Summary
Les adipocytes existent dans des dépôts discrets et ont des rôles divers au sein de leurs microenvironnements uniques. Comme les différences régionales dans le caractère et la fonction des adipocytes sont découvertes, l'identification normalisée et l'isolement des dépôts sont cruciaux pour l'avancement du champ. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l'excision de divers dépôts adipeux de souris.
Abstract
Les tissus adipeux sont des organes complexes avec un large éventail de fonctions, y compris le stockage et la mobilisation de l'énergie en réponse aux besoins locaux et mondiaux, le découplage du métabolisme pour générer de la chaleur, et la sécrétion d'adipokines pour réguler l'homéostasie du corps entier et réponses immunitaires. La recherche émergente identifie les différences régionales importantes dans les profils développementaux, moléculaires et fonctionnels des adipocytes situés dans des dépôts discrets dans tout le corps. Différentes propriétés des dépôts sont médicalement pertinentes puisque les maladies métaboliques démontrent souvent des effets spécifiques au dépôt. Ce protocole fournira aux chercheurs un atlas anatomique détaillé et un guide de dissection pour l'identification et l'excision reproductibles et précises de divers tissus adipeux de souris. La dissection normalisée des dépôts adipeux discrets permettra des comparaisons détaillées de leurs caractéristiques moléculaires et métaboliques et de leurs contributions aux états pathologiques locaux et systémiques dans diverses conditions nutritionnelles et environnementales.
Introduction
Les tissus adipeux jouent un rôle critique dans l'homéostasie du corps entier, y compris le stockage et la libération d'énergie en réponse aux besoins locaux et mondiaux, la thermorégulation et la sécrétion d'adipokines pour réguler l'équilibre énergétique, le métabolisme et les réponses immunitaires1 , 2. Les adipocytes sont distribués dans tout le corps dans des dépôts discrets, et dans certains cas servent des rôles spécialisés dans leurs microenvironnements3,4,5. Historiquement, l'étude du tissu adipeux a centré sur le tissu adipeux blanc (WAT), et son rôle dans le maintien de l'homéostasie de l'énergie. La plupart des adipocytes sont répartis dans tout le corps dans des dépôts WAT sous-cutanés et viscéraux. Les caractéristiques de ces dépôts sont importantes pour la susceptibilité différentielle aux maladies métaboliques. Les adipocytes sous-cutanés, situés sous la peau,ont été associés aux effets métaboliques protecteurs 5. Les adipocytes viscéraux, qui entourent les organes vitaux et sont contenus dans les dépôts gonadiques, périrénaux, rétropéritonés, omentaux et péricardiques, sont généralement liés à des troubles métaboliques, y compris le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires2 . Les tissus adipeux bruns (BAT) ont également été étudiés en profondeur. Les adipocytes bruns et bruns expriment le découplage des protéines 1 (UCP1) et jouent un rôle important dans la thermogenèse adaptative et l'homéostasie du glucose6,7. Les adipocytes bruns classiques sont contenus dans le dépôt interscapulaire bat8. Des grappes d'adipocytes bruns se trouvent également dans d'autres endroits, y compris les dépôts supraclavaires, infra/subscapulaires, cervicaux, paravertébraux et périaortiques8,9.
En plus de leur emplacement dans les principaux dépôts WAT et BAT, les adipocytes existent dans des niches discrètes dans tout le corps4, où ils peuvent effectuer des fonctions spécialisées dans leurs microenvironnements respectifs. Par exemple, le tissu adipeux de moelle osseuse (BMAT) sert de réservoir lipidique, est une source importante d'adiponectin circulant, et interagit étroitement avec les ostéoblastes, les ostéoclastes et les cellules hématopoïétiques10,11. Les adipocytes dermiques contribuent aux processus répandus, y compris la cicatrisation des plaies, la réponse immunitaire, la thermorégulation et la croissance du follicule pileux12,13. En outre, les adipocytes épicardiaux peuvent produire plusieurs adipokines et chemokines qui exercent des effets locaux et systémiques sur le développement et la progression de la maladie coronarienne14. L'expansion du WAT inter/intramusculaire a été positivement corrélée avec l'adiposity accru, la résistance systémique d'insuline, et la force musculaire et la mobilité diminuées15. En outre, les adipocytes popliteal servent de réservoir lipidique pour l'expansion lymphatique pendant l'infection16. Alors que les rôles spécifiques des différents dépôts articulaires sont généralement inconnus, le dépôt de Hoffa (infrapatellar) dans le genou est maintenant pensé pour contribuer à des pathologies, y compris la douleur antérieure du genou et l'arthrose17.
Alors que les différences régionales dans le caractère et la fonction des adipocytes font l'objet d'études approfondies, le champ est actuellement limité par l'absence d'un protocole normalisé pour l'identification et la dissection de divers dépôts de souris. Les méthodes publiées antérieurement ont généralement décrit l'isolement d'un ou deux dépôts spécifiques et n'ont pas le niveau de détail requis pour l'excision uniforme18,19. Le protocole décrit dans ce manuscrit fournit un guide complet pour les emplacements anatomiques spécifiques et les étapes d'isolement de nombreux dépôts adipeux de souris différents. Bien que les dépôts wat soient au centre de ce manuscrit, l'excision de la BAT interscapulaire est également décrite en détail. Les tissus adipeux excisés à l'aide de ce protocole peuvent être utilisés pour une grande variété de critères d'évaluation expérimentaux, y compris des études d'explantation, l'histologie et des analyses d'expression génique.
L'objectif de ce manuscrit est de fournir aux enquêteurs un protocole détaillé pour identifier et isoler clairement et précisément les dépôts adipeux de souris en vue et moins étudiés (figure 1). Cette ressource facilitera une étude plus complète des caractéristiques développementales, moléculaires et fonctionnelles des adipocytes dans diverses niches.
Figure 1 : Représentation schématique des dépôts adipeux de souris disséqués dans ce protocole. Cette image a été adaptée de Bagchi et al., 20184. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Protocol
Toutes les procédures animales sont effectuées avec l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Michigan.
1. Euthanisation
REMARQUE: Aux fins de ce protocole vidéo, des souris C57BL/6J de 4 à 6 mois sont utilisées.
- Placez la souris dans une chambre de vaporisateur d'isoflurane et ajustez le débit d'isoflurane à 5% ou plus. Poursuivre l'exposition à l'isoflurane jusqu'à une minute après l'arrêt de la respiration. Retirez ensuite la souris de la chambre de vaporisateur et confirmez l'euthanasie à l'aide d'une mesure secondaire approuvée.
REMARQUE: Les mesures secondaires approuvées varient selon le protocole de l'établissement et du protocole animal et peuvent inclure la dislocation ou la décapitation cervicale. - Placez la souris euthanasiée sur la casserole de dissection. Stériliser les surfaces externes dorsales et ventrales de la souris à l'aide de 70 % d'éthanol. Assurez-vous que la surface externe de la souris est suffisamment humide pour minimiser la contamination par la fourrure pendant la dissection.
2. Identification et isolement des principaux dépôts d'adipose subcutanées (sous-cutané antérieurs, Dorsolumbar, Inguinal, Gluteal) et Interscapular Brown Aadipose Tissue
- Identifier et isoler les sous-cutanés antérieurs Wat (en)
REMARQUE: Wat sous-cutané antérieur est situé entre les omoplates, descendant de la nuque au cou aux axillae de la souris7. Ce dépôt a alternativement été décrit comme suprascapulaire8 ou interscapulaire20 WAT et se trouve directement au-dessus du dépôt interscapulaire BAT.- Pour isoler le dépôt sous-cutané antérieur, poser la souris sur son estomac dans une position encline. Fixer les membres supérieurs et inférieurs à la casserole de dissection avec des goupilles de dissection.
- Utilisez des forceps pour soulever la peau dorsale à la nuque. Utilisez des ciseaux d'iris pour faire une petite (1 mm) coupée dans la peau.
- Insérez une lame des ciseaux d'iris dans la coupe initiale et faites une incision verticale de milieu de ligne (2-3 cm) par la peau, commençant à la nuque et descendant le long de la colonne vertébrale jusqu'au milieu du dos.
- Faire deux incisions horizontales (1 cm chacune) à l'aide des ciseaux à l'iris, s'étendant latéralement à partir de la ligne médiane, en haut et en bas de l'incision verticale initiale.
- Utilisez des forceps pour peler soigneusement la peau et exposer le dépôt sous-cutané antérieur.
- Utilisez des ciseaux d'iris pour enlever le dépôt en suivant les bordures naturelles du tissu.
REMARQUE: Cette méthode isole à la fois le WAT sous-cutané antérieur et le BAT interscapulaire. - Placez le dépôt disséqué sur la casserole de dissection et retirez soigneusement le BAT contaminant à l'aide de ciseaux d'iris.
- Identifier et isoler c BAT lassical
REMARQUE: Le BAT classique est situé sous le dépôt sous-cutané antérieur du WAT.- Pour isoler BAT, utilisez des ciseaux à l'iris pour couper horizontalement le long du bord inférieur du tissu sous-cutané antérieur, en suivant la bordure naturelle du dépôt.
- Ensuite, utilisez des ciseaux d'iris pour faire deux incisions verticales le long des bords latéraux du dépôt, en suivant les bordures naturelles du tissu.
- Utilisez des forceps pour retourner soigneusement le dépôt et révéler le BAT interscapulaire en forme de papillon intégré dans le WAT. Disséquez soigneusement le BAT hors du WAT environnant.
- Identifier et isoler sous-cutanée postérieure WAT,
- Poser la souris sur le dos en position de supine.
- Après avoir fixé les membres supérieurs et inférieurs avec des goupilles de dissection, utiliser des forceps pour soulever la peau à la base du sternum et faire une petite (1 mm) couper dans la peau.
- Insérez une lame des ciseaux d'iris dans la coupe initiale et faites une incision de milieu (4-5 cm) à travers la peau, commençant à la base du sternum et descendant à la base de la queue. Faites preuve de prudence lors de cette incision parce que la peau ventrale est très mince et est étroitement associée à la paroi sous-jacente de la cavité péritonéale.
- Faire deux incisions horizontales (1 cm chacune) à l'aide de ciseaux à l'iris, s'étendant latéralement à partir de la ligne médiane, au sommet de l'incision verticale initiale.
- Utilisez des forceps pour peler soigneusement la peau de la cavité péritonéale et de la jambe pour trouver le WAT sous-cutané postérieur, qui devrait rester associé à la peau. Sécurisez la peau tendue avec des goupilles de dissection pour faciliter l'excision complète du WAT.
REMARQUE: Bien que le WAT sous-cutané postérieur semble être continu, il est en fait composé de trois dépôts discrets: dorsolumbar, inguinal, et fessier1. Le dépôt de dorsolumbar s'étend de la colonne lombaire à la base de l'arrière-pays. Le dépôt inguinal triangulaire s'étend de la base de l'arrière-membre ventralement à travers l'aine et contient un ganglion lymphatique proéminent. Le dépôt fessier s'étend de façon inférieure de la base de l'aine et s'enroule autour de la jambe à la base de la queue.
3. Identification et isolement des dépôts adipeux viscéraux (Gonadal, Perirenal, Retroperitoneal, Omental, Pericardial)
- Identifier et isoler dépôts viscérales WAT
REMARQUE: Les dépôts wat, qui sont en grande partie contenus dans les cavités thoraciques et péritonéales, maintiennent la souris en position de supine. Fixer les membres supérieurs et inférieurs à la casserole de dissection avec des goupilles de dissection.- Utilisez des forceps pour soulever la paroi mince de la cavité péritonéale à la base du sternum et faire une petite coupe (1 mm) à l'aide de ciseaux à l'iris.
- Insérez une lame des ciseaux d'iris dans la coupe et faites une incision verticale descendante (4 à 5 cm) du haut de la cavité péritonéale (base du sternum) au rectum.
- Faire deux incisions horizontales (1 cm chacune) avec des ciseaux d'iris, s'étendant latéralement à partir de la ligne médiane, en haut et en bas de l'incision verticale.
- Utilisez des forceps pour éplucher le péritoine et exposer le contenu de la cavité abdominale. Épingler le péritoine tendu à la casserole de dissection.
- Identifier et isoler g (en) onadal (onadal) Wat (en)
REMARQUE: Gonadal WAT entoure l'utérus et les ovaires chez les femelles (ovaire ou paramétrial) et l'épididyme et les testicules chez les mâles (épididymal). Le WAT ovarien entoure les ovaires, l'utérus et la vessie. Chez les animaux obèses, le WAT gonadal et perifluré peut sembler continu — dans ce cas, séparer les dépôts à la corne utérine et aux ovaires. Le WAT épididymal est trouvé lié à l'épididyme, aux testicules, et au vaisseau sanguin épididymal proéminent.- Localiser les gonades (testicules ou ovaires) et utiliser des forceps pour soulever le WAT gonadal associé.
- Utilisez des ciseaux d'iris pour exciser soigneusement le WAT des gonades.
- Identifier et isoler p (en) erirenal Wat (en)
REMARQUE: Perirenal WAT entoure les reins bilatéralement. Chez les animaux obèses, ce dépôt peut sembler s'étendre de façon inférieure au sommet de la corne utérine et des ovaires. Bien que le WAT periré ait traditionnellement été classé comme dépôt viscéral21, plusieurs groupes l'ont identifié comme dépôt brun basé sur le traçage de lignée et les études radiolabeled d'absorption de glucose8,9, 20. Histologiquement il est composé d'un mélange d'adipocytes blancs et bruns.- Pour exciser le dépôt periré, localisez le rein et utilisez des forceps pour le soulever et tirez-le vers le haut pour voir une division claire entre les dépôts perirés et rétropéritonéaux.
- Accise le WAT directement associé aux reins. Assurez-vous que les glandes surrénales, situées au-dessus des reins, sont retirées du WAT.
- Identifier et isoler r (en) etroperitoneal Wat (en)
REMARQUE: Le WAT rétropéritonéen est situé dans une position paravertébralebral, le long de la frontière entre la paroi abdominale postérieure et la moelle épinière.- Pour exciser ce dépôt, utilisez des forceps pour soulever le rein vers le haut et vers la ligne médiane pour voir clairement la frontière entre les dépôts périréens et rétropéritonéaux.
REMARQUE: Chez les animaux obèses, il peut être difficile d'identifier cette frontière. - Ensuite, utilisez des ciseaux d'iris pour disséquer soigneusement le WAT rétropéritonéional de la paroi péritonéale postérieure.
- Pour exciser ce dépôt, utilisez des forceps pour soulever le rein vers le haut et vers la ligne médiane pour voir clairement la frontière entre les dépôts périréens et rétropéritonéaux.
- Identification et isolation de l'omental WAT
REMARQUE: Omental WAT est situé le long de la plus grande courbure de l'estomac. Bien que l'adipose omental soit un dépôt important chez l'homme, il est généralement présent seulement dans les souris morbide obèses.- Pour identifier le WAT mental viscéral, utilisez des forceps pour soulever l'estomac. Utilisez des ciseaux d'iris pour enlever le tissu adipeux associé le long de la bordure inférieure de l'estomac. Ne confondez pas l'omental WAT avec le pancréas.
- Identifier et isoler le mésentérique Wat (en)
REMARQUE: Mesenteric WAT est une structure web-like entourant et associée aux petits et grands intestins.- Pour exciser ce dépôt, retirer les intestins du reste du tube digestif en coupant à la base de l'estomac et du rectum. Utilisez des forceps pour soulever les intestins hors de la cavité viscérale et les démêler.
- Utilisez des ciseaux d'iris pour disséquer soigneusement le WAT mésentérique loin des intestins, en commençant par le duodénum et en continuant jusqu'à la fin du côlon. Enlevez soigneusement les ganglions lymphatiques qui sont étroitement associés au dépôt mésentérique.
- Identifier et isoler le WAT péricardique
REMARQUE: Pericardial WAT est situé à l'extérieur du péricarde viscéral et sur la surface externe du péricarde pariétal, souvent le long de l'aspect inférieur du cœur14.- Pour accéder à la cavité thoracique, gardez la souris en position de supine. Fixer les membres supérieurs et inférieurs à la casserole de dissection avec des goupilles de dissection.
- Utilisez des forceps pour soulever le processus de xyphoïde (cartilage à la base du sternum) et faire une petite (1 mm) couper dans la paroi thoracique de la cavité.
- Insérez une lame des ciseaux d'iris dans la coupe et faites deux incisions horizontales (1 cm chacune) s'étendant latéralement de la base du sternum. Ceci exposera le diaphragme et la bordure inférieure de la cavité thoracique.
- Utilisez des ciseaux disséquants pour faire deux incisions verticales ascendantes (3 à 4 cm) à travers la cage thoracique, s'étendant de façon supérieure des bordures latérales de la cavité thoracique à la clavicule.
- Utilisez des forceps pour soulever la moitié ventrale de la cage thoracique. Utilisez des ciseaux disséquants pour faire une coupe finale (2 cm) le long de la longueur inférieure de la clavicule pour enlever la cage thoracique et exposer le contenu de la cavité thoracique.
- S'il est présent, disséquez soigneusement l'adipose péricardique de la surface extérieure du péricarde.
4. Identification et isolement d'autres dépôts adipeux
- Identifier et isoler le WAT épicardique
REMARQUE: Le WAT épicardique est contenu dans le péricarde viscéral et est directement associé à la surface du myocarde.- Si présent, les adipocytes épicardiaux peuvent être observés histologiquement après isolement et fixation du coeur perfusé dans la formaline tamponnée neutre de 10% pendant 24 h.
- Identifier et isoler p (en) opliteal Wat (en)
REMARQUE: Popliteal WAT est situé dans la fossa popliteal dans le genou postérieur et contient un grand ganglion lymphatique. Ce dépôt n'est généralement pas visible chez les jeunes animaux.- Pour isoler le WAT popliteal, utilisez des ciseaux d'iris pour enlever soigneusement la peau de la base du membre postérieur au pied.
- Placez la rotule contre la casserole de dissection et fixez la jambe tendue avec une épingle dans le pied. Assurez-vous que la fossa popliteal à l'arrière du genou est orientée vers le haut.
- Utilisez des ciseaux d'iris pour faire une coupe à la bordure inférieure des têtes médiales et latérales du muscle gastrocnemius. Utilisez des forceps pour soulever le muscle et révéler le dépôt popliteal triangulaire.
- Utilisez des ciseaux d'iris pour exciser le dépôt le long des bordures naturelles des tissus.
- Identifier et isoler le WAT dermique
REMARQUE: Dermal WAT est une fine couche d'adipocytes situés entre le derme réticulaire et la couche musculaire panniculus carnosus.- Pour identifier les adipocytes dermiques par des méthodes histologiques, placez la souris sur son estomac dans une position encline. Après avoir fixé les membres supérieurs et inférieurs avec des goupilles de dissection, vaporiser la surface externe de la souris avec 70% d'éthanol pour mouiller la peau.
- Utilisez un scalpel pour enlever la fourrure mouillée d'une partie carrée de la peau sur le dos de la souris.
- Utilisez des ciseaux d'iris pour exciser soigneusement la partie rasée de la peau, qui comprendra le derme réticulaire, WAT dermique, carnosus panniculus, et certains WAT sous-cutané.
- Utilisez un scalpel pour couper la peau excisée en fines lanières verticales.
- Placez les fines bandes verticales avec la couche WAT sous-cutanée collante vers le bas.
- À partir d'une extrémité, rouler la bande sur elle-même pour former une spirale. La couche de WAT sous-cutanée collante à l'extérieur de la spirale permettra au rouleau de maintenir sa forme pendant la fixation.
- Placer la spirale dans un puits d'une plaque de 24 puits contenant 10% de formaline tamponneutre neutre pendant 24 h avant le traitement histologique22.
- Identifier et isoler le WAT intermusculaire
REMARQUE: Le WAT intermusculaire est largement défini comme des adipocytes situés sous le fascia profond des muscles. Ce terme inclut les adipocytes entrecoupés entre les fibres musculaires du muscle squelettique, également connu sous le nom de WAT intramusculaire, et les adipocytes situés dans les faisceaux musculaires eux-mêmes. Les souris de type sauvage n'ont généralement pas un grand nombre d'adipocytes intermusculaires. Cependant, il est possible dans certaines conditions d'identifier le WAT intermusculaire par des méthodes histologiques. Dans certaines conditions, les adipocytes intermusculaires peuvent également être trouvés dans les muscles lisses, tels que le diaphragme.- Pour isoler le muscle antérieur de tibialis (TA), par exemple, placez la souris sur son dos dans une position de supine et fixez les membres inférieurs à la casserole de dissection utilisant des goupilles de dissection. Mouillez la peau avec 70% d'éthanol pour minimiser la contamination par la fourrure.
- Utilisez des ciseaux d'iris pour enlever soigneusement la peau de la jambe et exposer le groupe musculaire quadriceps, situé au-dessus du genou sur l'arbre du fémur, et le TA situé sous le genou sur la surface ventrale du tibia.
REMARQUE: Le TA est épais près de l'extrémité proximale du tibia et plus tendineux près de l'extrémité distale. - Utilisez des ciseaux d'iris pour exciser un morceau du muscle et fixer dans 10% neutre formalintampone pendant 24 h avant le traitement histologique22.
- Identifier et isoler les dépôts WAT intra-articulaires
REMARQUE: Les dépôts WAT intra-articulaires sont situés dans des joints synovials.- Pour identifier le WAT infrapatellar, par exemple, par des méthodes histologiques, récoltez les os des jambes comme détaillé dans la section BMAT.
- Après l'enlèvement du complexe fémur-tibial, utilisez des ciseaux d'iris et des garnitures de gaze pour enlever autant de muscle et de tissu conjonctif que possible. Ne cassez pas l'articulation tibiofemoral.
- Fixer le complexe fémur-tibial dans la formaline tamponnée neutre de 10% pendant 24 h avant la décalcification et le traitement histologique (décrit ci-dessous, étape 4.6.8).
- Identifier et isoler le tissu adipeux de moelle osseuse
REMARQUE: Le tissu adipeux de moelle osseuse (BMAT) est contenu dans les os, entrecoupés de cellules hématopoïétiques. Anatomiquement, le BMAT peut être classé comme constitutif (tibia distal et vertèbres caudales) ou régulé (tibia mi-proximal, fémur, et vertèbres lombaires)10,11. L'isolement pur des adipocytes de moelle pour des analyses d'ARN et de protéine est provocant chez les souris. Cependant, les os de souris peuvent facilement être récoltés, fixés, décalcifiés et paraffines pour des analyses histologiques.- Pour récolter les os des jambes, par exemple, retirez d'abord les pattes de la souris. Utilisez des ciseaux de dissection pour couper l'articulation acetabulofemoral, en gardant la tête fémorale intacte.
- Utilisez des ciseaux d'iris pour enlever soigneusement la peau de la jambe, révélant les muscles des jambes.
- Disséquez soigneusement les muscles principaux du fémur et du tibia à l'aide de ciseaux à l'iris et de tampons de gaze.
- Lorsque le fémur est exposé, suivre le bord de l'os à l'articulation du bassin et du fémur et libérer soigneusement la tête fémorale de l'articulation acetabulofemoral. Utilisez de la gaze pour nettoyer les tissus restants du fémur.
- Suivez la bordure du tibia jusqu'à l'articulation de la cheville. Libérez soigneusement le malleolus médial, situé à l'extrémité du tibia, de l'articulation de la cheville.
- Une fois que le complexe fémur-tibial a été isolé, enlevez autant de muscle et de tissu conjonctif que possible en utilisant des ciseaux d'iris et/ou de la gaze.
- Séparez le tibia du fémur en insérant une lame des ciseaux d'iris dans l'articulation tibiofémoral et coupez doucement à travers les ligaments collatéraux médials et latéraux et les ligaments croisés antérieurs et postérieurs. N'enlevez pas la capsule de l'articulation du genou pour vous assurer que le tibia reste intact. Utilisez de la gaze pour nettoyer les tissus restants du tibia.
- Fixer les os dans 10% de formaline tamponnée neutre pendant 24 h à température ambiante, puis laver et stocker en fonction des besoins futurs.
- Pour analyser les paramètres osseux à l'aide de la tomographie microcomputée, entreposez les os dans le tampon de phosphate de Sorensen, pH 7,423.
- Pour la quantification de BMAT et les analyses histologiques, décalcifient des os dans 14% EDTA, pH 7.4, pendant 10-14 jours.
- Après la décalcification, utiliser la coloration du tétroxyde d'osmium et l'analyse cT pour quantifier le BMAT24. Sinon, traiter et paraffiner les os pour l'histologie23.
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Representative Results
L'identification et l'isolement réussis de divers dépôts adipeux de souris peuvent être réalisés utilisant le protocole décrit ci-dessus. Les emplacements anatomiques bruts des dépôts sous-cutanés (A, E-F), bruns (B), viscéraux (C, D, G-J) et popliteal (K) sont indiqués dans la figure 2.
Figure 2 : Emplacements anatomiques bruts des dépôts adipeux de souris. Anatomie brute de (A) sous-cutanée antérieure, (B) brun, (C) épididymal (b, vessie), (D) ovarien (u, cornes utérines), (E) postérieure sous-cutanée (dorsolumbar (d), inguinal (i), gluteal (g)), (F) inguinal, (G) mésenteric, (H) perirenal (k, rein), (I) retroperitoneal (k, rein), (J) péricardial (h, coeur), et (K) dépôts adipose popliteal chez les souris adultes C57BL/6J. Les flèches pointent vers des dépôts spécifiques si plusieurs dépôts sont représentés. Les organes pertinents sont désignés par des lettres appropriées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Les caractéristiques histologiques des dépôts adipeux sous-cutanés (A-D), bruns (E), viscéraux (F-K), popliteal (L), constitutifs (M) et marécages réglementés (N), intramusculaires (O) et infrapatellar (P) ont été évalués par Hematoxylin et Eosin (H et E) coloration22 et sont indiqués dans la figure 3.
Figure 3 : Évaluation histologique des dépôts adipeux discrets de souris. Histologie de (A) sous-cutanée antérieure, (B) dorsolumbar, (C) inguinal, (D) fessier, (E) brun, (F) gonadal, (G) perirenal, (H) retroperitoneal, (I) omental, ( J) mésenteric, (K) péricardique, (L) popliteal, (M) constitutive et (N) adité de moelle osseuse réglementée adipose, (O) intermusculaire, et (P) dépôts infrapatellar dans C57BL/6J souris adultes. Les tissus ont été isolés selon le protocole donné, fixés pendant la nuit dans 10% de formaline tamponneutre neutre, traités et incorporés dans la paraffine. 5 sections de m ont été tachées avec H et E. La plupart des images ont été prises à 100x grossissement; Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Comme l'importance des diverses caractéristiques moléculaires et fonctionnelles des amas d'adipocytes discrets est de plus en plus reconnue, il est crucial que les chercheurs sur le terrain identifient uniformément et excisient les dépôts adipeux pour d'autres analyses. À ce jour, il existe peu de protocoles pour la localisation normalisée et l'isolement de la vaste gamme de dépôts adipeux de souris. Les méthodes publiées précédemment sont axées principalement sur un ou deux dépôts et n'ont pas les détails nécessaires pour l'identification uniforme et l'excision par différents enquêteurs18,19. Ce manuscrit est une contribution nouvelle et importante au domaine de la biologie adipeuse puisqu'il fournit un guide détaillé de l'emplacement anatomique et de la dissection précise des dépôts couramment étudiés et moins connus dans toute la souris. L'emplacement anatomique brut et les analyses histologiques sont fournis pour démontrer la diversité des niches d'adipocytes.
L'isolement réussi des dépôts adipeux discrets utilisant ce protocole dépend de plusieurs étapes critiques. Le maintien d'un environnement de dissection propre est crucial; 70% d'éthanol peut être utilisé au besoin pour enlever les poils contaminants ou le sang du plateau de dissection et des outils. Lors de l'isolement postérieur sous-cutané WAT, il est impératif que l'incision initiale dans la peau ne pénètre pas dans la cavité péritonéale étroitement associée de sorte que les deux couches peuvent être efficacement séparées pour exposer le WAT. De même, lors de la coupe à travers la paroi péritonéale pour exposer le contenu de la cavité abdominale, les incisions ne doivent pas perforer les intestins sous-jacents pour prévenir la contamination par des éléments digestifs. La BAT interscapulaire doit être soigneusement excisée du tissu environnant pour prévenir la contamination par le WAT, ce qui faussera les analyses futures. L'identification cohérente des dépôts sous-cutanés postérieurs de dorsolumbar, inguinal, et fessier dépend de l'utilisation des repères anatomiques précis décrits dans le protocole. La distinction entre ces dépôts est particulièrement importante; bien que les dépôts puissent sembler continus, les adipocytes inguinaux situés au centre acquièrent des caractéristiques brunes plus facilement que leurs homologues environnants.
Les tissus adipeux isolés à l'aide de ce protocole peuvent être analysés à l'aide d'une variété de techniques. En plus de l'évaluation histologique (p. ex. coloration de H et E, immunohistochimie), les tissus adipeux peuvent être utilisés pour un large éventail d'analyses moléculaires, de la régulation de la transcription jusqu'aux modifications des protéines post-traductionnelles. Les adipocytes et les cellules vasculaires stromales dans les dépôts individuels peuvent être isolés par digestion de collagène et centrifugation différentielle. Ces fractions peuvent ensuite être utilisées pour des études moléculaires, métaboliques et de culture cellulaire. Les explants de dépôt peuvent également être utilisés pour des essais métaboliques et enzymatiques ex vivo.
Plusieurs défis et limitations surgissent pendant l'isolement et l'excision des tissus adipeux de souris. Tout d'abord, certains dépôts qui sont physiologiquement importants chez l'homme ne sont pas couramment présents chez les souris maigres et adultes. Par exemple, l'omental WAT, qui est le principal dépôt viscéral chez l'homme, ne peut être vu que chez les souris obèses génétiquement ou induites par l'alimentation. L'expansion de certains dépôts peut cependant être induite par des problèmes nutritionnels ou des traitements médicamenteux. Par exemple, l'alimentation à haute teneur en graisses peut causer l'expansion de l'omental et péricardique WAT. Le WAT intermusculaire peut être induit par des lésions musculaires squelettiques25,26 ou un régime riche en graisses27. BMAT réglementé se développe en réponse à divers défis, y compris l'alimentation riche en graisses, la restriction calorique et le traitement de la thiazolidinedione11,28. Deuxièmement, en raison de la petite taille des souris, l'obtention d'échantillons suffisants pour les analyses moléculaires ou métaboliques peut être difficile. Par exemple, l'isolement de suffisamment d'adipocytes de moelle osseuse pure pour des analyses ultérieures est difficile, même après la mise en commun des os de plusieurs souris. Troisièmement, il peut être difficile de définir avec précision les frontières de certains dépôts. Par exemple, le WAT sous-cutané postérieur semble être un dépôt continu, mais il est en fait composé de dépôts discrets de dorsolumbar, d'inguinal et de fessier. En outre, le periré peut sembler être fusionné à la fois les dépôts gonadal et rétroperitoneal chez les animaux très obèses. L'absence de frontières distinctes entre les dépôts adjacents peut rendre l'isolement pur de ces tissus difficile. Cependant, ce protocole de dissection fournit aux chercheurs un atlas détaillé et des conseils étape par étape pour la dissection précise et reproductible d'un large éventail de dépôts adipeux de souris. La normalisation à l'échelle du champ de l'identification et de l'isolement des dépôts adipeux discrets de souris décrits ci-dessus aidera sans aucun doute à élucider davantage les différences dans le développement, l'expression de gène, et les fonctions locales et systémiques d'précédemment niches d'adipocytes sous-étudiées.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
O.A.M. est soutenu par les subventions des NIH DK062876 et DK092759; D.P.B. est soutenu par le University of Michigan Medical Scientist Training Program (T32GM007863), le University of Michigan Training Program in Organogenesis (T32HD007605), l'University of Michigan Rackham Merit Fellowship et le Tylenol Future Care Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
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