Summary
지방세포는 별도의 창고에 존재하며 고유한 미세 환경 내에서 다양한 역할을 합니다. 지방세포 의 특성과 기능의 지역적 차이가 드러나기 때문에, 표준화된 식별과 창고의 격리는 현장의 발전을 위해 매우 중요합니다. 본 명세서에서, 우리는 다양한 마우스 지방 창고의 절제에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
지방 조직은 지역 및 글로벌 요구에 부응하여 에너지저장 및 동원, 열을 발생시키는 신진대사의 분리, 전신 항상성을 조절하는 아디포핀분비 등 다양한 기능을 갖춘 복합기관으로, 면역 반응. 신흥 연구는 몸 전체에 걸쳐 별도의 창고에 위치한 지방세포의 발달, 분자 및 기능적 프로필의 중요한 지역적 차이를 식별하고 있습니다. 신진 대사 질병은 종종 창고 특정 효과를 보여주기 때문에 창고의 다른 특성은 의학적으로 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 마우스 지방 조직의 재현 가능하고 정확한 식별 및 절제에 대한 자세한 해부학 아틀라스 및 해부 가이드를 조사자에게 제공 할 것입니다. 이산 지방 창고의 표준화 된 해부는 다양한 영양 및 환경 조건하에서 분자 및 대사 특성과 지역 및 전신 병리학 상태에 대한 기여도의 상세한 비교를 허용할 것입니다.
Introduction
지방 조직은 지역 및 글로벌 요구에 부응하여 에너지 저장 및 방출, 체온 조절 및 에너지 균형, 신진 대사 및 면역 반응을 조절하는 아디포핀분비를 포함하여 전신 항상성에 중요한 역할을 합니다1 , 2. 지방 세포는 별도의 창고에서 몸 전체에 분포하고, 어떤 경우에는 자신의 미세환경 내에서 특수 한 역할을 제공 3,4,5. 역사적으로, 지방 조직의 연구는 백색 지방 조직 (WAT)에 중심을 두고 있다, 그리고 에너지 항상성을 유지에 그것의 역할. 대부분의 지방세포는 피하 및 내장 WAT 창고에서 몸 전체에 분포됩니다. 이 창고의 특성은 신진 대사 질환에 대한 차동 감수성에 중요합니다. 피부 아래에 위치한 피하 지방세포는 보호 대사 효과5. 중요한 기관을 둘러싸고 gonadal, 회신, 후회, omental 및 심낭 창고 내에 포함되는 내장 지방세포는 일반적으로 타입-2 당뇨병과 심혈관 질환을 포함한 대사 장애에 연결됩니다2 . 갈색 지방 조직 (BAT) 또한 광범위 하 게 공부 하고있다. 갈색 및 갈색형 지방세포는 결합성 단백질 1(UCP1)을 발현하고 적응형 열발생 및 포도당 항상성6,7에서중요한 역할을 한다. 고전 적 갈색 지방 세포는 중간 BAT 창고8에포함되어 있습니다. 갈색 지방세포의 클러스터는 또한 상부, 적외선/ 자궁 경부, 자궁 경부, 파라척추 및 후부증 창고8,9를포함하여 그밖 위치에서 있습니다.
주요 WAT 및 BAT 창고에 위치하는 것 외에도, 지방세포는 각 마이크로 환경 내에서 특수 기능을 수행할 수 있는 신체4의 개별 틈새에 존재합니다. 예를 들어, 골수 지방 조직(BMAT)은 지질 저장소로서 역할을 하며, 순환 아디포넥틴의 주요 공급원이며, 조골세포, 파골세포 및 조혈세포(10,11)와밀접하게 상호작용한다. 진피 지방세포는 상처 치유, 면역 반응, 체온 조절 및 모낭 성장12,13을포함하는 광범위한 과정에 기여한다. 또한, 상피 지방세포는 관상 동맥 질환의 발달 및 진행에 국소 및 전신 효과를 발휘하는 여러 아디포킨 및 케모카인을 생성할 수 있다(14). 간/근육 내 WAT의 확장은 긍정적으로 증가 된 배분과 상관 관계가있다, 전신 인슐린 저항, 감소 근육 강도 및 이동성15. 또한, 포피라이트 지방세포는 감염 시 림프 확장에 대한 지질 저장소(16)의 역할을 한다. 상이한 관절 창고의 특정 역할은 일반적으로 알려지지 않았지만, 무릎 내의 호파 디포(infrapatellarlar)는 이제 전방 무릎 통증 및 골관절염(17)을 포함하는 병리학에 기여하는 것으로 생각된다.
지방세포 의 특성과 기능의 지역적 차이는 강렬한 연구를 받고 있는 반면, 이 분야는 현재 다양한 마우스 창고의 식별 및 해부를 위한 표준화된 프로토콜의 부재로 인해 제한됩니다. 이전에 공표된 방법은 전형적으로 하나 또는 두 개의 특정 디포의 격리를 설명하고 균일한 절제에 필요한 세부 수준이 결여되어있다(18,19). 이 원고에 설명된 프로토콜은 많은 다른 마우스 지방 창고의 특정 해부학 적 위치 및 격리 단계에 대한 포괄적 인 가이드를 제공합니다. WAT 창고가 이 원고의 주요 초점이지만, 중간 BAT의 절제도 자세히 설명되어 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 절제된 지방 조직은 이식 연구, 조직학 및 유전자 발현 분석을 포함한 다양한 실험 종점에 사용될 수 있다.
이 원고의 목적은 조사관에게 눈에 띄고 연구가 덜 된 마우스 지방 창고를 명확하고 정확하게 식별하고 격리하는상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다(그림 1). 이 리소스는 다양한 틈새 시장 내에서 지방세포의 발달, 분자 및 기능적 특성에 대한 보다 완전한 조사를 용이하게 합니다.
그림 1: 이 프로토콜에서 해부된 마우스 지방 창고의 회로도 묘사. 이 이미지는 Bagchi 외, 20184. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
모든 동물 절차는 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인으로 수행됩니다.
1. 안락사
참고: 이 비디오 프로토콜의 목적을 위해, 4~ 6개월 된 C57BL/6J 마우스가 사용된다.
- 마우스를 이소플루란 기화기 챔버에 놓고 이소플루란 유량을 5% 이상으로 조정합니다. 호흡이 멈출 때까지 1 분까지 이소플루란 노출을 계속하십시오. 그런 다음 기화기 챔버에서 마우스를 제거하고 승인 된 보조 측정을 사용하여 안락사를 확인합니다.
참고: 승인된 이차 조치는 기관 및 동물 프로토콜에 따라 다르며 자궁 경부 탈구 또는 참수등이 포함될 수 있습니다. - 안락사된 마우스를 해부 팬에 놓습니다. 70% 에탄올을 사용하여 마우스의 등쪽 및 복부 외부 표면을 살균합니다. 해부 중에 털의 오염을 최소화하기 위해 마우스의 외부 표면이 충분히 젖어 있는지 확인하십시오.
2. 주요 피하 지방 창고 (전방 피하, 도르솔룸바, 인기날, 글루테알) 및 갑피 갈색 지방 조직의 식별 및 격리
- 전방 피하 식별 및 격리 와트 (미국)
참고: 전방 피하 WAT는 견갑골 사이에 위치하며, 목덜미로부터 마우스 7의 축사까지 하강한다. 이 창고는 대체로 수위8 또는 중간20 WAT로 설명되었으며 중간 BAT 창고 바로 위에 있습니다.- 전방 피하 창고를 분리하려면 마우스를 위장에 놓습니다. 상반신과 하반신을 해부 핀으로 해부 팬에 고정합니다.
- 포셉을 사용하여 목 덜미에서 등지 피부를 들어 올립니다. 홍채 가위를 사용하여 피부에 작은 (1mm)을 자른다.
- 홍채 가위 한 쪽을 초기 절단에 넣고 목 덜미에서 시작하여 척추를 따라 중간 뒤쪽으로 내려가는 피부를 통해 중간선 수직 절개(2-3cm)를 만듭니다.
- 홍채 가위를 사용하여 두 개의 수평 절개를 (각 1cm)로 만들고, 초기 수직 절개의 위쪽과 아래쪽에서 중간선에서 측면으로 확장합니다.
- 포셉을 사용하여 조심스럽게 피부를 벗겨내고 전방 피하 창고를 노출시하십시오.
- 홍채 가위를 사용하여 조직의 자연 테두리를 따라 창고를 제거하십시오.
참고: 이 방법은 전방 피하 WAT와 중간 BAT를 모두 분리합니다. - 해부 팬에 해부 된 창고를 놓고 홍채 가위를 사용하여 오염 된 BAT를 조심스럽게 제거하십시오.
- 식별 및 격리 c 래시컬 배트
참고: 클래식 BAT는 전방 피하 WAT 창고 아래에 위치하고 있습니다.- BAT를 분리하려면 홍채 가위를 사용하여 창고의 자연 테두리를 따라 전방 피하 조직의 아래쪽 가장자리를 따라 수평으로 자릅니다.
- 그런 다음 홍채 가위를 사용하여 조직의 자연 테두리를 따라 창고의 측면 가장자리를 따라 두 개의 수직 절개를 만듭니다.
- 포셉을 사용하여 조심스럽게 창고를 뒤집고 WAT 내에 내장된 나비 모양의 중간 BAT를 드러냅니다. 조심스럽게 주변 WAT에서 BAT를 해부.
- 식별 및 격리 후방 피하 와트,
- 마우스를 등 뒤로 누우고 척추 자세로 놓습니다.
- 해부 핀으로 상지와 하반신을 고정한 후 포셉을 사용하여 흉골 의 기저부에서 피부를 들어 올리고 피부에 작은 (1mm)을 자른다.
- 홍채 가위 한 쪽을 초기 절단에 넣고 흉골 의 기저부에서 시작하여 꼬리 밑으로 내려오는 피부를 통해 중간 선 절개 (4-5cm)를 만듭니다. 복부 피부가 매우 얇고 기본 복막 벽과 밀접하게 관련되어 있기 때문에이 절개를 할 때주의하십시오.
- 홍채 가위를 사용하여 두 개의 수평 절개를 (각 1cm)로 만들고 초기 수직 절개 상단에서 중간선에서 측면으로 확장합니다.
- 포셉을 사용하여 복강과 다리에서 피부를 조심스럽게 벗겨내어 피부와 관련이 있어야하는 후부 피하 WAT를 찾습니다. 해부 핀으로 뻗은 피부를 고정하여 WAT의 완전한 절제를 용이하게 합니다.
참고: 후방 피하 WAT는 연속적인 것처럼 보이지만 실제로는 도르솔바, 인큐티컬 및 둔부1의세 개의 개별 디포로 구성됩니다. dorsolumbar 창고는 요추에서 뒷다리의 기지까지 확장됩니다. 삼각형 사타구니 창고는 사타구니를 가로 질러 통풍구의 뒷다리의 기지에서 확장하고 눈에 띄는 림프절을 포함합니다. 둔부 창고는 사타구니의 기지에서 열등하게 확장하고 꼬리의 기지에 다리 주위를 감싸는.
3. 내장 지방 창고의 식별 및 격리 (고나달, 회신, 복리후생, 오멘탈, 심낭)
- 식별 및 격리 내장 WAT 창고
참고: 주로 흉부 및 복막 내에 포함 되는 WAT 창고, supine 위치에 마우스를 유지. 상반신과 하반신을 해부 핀으로 해부 팬에 고정합니다.- 포셉을 사용하여 흉골 의 기저부에서 얇은 복막 구멍 벽을 들어 올리고 홍채 가위를 사용하여 작은 컷 (1mm)을 만듭니다.
- 홍채 가위 한 블레이드를 절단에 넣고 복막 강 (흉골의 염기)의 상단에서 직장으로 내림차순 수직 절개 (4-5cm)를 만듭니다.
- 홍채 가위로 두 개의 수평 절개를 (각 1cm) 만들고, 수직 절개의 위쪽과 아래쪽에서 중간선에서 측면으로 확장합니다.
- 집게를 사용하여 복강을 벗겨내고 복강 내용체를 노출시다. 뻗은 각막을 해부 팬에 고정합니다.
- 식별 및 격리 g 오나달 (오나달) 와트 (미국)
참고: Gonadal WAT는 여성의 자궁과 난소 (난소 또는 난소)와 남성의 부고환 및 고환 (부고환)을 둘러싸고 있습니다. 난소 WAT는 난소, 자궁 및 방광을 포위합니다. 비만 동물에서, gonadal 및 perirenal WAT는 연속적인 것처럼 보일 수 있습니다 -이 경우, 자궁 경적과 난소에 창고를 분리. 부고환 WAT는 부고환, 고환 및 눈에 띄는 부고환 혈관에 묶여 있는 것으로 밝혀졌다.- 생식선 (고환 또는 난소)을 찾아 관련 gonadal WAT를 들어 올리기 위해 집게를 사용합니다.
- 조리개 가위를 사용하여 생식선에서 WAT를 조심스럽게 제거합니다.
- 식별 및 격리 p 에리레네이드 와트 (미국)
참고: Perirenal WAT는 양측 신장을 포위합니다. 뚱뚱한 동물에서는, 이 창고는 자궁 뿔 및 난소의 꼭대기에 열등하게 확장하는 것처럼 보일 수 있습니다. perirenal WAT는 전통적으로 내장 창고(21)로분류되었지만, 몇몇 그룹은 혈통 추적 및 방사성 표지 된 포도당 섭취 연구 8,9에 기초하여 갈색 창고로 확인했다. 20. 조직학적으로 는 백색과 갈색 지방세포의 혼합물로 이루어져 있다.- perirenal 창고를 절제하기 위하여는, 신장을 찾아서 그것을 들어 올리기 위하여 포셉을 사용하고 perirenal 및 retroperitoneal 창고 사이 명확한 분할을 보기 위하여 그것을 중간선을 당깁니다.
- 신장과 직접 연관된 WAT를 절제합니다. 신장 위에 위치한 부신이 WAT에서 제거되었는지 확인하십시오.
- 식별 및 격리 r 에트로페리톤 와트 (미국)
참고: 복막 WAT는 후부 복벽과 척수 사이의 경계를 따라 파라척추 위치에 위치합니다.- 이 창고를 절제하려면 포셉을 사용하여 신장을 위로 올리고 중간선쪽으로 들어 올려 주회엽 창고와 복강막 창고 사이의 경계를 명확하게 볼 수 있습니다.
참고: 뚱뚱한 동물에서는, 이 국경을 확인하는 것은 도전적일 수 있습니다. - 그런 다음 홍채 가위를 사용하여 후복막 벽에서 복회하 WAT를 조심스럽게 해부합니다.
- 이 창고를 절제하려면 포셉을 사용하여 신장을 위로 올리고 중간선쪽으로 들어 올려 주회엽 창고와 복강막 창고 사이의 경계를 명확하게 볼 수 있습니다.
- omental WAT 식별 및 격리
참고: Omental WAT는 위장의 큰 곡률을 따라 위치하고 있습니다. 비록 omental 지방은 인간에 있는 중요 한 저장소, 그것은 일반적으로 병적으로 비만 마우스에서만 존재.- 내장 성 WAT를 식별하려면 포셉을 사용하여 위를 들어 올립니다. 홍채 가위를 사용하여 위장의 열등한 테두리를 따라 관련 지방 조직을 제거하십시오. omental WAT를 췌장과 혼동하지 마십시오.
- 방진을 식별하고 격리 와트 (미국)
참고: 장간막 WAT는 크고 작은 창자를 둘러싸고 연관된 웹과 같은 구조입니다.- 이 창고를 절제하려면 위장과 직장의 기지에서 절단하여 소화관의 나머지 부분에서 내장을 제거하십시오. 집게를 사용하여 내장을 내장 에서 들어 올려 해명하십시오.
- 홍채 가위를 사용하여 장간막 WAT를 창자에서 조심스럽게 해부하고 십이지장에서 시작하여 결장 끝까지 계속하십시오. 간간 극 창고와 밀접하게 관련된 림프절을 조심스럽게 제거하십시오.
- 심낭 WAT 식별 및 격리
참고: 심낭 WAT는 내장 심낭 외부및 정수리 심낭의 외부 표면에 위치하며, 종종 심장(14)의 열등한측면을 따라 있다.- 흉강 구멍에 접근하려면 마우스를 척추 위치에 두십시오. 상반신과 하반신을 해부 핀으로 해부 팬에 고정합니다.
- 포셉을 사용하여 xyphoid 과정 (흉골의 기지에서 연골)을 들어 올리고 흉강 벽에서 작은 (1mm)을 잘라냅니다.
- 홍채 가위 한 개를 절단에 넣고 흉골 의 기저부에서 측면으로 확장되는 두 개의 수평 절개 (각 1cm)를 만듭니다. 이것은 흉강의 다이어프램과 열등한 테두리를 드러을 것입니다.
- 해부 가위를 사용하여 흉곽을 통해 두 개의 오름차순 수직 절개 (3-4cm)를 만들고 흉강의 측면 경계에서 쇄골까지 우월하게 확장합니다.
- 집게를 사용하여 흉곽의 복부 절반을 들어 올립니다. 해부 가위를 사용하여 쇄골의 열등한 길이를 따라 최종 절단 (2cm)을 만들어 흉곽을 제거하고 흉강 내용기를 노출시십시오.
- 존재하는 경우 심낭의 외부 표면에서 심낭 지방을 조심스럽게 해부하십시오.
4. 다른 지방 창고의 식별 및 격리
- 전형 WAT 식별 및 격리
참고: 에피카디얼 WAT는 내장 심낭 내에 함유되어 있으며 심근의 표면과 직접 관련이 있습니다.- 존재하는 경우에, 상피 지방세포는 24 시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 있는 관상심의 격리 그리고 고정 후에 조직학적으로 관찰될 수 있습니다.
- 식별 및 격리 p 낙엽 수 와트 (미국)
참고: Popliteal WAT는 후방 무릎의 포피라이트 포사에 위치하고 있으며 큰 림프절을 포함합니다. 이 창고는 일반적으로 어린 동물에서 볼 수 없습니다.- popliteal WAT를 분리하려면 홍채 가위를 사용하여 뒷다리의 기저부에서 발까지 피부를 조심스럽게 제거하십시오.
- 슬개골을 해부 팬에 대고 뻗은 다리를 발에 핀으로 고정시다. 무릎 뒤쪽의 포퓰리터 포사(popliteal fossa)가 위쪽을 향하고 있는지 확인합니다.
- 홍채 가위를 사용하여 위장 근육의 내측 및 측면 머리의 열등한 테두리에서 잘라냅니다. 포셉을 사용하여 근육을 들어 올리고 삼각형 팝liteal 창고를 드러냅니다.
- 홍채 가위를 사용하여 자연 조직 경계를 따라 창고를 절제하십시오.
- 진피 WAT 식별 및 격리
참고: 진피 WAT는 망상 진피와 판니큘러스 카르노수스 근육 층 사이에 위치한 지방세포의 얇은 층입니다.- 조직학적 방법으로 진피 지방세포를 식별하려면 마우스를 위장에 놓습니다. 해부 핀으로 상지와 하반신을 고정한 후 마우스의 외부 표면에 70% 에탄올을 뿌려 피부를 적시게 합니다.
- 메스를 사용하여 마우스 뒷면의 피부 정사각형 부분에서 젖은 털을 제거합니다.
- 홍채 가위를 사용하여 피부의 면도 부분을 조심스럽게 제거하면 망상 진피, 진피 WAT, 판니큘러스 카르노수스 및 일부 피하 WAT가 포함됩니다.
- 메스를 사용하여 절제된 피부를 얇은 수직 스트립으로 자른다.
- 끈적끈적한 피하 WAT 레이어가 아래를 향하게 하여 얇은 수직 스트립을 배치합니다.
- 한쪽 끝에서 시작하여 스트립을 자체적으로 굴려 나선형을 형성합니다. 나선형 의 외부에 끈적 피하 WAT 층은 고정하는 동안 롤의 모양을 유지할 수 있습니다.
- 나선형을 조직학적 처리22전에24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린을 함유하는 24웰 플레이트의 웰에 놓는다.
- 간 간 WAT 식별 및 격리
참고: 근육 간 WAT는 광범위하게 근육의 깊은 근막 아래에 있는 지방세포로 정의됩니다. 이 용어는 골격 근육의 근육 섬유 사이에 산재 지방 세포, 또한 근육 WAT로 알려진, 그리고 근육 번들 자체 내에있는 지방 세포가 포함되어 있습니다. 야생형 마우스는 일반적으로 근육간 지방세포가 많지 않다. 그러나, 특정 조건하에서 조직학적 방법에 의해 근육 간 WAT를 식별할 수 있다. 몇몇 조건의 밑에, 근간 지방세포는 또한 다이어프램과 같은 평활근에서 찾아질 수 있습니다.- 경골 전방 (TA) 근육을 분리하기 위해, 예를 들어, 마우스를 뒤쪽의 척추 위치에 놓고 해부 핀을 사용하여 해부 팬에 하반신을 고정시다. 모피로 오염을 최소화하기 위해 70 % 에탄올로 피부를 적시십시오.
- 홍채 가위를 사용하여 다리에서 피부를 조심스럽게 제거하고 대퇴골 샤프트의 무릎 위에위치한 사두근 근육 그룹과 경골의 복부 표면에 무릎 아래에있는 TA를 노출하십시오.
참고: TA는 경골의 근위 끝 근처에 두껍고 말단 근처에 더 많은 건성입니다. - 홍채 가위를 사용하여 근육의 조각을 절제하고 조직학적 처리22전에 24 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린에 고정하십시오.
- 관절 내 WAT 창고 식별 및 격리
참고: 관절 내 WAT 창고는 활액 관절 내에 있습니다.- 예를 들어 조직학적 방법으로 인프라 WAT를 식별하려면 BMAT 섹션에 자세히 설명된 대로 다리 뼈를 수확합니다.
- 대퇴골 경골 복합체를 제거 한 후 홍채 가위와 거즈 패드를 사용하여 가능한 한 많은 근육과 결합 조직을 제거하십시오. 경골 관절을 중단하지 마십시오.
- 대퇴골 경골 복합체를 10% 중성 완충 포르말린을 탈석 및 조직학적 처리 전에 24시간 동안 고정합니다(아래 설명, 단계 4.6.8).
- 골수 지방 조직 식별 및 격리
참고: 골수 지방 조직 (BMAT) 뼈 안에 포함, 조혈 세포와 산재. 해부학적으로, BMAT는 구성적(원위 경골 및 척추 척추) 또는 규제(근위경골, 대퇴골 및 요추)로 분류될 수있다 10,11. RNA 및 단백질 분석을 위한 골수 지방세포의 깨끗한 분리는 마우스에서 도전적입니다. 그러나 마우스 골격은 조직학적 분석을 위해 쉽게 수확, 고정, 탈석 및 파라핀 내장될 수 있습니다.- 예를 들어 다리 뼈를 채취하려면 먼저 마우스에서 다리를 제거합니다. 해부 가위를 사용하여 대퇴골 머리를 그대로 유지하면서 아세타불로포포페도럴 관절을 절단하십시오.
- 홍채 가위를 사용하여 다리에서 피부를 조심스럽게 제거하여 다리 근육을 드러냅니다.
- 홍채 가위와 거즈 패드를 사용하여 대퇴골과 경골에서 주요 근육을 조심스럽게 해부하십시오.
- 대퇴골이 노출되면 골반과 대퇴골의 관절에 뼈의 가장자리를 따라 조심스럽게 아세타부로 포 유 저울 관절에서 대퇴 머리를 풀어 놓습니다. 대퇴골에서 남아있는 조직을 청소하기 위해 거즈를 사용합니다.
- 경골의 테두리를 따라 발목 관절까지. 경골의 끝에있는 내측 말레올루스를 발목 관절에서 조심스럽게 방출하십시오.
- 대퇴골 경골 복합체가 분리되면 홍채 가위 및 / 또는 거즈를 사용하여 가능한 한 많은 근육과 결합 조직을 제거하십시오.
- 홍채 가위의 한 블레이드를 경골 관절에 삽입하여 대퇴골에서 경골을 분리하고 내측 및 측부 인대와 전방 및 후방 십자 인대를 부드럽게 잘라냅니다. 경골이 그대로 유지되도록 무릎 관절의 캡슐을 제거하지 마십시오. 거즈를 사용하여 경골에서 남은 조직을 청소하십시오.
- 실온에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 뼈를 고정한 다음 미래의 필요에 따라 세척하고 보관하십시오.
- 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT)을 사용하여 뼈 매개 변수를 분석하려면 소렌슨의 인산 완충액, pH 7.423에뼈를 저장합니다.
- BMAT 정량화 및 조직학적 분석을 위해 10-14일 동안 14% EDTA, pH 7.4에서 뼈를 데칼화합니다.
- 탈석에 이어 오스뮴 테트옥사이드 염색 및 μCT 분석을 사용하여 BMAT24를정량화합니다. 그렇지 않으면, 조직학23에대한 처리 및 파라핀 포함 뼈.
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Representative Results
전술한 프로토콜을 사용하여 다양한 마우스 지방 창고의 성공적인 식별 및 격리가 달성될 수 있다. 피하(A, E-F), 브라운(B), 내장(C, D, G-J) 및 포플리탈(K) 디포의 총 해부학적 위치는 그림2에 나타내고 있다.
그림 2: 마우스 지방 창고의 총 해부학 적 위치. (A) 전방 피하의 총 해부학, (B)갈색, (C) 부고환 (b, 방광), (D) 난소 (u, 자궁 경적), (E) 후방 피하 (d), 인과염 (i), 글루테알 (g)),(F) [G) 장간막, (H)회음부 (k, 신장), (I) 후회막 (k, 신장), (J) 후낭식 (h, 심장), 및 (K) C57BL/6J 성인 마우스에서 포피랄 지방 창고. 화살표는 여러 저장소가 묘사된 경우 특정 저장소를 가리킵니다. 관련 기관은 적절한 편지로 지정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
피하 (A-D), 갈색 (E), 내장 (F-K), popliteal (L), 구성 (M) 및 규제 골수 지방 (N), 근육 내 (O) 및 인프라 (P) 지방 창고의 조직학적 특성은 헤마톡실린과 에오신 (H&E)에 의해 평가되었다 염색22 및 그림 3에나와 있습니다.
그림 3: 이산 마우스 지방 창고의 조직학적 평가. 조직학 (A) 전방 피하, (B)등룸바, (C)인큐니얼, (D) 글루테알,(E)갈색, (F) 고나달, (G) 회음부, (H) 복막, (I) J)간부,(K) 심낭,(L) 포피라이트, (M) 구성 및(N) 조절 골수 지방, (O) 근육, 및 (P) C57BL/6J 성인 마우스에 있는 적외선 창고. 조직은 주어진 프로토콜에 따라 분리되었고, 10% 중성 완충포르말린에서 하룻밤 고정, 처리되고, 파라핀에 내장하였다. 5 μm 단면을 H&E로 염색시켰다. 대부분의 이미지는 100배 배율로 촬영되었습니다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이산 지방세포 클러스터의 다양한 분자 및 기능적 특성의 중요성이 점점 더 인식됨에 따라, 현장 내의 조사자가 추가 분석을 위해 지방 창고를 균일하게 식별하고 절제하는 것이 중요합니다. 현재까지 표준화된 지역화 및 광범위한 마우스 지방 창고의 격리를 위한 프로토콜은 거의 없습니다. 이전에 공표된 방법은 주로 하나 또는 두 개의 창고에 초점을 맞추고 있으며, 다른 조사자들에 의한 균일한 식별 및 절제에 필요한 세부 사항이 부족하다18,19. 이 원고는 해부학 적 위치와 마우스를 통해 일반적으로 연구및 덜 알려진 창고의 정확한 해부에 대한 심층 가이드를 제공하기 때문에 지방 생물학 분야에 소설과 중요한 기여이다. 총 해부학 적 위치와 조직학적 분석은 지방 세포 틈새의 다양성을 보여주기 위해 제공됩니다.
이 프로토콜을 사용하여 개별 지방 창고를 성공적으로 격리하는 것은 몇 가지 중요한 단계에 따라 달라집니다. 깨끗한 해부 환경의 유지 보수는 매우 중요합니다. 70% 에탄올은 해부 트레이 및 도구에서 오염된 모발이나 혈액을 제거하는 데 필요에 따라 사용될 수 있습니다. 후부 피하 WAT를 분리할 때, 두 층이 WAT를 노출하기 위해 효율적으로 분리될 수 있도록 피부의 초기 절개가 밀접하게 연관된 복강을 관통하지 않는 것이 필수적이다. 마찬가지로 복강 내용을 노출하기 위해 복벽을 절단 할 때 절개는 소화 원소와의 오염을 방지하기 위해 기본 내장을 천공해서는 안됩니다. 간경간 BAT는 WAT 오염을 방지하기 위해 주변 조직에서 신중하게 제거되어야 하며, 이는 향후 분석을 왜곡할 것입니다. 후방 피하 등두, 인과식 및 둔부 창고의 일관된 식별은 프로토콜에 설명된 정확한 해부학 적 랜드 마크의 활용에 달려 있습니다. 이러한 창고 간의 구분은 특히 중요합니다. 창고는 연속적으로 보일 수 있지만, 중앙에 위치한 싱기날 지방세포는 주변 의 지방세포보다 갈색과 같은 특성을 더 쉽게 얻습니다.
이 프로토콜을 사용하여 단리된 지방 조직은 다양한 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 조직학적 평가(예: H&E 염색, 면역 조직 화학)에 추가하여, 지방 조직은 전사 조절에서 번역 후 단백질 수정에 이르기까지 다양한 분자 분석에 사용될 수 있습니다. 개별 창고 내의 지방 세포 및 기질 혈관 세포는 콜라게나아제 소화 및 분동 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 이 분획은 그 때 분자, 신진 대사 및 세포 배양 연구 결과를 위해 이용될 수 있습니다. 디포 이식은 또한 생체 대사 및 효소 세포 세포 에 사용될 수 있다.
마우스 지방 조직의 격리 및 절제 중에 몇 가지 도전과 제한이 발생합니다. 첫째, 인간에서 생리적으로 중요한 몇몇 창고는 마른, 성인 마우스에서 일반적으로 나타나지 않습니다. 예를 들면, 인간에 있는 중요한 내장 창고인 omental WAT는, 유전으로 또는 규정식 유도한 뚱뚱한 마우스에서만 보일 수 있습니다. 그러나 일부 창고의 확장은 영양 문제 나 약물 치료에 의해 유도 될 수 있습니다. 예를 들어, 고지방 다이어트 수유는 오멘탈 및 심낭 WAT의 확장을 일으킬 수 있습니다. 근육간 WAT는 골격근 손상25,26 또는 고지방식이요법(27)에의해 유도될 수 있다. 규제된 BMAT는 고지방 식단, 칼로리 제한 및 티아졸리딘디온 치료11,28을포함한 다양한 과제에 대응하여 확장된다. 둘째, 마우스의 작은 크기 때문에, 분자 또는 신진 대사 분석을 위한 충분한 견본을 얻는 것은 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 후속 분석을 위한 충분한 순수한 골수 지방세포의 분리는 여러 마우스에서 뼈를 풀링한 후에도 도전적입니다. 셋째, 특정 창고의 테두리를 정확하게 정의하는 것은 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 후방 피하 WAT는 하나의 연속 적인 창고로 보이지만 실제로는 이산 도르솔바, 인큐니컬 및 둔부 창고로 구성됩니다. 추가적으로, 회신은 매우 뚱뚱한 동물에 있는 gonadal 및 retroperitoneal 창고 둘 다에 융합되는 것처럼 보일 수 있습니다. 인접한 창고 사이의 뚜렷한 경계가 부족하면 이러한 조직을 깨끗하게 격리하기가 어려울 수 있습니다. 그러나 이 해부 프로토콜은 조사자에게 광범위한 마우스 지방 창고의 정확하고 재현 가능한 해부를 위한 상세한 아틀라스 및 단계별 지침을 제공합니다. 위에서 설명한 이산 마우스 지방 창고의 식별 및 격리에 대한 현장 전반의 표준화는 의심할 여지없이 이전의 발달, 유전자 발현 및 국소 및 전신 기능의 차이를 더 설명하는 데 도움이 될 것입니다. 밑에 공부한 지방세포 틈새 시장.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
O.A.M.은 NIH 교부금 DK062876 및 DK092759에 의해 지원됩니다. D.P.B.는 미시간 대학 의학 과학자 교육 프로그램 (T32GM007863), 조직 발생에 있는 미시간 대학 교육 프로그램 (T32HD007605), 미시간 랙햄 메리트 펠로우십 대학 및 타이레놀 미래 치료 동호회에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
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