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Biology

पहचान और विविध माउस एपोज़ डिपो के विच्छेदन

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59499
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Michigan Medical School

Summary

एडिपोसाइट्स असतत डिपो में मौजूद हैं और उनके अद्वितीय microenvironments के भीतर विविध भूमिका है. के रूप में adipocyte चरित्र और समारोह में क्षेत्रीय मतभेद का पर्दाफाश कर रहे हैं, मानकीकृत पहचान और डिपो के अलगाव क्षेत्र की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है. इसमें, हम विभिन्न माउस वसा डिपो के चीरा के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

एडिपोज ऊतक कार्यों की एक विस्तृत सरणी के साथ जटिल अंग हैं, जिसमें स्थानीय और वैश्विक जरूरतों के जवाब में ऊर्जा का भंडारण और जुटाना, गर्मी उत्पन्न करने के लिए चयापचय का असहयोग, और पूरे शरीर के homeostasis को विनियमित करने के लिए एडिपोकिन्स का स्राव शामिल है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं. उभरते अनुसंधान पूरे शरीर में असतत डिपो में स्थित adipocytes के विकास, आणविक, और कार्यात्मक प्रोफाइल में महत्वपूर्ण क्षेत्रीय मतभेदों की पहचान है. डिपो के विभिन्न गुण चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक हैं क्योंकि चयापचय रोग अक्सर डिपो-विशिष्ट प्रभावप्रदर्शित करते हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ जांचकर्ताओं एक विस्तृत शारीरिक एटलस और विच्छेदन गाइड reproduible और सटीक पहचान और विविध माउस वसा ऊतकों के चीरा के लिए प्रदान करेगा. असतत वसा डिपो के मानकीकृत विच्छेदन उनके आणविक और चयापचय विशेषताओं और विभिन्न पोषण और पर्यावरणीय स्थितियों के तहत स्थानीय और प्रणालीगत रोगग्रस्त राज्यों के लिए योगदान की विस्तृत तुलना की अनुमति देगा.

Introduction

वसा ऊतक पूरे शरीर homeostasis में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, भंडारण और स्थानीय और वैश्विक जरूरतों के जवाब में ऊर्जा की रिहाई सहित, thermoregulation, और adipokines के स्राव ऊर्जा संतुलन को विनियमित करने के लिए, चयापचय और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं1 , 2. आदिकोशिकाओं को पूरे शरीर में असतत डिपो में वितरित किया जाता है और कुछ मामलों में वे अपने सूक्ष्म वातावरण3,4,5में विशिष्ट भूमिका निभाते हैं . ऐतिहासिक रूप से, वसा ऊतक का अध्ययन सफेद वसा ऊतक (वैट) पर केंद्रित है, और ऊर्जा homeostasis को बनाए रखने में अपनी भूमिका. अधिकांश एडिपोसाइट्स को पूरे शरीर में त्वचीय और अंतरंग वाट डिपो में वितरित किया जाता है। इन डिपो की विशेषताओं चयापचय रोगों के लिए अंतर संवेदनशीलता के लिए महत्वपूर्ण हैं. त्वचा के नीचे स्थित उपत्वचा एडिपोसाइट्स, सुरक्षात्मक चयापचय प्रभाव5के साथ जुड़े रहे हैं। Visceral adipocytes, जो महत्वपूर्ण अंगों के चारों ओर और gonadal के भीतर निहित हैं, perirenal, retroperitoneal, omental और pericardial डिपो, आमतौर पर चयापचय विकारों से जुड़े हुए हैं, प्रकार सहित 2 मधुमेह और हृदय रोग2 . ब्राउन वसा ऊतकों (बैट) भी बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है. भूरे और भूरे रंग की तरह एडियोसाइट्स अयुग्मक प्रोटीन 1 (यूसीपी 1) कोव्यक्त करते हैं और अनुकूली तापजनन और ग्लूकोज होमियोस्टेसिस 6,7में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। क्लासिकल ब्राउन एडिपोसाइट्स इंटरस्कैपलर बैट डिपो8में समाहित होते हैं . भूरे रंग के एडिपोसाइट्स के गुच्छ अन्य स्थानों में भी पाए जाते हैं, जिनमें सुप्राक्लेव्युलर, इन्फ्रा/

प्रमुख वाट और बैट डिपो में उनके स्थान के अलावा, adipocytes शरीर4भर में असतत niches में मौजूद हैं, जहां वे अपने संबंधित microenvironments के भीतर विशेष कार्य कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, अस्थि मज्जा वसा ऊतक (BMAT) एक लिपिड जलाशय के रूप में कार्य करता है, adiponectin घूम का एक प्रमुख स्रोत है, और बारीकी से ऑस्टियोब्लास्ट्स, ऑस्टियोक्लेस्ट, और hematopoietic कोशिकाओं के साथ सूचना का आदान प्रदान10,11. Dermal adipocytes घाव भरने, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, थर्मोनियमन, और बाल कूप विकास12,13सहित व्यापक प्रक्रियाओं के लिए योगदान करते हैं। इसके अलावा, एपिकार्डियल एडिपोसाइट्स कई एडिपोकिन और कीमोकिन का उत्पादन कर सकते हैं जो कोरोनरी धमनी रोग14के विकास और प्रगति पर स्थानीय और प्रणालीगत प्रभाव डालते हैं। अंतर/इंट्रामस्क्युलर वॉट का विस्तार वृद्धि हुई adiposity, प्रणालीगत इंसुलिन प्रतिरोध, और मांसपेशियों की शक्ति और गतिशीलता15में कमी के साथ सकारात्मक सहसंबद्ध किया गया है। इसके अलावा, popliteal adipocytes संक्रमण16के दौरान लसीका विस्तार के लिए एक लिपिड जलाशय के रूप में सेवा करते हैं. जबकि विभिन्न संधिक डिपो की विशिष्ट भूमिकाआम तौर पर अज्ञात है, घुटने के भीतर हॉफा डिपो (इन्फ्रापेटलर) अब पूर्वकाल घुटने के दर्द और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस17सहित रोगों में योगदान करने के लिए सोचा है।

जबकि adipocyte चरित्र और समारोह में क्षेत्रीय मतभेद गहन अध्ययन के तहत कर रहे हैं, क्षेत्र वर्तमान में पहचान और विविध माउस डिपो के विच्छेदन के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल की कमी से सीमित है. पहले प्रकाशित विधियों में आम तौर पर एक या दो विशिष्ट डिपोों के पृथक्करण का वर्णन किया जाता था और एक समान उच्छेदन18,19के लिए आवश्यक विस्तार के स्तर की कमी होती थी . इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल विशिष्ट परमाणु स्थानों और कई अलग अलग माउस वसा डिपो के अलगाव कदम के लिए एक व्यापक गाइड प्रदान करता है. हालांकि वाट डिपो इस पांडुलिपि का प्राथमिक ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, interscapular बैट के चीरा भी विस्तार से वर्णित है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पादित वसा ऊतकों का उपयोग विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक एंडपॉइंट के लिए किया जा सकता है, जिसमें एक्सप्लांट अध्ययन, ऊतक विज्ञान, और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण शामिल हैं।

इस पांडुलिपि का लक्ष्य जांचकर्ताओं को एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है ताकि प्रमुख और कम अध्ययन वाले माउस वसा डिपो (चित्र1) दोनों की स्पष्ट रूप से और ठीक से पहचान और अलग-अलग किया जा सके। इस संसाधन के विकास की एक और अधिक पूरी जांच की सुविधा होगी, आणविक, और विविध niches के भीतर apocytes के कार्यात्मक विशेषताओं.

Figure 1
चित्र 1: माउस वसा डिपो का योजनाबद्ध चित्रण इस प्रोटोकॉल में विच्छेदित है। इस छवि को बागची एट अल से अनुकूलित किया गया है, 20184. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं मिशिगन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं.

1. यूथेनाइजेशन

नोट: इस वीडियो प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए, 4 से 6 महीने पुराने C57BL/6J चूहों का उपयोग किया जाता है.

  1. माउस को एक समलूरेन वाष्पित्र कक्ष में रखें और isoflurane प्रवाह दर को 5% या उससे अधिक समायोजित करें। सांस लेने के बंद होने के एक मिनट बाद तक isoflurane जोखिम जारी रखें. फिर vaporizer कक्ष से माउस को हटाने और एक अनुमोदित माध्यमिक उपाय का उपयोग कर इच्छामृत्यु की पुष्टि करें.
    नोट: स्वीकृत माध्यमिक उपायों संस्था और पशु प्रोटोकॉल के आधार पर अलग अलग होंगे और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या decapitation शामिल हो सकते हैं.
  2. विच्छेदन पैन पर सुथानायुक्त माउस रखें। 70% इथेनॉल का उपयोग करके माउस के पृष्ठीय और अधर बाह्य सतहों को स्टरलाइज़ करें। सुनिश्चित करें कि विच्छेदन के दौरान फर से संदूषण को कम करने के लिए माउस की बाहरी सतह पर्याप्त रूप से गीली है।

2. मेजर subcutaneous एडिपोस Ddepots की पहचान और अलगाव (पूर्व उपत्वचा, डोर्सोलमबार, इंगुइनल, ग्लूटील) और Interscapular ब्राउन Aadipose ऊतक

  1. पूर्वके के उपत्वचा की पहचान करना और अलग करना वाई.डब्ल्यू.ए
    नोट: पूर्ववर्ती अधस्त्वक् वाट स्कापुला के बीच स्थित है, जो गर्दन के नेप से माउस7की एक्सिलई तक उतरता है। इस डिपो को वैकल्पिक रूप से सुपरस्कैपुलर8 या इंटरस्कैपुलर20 वॉट के रूप में वर्णित किया गया है और यह सीधे इंटरस्कैपलर बैट डिपो के शीर्ष पर स्थित है।
    1. पूर्वकाल के अधस्त्वकिये डिपो को अलग करने के लिए, चूहे को अपने पेट पर एक प्रवण स्थिति में रखें। विच्छेदन पिन के साथ विच्छेदन पैन करने के लिए ऊपरी और निचले अंगों को सुरक्षित।
    2. गर्दन की झपकी पर पृष्ठीय त्वचा को उठाने के लिए बलप्स का प्रयोग करें। त्वचा में एक छोटा (1 मिमी) कटौती करने के लिए आईरिस कैंची का प्रयोग करें।
    3. प्रारंभिक कटौती में आईरिस कैंची के एक ब्लेड डालें और त्वचा के माध्यम से एक मिडलाइन ऊर्ध्वाधर चीरा (2-3 सेमी) बनाते हैं, गर्दन की झपकी पर शुरुआत करते हैं और मध्य पीठ के लिए रीढ़ के साथ उतरते हैं।
    4. आईरिस कैंची का उपयोग करते हुए दो क्षैतिज चीरे (1 सेमी प्रत्येक) बनाएं, जो प्रारंभिक ऊर्ध्वाधर चीरा के ऊपर और नीचे मिडलाइन से बाद में विस्तारित होता है।
    5. सावधानी से त्वचा वापस छील और पूर्वकाल चमड़े के नीचे डिपो का पर्दाफाश करने के लिए बल का प्रयोग करें.
    6. ऊतक की प्राकृतिक सीमाओं का पालन करते हुए डिपो को हटाने के लिए आईरिस कैंची का प्रयोग करें।
      नोट: इस विधि दोनों पूर्वकाल subcutaneous वाट और interscapular बैट को अलग.
    7. विच्छेदन पैन पर विच्छेदन डिपो प्लेस और ध्यान से आईरिस कैंची का उपयोग कर दूषित बैट हटा दें।
  2. पहचान और अलग-थलग करना सी लकी बैट
    नोट: शास्त्रीय बैट पूर्वकाल subcutaneous वाट डिपो के नीचे स्थित है.
    1. बैट को अलग करने के लिए, डिपो की प्राकृतिक सीमा के बाद, पूर्वकाल के निचले किनारे के साथ क्षैतिज रूप से कटौती करने के लिए आईरिस कैंची का उपयोग करें।
    2. फिर, ऊतक की प्राकृतिक सीमाओं का पालन करते हुए, डिपो के पार्श्व किनारों के साथ दो ऊर्ध्वाधर चीरे बनाने के लिए आईरिस कैंची का उपयोग करें।
    3. ध्यान से डिपो फ्लिप और तितली के आकार का interscapular बैट WAT के भीतर एम्बेडेड प्रकट करने के लिए forceps का प्रयोग करें। ध्यान से आसपास के वाट से बैट बाहर विच्छेदन.
  3. पहचान और अलग-थलग करना पश् च अध:स्त्वज वॉट्स,
    1. माउस को अपनी पीठ पर एक सुपाच्य स्थिति में रखें।
    2. विच्छेदन पिन के साथ ऊपरी और निचले अंगों को सुरक्षित करने के बाद, स्टर्नम के आधार पर त्वचा को उठाने और त्वचा में एक छोटा (1 मिमी) कटौती करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
    3. प्रारंभिक कटौती में आईरिस कैंची के एक ब्लेड डालें और त्वचा के माध्यम से एक मिडलाइन चीरा (4-5 सेमी) बनाने के लिए, स्टर्नम के आधार पर शुरुआत और पूंछ के आधार पर उतरते। यह चीरा बनाते समय सावधानी बरतें क्योंकि अधर त्वचा बहुत पतली है और अंतर्निहित पेरिटोनल गुहा दीवार के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है।
    4. दो क्षैतिज चीरों (1 सेमी प्रत्येक) आईरिस कैंची का उपयोग कर, बाद में मिडलाइन से विस्तार, प्रारंभिक ऊर्ध्वाधर चीरा के शीर्ष पर बनाओ.
    5. पीछे चमड़े के नीचे की वाट खोजने के लिए peritoneal गुहा और पैर से त्वचा को सावधानी से वापस छील करने के लिए बलप्स का उपयोग करें, जो त्वचा के साथ जुड़े रहना चाहिए। WAT के पूर्ण चीरा को कम करने के लिए विच्छेदन पिन के साथ फैला हुआ त्वचा को सुरक्षित करें।
      नोट: हालांकि पीछे चमड़े के नीचे वाट निरंतर प्रतीत होता है, यह वास्तव में तीन असतत डिपो के शामिल है: डोर्सोलमबार, वंवाहिक, और gluteal1. डोर्सोलमबार डिपो काठ की रीढ़ से हिंदलिम्ब के आधार तक फैली हुई है। त्रिकोणीय वंपल डिपो कमर के पार hindlimb ventrally के आधार से फैली हुई है और एक प्रमुख लिम्फ नोड शामिल हैं। ग्लूटल डिपो कमर के आधार से हीनता से फैली हुई है और पैर के चारों ओर पूंछ के आधार पर लपेटता है।

3. विसरल एडिपोज डिपो की पहचान और अलगाव (गोनाडाल, पेरिनेनल, रेट्रोपेरिटोनियल, ओमेंटल, पेरिकार्डियल)

  1. पहचान और अलग-थलग करना अंतरंग वाट डिपो
    नोट: वाट डिपो, जो मोटे तौर पर वक्ष और peritoneal गुहाओं के भीतर निहित हैं, एक सुपाच्य स्थिति में माउस रखना. विच्छेदन पिन के साथ विच्छेदन पैन करने के लिए ऊपरी और निचले अंगों को सुरक्षित।
    1. स्टर्नम के आधार पर पतली peritoneal गुहा दीवार को उठाने और आईरिस कैंची का उपयोग कर एक छोटे से कटौती (1 मिमी) बनाने के लिए बलप्स का प्रयोग करें।
    2. कट में आईरिस कैंची के एक ब्लेड डालें और एक अवरोही ऊर्ध्वाधर चीरा (4-5 सेमी) peritoneal गुहा के शीर्ष से ( स्टर्नम के आधार) मलाशय के लिए.
    3. आईरिस कैंची के साथ दो क्षैतिज चीरों (1 सेमी प्रत्येक) बनाओ, बाद में मिडलाइन से विस्तार, ऊर्ध्वाधर चीरा के ऊपर और नीचे.
    4. पेरिटोनम को वापस छील करने और पेट की गुहा की सामग्री को उजागर करने के लिए बलप्स का उपयोग करें। फैलाव पैन में फैला हुआ पेरिटोनम पिन करें।
  2. पहचान और अलग-थलग करना छ ओनाडाल वाई.डब्ल्यू.ए
    नोट: गोनाडल वाट महिलाओं में गर्भाशय और अंडाशय (ओवेरियन या पैरामेटिक) और पुरुषों में एपिडिडिमिस और टेस्ट (एपिडिडियल) को घेरे हुए हैं। डिम्बग्रंथि WAT अंडाशय, गर्भाशय, और मूत्राशय के चारों ओर. मोटापे से ग्रस्त जानवरों में, गोनाडल और पेरिनेनल वाट इस मामले में निरंतर दिखाई दे सकते हैं - गर्भाशय सींग और अंडाशय पर डिपो को अलग कर सकते हैं। एपिडिडमधील वाट एपिडिडिमिस, टेस्टेस, और प्रमुख एपिडिडमधील रक्त वाहिका से बंधे पाया जाता है।
    1. गोनाड्स (परीक्षण या अंडाशय) का पता लगाएँ और संबद्ध गोनाडल वॉट को उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
    2. गोनाड्स से वॉट को सावधानीपूर्वक उत्पादित करने के लिए आईरिस कैंची का प्रयोग करें।
  3. पहचान और अलग-थलग करना पी erirenal वाई.डब्ल्यू.ए
    नोट: पेरिनेल वाट गुर्दे द्विपक्षीय रूप से चारों ओर से घेरे हुए है। मोटापे से ग्रस्त जानवरों में, इस डिपो गर्भाशय सींग और अंडाशय के शीर्ष करने के लिए अवर विस्तार करने के लिए प्रकट कर सकते हैं। यद्यपि परिपरक वाट को परंपरागत रूप से अंतरंग डिपोकेरूप में वर्गीकृत किया गया है , कई समूहों ने इसे वंश अनुरेखण और रेडियो लेबल वाले ग्लूकोज अपटेक अध्ययन8,9 के आधार पर भूरे रंग के डिपो के रूप में पहचानाहै, 20.हिस्टोलॉजिकल रूप से इसमें सफेद और भूरे रंग के एडिपोसाइट्स का मिश्रण होता है।
    1. पेरिनल डिपो को उत्पादित करने के लिए, गुर्दे का पता लगाने और उसे उठाने के लिए बलप्स का उपयोग करें और इसे मिडलाइन खींचकर पेरिनल और रेट्रोपेरिटोनल डिपो के बीच एक स्पष्ट विभाजन देखने के लिए।
    2. सीधे गुर्दे के साथ जुड़े WAT उत्पाद निकालना. सुनिश्चित करें कि अधिवृक्क ग्रंथियों, गुर्दे के ऊपर स्थित, WAT से हटा रहे हैं.
  4. पहचान और अलग-थलग करना त एट्रोपेरिटोनियल वाई.डब्ल्यू.ए
    नोट: Retroperitoneal WAT एक पैराकशेरुक स्थिति में स्थित है, पीछे पेट की दीवार और रीढ़ की हड्डी के बीच सीमा के साथ.
    1. इस डिपो को उत्पादित करने के लिए, गुर्दे को ऊपर और मिडलाइन की ओर उठाने के लिए बलप्स का उपयोग करें ताकि स्पष्ट रूप से पेरिनल और रेट्रोपेरिटोनल डिपो के बीच की सीमा को देखा जा सके।
      नोट: मोटापे से ग्रस्त जानवरों में, इस सीमा की पहचान चुनौतीपूर्ण हो सकता है.
    2. फिर, आईरिस कैंची का उपयोग करने के लिए ध्यान से पीछे peritoneal दीवार से retroperitoneal WAT विच्छेदन.
  5. omental WAT की पहचान करना और अलग-थलग करना
    नोट: Omental WAT पेट की अधिक वक्रता के साथ स्थित है. हालांकि omental वसा मनुष्यों में एक महत्वपूर्ण डिपो है, यह आम तौर पर केवल morbidly मोटापे से ग्रस्त चूहों में मौजूद है.
    1. आंत omental WAT की पहचान करने के लिए, पेट ऊपर उठाने के लिए forceps का उपयोग करें. पेट की अवर सीमा पर संबद्ध वसा ऊतक को हटाने के लिए आईरिस कैंची का प्रयोग करें। अग्न्याशय के साथ omental WAT भ्रमित मत करो.
  6. मेसेंटेरिक की पहचान करना और अलग-थलग करना वाई.डब्ल्यू.ए
    नोट: Mesenteric WAT एक वेब की तरह संरचना के आसपास है और छोटे और बड़े आंतों के साथ जुड़े.
    1. इस डिपो को उत्पादित करने के लिए, पेट और मलाशय के आधार पर काटने से पाचन तंत्र के बाकी हिस्सों से आंतों को हटा दें। आंतों को आंतों को आंतों को बाहर निकालने और उन्हें जानने के लिए संदंश का उपयोग करें।
    2. आईरिस कैंची का प्रयोग करें ध्यान से आंतों से दूर mesenteric वाट विच्छेदन, ग्रहणी पर शुरू करने और बृहदान्त्र के अंत करने के लिए जारी रखने के लिए। ध्यान से लिम्फ नोड्स है कि बारीकी से mesenteric डिपो के साथ जुड़े रहे हैं हटा दें।
  7. हृदयावरणी वाट की पहचान और अलग-थलग करना
    नोट: हृदयावरणी वाट आंत पेरिकार्डियम के बाहर और पार्श्विक परिकार्डियम की बाहरी सतह पर स्थित होती है,जो प्रायः हृदय के निम्न पक्ष के साथ होती है।
    1. वक्ष गुहा तक पहुँच प्राप्त करने के लिए, माउस को एक सुपाच्य स्थिति में रखें। विच्छेदन पिन के साथ विच्छेदन पैन करने के लिए ऊपरी और निचले अंगों को सुरक्षित।
    2. जाइफोइड प्रक्रिया (स्टर्नम के आधार पर उपास्थि) को उठाने के लिए बलकाओं का उपयोग करें और वक्ष गुहा दीवार में एक छोटा (1 मिमी) कटौती करें।
    3. कट में आईरिस कैंची के एक ब्लेड डालें और दो क्षैतिज चीरों (1 सेमी प्रत्येक) स्टर्नम के आधार से बाद में विस्तार करते हैं। यह वक्ष गुहा के डायाफ्राम और निम्न सीमा का पर्दाफाश करेगा।
    4. रिबकेज के माध्यम से दो आरोही ऊर्ध्वाधर चीरों (3-4 सेमी) बनाने के लिए कैंची का विच्छेदन का उपयोग करें, जो वक्ष गुहा की पार्श्व सीमाओं से क्लैविकल तक बेहतर ढंग से विस्तार करते हैं।
    5. रिबकेज के अधर आधे को उठाने के लिए बलकाउपयोग करें। रिबकेज को हटाने और वक्ष गुहा की सामग्री को उजागर करने के लिए क्लैविकल की अवर लंबाई के साथ अंतिम कट (2 सेमी) बनाने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें।
    6. यदि उपस्थित हो, तो हृदयावरणीय वसा को पेरिकार्डियम की बाहरी सतह से सावधानीपूर्वक काट लें।

4. पहचान और अन्य वसा डिपो के अलगाव

  1. epicardial WAT की पहचान करना और अलग करना
    नोट: एपिकार्डियल वाट आंत pericardium के भीतर निहित है और सीधे मायोकार्डियम की सतह के साथ जुड़ा हुआ है.
    1. यदि उपस्थित हो, तो अधिकार्डियल एडिपोसाइट्स को 24 ज के लिए 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन में परिक्षाकृत हृदय के पृथक्करण और निर्धारण के बाद हिस्टोलॉजिकल रूप से देखा जा सकता है।
  2. पहचान और अलग-थलग करना पी ऑपलाइटी वाई.डब्ल्यू.ए
    नोट: Popliteal WAT पीछे घुटने में popliteal खात में स्थित है और एक बड़े लिम्फ नोड शामिल हैं. यह डिपो आमतौर पर युवा जानवरों में दिखाई नहीं देता है।
    1. पॉपलाइटियल वॉट को अलग करने के लिए, पिछले अंग के आधार से पैर तक त्वचा को सावधानी से हटाने के लिए आईरिस कैंची का उपयोग करें।
    2. विच्छेदन पैन के खिलाफ पेटला रखें और पैर में एक पिन के साथ फैला पैर सुरक्षित. सुनिश्चित करें कि घुटने के पीछे popliteal खात ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है.
    3. गैस्ट्रोकेमियस मांसपेशियों के मध्यस्थ और पार्श्व सिर की अवर सीमा पर कटौती करने के लिए आईरिस कैंची का प्रयोग करें। मांसपेशियों को उठाने और त्रिकोणीय पॉपलाइटल डिपो को प्रकट करने के लिए बलप्स का उपयोग करें।
    4. प्राकृतिक ऊतक सीमाओं के साथ डिपो को उत्पादित करने के लिए आईरिस कैंची का प्रयोग करें।
  3. dermal WAT की पहचान करना और अलग करना
    नोट: डर्मल वाट एक पतली परत है जो रेटिक्युलर डर्मिस और पैनिक्युलस कार्नोसस मांसपेशी परत के बीच स्थित होती है।
    1. हिस्टोलॉजिकल तरीकों से त्वचा एडिपोसाइट्स की पहचान करने के लिए, माउस को उसके पेट पर प्रवण स्थिति में रखें। विच्छेदन पिन के साथ ऊपरी और निचले अंगों को सुरक्षित करने के बाद, त्वचा गीला करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस की बाहरी सतह स्प्रे।
    2. माउस के पीछे त्वचा के एक वर्ग भाग से गीला फर को हटाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
    3. त्वचा के मुंडा हिस्से को सावधानी से उत्पादित करने के लिए आईरिस कैंची का उपयोग करें, जिसमें रेटिक्युलर चर्कांकित, चर्ममय वाट, पैनिक्युलस कार्नोसस, और कुछ चमड़े के नीचे की वाट शामिल होंगे।
    4. एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए पतली ऊर्ध्वाधर स्ट्रिप्स में excised त्वचा में कटौती.
    5. चिपचिपा subcutaneous वाट परत नीचे का सामना करना पड़ के साथ पतली ऊर्ध्वाधर स्ट्रिप्स स्थिति.
    6. एक छोर पर शुरू, खुद पर पट्टी रोल करने के लिए एक सर्पिल फार्म. सर्पिल के बाहर चिपचिपा subcutaneous वाट परत रोल निर्धारण के दौरान अपने आकार को बनाए रखने के लिए अनुमति देगा.
    7. विस्तरण को 24 कूप प्लेट के कुएं में रखें जिसमें हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग22से पहले 24 ज के लिए 10% न्यूट्रल बफर्ड फॉर्मेलिन है .
  4. अंतरपेशीय वाट की पहचान करना और अलग करना
    नोट: अंतरपेशीय वाट मोटे तौर पर मांसपेशियों की गहरी फासिया के नीचे स्थित एडिपोसाइट्स के रूप में परिभाषित किया गया है। इस शब्द में कंकाल की मांसपेशी के मांसपेशी फाइबर के बीच इंटरस्पेयड एडपोसाइट्स शामिल हैं, जिसे इंट्रामस्क्युलर वॉट के रूप में भी जाना जाता है, और मांसपेशियों के भीतर स्थित एडिपोसाइट्स खुद को बंडल करता है। वाइल्डटाइप चूहों में आम तौर पर बड़ी संख्या में अंतरपेशीय एडिपोसाइट्स नहीं होते हैं। हालांकि, यह कुछ शर्तों के तहत संभव है हिस्टोलॉजिकल तरीकों से intermuscular WAT की पहचान करने के लिए. कुछ शर्तों के तहत, intermuscular adipocytes भी चिकनी मांसपेशियों में पाया जा सकता है, जैसे डायाफ्राम के रूप में.
    1. tibialis पूर्वकाल को अलग करने के लिए (टीए) मांसपेशियों, उदाहरण के लिए, माउस एक supine स्थिति में अपनी पीठ पर जगह है और विच्छेदन पिन का उपयोग कर विच्छेदन पैन के लिए निचले अंगों को सुरक्षित. फर के साथ संदूषण को कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ त्वचा गीला।
    2. ध्यान से पैर से त्वचा को हटाने के लिए आईरिस कैंची का प्रयोग करें और क्वारीसेप्स मांसपेशी समूह का पर्दाफाश, फीमर शाफ्ट पर घुटने के ऊपर स्थित है, और टीए टिबिया के अधर सतह पर घुटने के नीचे स्थित है।
      नोट: टीए टिबिया के निकट के अंत के पास मोटी है और दूर के छोर के पास अधिक tendinous.
    3. मांसपेशी के एक टुकड़े को उत्पादित करने के लिए आईरिस कैंची का प्रयोग करें और हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग22से पहले 24 ज के लिए 10% तटस्थ बफरफॉर्मिन में ठीक करें .
  5. अंतर-कलाकृत वाट डिपो की पहचान करना और अलग करना
    नोट: अंतर-कलायल वाट डिपो सिनोवियल जोड़ों के भीतर स्थित हैं।
    1. इन्फ्रापेटलर WAT की पहचान करने के लिए, उदाहरण के लिए, हिस्टोलॉजिकल तरीकों से, BMAT अनुभाग में विस्तृत रूप में फसल पैर की हड्डियों।
    2. फीमर-टिबियल कॉम्प्लेक्स को हटाने के बाद, संभव के रूप में ज्यादा मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को हटाने के लिए आईरिस कैंची और धुंध पैड का उपयोग करें। टिबिओफेमोरल जोड़ को न तोड़ें।
    3. decalcification और हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग से पहले 24 h के लिए 10% तटस्थ बफर फॉर्मलिन में फीमर-टिबियल परिसर को ठीक करें (नीचे वर्णित, चरण 4.6.8)।
  6. अस्थि मज्जा वसा ऊतक की पहचान और अलग-थलग करना
    नोट: अस्थि मज्जा वसा ऊतक (BMAT) हड्डियों के भीतर निहित है, hematopoietic कोशिकाओं के साथ interspersed. परमाणु, BMAT संरचक के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है (जिला टिबिया और पुच्छ कशेरुकी) या विनियमित (मध्य से proximaal टिबिया, femur, और काठ का कशेरुकी)10,11. आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए अस्थि मज्जा adipocytes के स्वच्छ अलगाव चूहों में चुनौतीपूर्ण है. हालांकि, माउस हड्डियों आसानी से काटा जा सकता है, तय, decalcified और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए पैराफिन-एम्बेडेड.
    1. उदाहरण के लिए, पैर की हड्डियों को काटने के लिए, पहले माउस से पैरों को हटा दें। एकेस्टोबुलोफेमोरल जोड़ को काटने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें, ऊरु सिर को बरकरार रखते हुए।
    2. ध्यान से पैर से त्वचा को हटाने के लिए आईरिस कैंची का प्रयोग करें, पैर की मांसपेशियों को खुलासा.
    3. ध्यान से आइरिस कैंची और धुंध पैड का उपयोग कर फीमर और टिबिया से मुख्य मांसपेशियों को दूर।
    4. जब फीमर उजागर होता है, श्रोणि और फीमर की अभिव्यक्ति के लिए हड्डी के किनारे का पालन करें और ध्यान से acetabulofemoral संयुक्त से ऊरु सिर जारी. फीमर से किसी भी शेष ऊतक को साफ करने के लिए धुंध का उपयोग करें।
    5. टखने के जोड़ के लिए टिबिया की सीमा का पालन करें। ध्यान से मध्य malleolus, tibia की नोक पर स्थित, टखने के संयुक्त से जारी.
    6. एक बार फीमर-टिबियल कॉम्प्लेक्स को अलग कर दिया गया है, आईरिस कैंची और /या धुंध का उपयोग करके जितना संभव हो उतना मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को हटा दें।
    7. टिबिओफेमोरल जोड़ में आईरिस कैंची के एक ब्लेड को डालने से फीमर से टिबिया को अलग करें और धीरे से मध्यस्थ और पार्श्व संपार्श्विक स्नायुबंधन और पूर्वकाल और पीछे के क्रूसिएट लिगामेंट के माध्यम से काट लें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि टिबिया बरकरार रहे, घुटने के जोड़ के कैप्सूल को न निकालें। टिबिया से किसी भी शेष ऊतक को साफ करने के लिए धुंध का प्रयोग करें।
    8. कमरे के तापमान पर 24 एच के लिए 10% तटस्थ बफर फॉर्मलिन में हड्डियों को ठीक करें और फिर भविष्य की जरूरतों के अनुसार धोने और स्टोर करें।
      1. माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी (जेडसीटी) का उपयोग करके हड्डियों के पैरामीटरों का विश्लेषण करने के लिए, सोरेनसेन के फॉस्फेट बफर, पीएच 7-423में हड्डियों की दुकान करें।
      2. BMAT परिमाणीकरण और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए, 10-14 दिनों के लिए 14% EDTA, पीएच 7.4, में हड्डियों decalcify.
      3. decalcification के बाद, Osmium tetroxide धुंधला और $CT विश्लेषण का उपयोग करने के लिए BMAT24मात्रा . अन्यथा, प्रक्रिया और ऊतक विज्ञान23के लिए पैराफिन-एम्बेड हड्डियों |

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Representative Results

विभिन्न माउस वसा डिपो की सफल पहचान और अलगाव ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। अधत्वकात् (ए, ई-एफ), ब्राउन (बी), अंतरंग (सी, डी, जी-जे) के सकल शारीरिक स्थानों और पॉपलाइटल (के) डिपो चित्र 2में दिखाए गए हैं।

Figure 2
चित्र 2: माउस वसा डिपो के सकल शारीरिक स्थानों. (a) पूर्वकाल के अधस्त्वक् , (बी) भूरे, (सी) एपिडिडमल (बी, मूत्राशय), (डी) डिम्बग्रंथि (यू , गर्भाशय सींग ), (ई) पीछे के अध:स्त्वीय (द) (d), inguinal (i), ग्लूटिल (g ) (F) वंफला , (जी) मध्यंतरी , (एच) पेरिनेल (k, kidney ), (i ) retroperitoneal (k, kidney ), (J) पेरिकार्डियल (ज , दिल ), और (k) C57BL/6J वयस्क चूहों में popliteal वसा डिपो. तीर विशिष्ट डिपो को इंगित करते हैं यदि कई डिपो चित्रित किए जाते हैं। प्रासंगिक अंगों उचित पत्र द्वारा नामित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अधत्वकात्से (ए-डी), भूरे (ई), आंत (एफ-के), पॉपलाइटल (एल), संरचक (एम) और विनियमित मज्जा वसा (एन), इंट्रामस्क्युलर (ओ), और इन्फ्रापेटेलर (पी) वसा डिपो के ऊतकालॉजिकल विशेषताओं का मूल्यांकन हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) द्वारा किया गया था। दाग22 और चित्र 3में दिखाए गए हैं।

Figure 3
चित्र 3: विविक्त माउस वसा डिपो का ऊतकीय मूल्यांकन। (ए) पूर्वकाल के अधत्वक , (बी) डोर्सोलुम्बर , (सी) अधिवक् ता , (डी) ग्लूटल , (ई) भूरे रंग का , (एफ) गोनाडाल , (जी) परीरीनल , (एच) प्रतिपरिछिद्र , ( मैं ) (( I) omental , ( ( जे) मध्याक्षरी , (के) परिहृदयीय , (एल) पोपलाइटियल , (एम) गठन और (छ) विनियमित अस्थि मज्जा वसा , (हे) अंतरपेशीय , और (पी) भ्रातृपटेलर डिपो में C57BL/ ऊतक दिए गए प्रोटोकॉल के अनुसार अलग-अलग थे, 10% तटस्थ बफर फॉर्मलिन में रात भर तय, संसाधित, और पैराफिन में एम्बेडेड। 5 डिग्री वर्गों एच एंड ई के साथ दाग थे। अधिकांश छवियों 100x आवर्धन पर लिया गया; स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

के रूप में असतत adipocyte समूहों के विविध आणविक और कार्यात्मक विशेषताओं के महत्व को तेजी से मान्यता प्राप्त है, यह महत्वपूर्ण है कि क्षेत्र के भीतर जांचकर्ताओं समान रूप से पहचान और आगे विश्लेषण के लिए उत्पाद वसा डिपो. तारीख करने के लिए, कुछ प्रोटोकॉल मानकीकृत स्थानीयकरण और माउस वसा डिपो की विस्तृत श्रृंखला के अलगाव के लिए मौजूद हैं. पहले प्रकाशित विधियाँ मुख्य रूप से एक या दो डिपो पर केंद्रित होती हैं और विभिन्न अन्वेषकों द्वारा एक समान पहचान और चीरा के लिए आवश्यक विवरण ों की कमीहोती है 18,19. यह पांडुलिपि वसा जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक उपन्यास और महत्वपूर्ण योगदान है क्योंकि यह एक में गहराई से एक परमाणु स्थान और माउस भर में आमतौर पर अध्ययन किया और कम ज्ञात डिपो के सटीक विच्छेदन के लिए मार्गदर्शन प्रदान करता है. सकल शारीरिक स्थान और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए adipocyte niches की विविधता का प्रदर्शन प्रदान की जाती हैं.

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर असतत वसा डिपो के सफल अलगाव कई महत्वपूर्ण कदम पर निर्भर है. एक स्वच्छ विच्छेदन पर्यावरण का रखरखाव महत्वपूर्ण है; 70% इथेनॉल विच्छेदन ट्रे और उपकरणों से बालों या रक्त contaminating को दूर करने के लिए आवश्यक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. जब पीछे चमड़े के नीचे WAT विरूपित, यह जरूरी है कि त्वचा में प्रारंभिक चीरा बारीकी से जुड़े peritoneal गुहा घुसना इतना है कि दो परतों कुशलता से WAT बेनकाब करने के लिए अलग किया जा सकता है. इसी तरह, जब पेट की गुहा की सामग्री को उजागर करने के लिए peritoneal दीवार के माध्यम से काटने, चीरों पाचन तत्वों के साथ संदूषण को रोकने के लिए अंतर्निहित आंतों perforate नहीं करना चाहिए। इंटरस्केपुलर बैट को वॉट संदूषण को रोकने के लिए आसपास के ऊतकों से सावधानी से निकाला जाना चाहिए, जो भविष्य के विश्लेषण को तिरछा करेगा। पीछे के उपत्वचा डोर्सोलमबार, वंक्षण, और gluteal डिपो की लगातार पहचान प्रोटोकॉल में वर्णित सटीक शारीरिक स्थलों के उपयोग पर निर्भर करता है। इन डिपो के बीच अंतर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है; हालांकि डिपो निरंतर प्रतीत हो सकते हैं, केंद्रीय रूप से स्थित अधिवक् ता एडिपोसाइट्स अपने आसपास के समकक्षों की तुलना में अधिक आसानी से भूरे रंग की तरह विशेषताओं को प्राप्त करते हैं।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पृथक वसा ऊतकों का विभिन्न प्रकार की तकनीकों का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है। हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन (जैसे एच एंड ई धुंधला, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री) के अलावा, वसा ऊतकों आणविक विश्लेषण की एक विस्तृत सरणी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, posttranslational प्रोटीन संशोधनों के माध्यम से प्रतिलेखन के विनियमन से. अलग-अलग डिपो के भीतर एडिपोसाइट्स और स्ट्रॉमल संवहनी कोशिकाओं को कोलाजनेस पाचन और अंतर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा अलग किया जा सकता है। इन अंशों तो आणविक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, चयापचय, और सेल संस्कृति के अध्ययन. डिपो एक्सप्लांट्स का उपयोग पूर्व विवो चयापचय और एंजाइमी परख के लिए भी किया जा सकता है।

माउस वसा ऊतकों के अलगाव और चीरा के दौरान कई चुनौतियां और सीमाएं उत्पन्न होती हैं। सबसे पहले, कुछ डिपो है कि शारीरिक रूप से मनुष्यों में महत्वपूर्ण हैं आमतौर पर दुबला, वयस्क चूहों में मौजूद नहीं हैं. उदाहरण के लिए, omental WAT, जो मनुष्यों में प्रमुख आंत डिपो है, केवल आनुवंशिक रूप से या आहार प्रेरित मोटापे से ग्रस्त चूहों में देखा जा सकता है. तथापि, कुछ डिपो का विस्तार पोषण संबंधी चुनौतियों या औषध उपचारों से प्रेरित हो सकता है। उदाहरण के लिए, उच्च वसा वाले आहार खिला omental और हृदयीय वाट के विस्तार का कारण बन सकता है. अंतरपेशीय वाट कंकाल की मांसपेशी चोट25,26 या उच्च वसा वाले आहार27द्वारा प्रेरित किया जा सकता है . विनियमित BMAT उच्च वसा वाले आहार, कैलोरी प्रतिबंध और thiazolidinedione उपचार11,28सहित विभिन्न चुनौतियों के जवाब में फैलता है. दूसरा, चूहों के छोटे आकार के कारण, आणविक या चयापचय विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूना प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है. उदाहरण के लिए, बाद के विश्लेषण के लिए पर्याप्त शुद्ध अस्थि मज्जा adipocytes के अलगाव चुनौतीपूर्ण है, यहां तक कि कई चूहों से हड्डियों पूलिंग के बाद. तीसरा, कुछ डिपो की सीमाओं को सही ढंग से परिभाषित करना मुश्किल हो सकता है। उदाहरण के लिए, पश्च अधस्त्वक् वाट एक सतत डिपो प्रतीत होता है, लेकिन वास्तव में असतत डोर्सोलमबार, वंकुलीय, और ग्लूटियल डिपो शामिल है। इसके अतिरिक्त, पेरिनेल बहुत मोटापे से ग्रस्त जानवरों में गोनाडल और रेट्रोपेरिटोनल डिपो दोनों के लिए जुड़े हुए प्रतीत हो सकता है। आसन्न डिपो के बीच अलग सीमाओं की कमी इन ऊतकों को साफ अलगाव चुनौतीपूर्ण बना सकती है। हालांकि, इस विच्छेदन प्रोटोकॉल माउस वसा डिपो की एक विस्तृत श्रृंखला के सटीक और reproduible विच्छेदन के लिए एक विस्तृत एटलस और कदम दर कदम मार्गदर्शन के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है. ऊपर वर्णित असतत माउस वसा डिपो की पहचान और अलगाव के फील्ड-वाइड मानकीकरण निस्संदेह विकास, जीन अभिव्यक्ति, और पहले के स्थानीय और प्रणालीगत कार्यों में अंतर को स्पष्ट करने में मदद करेगा अल्पअध्ययनित आणि कोशिका आला.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

O.A.M. NIH अनुदान DK062876 और DK092759 द्वारा समर्थित है; D.P.B. मिशिगन चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम के विश्वविद्यालय (T32GM007863), Organogenesis में मिशिगन प्रशिक्षण कार्यक्रम के विश्वविद्यालय (T32HD007605), मिशिगन Rackham मेरिट फैलोशिप विश्वविद्यालय, और Tylenol भविष्य की देखभाल फैलोशिप द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Fisher Scientific 22-110-869
24-well plates, untreated Sigma-Aldrich CLS3738
70% ethanol (dilute from 95%) Fisher Scientific 04-355-226
Dissecting forceps with curved tips VWR 89259-946
Dissecting pan Carolina Biological Supply Company 629004
Dissecting scissors (sharp/blunt tip) VWR 82027-588
Gauze sponges Vitality Medical 2634 Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply
Handi-Pins for dissection Carolina Biological Supply Company 629132
Iris scissors (straight) VWR 470018-890
Isoflurane VetOne 501017
Scalpel VWR 100499-578 Feather scalpel handle with blade, disposable

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References

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जीव विज्ञान अंक 149 Adipocyte विच्छेदन subcutaneous वसा ऊतक आंत वसा ऊतक सफेद वसा ऊतक (WAT) भूरे रंग के वसा ऊतक (बैट) अस्थि मज्जा वसा ऊतक (BMAT)
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Bagchi, D. P., MacDougald, O. A.… More

Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. J. Vis. Exp. (149), e59499, doi:10.3791/59499 (2019).

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