Summary
Los adipocitos existen en depósitos discretos y tienen diversos roles dentro de sus microambientes únicos. A medida que se descubren las diferencias regionales en el carácter y la función de los adipocitos, la identificación y el aislamiento estandarizados de los depósitos es crucial para el avance del campo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la escisión de varios depósitos adiposos de ratón.
Abstract
Los tejidos adiposos son órganos complejos con una amplia gama de funciones, incluyendo el almacenamiento y movilización de energía en respuesta a las necesidades locales y globales, el desacoplamiento del metabolismo para generar calor y la secreción de adipolinas para regular la homeostasis de todo el cuerpo y respuestas inmunitarias. La investigación emergente está identificando importantes diferencias regionales en los perfiles de desarrollo, moleculares y funcionales de los adipocitos ubicados en depósitos discretos en todo el cuerpo. Diferentes propiedades de los depósitos son médicamente relevantes ya que las enfermedades metabólicas a menudo demuestran efectos específicos del depósito. Este protocolo proporcionará a los investigadores una guía detallada de atlas anatómicos y disección para la identificación y escisión reproducibles y precisas de diversos tejidos adiposos de ratón. La disección estandarizada de depósitos adiposos discretos permitirá realizar comparaciones detalladas de sus características moleculares y metabólicas y contribuciones a estados patológicos locales y sistémicos en diversas condiciones nutricionales y ambientales.
Introduction
Los tejidos adiposos desempeñan un papel fundamental en la homeostasis de todo el cuerpo, incluido el almacenamiento y la liberación de energía en respuesta a las necesidades locales y mundiales, la termorregulación y la secreción de adipolinas para regular el equilibrio energético, el metabolismo y las respuestas inmunitarias1 , 2. Los adipocitos se distribuyen por todo el cuerpo en depósitos discretos, y en algunos casos cumplen funciones especializadas dentro de sus microambientes3,4,5. Históricamente, el estudio del tejido adiposo se ha centrado en el tejido adiposo blanco (WAT), y su papel en el mantenimiento de la homeostasis energética. La mayoría de los adipocitos se distribuyen por todo el cuerpo en depósitos WAT subcutáneos y viscerales. Las características de estos depósitos son importantes para la susceptibilidad diferencial a las enfermedades metabólicas. Los adipocitos subcutáneos, situados debajo de la piel, se han asociado con efectos metabólicos protectores5. Los adipocitos viscerales, que rodean los órganos vitales y están contenidos dentro de los depósitos gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental y pericárdico, están comúnmente vinculados a trastornos metabólicos, incluyendo diabetes tipo 2 y enfermedades cardiovasculares2 . Los tejidos adiposos marrones (BAT) también se han estudiado extensamente. Los adipocitos marrones y marrones expresan la proteína desacoplamiento 1 (UCP1) y desempeñan un papel importante en la termogénesis adaptativa y la homeostasis de glucosa6,7. Los adipocitos marrones clásicos se encuentran enel depósito interescapular BAT 8. Los racimos de adipocitos marrones también se encuentran en otros lugares, incluyendo supraclavicular, infra/subscapular, cervical, paravertebral y depósitos periaorticos8,9.
Además de su ubicación en los principales depósitos WAT y BAT, losadipocitos existen en nichos discretos en todo el cuerpo 4, donde pueden realizar funciones especializadas dentro de sus respectivos microambientes. Por ejemplo, el tejido adiposo de médula ósea (BMAT) sirve como reservorio de lípidos, es una fuente importante de adiponectina circulante, e interactúa estrechamente con osteoblastos, osteoclastos y células hematopoyéticas10,11. Los adipocitos dérmicos contribuyen a procesos generalizados, incluyendo la cicatrización de heridas, la respuesta inmune, la termorregulación y el crecimiento del folículo piloso12,13. Además, los adipocitos epicardiales pueden producir varias adipunos y quimioquinas que ejercen efectos locales y sistémicos sobre el desarrollo y progresión de la enfermedad de las arterias coronarias14. La expansión del WAT intermuscular se ha correlacionado positivamente con el aumento de la adiposidad, la resistencia sistémica a la insulina y la disminución de la fuerza muscular y la movilidad15. Además, los adipocitos popliteales sirven como reservorio de lípidos para la expansión linfática durante la infección16. Mientras que las funciones específicas de diferentes depósitos articulares son generalmente desconocidas, el depósito de Hoffa (infrapatellar) dentro de la rodilla ahora se piensa para contribuir a las patologías, incluyendo dolor de rodilla anterior y osteoartritis17.
Mientras que las diferencias regionales en el carácter y la función de los adipocitos están bajo un estudio intenso, el campo está actualmente limitado por la falta de un protocolo estandarizado para la identificación y disección de diversos depósitos de ratones. Los métodos publicados anteriormente normalmente han descrito el aislamiento de uno o dos depósitos específicos y carecen del nivel de detalle necesario para la escisión uniforme18,19. El protocolo descrito en este manuscrito proporciona una guía completa para los lugares anatómicos específicos y los pasos de aislamiento de muchos depósitos adiposos de ratón diferentes. Aunque los depósitos WAT son el foco principal de este manuscrito, la escisión de BAT interescapular también se describe en detalle. Los tejidos adiposos extusos utilizando este protocolo se pueden utilizar para una amplia variedad de puntos finales experimentales, incluidos estudios explantados, histología y análisis de expresión génica.
El objetivo de este manuscrito es proporcionar a los investigadores un protocolo detallado para identificar y aislar de forma clara y precisa los depósitos de adiposos de ratón prominentes y menos estudiados (Figura1). Este recurso facilitará una investigación más completa de las características de desarrollo, moleculares y funcionales de los adipocitos dentro de diversos nichos.
Figura 1: Representación esquemática de depósitos adiposos de ratón diseccionados en este protocolo. Esta imagen ha sido adaptada de Bagchi et al., 20184. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
Todos los procedimientos de animales se realizan con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Michigan.
1. Eutanización
NOTA: Para este protocolo de vídeo, se utilizan ratones C57BL/6J de 4 a 6 meses de edad.
- Coloque el ratón en una cámara vaporizadora de isoflurano y ajuste el caudal de isoflurano al 5% o superior. Continúe la exposición al isoflurano hasta un minuto después de que se detenga la respiración. A continuación, retire el ratón de la cámara del vaporizador y confirme la eutanasia utilizando una medida secundaria aprobada.
NOTA: Las medidas secundarias aprobadas variarán según la institución y el protocolo animal y pueden incluir la dislocación cervical o la decapitación. - Coloque el ratón eutanasiado en la bandeja de disección. Esterilice las superficies externas dorsales y ventrales del ratón con un 70% de etanol. Asegúrese de que la superficie externa del ratón esté lo suficientemente húmeda para minimizar la contaminación por el pelaje durante la disección.
2. Identificación y aislamiento de Ddepots adiposos subcutáneos principales (anteriorsubcutánea, dorsolumbar, inguinal, glúteo) y tejido aadipos de color aadipos de color marrón interescapulares
- Identificación y aislación subcutánea anterior WAT
NOTA: El WAT subcutáneo anterior se encuentra entre las escápulas, descendiendo desde la nuca hasta las axilas del ratón7. Este depósito se ha descrito alternativamente como supraescapular8 o interescapular20 WAT y se encuentra directamente en la parte superior del depósito interescapular BAT.- Para aislar el depósito subcutáneo anterior, coloque el ratón sobre su estómago en una posición propensa. Fije las extremidades superior e inferior a la bandeja de disección con pasadores de disección.
- Usa fórceps para levantar la piel dorsal en la nuca. Usa tijeras de iris para hacer un corte pequeño (1 mm) en la piel.
- Inserte una hoja de las tijeras de iris en el corte inicial y haga una incisión vertical de línea media (2-3 cm) a través de la piel, comenzando en la nuca y descendiendo a lo largo de la columna vertebral hasta la mitad de la espalda.
- Realice dos incisiones horizontales (1 cm cada una) utilizando las tijeras de iris, extendiéndose lateralmente desde la línea media, en la parte superior e inferior de la incisión vertical inicial.
- Use fórceps para pelar cuidadosamente la piel y exponer el depósito subcutáneo anterior.
- Utilice tijeras de iris para eliminar el depósito siguiendo los bordes naturales del tejido.
NOTA: Este método aísla tanto el WAT subcutáneo anterior como el BAT interescapular. - Coloque el depósito diseccionado en la bandeja de disección y retire cuidadosamente el BAT contaminante usando tijeras de iris.
- Identificación y aislamiento c BAT lassical
NOTA: El BAT clásico se encuentra debajo del depósito WAT subcutáneo anterior.- Para aislar BAT, utilice tijeras de iris para cortar horizontalmente a lo largo del borde inferior del tejido subcutáneo anterior, siguiendo el borde natural del depósito.
- Luego, usa tijeras de iris para hacer dos incisiones verticales a lo largo de los bordes laterales del depósito, siguiendo los bordes naturales del tejido.
- Utilice fórceps para voltear cuidadosamente el depósito hacia arriba y revelar el BAT interescapular en forma de mariposa incrustado dentro del WAT. Diseccione cuidadosamente el BAT fuera del WAT circundante.
- Identificación y aislamiento subcutáneo posterior WAT,
- Coloque el ratón sobre su espalda en una posición supina.
- Después de asegurar las extremidades superiore e inferior con pasadores de disección, utilice fórceps para levantar la piel en la base del esternón y hacer un pequeño corte (1 mm) en la piel.
- Inserte una hoja de las tijeras de iris en el corte inicial y haga una incisión de línea media (4-5 cm) a través de la piel, comenzando en la base del esternón y descendiendo a la base de la cola. Tenga cuidado al hacer esta incisión porque la piel ventral es muy delgada y está estrechamente asociada con la pared subyacente de la cavidad peritoneal.
- Realice dos incisiones horizontales (1 cm cada una) utilizando tijeras de iris, que se extienden lateralmente desde la línea media, en la parte superior de la incisión vertical inicial.
- Use fórceps para pelar cuidadosamente la piel de la cavidad peritoneal y la pierna para encontrar el WAT subcutáneo posterior, que debe permanecer asociado con la piel. Asegure la piel extendida con pasadores de disección para facilitar la escisión completa del WAT.
NOTA: Aunque el WAT subcutáneo posterior parece ser continuo, en realidad se compone de tres depósitos discretos: dorsolumbar, inguinal y glúteo1. El depósito dorsolumbar se extiende desde la columna lumbar hasta la base de la extremidad posterior. El depósito inguinal triangular se extiende desde la base de la extremidad posterior ventralmente a través de la ingle y contiene un ganglio linfático prominente. El depósito de glúteos se extiende inferiormente desde la base de la ingle y se envuelve alrededor de la pierna hasta la base de la cola.
3. Identificación y aislamiento de depósitos de adiposos viscerales (Gonadal, Perirenal, Retroperitoneal, Omental, Pericardial)
- Identificación y aislamiento depósitos WAT viscerales
NOTA: Los depósitos WAT, que se encuentran en gran parte dentro de las cavidades torácica y peritoneal, mantienen el ratón en una posición supina. Fije las extremidades superior e inferior a la bandeja de disección con pasadores de disección.- Usa fórceps para levantar la fina pared de la cavidad peritoneal en la base del esternón y hacer un pequeño corte (1 mm) usando tijeras de iris.
- Inserte una hoja de las tijeras de iris en el corte y haga una incisión vertical descendente (4-5 cm) desde la parte superior de la cavidad peritoneal (base del esternón) hasta el recto.
- Hacer dos incisiones horizontales (1 cm cada una) con tijeras de iris, extendiéndose lateralmente desde la línea media, en la parte superior e inferior de la incisión vertical.
- Use fórceps para pelar el peritoneo y exponer el contenido de la cavidad abdominal. Ancle el peritoneo extendido a la bandeja de disección.
- Identificación y aislamiento g onadal WAT
NOTA: Gonadal WAT rodea el útero y los ovarios en las hembras (ovario o parametrial) y el epidídilo y los testículos en los machos (epididimales). El WAT ovárico rodea los ovarios, el útero y la vejiga. En animales obesanos, el WAT gonadal y perirenal puede parecer continuo, en este caso, separar los depósitos en el cuerno uterino y los ovarios. El WAT epidídilo se encuentra ligado al epidídilo, los testículos y el vaso sanguíneo epidídilo prominente.- Localice las gónadas (testículos u ovarios) y use fórceps para levantar el WAT gonadal asociado.
- Use tijeras de iris para extirpar cuidadosamente el WAT de las gónadas.
- Identificación y aislamiento p erirenal WAT
NOTA: El WAT perirrenal rodea los riñones bilateralmente. En animales obestosos, este depósito puede parecer que se extiende inferiormente a la parte superior del cuerno uterino y los ovarios. Aunque el WAT perirenal ha sido clasificado tradicionalmente como un depósito visceral21,varios grupos lo han identificado como un depósito marrón basado en el rastreo de linaje y estudios de acumulación de glucosa radiomarcados8,9, 20. Histológicamente se compone de una mezcla de adipocitos blancos y marrones.- Para extirpar el depósito perirrenal, localice el riñón y use fórceps para levantarlo y tirar de él en la línea media para ver una división clara entre los depósitos perirrenales y retroperitoneales.
- Excise el WAT directamente asociado con los riñones. Asegúrese de que las glándulas suprarrenales, situadas por encima de los riñones, se extraen del WAT.
- Identificación y aislamiento r etroperitoneal WAT
NOTA: El WAT retroperitoneal se encuentra en una posición paravertebral, a lo largo del borde entre la pared abdominal posterior y la médula espinal.- Para extirpar este depósito, utilice fórceps para levantar el riñón hacia arriba y hacia la línea media para ver claramente la frontera entre los depósitos perirrenales y retroperitoneales.
NOTA: En animales obesanos, identificar esta frontera puede ser un reto. - Luego, usa tijeras de iris para diseccionar cuidadosamente el WAT retroperitoneal de la pared peritoneal posterior.
- Para extirpar este depósito, utilice fórceps para levantar el riñón hacia arriba y hacia la línea media para ver claramente la frontera entre los depósitos perirrenales y retroperitoneales.
- Identificación y aislación de WAT omental
NOTA: Omental WAT se encuentra a lo largo de la mayor curvatura del estómago. Aunque el adipo mental es un depósito importante en los seres humanos, generalmente está presente sólo en ratones con obesidad mórbida.- Para identificar el WAT omental visceral, usa fórceps para levantar el estómago. Use tijeras de iris para extraer el tejido adiposo asociado a lo largo del borde inferior del estómago. No confunda el WAT omental con el páncreas.
- Identificar y aislar el mesentérico WAT
NOTA: Mesentérico WAT es una estructura similar a una red que rodea y se asocia con los intestinos pequeños y grandes.- Para extirpar este depósito, retire los intestinos del resto del tracto digestivo cortando en la base del estómago y el recto. Use fórceps para levantar los intestinos de la cavidad visceral y desentrañarlos.
- Use tijeras de iris para diseccionar cuidadosamente el WAT mesentérico lejos de los intestinos, comenzando en el duodeno y continuando hasta el final del colon. Retire cuidadosamente los ganglios linfáticos que están estrechamente asociados con el depósito mesentérico.
- Identificación y aislación de WAT pericárdico
NOTA: El PERIcardio WAT se encuentra fuera del pericardio visceral y en la superficie externa del pericardio parietal, a menudo a lo largo del aspecto inferior del corazón14.- Para acceder a la cavidad torácica, mantenga el ratón en posición supina. Fije las extremidades superior e inferior a la bandeja de disección con pasadores de disección.
- Utilice fórceps para levantar el proceso de xifoide (cartílago en la base del esternón) y hacer un pequeño (1 mm) cortado en la pared de la cavidad torácica.
- Inserte una hoja de las tijeras de iris en el corte y haga dos incisiones horizontales (1 cm cada una) que se extienden lateralmente desde la base del esternón. Esto expondrá el diafragma y el borde inferior de la cavidad torácica.
- Utilice tijeras dissección para hacer dos incisiones verticales ascendentes (3-4 cm) a través de la caja torácica, extendiéndose superiormente desde los bordes laterales de la cavidad torácica hasta la clavícula.
- Usa fórceps para levantar la mitad ventral de la caja torácica. Utilice tijeras dissección para hacer un corte final (2 cm) a lo largo de la longitud inferior de la clavícula para eliminar la caja torácica y exponer el contenido de la cavidad torácica.
- Si está presente, diseccione cuidadosamente el adipoto pericárdico de la superficie exterior del pericardio.
4. Identificación y aislamiento de otros depósitos adiposos
- Identificación y aislación de WAT epicardial
NOTA: Epicardial WAT se encuentra dentro del pericardio visceral y se asocia directamente con la superficie del miocardio.- Si está presente, los adipocitos epicardiales se pueden observar histológicamente después del aislamiento y la fijación del corazón perfundido en una formalina tamponada neutra al 10% durante 24 horas.
- Identificación y aislamiento p oliteal WAT
NOTA: El WAT popliteal se encuentra en la fosa popliteal en la rodilla posterior y contiene un gran ganglio linfático. Este depósito no es típicamente visible en animales jóvenes.- Para aislar el WAT popliteal, utilice tijeras de iris para eliminar cuidadosamente la piel de la base de la extremidad posterior hasta el pie.
- Coloque la rótula contra la sartén de disección y fije la pierna extendida con un alfiler en el pie. Asegúrese de que la fosa popliteal en la parte posterior de la rodilla esté mirando hacia arriba.
- Utilice tijeras de iris para hacer un corte en el borde inferior de las cabezas mediales y laterales del músculo gastrocnemius. Usa fórceps para levantar el músculo y revelar el depósito popliteal triangular.
- Use tijeras de iris para extirpar el depósito a lo largo de los bordes del tejido natural.
- Identificación y aislación de WAT dérmico
NOTA: Wat dérmico es una capa delgada de adipocitos situados entre la dermis reticular y la capa muscular panniculus carnosus.- Para identificar adipocitos dérmicos por métodos histológicos, coloque el ratón sobre su estómago en una posición propensa. Después de asegurar las extremidades superiores e inferiores con pasadores de disección, rocíe la superficie externa del ratón con un 70% de etanol para mojar la piel.
- Use un bisturí para eliminar el pelaje humedecido de una porción cuadrada de la piel en la parte posterior del ratón.
- Use tijeras de iris para extirpar cuidadosamente la porción avededa de la piel, que incluirá la dermis reticular, WAT dérmico, panniculus carnosus, y algunos WAT subcutáneos.
- Usa un bisturí para cortar la piel extirpada en tiras verticales delgadas.
- Coloque las tiras verticales delgadas con la capa WAT subcutánea pegajosa hacia abajo.
- Comenzando en un extremo, rodar la tira sobre sí misma para formar una espiral. La capa WAT subcutánea pegajosa en el exterior de la espiral permitirá que el rollo mantenga su forma durante la fijación.
- Coloque la espiral en un pozo de una placa de 24 pocillos que contenga un 10% de formalina tamponada neutra durante 24 horas antes del procesamiento histológico22.
- Identificación y aislación del WAT intermuscular
NOTA: El WAT intermuscular se define ampliamente como adipocitos situados debajo de la fascia profunda de los músculos. Este término incluye adipocitos intercalados entre las fibras musculares del músculo esquelético, también conocido como WAT intramuscular, y adipocitos ubicados dentro de los propios haces musculares. Los ratones de tipo salvaje generalmente no tienen un gran número de adipocitos intermusculares. Sin embargo, bajo ciertas condiciones es posible identificar WAT intermuscular por métodos histológicos. Bajo algunas condiciones, los adipocitos intermusculares también se pueden encontrar en músculos lisos, como el diafragma.- Para aislar el músculo tibialis anterior (TA), por ejemplo, coloque el ratón sobre su espalda en una posición supina y fije las extremidades inferiores a la bandeja de disección usando pasadores de disección. Humedezca la piel con 70% de etanol para minimizar la contaminación con piel.
- Use tijeras de iris para eliminar cuidadosamente la piel de la pierna y exponer el grupo muscular del cuádriceps, situado por encima de la rodilla en el eje del fémur, y el TA situado debajo de la rodilla en la superficie ventral de la tibia.
NOTA: El TA es grueso cerca del extremo proximal de la tibia y más tendinoso cerca del extremo distal. - Utilice tijeras de iris para extirpar un pedazo del músculo y fijar en 10% de formalina tamponada neutra durante 24 horas antes del procesamiento histológico22.
- Identificación y aislación de depósitos WAT intraarticulares
NOTA: Los depósitos WAT intraarticulares se encuentran dentro de las articulaciones sinoviales.- Para identificar el WAT infrapatellar, por ejemplo, por métodos histológicos, cosecha los huesos de las piernas como se detalla en la sección BMAT.
- Después de la extracción del complejo fémur-tibial, utilizar tijeras de iris y gasas para eliminar tanto músculo y tejido conectivo como sea posible. No rompas la articulación tibiofemoral.
- Fijar el complejo fémur-tibial en 10% de formalina tamponada neutra durante 24 horas antes de la descalcificación y el procesamiento histológico (descrito a continuación, paso 4.6.8).
- Identificación y aislar el tejido adiposo de la médula ósea
NOTA: El tejido adiposo de médula ósea (BMAT) se encuentra dentro de los huesos, intercalado con células hematopoyéticas. Anatómicamente, el BMAT puede clasificarse como constitutivo (tibia distal y vértebras caudales) o regulado (tibia media-proximal, fémur y vértebras lumbares)10,11. El aislamiento limpio de adipocitos de médula ósea para análisis de ARN y proteínas es difícil en ratones. Sin embargo, los huesos del ratón se pueden cosechar fácilmente, fijar, descalcificar y incrustar parafina para análisis histológicos.- Para cosechar huesos de las piernas, por ejemplo, primero retire las piernas del ratón. Use tijeras de disección para cortar la articulación acetabulofemoral, manteniendo intacta la cabeza femoral.
- Usa tijeras de iris para eliminar cuidadosamente la piel de la pierna, revelando los músculos de las piernas.
- Disecciona cuidadosamente los músculos principales del fémur y la tibia usando tijeras de iris y gasas.
- Cuando el fémur esté expuesto, siga el borde del hueso hasta la articulación de la pelvis y el fémur y libere cuidadosamente la cabeza femoral de la articulación acetabulofemoral. Use gasa para limpiar el tejido restante del fémur.
- Siga el borde de la tibia hasta la articulación del tobillo. Libera cuidadosamente el maleolus medial, situado en la punta de la tibia, de la articulación del tobillo.
- Una vez que el complejo fémur-tibial ha sido aislado, eliminar tanto músculo y tejido conectivo como sea posible utilizando tijeras de iris y / o gasa.
- Separe la tibia del fémur insertando una hoja de las tijeras de iris en la articulación tibiofemoral y corte suavemente los ligamentos colaterales mediales y laterales y los ligamentos cruzados anteriores y posteriores. No retire la cápsula de la articulación de la rodilla para asegurarse de que la tibia permanezca intacta. Use gasa para limpiar el tejido restante de la tibia.
- Fijar los huesos en 10% de formalina tamponada neutra durante 24 horas a temperatura ambiente y luego lavar y almacenar de acuerdo a las necesidades futuras.
- Para analizar los parámetros óseos mediante tomografía microcomputada (CT), almacene los huesos en el tampón de fosfato de Sorensen, pH 7,423.
- Para la cuantificación BMAT y los análisis histológicos, descalcifice los huesos en 14% EDTA, pH 7.4, durante 10-14 días.
- Después de la descalcificación, utilice la tinción de tetróxido de osmio y el análisis de CT para cuantificar BMAT24. De lo contrario, procesos y huesos incrustados en parafina para histología23.
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Representative Results
La identificación y el aislamiento exitosos de varios depósitos adiposos de ratón se pueden lograr utilizando el protocolo descrito anteriormente. Las ubicaciones anatómicas brutas de los depósitos subcutáneos (A, E-F), marrones (B), viscerales (C, D, G-J) y popliteal (K) se muestran en la Figura2.
Figura 2: Ubicaciones anatómicas brutas de los depósitos adiposos de ratón. Anatomía bruta de (A) subcutánea anterior, (B) marrón, (C) epididimal (b, vejiga), (D) ovario (u, cuernos uterinos), (E) subcutánea posterior (dorsolumbar (d), inguinal (i), glúteo (g)), (F) inguinal, (G) mesentérico, (H) perirenal (k, riñón), (I) retroperitoneal (k, riñón), (J) pericardial (h, corazón) y (K) depósitos de adiposos popliteales en ratones adultos C57BL/6J. Las flechas apuntan a depósitos específicos si se representan varios depósitos. Los órganos pertinentes se designan mediante cartas apropiadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las características histológicas de los depósitos de adiposo subcutáneo (A-D), marrón (E), visceral (F-K), popliteal (L), constitutivo (M) y médula regulada (N), intramuscular (O) e infracapa (P) fueron evaluados por Hematoxilina y Eosina (H&E) tinción22 y se muestran en la Figura 3.
Figura 3: Evaluación histológica de depósitos adiposos discretos de ratón. Histología de (A) subcutánea anterior, (B) dorsolumbar, (C) inguinal, (D) glúteo, (E) marrón, (F) gonadal, (G) perirrenal, (H) retroperitoneal, (I) omental, ( J) mesentérico, (K) pericardial, (L) popliteal, (M) adiposo de médula ósea regulado y (N), (O ) intermuscular y (P) depósitos infraciclistas en ratones adultos C57BL/6J. Los tejidos se aislaron de acuerdo con el protocolo dado, se fijaron durante la noche en una formalina tamponada neutra al 10%, procesada e incrustada en parafina. Se tiñeron 5 secciones con H&E. La mayoría de las imágenes fueron tomadas con aumento de 100x; Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
A medida que se reconoce cada vez más la importancia de las diversas características moleculares y funcionales de los grupos de adipocitos discretos, es crucial que los investigadores dentro del campo identifiquen y exifren uniformemente los depósitos de adiposo para análisis posteriores. Hasta la fecha, existen pocos protocolos para la localización estandarizada y el aislamiento de la amplia gama de depósitos adiposos de ratón. Los métodos publicados anteriormente se centran principalmente en uno o dos depósitos y carecen de los detalles necesarios para la identificación uniforme y la escisión por diferentes investigadores18,19. Este manuscrito es una contribución novedosa e importante al campo de la biología adiposa ya que proporciona una guía en profundidad sobre la ubicación anatómica y la disección precisa de depósitos comúnmente estudiados y menos conocidos en todo el ratón. Se proporciona una ubicación anatómica bruta y análisis histológicos para demostrar la diversidad de nichos de adipocitos.
El aislamiento exitoso de depósitos adiposos discretos que utilizan este protocolo depende de varios pasos críticos. El mantenimiento de un entorno de disección limpia es crucial; 70% etanol se puede utilizar según sea necesario para eliminar los pelos contaminantes o la sangre de la bandeja de disección y las herramientas. Al aislar el WAT subcutáneo posterior, es imperativo que la incisión inicial en la piel no penetre en la cavidad peritoneal estrechamente asociada para que las dos capas se puedan separar eficientemente para exponer el WAT. Del mismo modo, al cortar a través de la pared peritoneal para exponer el contenido de la cavidad abdominal, las incisiones no deben perforar los intestinos subyacentes para evitar la contaminación con elementos digestivos. Bat interescapular debe ser cuidadosamente extirpado del tejido circundante para evitar la contaminación WAT, que sesgará futuros análisis. La identificación constante de los depósitos subcutáneos posteriores dorsolumbar, inguinal y glúteodepende de la utilización de puntos de referencia anatómicos precisos descritos en el protocolo. La distinción entre estos depósitos es particularmente importante; aunque los depósitos pueden parecer continuos, los adipocitos inguinales ubicados centralmente adquieren características similares a las de un pardo más fácilmente que sus homólogos circundantes.
Los tejidos adiposos aislados mediante este protocolo se pueden analizar utilizando una variedad de técnicas. Además de la evaluación histológica (por ejemplo, tinción de H&E, inmunohistoquímica), los tejidos adiposos se pueden utilizar para una amplia gama de análisis moleculares, desde la regulación de la transcripción hasta las modificaciones posttranslacionales de proteínas. Los adipocitos y las células vasculares estromales dentro de depósitos individuales pueden ser aislados por la digestión de la colagenasa y la centrifugación diferencial. Estas fracciones se pueden utilizar para estudios moleculares, metabólicos y de cultivo celular. Los explantes de depósito también se pueden utilizar para ensayos metabólicos y enzimáticos ex vivos.
Varios desafíos y limitaciones surgen durante el aislamiento y la escisión de los tejidos adiposos del ratón. En primer lugar, algunos depósitos que son fisiológicamente importantes en los seres humanos no están comúnmente presentes en magra, ratones adultos. Por ejemplo, el WAT omental, que es el importante depósito visceral en humanos, sólo se puede ver en ratones obesos genéticamente o inducidos por la dieta. Sin embargo, la expansión de algunos depósitos puede ser inducida por desafíos nutricionales o tratamientos farmacológicos. Por ejemplo, la alimentación con dieta alta en grasas puede causar la expansión del WAT omental y pericárdico. El WAT intermuscular puede ser inducido por lesión muscular esquelética25,26 o dieta alta en grasas27. BMAT regulado se expande en respuesta a varios desafíos, incluyendo dieta alta en grasas, restricción de calorías y tratamiento de tiazolidinediona11,28. En segundo lugar, debido al pequeño tamaño de los ratones, obtener suficiente muestra para análisis moleculares o metabólicos puede ser difícil. Por ejemplo, el aislamiento de suficientes adipocitos de médula ósea pura para análisis posteriores es un desafío, incluso después de agrupar huesos de varios ratones. En tercer lugar, definir con precisión las fronteras de ciertos depósitos puede ser difícil. Por ejemplo, el WAT subcutáneo posterior parece ser un depósito continuo, pero en realidad se compone de depósitos dorsolumbares, inguinales y glúteos discretos. Además, el perirenal puede parecer fusionado a los depósitos gonadal y retroperitoneal en animales muy obusos. La falta de fronteras distintas entre los depósitos adyacentes puede hacer que el aislamiento limpio de estos tejidos sea un desafío. Sin embargo, este protocolo de disección proporciona a los investigadores un atlas detallado y orientación paso a paso para la disección precisa y reproducible de una amplia gama de depósitos adiposos de ratón. La estandarización en todo el campo de la identificación y el aislamiento de depósitos adiposos discretos de ratón descritos anteriormente sin duda ayudará a dilucidar aún más las diferencias en el desarrollo, la expresión génica y las funciones locales y sistémicas de las funciones locales y sistémicas anteriormente nichos de adipocitos poco estudiados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
O.A.M. es apoyado por las subvenciones NIH DK062876 y DK092759; D.P.B. cuenta con el apoyo del Programa de Capacitación de Científicos Médicos de la Universidad de Michigan (T32GM007863), el Programa de Capacitación de la Universidad de Michigan en Organogénesis (T32HD007605), la Beca al Mérito rackham de la Universidad de Michigan y la beca Tylenol Future Care Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
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- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
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