Summary
Her beskriver vi monteringen av RNA polymerase II (Pol II) forlengelse komplekser som kun krever kort syntetisk DNA og RNA-oligonukleotider og renset Pol II. Disse komplekser er nyttige for å studere mekanismer underliggende co-transcriptional behandling av transkripsjoner knyttet til Pol II forlengelse kompleks.
Abstract
Eukaryote mRNA syntese er en kompleks biokjemiske prosess som krever transkripsjon av en DNA-mal til en forløper RNA av multi-delenhet enzym RNA polymerase II og co-transcriptional capping og skjøting av forløperen RNA å danne den modne mRNA. Under mRNA syntese, er RNA polymerase II forlengelse komplekset et mål for regulering av en stor samling av transkripsjon faktorer som styrer sin katalysator, samt capping, skjøting, og 3 '-prosessering enzymer som skaper den modne mRNA. På grunn av den iboende kompleksiteten i mRNA syntese, enklere eksperimentelle systemer muliggjør isolering og etterforskning av sine ulike co-transcriptional stadier har stor nytte.
I denne artikkelen beskriver vi en slik enkel eksperimentell system egnet for å undersøke co-transcriptional RNA capping. Dette systemet er avhengig av definerte RNA polymerase II forlengelse komplekser samlet fra renset polymerase og kunstige transkripsjon bobler. Ved immobilisert via biotinylated DNA gir disse RNA polymerase II forlengelse komplekser et lett manipulable verktøy for dissekere med transcriptional RNA-capping og mekanismer der forlengelse komplekse rekrutter og regulerer capping enzym under transcriptional RNA-capping. Vi forventer at dette systemet kan bli tilpasset for å studere rekruttering og/eller montering av proteiner eller protein komplekser med roller i andre stadier av mRNA modning koplet til RNA polymerase II forlengelse kompleks.
Introduction
Eukaryote Messenger RNA (mRNA)-syntese er en forseggjort biokjemiske prosess som involverer syntese av en ubehandlet forløper RNA ved RNA polymerase II og behandling av forløperen RNA for å gi den modne mRNA. RNA prosessering trinnene av capping, skjøting, og polyadenylation utføres i stor grad co-transcriptionally. Pol II forlengelse-komplekset fungerer som et stillas som rekrutterer og appartefakter aktivitetene til mange av RNA prosesserings enzymene. Følgelig, vår ultimate forståelse av hvordan modne eukaryote mRNAs genereres vil stole tungt på utviklingen av eksperimentelle systemer for å tillate Disseksjon av biokjemiske mekanismer underliggende rekruttering til forlengelse komplekse og regulering av enzymer ansvarlig for co-transcriptional capping, skjøting, og polyadenylation.
Ikke overraskende har utviklingen av slike eksperimentelle systemer vært vanskelig. Et stort hinder har vært bemerkelsesverdig kompleksiteten i Pol II transkripsjon selv der bare rekonstituering av basal transkripsjon av pol II in vitro krever et minimum sett av fem generelle transkripsjon innvielse faktorer: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, og TFIIH 1. dess, rekonstituering av noen form for REGULERT Pol II transkripsjon in vitro krever et enda større sett med transkripsjon faktorer og coregulators. Dermed har et stort mål vært å utvikle enklere eksperimentelle systemer slik rekonstituering av aktive Pol II forlengelse komplekser egnet for undersøkelser av funksjonell kopling av pol II transkripsjon og RNA prosessering.
En slik enklere metode for rekonstituering av aktiv Pol II forlengelse komplekser har vist seg nyttig for strukturelle og biokjemiske studier av elongating Pol II og, mer nylig, for å undersøke co-transcriptional RNA prosessering2,3 ,4,5. I denne artikkelen viser vi hvordan Pol II forlengelse komplekser tilberedt av renset Pol II og syntetisk transkripsjon bobler kan brukes effektivt for å undersøke mekanismene underliggende co-transcriptional capping av begynnende Pol II transkripsjoner.
Capping refererer til kovalente tillegg av en 5 '-guanosin "cap" til 5 '-trifosfat slutten av begynnende Pol II transkripsjoner. Hetten er viktig for påfølgende trinn av mRNA modning, transport, oversettelse, og andre prosesser6,7. Hetten er lagt co-transcriptionally til Pol II transkripsjoner av et enzym referert til som capping enzym. I pattedyrceller, aktive nettsteder ansvarlig for RNA 5 '-triphosphatase og guanylyl glutamyltransferase aktiviteter av capping enzymet er inneholdt innenfor en enkelt polypeptid8. Capping enzymet er rekruttert til Pol II forlengelse komplekse gjennom interaksjoner med ennå ikke er definert overflater på Pol II kroppen og Rpb1 carboxy-Terminal domene (CTD) fosforylert på Ser5 av sine heptapeptide gjentar5. I forlengelse komplekset, capping enzymet katalyserer tillegg av en 5-guanosin cap når begynnende transkripsjon når en lengde på minst 18 nukleotider og har dukket opp fra polymerase RNA exit kanal. I første trinn av capping-reaksjonen hydrolyzes triphosphatase RNA 5 '-trifosfat for å gi en 5-uridindifosfatglukuronosyltransferase. I det andre trinnet, er GTP hydrolysert til GMP av guanylyl glutamyltransferase, danner et GMP-capping enzym mellomliggende. Til slutt overfører guanylyl glutamyltransferase GMP til 5 '-uridindifosfatglukuronosyltransferase slutten av den begynnende transkripsjon å produsere hetten.
En bemerkelsesverdig trekk ved capping reaksjonen er at co-transcriptional capping (dvs. capping av transkripsjoner forbundet med funksjonell Pol II forlengelse komplekser) er mye mer effektivt enn capping av gratis RNA5,9. Således, et stort spørsmål i feltet har vært hvordan denne dramatiske aktiveringen av capping oppnås via interaksjoner av capping enzymet med Pol II forlengelse kompleks. I denne protokollen beskriver vi monteringen av aktive RNA polymerase II forlengelse komplekser med bare renset RNA polymerase II og kunstige transkripsjon bobler. Disse metodene tillater opprettelse av RNA polymerase II forlengelse komplekser med transkripsjoner av definert lengde og sekvens. I en fersk studie brukte vi disse definerte RNA polymerase II-forlengelse komplekser som modell for å undersøke aspekter ved mekanismene til RNA-capping5. Spesielt viste vi at (i) capping av RNA assosiert med disse forlengelse komplekser var mer enn 100-fold mer effektiv enn capping av fri RNA og (II) ble stimulert av TFIIH-avhengige fosforylering av pol II CTD. Tilnærmingen som beskrives her, kan i prinsippet tilpasses til å generere underlag for å studere andre transcriptional RNA-behandlings reaksjoner knyttet til Pol II-forlengelse komplekset.
I del 1 av denne protokollen, kunstige forlengelse komplekser er opprettet av annealing en syntetisk mal Strand DNA oligonukleotid til en RNA oligonukleotid som er komplementære på sitt 3 '-end til ca 9 nukleotider av malen Strand DNA. Pol II blir deretter lastet inn på DNA: RNA dupleks. Forlengelse komplekset blir deretter fullført ved tilsetning av en delvis utfyllende, ikke-mal Strand DNA-oligonukleotid som er merket med biotin på sitt 3 '-end (figur 1 og figur 2a). RNA-oligonukleotid utvides av pol II i disse forlengelse komplekser for å gjøre radiolabeled utskrifter av definert lengde og sekvens ved tilsetning av egnede kombinasjoner av radiolabeled nukleotider. I tillegg, ved hjelp av en kombinasjon av vasker for å fjerne næringsdrivende nukleotider og videre tillegg av ulike kombinasjoner av nukleotider, kan man "gå" Pol II til ulike posisjoner langs DNA malen og syntetisere RNA av definerte lengder. RNA blir deretter renset og utsatt for elektroforese i denaturering urea-side gels. I del 2 av protokollen brukes kunstige forlengelse komplekser til å analysere transcriptional RNA-capping. Eksempelet presentert måler effekten av TFIIH-avhengige fosforylering av pol II CTD på co-transcriptional RNA capping. I dette eksperimentet måler vi omfanget av co-transcriptional capping som en funksjon av capping enzym konsentrasjon (5, 15 og 45 ng per reaksjon) og tid (1, 2 og 4 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. montering av kunstige forlengelse komplekser og Pol II walking
- Nakkens 1 nmol av ikke-mal DNA oligo inneholder et 3 ' biotin molekyl på magnetiske perler.
Merk: følgende trinn kan gjøres på forhånd for å forberede for fremtidige eksperimenter. Alle oligo sekvenser som brukes i denne protokollen, er angitt i tabell 1. RNA oligos er syntetisert med 5 '-trifosfat modifikasjoner.- Tilsett 200 μL av magnetiske perler (10 mg/mL) til en lav-proteinbinding 1,5 mL rør, og plasser deretter på et magnetisk stativ i 2 min.
- Mens røret er på magnet stativet, Fjern væsken fra røret uten å forstyrre perlene. For å vaske perlene, Fjern slangen fra stativet, tilsett 1 mL 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, returner røret til stativet og fjern vaskeløsningen etter 2 min..
- Gjenta vask 2 ganger til ved hjelp av 200 μL av samme buffer.
- Resuspend magnetiske perler i 400 μL av 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, buffer. Bland deretter med 380 μL av H2O og 20 μL av ikke-biotinylated DNA-oligo på 10 μM. Plasser røret på en nutator og ruge i 30 min ved romtemperatur.
- Vask immobilisert ikke-mal DNA oligo 3 ganger med 200 μL av 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, og deretter 3 ganger med 200 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glyserol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL storfe serum albumin.
- La røret over natten ved 4 ° c for å fullføre blokkering av perler med BSA.
- Neste dag, plassere røret i den magnetiske rack, fjerne og forkaste væsken, og resuspend perler i 200 μL av 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glyserol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL storfe serum albumin og overføre til et nytt rør. For denne DNA malen, er endelig konsentrasjon ca 5 μM.
Merk: Inkubasjonstid og oligo konsentrasjon må empirisk bestemmes for hvert biotinylated DNA-oligo. Denne malen skal gi nok for 200 reaksjoner, og vare i minst 6 måneder når den oppbevares ved 4 ° c.
- Anneal RNA og DNA mal strand oligonukleotid oligos i en 2:1 molar ratio (20 og 10 pmol, henholdsvis) for å oppnå DNA: RNA duplex.
- Sett opp en 10 μL annealing Mix som beskrevet i tabell 2.
Merk: 10 μL av annealing Mix er tilstrekkelig for 10 reaksjoner. Den annealing blandingen kan skaleres opp etter behov hvis flere analyser skal utføres. - Utfør annealing reaksjoner i en termisk cycler ved hjelp av følgende program: 5 min ved 45 ° c, etterfulgt av 12 sykluser på 2 min hver, som starter ved 43 ° c og reduserer temperaturen 2 ° c per syklus. Inaktiv ved 4 ° c.
Merk: Dette er en fleksibel timepoint. Annealing er ferdig innen ~ 30 min, men kan etterlates ved 4 ° c i en lengre periode. I laboratoriet har annealing blandinger blitt sittende i opptil 4 timer uten å observere noen nedgang i reaksjons effektivitet. - Mens annealing RNA til mal tråd DNA, klargjør du buffere for senere trinn i protokollen. Ingrediensene som trengs for å forberede hver buffer for en enkelt reaksjon med hver buffer er oppført i tabeller 2 til 8. Skaler opp oppskrifter med en faktor på [Y (X + 1) + 1] for vask og (X + 1) for alle andre buffere. X = antall reaksjoner som skal utarbeides; Y = antall vasketrinn som trengs (minimum 3).
Merk: Forbered alle buffere friskt på dagen for eksperimentet. Ikke plasser rør på isen etter at PVA er lagt til buffere. Legg til Pol II eller nukleotider til buffere rett før du bruker.
- Sett opp en 10 μL annealing Mix som beskrevet i tabell 2.
- Load renset RNA polymerase II på DNA: RNA hybrid.
- Bland 1 pmol (1 μL) av DNA: RNA duplex med 13 μL av pol II-buffer (fra tabell 3).
- Tilsett ~ 0,02 enheter av renset RNA Pol II (1 μL) til blandingen fra trinn 1.3.1 og bland ved å forsiktig pipettering opp og ned og røre med Pipet spissen, uten å innføre bobler. Ruge i 10 min ved 30 ° c.
Merk: Volumer gitt fra her på er for en enkelt reaksjon; skalere opp etter behov for antall reaksjoner i eksperimentet. RNA Pol II-renset fra rotte leveren som beskrevet10 brukes i dette eksempelet; men RNA Pol II renset fra andre kilder, inkludert kultivert pattedyrceller eller gjær kan også brukes3,4,5,11,12,13.
- Fullfør forlengelse komplekset ved tilsetning av biotinylated ikke-mal DNA.
- Tilsett 5 pmol (1 μL) av immobilisert ikke-mal DNA-oligo til 14 μL av ikke-mal DNA-buffer (fra Tabell 4), Legg til rør fra trinn 1.3.2 og ruge i 10 min ved 37 ° c.
- Plasser prøven i magnetisk rack i 2 min. vask 1x med 30 μL vaskebuffer (fra Tabell 7) for å fjerne næringsdrivende Pol II og oligos.
- Generer forlengelse komplekser som inneholder radiolabeled RNA 23mers.
- Utfør alle ytterligere incubations ved 30 ° c. Tilsett 1 μL av 15 μM ATP og 10 μCi (1 μL) av [α-32P] UTP (3 000 CI/mmol) til 23 ΜL av Pulse buffer og bruke dette til å resuspend vasket magnetiske perler.
Forsiktig: Radioaktivt materiale er farlig. Pass på at du bruker egnet verneutstyr og følger alle retningslinjene for laboratorier for sikker bruk og kassering av radioaktivt materiale.
Merk: Erstatt radiolabeled UTP med 15 μM UTP når radiolabeled RNA ikke er nødvendig, slik som for Western Blot eksperimenter. - Ruge reaksjonen for 10 min å tillate syntesen av radiolabeled 23mers.
- Tilsett 1,5 μL oppløsning som inneholder 100 μM ATP og 100 μM UTP Mix til 3,5 μL av jage buffer, legge til rør som inneholder forhåndsmonterte forlengelse komplekser, og ruge for 5 min å jage alle begynnende transkripsjoner i 23mers.
- Sett prøven i magnetisk rack i 2 minutter, Fjern supernatanten, vask en gang med 30 μL vaskebuffer for å fjerne nærings nukleotider, og resuspend i 30 μL vaskebuffer.
- Enten tilsett 94 μL av stopp Mix med proteinase K og glykogen (tabell 9) for å avslutte reaksjoner eller gå videre til § 1,6 for å generere forlengelse komplekser med lengre transkripsjoner eller § 2 for å utføre capping analyser.
- Utfør alle ytterligere incubations ved 30 ° c. Tilsett 1 μL av 15 μM ATP og 10 μCi (1 μL) av [α-32P] UTP (3 000 CI/mmol) til 23 ΜL av Pulse buffer og bruke dette til å resuspend vasket magnetiske perler.
- Valgfritt Walk Pol II å lage 23, 25, og 29 nukleotid transkripsjoner
- Følg fremgangsmåten som er beskrevet i trinn 1.2.1 gjennom 1.5.4 for å klargjøre forlengelse komplekser som inneholder radiolabeled 23mers. Skaler opp 4-fold for å generere 120 μL av vasket forlengelse komplekser, som er nok komplekser for 4 reaksjoner.
- Label 3 nye rør "23mer", "25mer" og "29mer". Overfør 30 μL av vasket forlengelse komplekser til "23mer" tube og tilsett 94 μL av stopp Mix med proteinase K og glykogen.
- Plasser røret som inneholder de resterende 90 μL av vasket forlengelse komplekser i det magnetiske stativet i 2 minutter, Fjern supernatanten og resuspend perler i 90 μL av BTB supplert med 1,2 μL hver av 1,5 mM ATP og 1,5 mM CTP. Ruge i 10 min ved 30 ° c.
- Etter vask en gang med 90 μL av vaskebuffer og blanding i 90 μL vaskebuffer som beskrevet i trinn 1.5.4, Overfør 30 μL av forlengelse komplekser til "25mer" rør og tilsett 94 μL av stopp miks med proteinase K og glykogen.
- Plasser røret som inneholder de resterende 60 μL av forlengelse komplekser i det magnetiske stativet i 2 minutter, Fjern supernatanten og resuspend perler i 60 μL av BTB supplert med 0,8 μL hver av 1,5 mM ATP og 1,5 mM CTP.
- Ruge i 10 min ved 30 ° c, vask en gang med 60 μL av vaskebuffer som i Seksjon 1.5.5, og resuspend i 60 μL vaskebuffer.
- Overfør 30 μL fra 2x prøve til "29mer" tube og enten tilsett 94 μL av stopp Mix med proteinase K og glykogen eller Fortsett til seksjon 2 for å utføre capping analyser.
- Fortsett til RNA-rensing og-analyse (avsnitt 3).
2. bruke kunstige forlengelse komplekser til analysen Cotranscriptional capping
- Generer vasket forlengelse komplekser som inneholder 23mers ved å skalere opp prosedyren som er beskrevet i trinn 1.2.1 gjennom 1.5.5 13-fold. Dette er nok for 12 reaksjoner + 1 ekstra.
-
Pol II CTD fosforylering
- Plasser røret som inneholder vasket forlengelse komplekser i den magnetiske rack i 2 min, Fjern supernatanten, og resuspend perler i 377 μL av BTB supplert med 13 μL av 1,5 mM ATP.
- Forbered to nye rør, merket + H og-H, henholdsvis. Til røret merket + H tilsett 3 μL av ~ 300 ng/μL TFIIH, og til røret merket-H tilsett 9 μL av 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glyserol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL storfe serum albumin.
Merk: Vi bruker vanligvis TFIIH renset fra rotte leveren, men vi har fått lignende resultater ved hjelp av ~ 0,6 μg/reaksjon av kommersielt tilgjengelige rekombinant Cdk7/cyclin H/MAT1 (CAK, som er kinase modulen fra TFIIH). Se tabell over materialer for informasjon. - Tilsett 87 μL av den vasket forlengelse komplekser fra trinn 2.2.1 til røret merket + H og 270 μL av vasket forlengelse komplekser til røret merket-H. ruge 10 min ved 30 ° c.
- Plasser prøven i magnetisk rack i 2 min. For å fjerne overflødig nukleotider og ubundet protein, vask forlengelse komplekser i + H og-H reaksjoner med 90 μL eller 270 μL av vaskebuffer, henholdsvis.
-
RNA-capping
- Resuspend forlengelse komplekser i røret merket med + H i 87 av μL-mix (BTB supplert med 50 μM GTP (Tabell 10). Resuspend forlengelse komplekser i røret merket-H i 261 μL av capping mix.
- Forbered 4 nye rør merket 5 ng CE + H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Fortynne capping enzym (CE) i 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glyserol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL storfe serum albumin å forberede løsninger som inneholder 5 ng CE/μL, 15 ng CE/μL, eller 45 ng CE/μL og dispensere 3 μL av den aktuelle løsningen i hvert av de 4 rørene.
- Forbered 12 nye rør med 94 μL av stopp buffer (2.1.1) lagt til hver.
- Start hver capping reaksjon ved å tilsette 87 μL av forlengelse kompleks behandlet med TFIIH eller ikke merket rør som inneholder capping enzym. Ruge ved 30 ° c i en varme blokk.
- Etter 1, 2 eller 4 min, stopp reaksjoner ved å overføre 30 μL av hver reaksjons blanding til rør som inneholder 94 μL av stopp buffer. Rens og analyser reaksjons produkter som beskrevet i avsnitt 3.
3. RNA rensing og analyse
- Rens RNA
- Ruge reaksjons produkter i stopp buffer i 20 minutter ved romtemperatur.
Merk: Stoppe punktet midlertidig. Prøvene i denne bufferen har blitt opprettholdt i opptil 4 timer uten tap eller nedbrytning av RNA. - Pakk en gang med 124 μL av fenol: kloroform: isoamylacetat alkohol (25:24:1) og en gang med kloroform: isoamylacetat alkohol (24:1).
Forsiktig: Fenol er svært giftig og absorberes raskt av huden. Bruk egnet verneutstyr.
Merk: For å maksimere utvinningen av RNA under ekstraksjon, bruk kommersielt tilgjengelige rør som inneholder en gel med høy tetthet, som danner en stabil barriere mellom vandige og organiske faser. Se diskusjon og tabell over materialer. - Overfør den vandige fasen (det øverste laget) til nye rør som inneholder 12,4 μL av 3 M natrium acetate pH 5,2.
- Ruge reaksjons produkter i stopp buffer i 20 minutter ved romtemperatur.
- Etanol nedbør
- Tilsett 350 μL av 100% etanol og bland godt ved inversjon.
- Ruge i minst 10 minutter på tørr is.
Merk: Stoppe punktet midlertidig. For enkelhets skyld kan man stoppe her og fullføre prosedyren på neste dag; Det er imidlertid mulig å gå direkte til trinn 3,3 og kjøre gelen på samme dag. RNA kan oppbevares ved-80 ° c for et par dager før videre behandling, men ikke la stå lenger.
- Klargjøre RNA-prøver for gel-elektroforese
- Tillat prøver å tine, bland med invertere 2-3 ganger, og sentrifuger for 15 min ved 21 000 x g, 4 ° c, i en tabletop sentrifuge. I mellomtiden, sette opp denaturering gel mix (§ 3.4.1).
- Fjern forsiktig etanol fra prøver uten å forstyrre pellet.
- Tilsett 500 μL av 70% etanol, inverter rør et par ganger for å vaske pellet, og deretter sentrifuger igjen ved 21 000 x g i 5 min ved enten romtemperatur eller 4 ° c.
- Fjern så mye etanol som mulig og gjøre en rask Spin (5-10 s) av rørene i en bordplate sentrifuger. Deretter, med en gel-loading spissen, fjerne den siste gjenværende volum av etanol.
- Luft-tørr pellet i 3 minutter ved romtemperatur.
- Løs opp RNA-en ved å tilsette 4 μL av H2O til toppen av hver pellet. Ruge 5 min ved romtemperatur.
- Tilsett 4 μL av 2x RNA fargestoff (se tabell over materialer) til blandingen, og deretter Vortex hvert rør for et par sekunder for å fullt resuspend RNA.
Merk: RNA fargestoff som inneholder formamid istedenfor urea anbefales, siden sistnevnte precipitates ved lave temperaturer. - Quick-spin rørene, og deretter ruge dem ved 70 ° c for 10 min i en varme blokk.
-
Oppbevar rør på tørr is til klar til å laste på gel.
Merk: å holde RNA på tørr is gir fleksibilitet til å arbeide med andre eksperimenter mens gelen er lysherde. Prøvene trenger ikke å bli reheated etter tine. Imidlertid kan RNA lastes direkte etter oppvarming hvis gelen er klar til å kjøre.
- Forbereder urea-side gel
- For 40 mL gel mix, Kombiner i et 50 mL konisk rør: 16,7 g urea, 15 mL 40% BIS: akrylamid oppløsning (19:1 ratio), 4 mL 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M natrium borate, 20 mM EDTA), og 8 mL av H2O. Dette volumet er tilstrekkelig for en standard størrelse gel (18 cm høyde x 16 cm bredde) med 1,0 mm avstandsstykker.
Forsiktig: Akrylamid er svært giftig. Mens det er ingen innånding risiko når den er i løsningen, alltid bruke Laboratoriefrakk, hansker, og vernebriller under håndtering.
Merk: Denne blandingen er for støping av en denaturering 15% polyakrylamid gel, som lett løser RNA mellom 15-50 NT. endre konsentrasjonen av BIS/akrylamid etter behov for å løse forskjellige RNA-utskrifter av ulik lengde. - Plasser lukket rør som inneholder gel Mix på en nutator til urea er helt oppløst.
- Sett opp gel-Casting stasjon med glassplater, 1 mm avstandsstykker og en 15-brønn kam.
- Arbeid raskt, tilsett 40 μL av TEMED og 400 μL av 10% ammonium persulfate løsning til gel-løsning og bland godt. Ved hjelp av en 25 mL Pipet, helle gel løsning mellom platene, sett kam, og la gelen å polymeres i minst 2 t.
Merk: Hvis gelen helles mer enn 2 h før bruk, når den har polymerisert dekke den med fuktig papir håndkle (forlater kam på plass) og pakk med plastfolie for å hindre at den tørker ut.
- For 40 mL gel mix, Kombiner i et 50 mL konisk rør: 16,7 g urea, 15 mL 40% BIS: akrylamid oppløsning (19:1 ratio), 4 mL 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M natrium borate, 20 mM EDTA), og 8 mL av H2O. Dette volumet er tilstrekkelig for en standard størrelse gel (18 cm høyde x 16 cm bredde) med 1,0 mm avstandsstykker.
- Denaturering gel RNA-elektroforese
- Etter polymerisering, forflytning gel å running tank og pre-løpe den for 20 mA inne 1x TBE for 15-30 min.
- I mellomtiden tine prøver (hvis frosset), Vortex, og spinne dem for 4 min på 2 000 x g, 4 ° c.
- Når du er klar, slå av strømforsyningen, og skyll forsiktig hver brønn med 1x TBE ved hjelp av en sprøyte.
- Bruk gel-lasting tips for å laste prøver på gel.
- Kjør gel på en konstant 20-30 mA for ca 2 h eller til lavere fargestoff (xylen cyanol FF) når bunnen av gelen.
- Fjern gelen, Legg den på et stykke absorberende papir, og pakk med plastfolie.
- Utsett radiolabeled gel for en phosphorscreen.
- Skann phosphorscreen ved hjelp av en phosphorimager og analyser bildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tall 2 og 3 viser representative resultat reaksjoner som brukes til å generere kunstige forlengelse komplekser som inneholder transkripsjoner av ulik lengde ved å utvide eller Pol II fra ulike kilder. Figur 4 viser hvordan disse forlengelse komplekser kan brukes til å analysen co-transcriptional CTD fosforylering-avhengige RNA capping.
Figur 2a er et diagram av DNA og RNA molekyler i kunstige forlengelse komplekser. Figur 2b viser transkripsjoner av ulik lengde generert i reaksjoner utført nøyaktig som beskrevet i protokoll 1, der Start kunstige forlengelse komplekser ble tilberedt ved hjelp av en syntetisk RNA-oligo på 20 NT (mørk blå i figur 2a ; RNA_20mer, tabell 1). Siden vi kjenner Start RNA lengde og DNA mal sekvens, kan vi bestemme undergruppe av nukleotider-ATP, CTP, GTP, eller UTP-nødvendig å gå Pol II til en definert posisjon langs malen. Antallet nye syntetisert nukleotider legges til startstørrelsen til RNA oligonukleotid primer for å bestemme den endelige forventede lengden (RNA oligo størrelse + antall nukleotider lagt til). I nærvær av ATP og UTP, Pol II kanne sammenlegge 3 NT å det 20 NT RNA oligo å utvikle forlengelse komplekser inneholder en 23mer RNA. Hvis man vasker bort kommunefritt ATP og UTP og deretter legger ATP og CTP, de 20 NT oligo er utvidet med 2 NT for å gjøre en 25mer, og hvis man så igjen vasker bort kommunefritt nukleotider og legger ATP og GTP, er transkripsjon utvidet ytterligere 4 NT for å gjøre en 29mer. sin CE den nylig genererte transkripsjoner tilsvare forventet RNA størrelse og siden nesten alle av radiolabeled 23mers kan bli kvantitativt jaget inn i lengre produkter, vet man at ved hjelp av denne metoden (i) RNA oligo er riktig plassert ved Pol II exit kanal under montering og (II) radiolabeled RNAs er assosiert med aktiv Pol II forlengelse komplekser.
Figur 2C viser en variant av protokollen, der Start forlengelse komplekser ble klargjort ved hjelp av samme DNA-mal og ikke-mal strand oligos og en RNA-oligo (RNA_29mer, tabell 1) som inneholder ytterligere 9 nukleotider ved sin 5 '-end, men er ellers identiske i rekkefølge til 20 NT RNA oligo. Fordi Start RNA lengden er 29 NT i dette tilfellet, forlengelse komplekser som inneholder 32mer, 34mer, og 38mer transkripsjoner kan genereres ved hjelp av samme Pol II walking trinn beskrevet ovenfor.
Avhengig av omfanget av analysen, gir denne metoden fleksibilitet i kilden til Pol II. I Figur 3 sammenligner vi reaksjoner med Pol II fra forskjellige kilder. I reaksjonene som vises i de første 4 baner, kunstige forlengelse komplekser ble satt sammen med endogene, vill type Pol II renset fra enten rotte leveren eller fisjon gjær og gikk som beskrevet ovenfor for å generere 23mers eller 25mers. Rotte og fisjon gjær Pol IIs brukes i disse reaksjonene ble renset til nær homogenitet bruker flere kromatografiske trinn.
Metoden kan også brukes til å generere kunstige forlengelse komplekser som inneholder vill type eller mutant Pol II tilberedt ved hjelp av en enkel, ett-trinns rensing metoden. De to siste kjørefelt i figuren viser analysene utføres ved hjelp av en mutant form av menneskelig Pol II som mangler CTD i sin Rpb1 delenhet, som ikke er nødvendig for Pol II katalysator, men bidrar til å par transkripsjon til RNA capping. Den CTD-less Pol II brukes i disse analysene ble renset ved anti-FLAG Immuno-rensing fra en menneskelig cellelinje uttrykker en FLAG epitope Tagged versjon av Rpb1. Det er viktig å merke seg at konsentrasjonen av aktiv Pol II vil variere fra forberedelse til forberedelse. Dermed er det viktig å utføre innledende eksperimenter der mengden av pol II som brukes i reaksjoner er variert for å bestemme mengden som trengs for å oppnå ønsket aktivitet.
Figur 4 viser et representativt eksempel på en analyse som sammenligner capping av radiolabeled transkripsjoner forbundet med kunstige forlengelse komplekser som inneholder Pol II med enten en fosforylert eller unphosphorylated CTD. For disse analysene, forlengelse komplekser inneholdende 23 nukleotid transkripsjoner med en 5 '-trifosfat slutt ble utarbeidet som beskrevet i protokoll 2.
Inkubasjons av forlengelse komplekser med capping enzym fører til en mobilitet skifte av rundt 1 NT, noe som indikerer tillegg av en 5 ' cap14, 15. For å quantitate capping reaksjoner, bestemmer man capping effektivitet, uttrykt som prosent av RNA som er avkortet. Capping effektivitet er forholdet mellom avkortet RNA til total RNA, dividert med maksimal oppnåelig capping. I våre analyser finner vi den maksimale oppnåelig capping av RNA oligos innhentet fra kommersielle kilder er ~ 85%, sannsynligvis på grunn av ufullstendige triphosphorylation av syntetisk RNA.
I reaksjonene som vises i de første 3 baner, forlengelse komplekser ble inkubert med den generelle transkripsjon faktor TFIIH og co-Factor ATP å phosphorylate Pol II CTD før capping. I disse reaksjonene, nær maksimal capping ble observert ~ 1 min etter tilsetning av 5 ng av capping enzym. Når analysene ble utført ved hjelp av forlengelse komplekser som ikke er inkubert med TFIIH og dermed inneholder unphosphorylated Pol II, tok det nesten 10 ganger så mye capping enzym å observere lignende nivåer av capping. De to siste kjørefelt av Figur 4 viser produkter av reaksjoner der forlengelse komplekser ble inkubert med eller uten capping enzym, i nærvær av TFIIH. Viktigere, den TFIIH-avhengighet av co-transcriptional capping kunstige forlengelse komplekser demonstrert i dette tallet er svært lik som observert i forlengelse komplekser som hadde initiert transkripsjon på en promoter i mer komplekse enzym systemer fempå.
Figur 1: montering av kunstige forlengelse komplekser. (A) RNA oligo (mørk blå) på 20 NT er glødet til en DNA mal strand (grønn) gjennom en komplementær sekvens på 9 NT. (B) RNA POLYMERASE II (Pol II) BLANDES med det glødet DNA: RNA hybrid for å posisjonere RNA 3 '-enden på Pol II-katalysatoren. (C) en molar overkant av 3 ' biotinylated ikke-mal Strand DNA oligo (lys blå) er lagt til reaksjonen Mix å legge og ytterligere stabilisere forlengelse komplekse. (D) immobilisert forlengelse komplekser vaskes for å fjerne overflødig oligos og inkubert med egnede kombinasjoner av nukleotider slik at Pol II kan forlenge RNA-oligo til ønsket lengde. Den nylig syntetisert delen av RNA-en vises i gult. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Pol II gå med RNA oligos av ulik lengde. (A) diagram av kunstige forlengelse komplekser, viser nukleotider lagt under turer. Non-mal tråd og mal Strand DNA er vist i lyseblått og grønt, henholdsvis. Den 20 NT RNA oligo er vist i mørk blå. Også vist er nukleotider lagt under suksessive turer for å generere 23mer RNA (oransje), 25mer RNA (brun), og 29mer RNA (magenta). (B) denaturering gel elektroforese viser RNAs av definert lengde innhentet etter å ha gått Pol II ved hjelp av en 20 NT RNA primer, som beskrevet i protokoll 1. Nukleotider lagt under hvert sekvensielle walking trinn av protokollen er fargekodet oransje (23mer), brun (25mer), og magenta (29mer). (C) Pol II walking starter med en 29 NT RNA primer, men ellers nøyaktig slik som vist i B. (B og C) viser deler av samme gel, men ble separert for illustrasjon formål. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: transkripsjoner syntetisert av kunstige forlengelse komplekser som inneholder vill type eller mutant Pol II. Kunstige forlengelse komplekser ble montert ved hjelp av 20 NT RNA primer og svært renset endogene Pol II fra rotte leveren eller fisjon gjær eller flagg immunopurified Pol II mangler Rpb1 fra jakten celler (F: Rpb1-ΔCTD). RNA i hvert kompleks ble ytterligere forlenget til 23 NT eller 25 NT. Se tekst for detaljer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilde 4: fosforylering-avhengig aktivering av TRANSCRIPTIONAL RNA-capping. Kunstige forlengelse komplekser som inneholder rotte lever Pol II og radiolabeled 23mer RNA var inkubert med ATP og den generelle transkripsjon faktor TFIIH eller buffer i 10 min til phosphorylate Pol II CTD. Etter vask, forlengelse komplekser ble inkubert med 5 ng, 15 ng, eller 45 ng av pattedyr capping enzym for 1, 2 eller 4 min. avkortet og uncapped 23mers ble løst i en denaturering gel (topp, første 12 baner) og% avkortet RNA var kvantifisert og plottet (nederst). Denne delen av figuren ble opprinnelig publisert i REF 5, som ble publisert som en åpen tilgang artikkel under en CC-by lisens. De to siste kjørefelt, som kommer fra et eget eksperiment, illustrerer produkter av reaksjoner der forlengelse komplekser ble inkubert med eller uten capping enzym, i nærvær av TFIIH. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sekvens | Kommentarer | |
| RNA_20mer | ACUCUCAUGUCUGAUGCUUA | 5 ' trifosfat modifikasjon; SIDE & RP-HPLC renset |
| RNA_29mer | ACUCUAUGACUCUUCAUGUCUGAUGCUUA | 5 ' trifosfat modifikasjon; SIDE & RP-HPLC renset |
| Mal Strand DNA | CTACGGTTAAGCTCACGGTACATTTCTGAA TTAAGCATCATGG |
Dobbel side & HPLC renset |
| Ikke-mal Strand DNA | ATCAGAAATGTACCGTGAGCTTAACCGTAG | 5 ' TEG-biotinylated; HPLC renset |
Tabell 1: DNA-og RNA-oligonukleotider
| Endelig konsentrasjon | Volum | |
| Tris HCl pH 7,5 | 12 mM * | |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM av | 1 μL |
| 300 mM KCl | 50 mM | 1,67 μL |
| 10 μM mal Strand DNA-oligo i 100 mM Tris-HCl pH 7,5 | 1 μM av | 1 μL |
| 10 μM RNA-oligo i 10 mM Tris-HCl pH 7,5 |
2 μM av | 2 μL |
| Vann | 4,33 μL | |
| 10 μL | ||
| * Alle Tris-HCl kommer fra DNA-og RNA-oligo løsninger | ||
Tabell 2: cocktail for annealing DNA og RNA-oligos
| Pol II-buffer | Endelig konsentrasjon | Volum/reaksjon |
| Vann | 4,52 μL | |
| 50 mM MgCl2 | ^ 4,67 mM | 1,40 μL |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | ^ 23 mM | 1,40 μL |
| 300 mM KCl | * 27 mM | 1,33 μL |
| 50% glyserol | 3 | 0,9 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 μL |
| 100 mM | 0,5 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 3 μL |
| 13 μL | ||
| Rett før du bruker buffer legge til: | ||
| Glødet mal Strand DNA: RNA (fra tabell 1) | 1 μL | |
| RNA polymerase II | 1 μL | |
| * Final KCl konsentrasjon i miksen er ~ 50 mM, med ekstra KCl kommer fra Pol II | ||
| ^ Final MgCl2 og Tris HCL konsentrasjonene er henholdsvis 5 mm og 25 mm, | ||
| Den ekstra MgCl2 og Tris HCL kommer fra glødet DNA: RNA Product. | ||
Tabell 3: Pol II Mix
| Ikke-mal DNA buffer | Endelig konsentrasjon | Volum/reaksjon |
| Vann | 4,48 μL | |
| 300 mM KCl | * 43,33 mM | 2,17 μL |
| 50 mM MgCl2 | 5 mM av | 1,50 μL |
| 250 mM Tris HCl, pH 7,5 | 25 mM | 1,50 μL |
| 50% glyserol | 3 | 0,9 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,38 μL |
| 100 mM | 0,5 mM | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 3 μL |
| 14 μL | ||
| Rett før du bruker buffer legge til: | ||
| 5 μM Biotinylated ikke-mal DNA oligo | 1 μL | |
| * Final KCl konsentrasjon i miksen er 50 mM, med ekstra KCl kommer fra ikke-mal DNA oligo buffer. | ||
Tabell 4: ikke-mal DNA-miks
| Buffer for puls merking | Endelig konsentrasjon | Volum/reaksjon |
| Vann | 9,98 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 5 μL |
| 50% glyserol | 3 | 1,5 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,63 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM med | 0,4 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | * 12 mM | 0,3 μL |
| 100 mM | 0,5 mM | 0,13 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM av | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 5 μL |
| 23 μL | ||
| Rett før du bruker buffer legge til: | ||
| 15 μM ATP | 0,6 μM | 1 μL |
| 3,3 μM [α-32P] UTP | 0,13 μM | 1 μL |
| * Final Tris HCl konsentrasjon er 20mM, med ekstra Tris HCl kommer fra nukleotid buffer. | ||
Tabell 5: Pulse merking NTP Mix
| Chase buffer | Endelig konsentrasjon | Volum/reaksjon |
| Tris HCl, pH 7,5 | * 30 mM | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 1 μL |
| Vann | 0,6 μL | |
| 50% glyserol | 3 | 0,3 μL |
| 10 mM DTT | 0,5 mM | 0,25 μL |
| 100 mM HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM av | 0,15 μL |
| 20 mg/mL BSA | 0,5 mg/ml | 0,13 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM med | 0,08 μL |
| 10% PVA | 2 | 1 μL |
| 3,5 μL | ||
| Rett før du bruker buffer legge til: | ||
| 100 μM UTP, 100 μM ATP fortynnet i 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 | 5 μM | 1,5 μL |
| * Alle Tris HCl kommer fra nukleotid buffer |
Tabell 6: Chase NTP Mix
| Endelig konsentrasjon | Volum/reaksjon | |
| Vann | 24,21 μL | |
| 1 M KCl | 60 mM | 1,8 μL |
| 50% glyserol | 3 | 1,8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/mL | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 μL |
| 10% PVA | 0,2 prosent | 0,6 μL |
| 100 mM | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM av | 0,09 μL |
| 30 μL |
Tabell 7: vaskebuffer
| Endelig konsentrasjon | Volum/reaksjon | |
| Vann | 14,13 μL | |
| 300 mM KCl | 60 mM | 6 μL |
| 50% glyserol | 3 | 1,8 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | 20 mM | 0,6 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM med | 0,48 μL |
| 100 mM | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM av | 0,09 μL |
| 10% PVA | 2 | 6 μL |
| 30 μL |
Tabell 8: base transkripsjon buffer (BTB)
| Stopp buffer | Endelig konsentrasjon | Volum/reaksjon |
| Vann | 55,74 μL | |
| 1 M Tris HCl, pH 7,5 | 10 mM av | 0,6 μL |
| 5 M NaCl | 300 mM NaCl | 3,6 μL |
| 500 mM EDTA | 0,5 mM EDTA | 0,06 μL |
| 10% SDS | 0,2% SDS | 1,2 μL |
| 60 μL | ||
| Rett før du bruker buffer legge til: | ||
| 15 mg/mL glykogen | 2 μL | |
| 20 mg/mL proteinase K | 2 μL | |
| Vann | 30 μL | |
Tabell 9: Stopp blanding
| Endelig konsentrasjon | Volum/reaksjon | |
| Vann | 11,9 μL | |
| 300 mM KCl | * 53,33 mM | 5,33 μL |
| 50% glyserol | 3 | 1,8 μL |
| 1,5 μM GTP fortynnet i 100 mM Tris HCl, pH 7,5 | 50 μM | 1 μL |
| 100 enheter/mL uorganisk Pyrophosphatase, gjær | 0,1 enheter/reaksjon | 1 μL |
| 20 mg/ml BSA | 0,5 mg/ml | 0,75 μL |
| 1 M Tris HCl, pH 7,9 | ^ 16,67 mM | 0,5 μL |
| 500 mM MgCl2 | 8 mM med | 0,48 μL |
| 100 mM | 0,5 mM | 0,15 μL |
| 1 M HEPES-NaOH, pH 7,9 | 3 mM av | 0,09 μL |
| 10% PVA | 2 | 6 μL |
| 29 μL | ||
| Rett før du bruker buffer legge til: | ||
| Capping enzym | 1 μL | |
| * Final KCl konsentrasjon i miksen er ~ 60 mM, med ekstra KCl kommer fra capping enzym og pyrophosphatase | ||
| ^ Final Tris HCl konsentrasjon er 20 mM, med ekstra Tris HCl kommer fra nukleotid buffer | ||
Tabell 10: capping Mix
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studier det søke å analysere begivenheter koplet å Pol II forlengelse innviklet som RNA bearbeiding og reguleringen av utskriften forlengelse selv kan høyeste lettere ved bruk av en høylig renset enzym system. Sette opp slike enzym systemer kan være utfordrende. Promoter-avhengig transkripsjon av pol II krever minst fem generelle transkripsjon faktorer. Utarbeidelse og lagring av disse faktorene kan ta måneder; Derfor er det rate-begrensende trinn i denne prosessen ofte bare forbereder den av transkripsjon faktorer som trengs for å Rekonstituer basal transkripsjon i reagensglasset.
I denne artikkelen beskriver vi en tilpasning av tidligere utviklede metoder for generering av kunstig transkripsjon forlengelse komplekser2,3 med bare renset Pol II og syntetisk DNA og RNA oligonukleotider. De resulterende forlengelse komplekser er transcriptionally aktive og egner seg for bruk i å undersøke koplingen av pol II-transkripsjon og RNA-capping5. Det er viktig å merke seg at transkripsjon og RNA capping forekomme i vivo i sammenheng med kromatin og mange andre proteiner som ikke finnes i dette definerte enzymsystemet; Derfor er dette systemet forventes å recapitulate mange, men ikke alle, funksjoner av reaksjoner som oppstår i vivo. Protokollen vi beskriver bygger på tidligere metoder ved immobilizing kunstige forlengelse komplekser gjennom biotinylated DNA bundet til magnetiske perler, slik at forskeren lett å endre reaksjonsforhold og/eller fjerne kommunefritt nukleotider under ulike stadier av analysene. Viktigere, fordi koden brukes til å nakkens forlengelse komplekser er på den ene enden av ikke-mal strand av DNA i stedet for på Pol II seg selv eller på malen strand, bare de Pol IIs forbundet med komplett forlengelse komplekser vil bli beholdt på perler.
Fordi begynnende transkripsjoner må ha en 5 '-trifosfat ende for å bli modifisert av capping enzym, den syntetiske RNA oligonukleotider brukes for capping eksperimenter er kjøpt med 5 '-trifosfat Termini. Uendret RNA-oligos kan imidlertid brukes til andre programmer, inkludert studier av andre transcriptional RNA-behandlingshendelser eller aktiviteter med transkripsjon faktorer som regulerer Pol II-forlengelse. Uavhengig av nedstrøms søknad, anbefaler vi montering forlengelse komplekser med høyt renset DNA og RNA oligos. Spesielt bør biotinylated DNA-oligos renses ved HPLC, og andre DNA-og RNA-oligos bør renses ved polyakrylamid gel elektroforese og/eller HPLC. Renhet av enzymatisk aktiviteter, men vil måtte fastsettes på et sak-til-sak grunnlag og vil avhenge av omfanget av hvert eksperiment.
Legge til ikke-mal biotinylated DNA-oligo i det siste trinnet av forsamlingen bør i prinsippet tilstrekkelig å få en trefoldig kompleks. Vi inkluderer imidlertid alltid minst ett "walking" trinn for å bekrefte at Pol II inneholder riktig antall nukleotider: Hvis målet med eksperimentet er å generere underlag for assaying transcriptional capping eller andre RNA prosesstrinn eller for å følge Pol II forlengelse, vi alltid inkludere en 32P-merket ribonucleotide i den første "gå", slik at transkripsjon kan bli visualisere og bruke umerkede "kald" nukleotider for påfølgende walking trinn slik at den spesifikke aktiviteten til transkripsjoner av forskjellige lengder forblir konstant. Selv om metoden beskrevet i denne protokollen bruker 32P-merket nukleotider for å visualisere begynnende transkripsjoner, kan fluorescens analyser brukes til å måle RNA-merking når det ikke er mulig å arbeide med radioaktive materialer. Det er imidlertid viktig å merke seg at følsomheten for Slike analyser er vanligvis mye mindre enn de som bruker radioaktive etiketter, og de vanligvis krever større mengder enzym.
Et viktig trinn for reproduserbar eksperimenter er god RNA-gjenoppretting under fenol: kloroform: isoamylacetat ekstraksjon og etanol nedbør. Vi har funnet ut at bruk av mikrosentrifugen-rør med høy tetthet gels (se tabell av materialer) for fenol: kloroform: isoamylacetat utvinning øker reproduserbarhet og utbytte av nukleinsyre syre fra dette trinnet. I tillegg er bruken av farget glykogen (se tabell over materialer) som transportør under etanol nedbør gjør det lettere å se små nukleinsyre yre pellets, noe som gjør det mindre sannsynlig at man utilsiktet mister pellet ved aspirating det under fjerning av etanol supernatanten.
Kunstige forlengelse komplekser generert ved hjelp av protokoller som ligner på de vi beskriver bør også være nyttig for å måle protein-protein eller protein-nukleinsyre syre interaksjoner mellom Pol II forlengelse komplekse og faktorer som regulerer transkripsjon forlengelse eller RNA prosessering hendelser knyttet til forlengelse. I dette tilfellet er proteiner som forblir bundet til kunstige forlengelse komplekser etter vask oppdages av vestlige blotting eller masse massespektrometri; radiolabeling RNA er ikke nødvendig, og vi gjør alle transkripsjon skritt med bare "kald" nukleotider.
Endelig kan denne metoden være til nytte for strukturelle analyser av transkripsjon komplekser. Faktisk har relaterte metoder blitt brukt i Rekonstituer-studier med gjær og pattedyr enzymer for å håndtere capping enzym-Pol II interaksjoner13, og interaksjoner av pol II med andre proteiner eller protein komplekser under forlengelse12, pause16,17, og sist, bundet til en nucleosome18. En mulig komplikasjon for strukturelle analyser av transkripsjon komplekser generert ved hjelp av denne metoden er behovet for å fjerne biotin/magnetiske perler fra komplekset; men dette kan løses ved å inkludere i DNA oligos bestemte områder anerkjent av restriksjon enzymer eller ved å bruke biotin Linkers som er kløyvde av etter UV Ray behandling19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker S. Shuman for å gi pattedyr capping enzymet cDNA. Dette arbeidet ble støttet delvis av et stipend til Stowers Institute for Medical Research fra Helen Nelson Medical Research Fund ved Greater Kansas City Community Foundation. Opprinnelige data underliggende dette manuskriptet kan nås fra Stowers opprinnelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D.
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
