 100 mM Tris HCl, pH 7,5 | 50 M | 1 ll |
| 100 unità/mL Pirofosofasi inorganico, lievito | 0,1 unità/reazione | 1 ll |
| 20 mg/ml di BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 l |
| 1 M Tris HCl, pH 7.9 | 16,67 mM | 0,5 l l |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM | 0,48 l |
| 100 mM DTT | 0,5 mM | 0,15 l |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM | 0,09 - L |
| 10% PVA | 2% | 6 ll |
| 29 ll | ||
| Subito prima di utilizzare buffer add: | ||
| Enzima capping | 1 ll | |
| La concentrazione finale di KCl nel mix è di 60 mM, con ML aggiuntivo proveniente da enzima di tappatura e pirofosasi | ||
| La concentrazione di HCl di Tris è di 20 mM, con tris HCl aggiuntivo proveniente da buffer nucleotide | ||
Tabella 10: Miscela di capping
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Discussion
Gli studi che cercano di sezionare gli eventi accoppiati al complesso di allungamento di Pol II come l'elaborazione dell'RNA e la regolazione dell'allungamento della trascrizione stessa possono essere notevolmente facilitati dall'uso di un sistema enzimatico altamente purificato. La creazione di tali sistemi enzimatici può essere difficile. La trascrizione dipendente dal promoter da Pol II richiede almeno cinque fattori generali di trascrizione. La preparazione e l'accumulo di questi fattori possono richiedere mesi; quindi, la fase di limitazione del tasso in questo processo è spesso semplicemente preparando il gruppo di fattori di trascrizione necessari per ricostituire la trascrizione basale nella provetta.
In questo articolo, descriviamo un adattamento di metodi sviluppati in precedenza per generare complessi di allungazione della trascrizione artificiale2,3 utilizzando solo Pol II purificato e DNA sintetico e oligonucleotidi DELL'RNA. I complessi di allungamento risultanti sono trascrizionalmente attivi e sono adatti per l'uso nello studio dell'accoppiamento della trascrizione di Pol II e del capping dell'RNA5. È importante notare che la trascrizione e il tappare dell'RNA si verificano in vivo nel contesto della cromatina e di molte altre proteine non presenti in questo sistema enzimatico definito; quindi, questo sistema dovrebbe ricapitolare molte, ma non tutte, caratteristiche di reazioni che si verificano in vivo. Il protocollo che descriviamo si basa su metodi precedenti immobilizzando complessi di allungamento artificiale attraverso il DNA biotinylato legato a perline magnetiche, consentendo al ricercatore di modificare facilmente le condizioni di reazione e/o rimuovere i nucleotidi non incorporati durante le diverse fasi dei saggi. È importante sottolineare che, poiché il tag utilizzato per immobilizzare i complessi di allungamento si trova su un'estremità del filamento di DNA non modello piuttosto che su Pol II stesso o sul filamento di modello, solo i complessi Pol IIs associati a complessi di allungamento completi verranno mantenuti sulle perline.
Poiché le trascrizioni nascenti devono avere una fine di 5' triposfato per essere modificate da enzima capping, gli oligonucleotidi RNA sintetici utilizzati per gli esperimenti di tappatura vengono acquistati con 5' -triposfato termini. Tuttavia, gli oligoRNA non modificati possono essere utilizzati per altre applicazioni, tra cui studi di altri eventi di elaborazione dell'RNA co-trascrizione o le attività di fattori di trascrizione che regolano l'allungamento di Pol II. Indipendentemente dall'applicazione a valle, si consiglia di assemblare complessi di allungamento con oligos di DNA e RNA altamente purificati. In particolare, gli oligo di DNA biotinylato devono essere purificati dall'HPLC e altri oligo di DNA e RNA devono essere purificati dall'elettroforesi del gel di poliacrilamita e/o dall'HPLC. La purezza delle attività ezimatiche, tuttavia, dovrà essere determinata caso per caso e dipenderà dalla portata di ogni esperimento.
L'aggiunta dell'oligo del DNA biotinylato non modello nell'ultima fase di assemblaggio dovrebbe essere, in linea di principio, sufficiente per ottenere un complesso ternario. Tuttavia, includiamo sempre almeno un passo "a piedi" per confermare Pol II incorpora il numero corretto di nucleotidi: Se l'obiettivo dell'esperimento è quello di generare substrati per andire il limite co-trascrizione o altre fasi di elaborazione dell'RNA o per seguire Pol II l'allungamento, includiamo sempre un ribonucleotide con etichetta 32 P nel "camminare" iniziale in modo che la trascrizione possa essere visualizzata e utilizzare nucleotidi "freddi" senza etichetta per i successivi passi in modo che l'attività specifica delle trascrizioni di diverse lunghezze rimane costante. Anche se il metodo descritto in questo protocollo utilizza nucleotidi con etichetta 32P per visualizzare le trascrizioni nascenti, i saggi basati sulla fluorescenza possono essere utilizzati per misurare l'etichettatura dell'RNA quando non è possibile lavorare con materiali radioattivi. Tuttavia, è importante notare che la sensibilità di tali saggi è in genere molto inferiore a quelli che utilizzano etichette radioattive, e di solito richiedono grandi quantità di enzimi.
Un passo chiave per esperimenti riproducibili è un buon recupero dell'RNA durante l'estrazione del fenolo:cloroformato:isoamyl e la precipitazione dell'etanolo. Abbiamo scoperto che l'utilizzo di tubi di microcentrifuga contenenti gel ad alta densità (vedi Tabella deimateriali) per l'estrazione del fenolo:cloroformato:isoamyl aumenta la riproducibilità e la resa dell'acido nucleico da questo passaggio. Inoltre, l'uso del glicogeno colorato (vedi Tabella dei materiali) come vettore durante le precipitazioni di etanolo rende più facile vedere piccoli pellet di acido nucleico, rendendo meno probabile che si perda inavvertitamente il pellet aspirandolo durante la rimozione del solatto etanolo.
I complessi di allungamento artificiale generati utilizzando protocolli simili a quelli che descriviamo dovrebbero essere utili anche per misurare le interazioni tra proteine-proteine o acido proteino-nucleico tra il complesso di allungamento di Pol II e i fattori che regolano la trascrizione eventi di allungamento o di elaborazione dell'RNA legati all'allungamento. In questo caso, le proteine che rimangono legate a complessi di allungamento artificiale dopo il lavaggio vengono rilevate da gonfiore occidentale o spettrometria di massa; radioetichettatura RNA non è necessario e facciamo tutti i passaggi di trascrizione con solo nucleotidi "freddi".
Infine, questo metodo potrebbe essere utile per le analisi strutturali dei complessi di trascrizione. Infatti, sono stati utilizzati metodi correlati negli studi crio-EM con lieviti ed enzimi mammiferi per ricostituire le interazioni enzimatiche-Pol II di tappatura13e le interazioni di Pol II con altre proteine o complessi proteici durante l'allungamento12, mettendo in pausa16,17e più recentemente, legato a un nucleosomo18. Una possibile complicazione per le analisi strutturali dei carnagioni di trascrizione generati con questo metodo è la necessità di rimuovere le perline biotina/magnetiche dal complesso; tuttavia, questo può essere risolto includendo in oligos DNA siti specifici riconosciuti da enzimi di restrizione o utilizzando linker di biotina che vengono spenti dopo il trattamento a raggi UV19.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo S. Shuman per aver fornito al mammifero l'enzima cDNA. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione allo Stowers Institute for Medical Research dell'Helen Nelson Medical Research Fund presso la Greater Kansas City Community Foundation. I dati originali sottostanti questo manoscritto sono accessibili dal Stowers Original Data Repository di http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
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