Summary
Adipocytes bestaan in discrete depots en hebben verschillende rollen binnen hun unieke micro-omgevingen. Aangezien regionale verschillen in het adipocyten karakter en de functie worden blootgelegd, is gestandaardiseerde identificatie en isolatie van depots cruciaal voor de vooruitgang van het veld. Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor de excisie van verschillende muis vetweefdepots.
Abstract
Adipeus weefsels zijn complexe organen met een breed scala van functies, met inbegrip van opslag en mobilisatie van energie in reactie op lokale en mondiale behoeften, ontkoppeling van metabolisme om warmte te genereren, en de afscheiding van zijn om te reguleren van het hele lichaam homeostase en immuunresponsen. Opkomende onderzoek is het identificeren van belangrijke regionale verschillen in de ontwikkelings-, moleculaire, en functionele profielen van adipocytes gelegen in discrete depots door het hele lichaam. Verschillende eigenschappen van de depots zijn medisch relevant, omdat stofwisselingsziekten vaak depot-specifieke effecten aantonen. Dit protocol zal onderzoekers voorzien van een gedetailleerde anatomische Atlas en dissectie gids voor de reproduceerbare en nauwkeurige identificatie en excisie van diverse muizen vetweefsels. Gestandaardiseerde dissectie van discrete vetweefdepots zal gedetailleerde vergelijkingen van hun moleculaire en metabole kenmerken en bijdragen aan lokale en systemische pathologische toestanden onder verschillende voedings-en milieuomstandigheden mogelijk maken.
Introduction
Adipeus weefsels spelen kritieke rollen in whole-body homeostase, met inbegrip van opslag en vrijlating van energie in reactie op lokale en mondiale behoeften, thermoregulatie, en afscheiding van zijn om de energiebalans te reguleren, metabolisme en immuunresponsen1 , 2. adipocytes worden verspreid door het hele lichaam in discrete depots, en in sommige gevallen dienen gespecialiseerde rollen binnen hun micro-omgevingen3,4,5. Historisch, de studie van vetweefsel heeft gecentreerd op witte vetweefsel (WAT), en haar rol in het handhaven van energie homeostase. De meeste adipocytes worden verspreid door het hele lichaam in subcutane en viscerale WAT depots. De kenmerken van deze depots zijn belangrijk voor de differentiële gevoeligheid voor metabole ziekten. Subcutane adipocyten, gelegen onder de huid, zijn in verband gebracht met beschermende metabole effecten5. Viscerale adipocytes, die de vitale organen omringen en zijn opgenomen in de gonadale, perirenal, retroperitoneale, omental en pericardiale depots, zijn vaak gekoppeld aan metabole stoornissen, waaronder type 2 diabetes en cardiovasculaire aandoening2 . Bruine vetweefsel (BAT) zijn ook uitgebreid bestudeerd. Bruin en bruin-achtige adipocytes Express ontkoppeling eiwit 1 (UCP1) en spelen belangrijke rollen in adaptieve thermogenese en glucose homeostase6,7. Klassieke bruine adipocytes zijn opgenomen in de interscapular BAT depot8. Clusters van bruin adipocytes zijn ook gevonden op andere locaties, met inbegrip van supraclavicular, infra/subscapulaire, cervicale, paravertebrale en periaorta depots8,9.
In aanvulling op hun locatie in grote WAT en BAT depots, adipocytes bestaan in discrete niches door het hele lichaam4, waar ze gespecialiseerde functies kunnen uitvoeren binnen hun respectieve micro-omgevingen. Bijvoorbeeld, beenmerg vetweefsel (BMAT) fungeert als een lipide reservoir, is een belangrijke bron van circulerende adiponectine, en nauw samenwerkt met osteoblasten, osteoclasten, en hematopoietische cellen10,11. Dermale adipocyten dragen bij aan wijdverbreide processen, waaronder wondgenezing, immuunrespons, thermoregulatie en haarfollikel groei12,13. Verder, epicarbel adipocytes kan produceren verschillende zijn en chemokines die lokale en systemische effecten op de ontwikkeling en de progressie van coronaire hartziekte uitoefenen14. Uitbreiding van Inter/intramusculaire WAT is positief gecorreleerd met verhoogde adipositeit, systemische insulineresistentie, en verminderde spierkracht en mobiliteit15. Daarnaast dienen popliteale adipocytes als een lipide reservoir voor lymfatische expansie tijdens infectie16. Hoewel de specifieke rollen van verschillende articulaire depots over het algemeen onbekend zijn, wordt het Hoffa depot (infrapatellar) binnen de knie nu verondersteld om bij te dragen aan pathologieën, waaronder anterieure kniepijn en osteoartritis17.
Terwijl regionale verschillen in het adipocyten karakter en de functie intensief worden bestudeerd, wordt het veld momenteel beperkt door het ontbreken van een gestandaardiseerd protocol voor de identificatie en de dissectie van diverse muis depots. Eerder gepubliceerde methoden hebben meestal de isolatie van een of twee specifieke depots beschreven en missen het detailniveau dat nodig is voor uniforme excisie18,19. Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, biedt een uitgebreide handleiding voor de specifieke anatomische locaties en isolatie stappen van veel verschillende muis vetweefdepots. Hoewel WAT depots de primaire focus van dit manuscript zijn, wordt de excisie van interscapular BAT ook gedetailleerd beschreven. Vetweefsel dat met dit protocol wordt uitgesneden, kan worden gebruikt voor een breed scala aan experimentele eindpunten, waaronder explant studies, histologie en genexpressie analyses.
Het doel van dit manuscript is om onderzoekers een gedetailleerd protocol te bieden om zowel prominente als minder bestudeerde depots voor muizen te identificeren en te isoleren (Figuur 1). Deze bron zal een vollediger onderzoek van de ontwikkelings-, moleculaire en functionele kenmerken van adipocytes in diverse niches vergemakkelijken.
Figuur 1: schematische weergave van de depots van muis vetweefsels ontleed in dit protocol. Deze afbeelding is aangepast van Bagchi et al., 20184. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier procedures worden uitgevoerd met de goedkeuring van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.
1. euthanisatie
Opmerking: Voor het doel van dit video protocol worden 4 tot 6 maanden oude C57BL/6J muizen gebruikt.
- Plaats de muis in een Isofluraan vaporizer kamer en stel de Isofluraan stroom in op 5% of meer. Ga door met de blootstelling aan Isofluraan tot een minuut na het ademhalen. Verwijder vervolgens de muis uit de vaporizer kamer en bevestig euthanasie met een goedgekeurde secundaire maatregel.
Opmerking: Goedgekeurde secundaire maatregelen zullen variëren per instelling en dierlijk protocol en kunnen cervicale dislocatie of onthoofding omvatten. - Plaats de geëchaniseerde muis op de dissectie-pan. Steriliseren de rugspieren en ventrale buitenoppervlakken van de muis met 70% ethanol. Zorg ervoor dat het buitenoppervlak van de muis voldoende nat is om besmetting van bont tijdens het dissectie te minimaliseren.
2. identificatie en isolatie van grote subcutane Adipese Ddepots (anterieure subcutane, Dorsolumbar, inguinale, Gluteus) en Interscapular bruin Aadipeweefsel
- Identificeren en isoleren van anterieure subcutane Wat
Opmerking: Anterieure subcutane WAT bevindt zich tussen de scapulae, aflopend van de nek naar de axillae van de muis7. Dit depot is ook beschreven als supraorbitalis8 of interscapular20 wat en ligt direct bovenop het interscapular bat depot.- Om het voorste subcutane depot te isoleren, leg je de muis op zijn buik in een liggende positie. Bevestig de bovenste en onderste ledematen aan de dissectie pan met dissectie pinnen.
- Gebruik de tang om de rughuid van de nek op te tillen. Gebruik de Iris schaar om een kleine (1 mm) snede in de huid te maken.
- Steek een lemmet van de Iris schaar in de eerste snede en maak een middenlijn verticale incisie (2 – 3 cm) door de huid, beginnend bij het nek van de nek en afdalen langs de wervelkolom naar mid-back.
- Maak twee horizontale incisies (1 cm elk) met behulp van de Iris schaar, lateraal uit te breiden van middellijn, aan de boven-en onderkant van de initiële verticale incisie.
- Gebruik de tang om de huid voorzichtig terug te pellen en het voorste subcutane depot bloot te leggen.
- Gebruik Iris schaar om het depot te verwijderen na de natuurlijke randen van het weefsel.
Opmerking: Deze methode isoleert zowel anterieure subcutane WAT en interscapular BAT. - Plaats het ontleed depot op de dissectie pan en verwijder voorzichtig de vervuilende VLEERMUIS met Iris schaar.
- Identificeren en isoleren c lassical bat
Opmerking: De klassieke VLEERMUIS bevindt zich onder het voorste subcutane WAT depot.- Om BAT te isoleren, gebruik je Iris-schaar om horizontaal langs de onderrand van het voorste subcutane weefsel te snijden, na de natuurlijke rand van het depot.
- Gebruik vervolgens de Iris-schaar om twee verticale incisies langs de laterale randen van het depot te maken, na de natuurlijke randen van het weefsel.
- Gebruik de tang om het depot voorzichtig om te draaien en onthul de vlindervormige interscapular VLEERMUIS ingebed in de WAT. Zorgvuldig ontleden de VLEERMUIS uit de omringende WAT.
- Identificeren en isoleren posterieure subcutane Wat,
- Leg de muis op zijn rug in rugligging.
- Na het vastzetten van de bovenste en onderste ledematen met dissectie pinnen, gebruik je de tang om de huid op te tillen aan de basis van het borstbeen en maak je een kleine (1 mm) snede in de huid.
- Steek een lemmet van de Iris schaar in de eerste snede en maak een middenlijn incisie (4 – 5 cm) door de huid, beginnend bij de basis van het borstbeen en aflopend naar de voet van de staart. Wees voorzichtig bij het maken van deze incisie omdat de ventrale huid erg dun is en nauw verbonden is met de onderliggende peritoneale holte wand.
- Maak twee horizontale incisies (1 cm elk) met behulp van Iris schaar, lateraal uit te breiden van middellijn, aan de bovenkant van de initiële verticale incisie.
- Gebruik de tang om de huid van de peritoneale Holte en het been voorzichtig terug te pellen om de posterieure subcutane WAT te vinden, die geassocieerd moet blijven met de huid. Beveilig de uitgestrekte huid met dissectie pinnen om volledige excisie van de WAT te verlichten.
Opmerking: Hoewel de posterieure subcutane wat continu lijkt te zijn, bestaat het eigenlijk uit drie discrete depots: dorsolumbar, Inguinal en bilspieren1. Het dorsolumbar depot strekt zich uit van de lumbale wervelkolom tot de voet van de achterledemaat. Het driehoekige inguinale depot strekt zich uit van de voet van de achterledemaat, ventraal over de lies, en bevat een prominente lymfeklier. Het bilspieren depot strekt zich uit van de bodem van de lies en wikkelt rond het been naar de voet van de staart.
3. identificatie en isolatie van viscerale Vetweeftjes (gonadale, Perirenal, Retroperitoneale, Omental, Pericardial)
- Identificeren en isoleren viscerale wat depots
Opmerking: WAT depots, die grotendeels zijn opgenomen in de thoracale en peritoneale Holten, houden de muis in rugligging. Bevestig de bovenste en onderste ledematen aan de dissectie pan met dissectie pinnen.- Gebruik de tang om de dunne peritoneale holte aan de basis van het borstbeen op te tillen en maak een kleine snede (1 mm) met Iris schaar.
- Steek een lemmet van de Iris schaar in de snede en maak een dalende verticale incisie (4 – 5 cm) van de bovenkant van de peritoneale Holte (basis van het borstbeen) naar het rectum.
- Maak twee horizontale incisies (elk 1 cm) met Iris schaar, lateraal van de middenlijn, aan de boven-en onderkant van de verticale incisie.
- Gebruik de tang om het peritoneum terug te pellen en de inhoud van de buikholte bloot te leggen. Speld het uitgerekt peritoneum aan de dissectie-pan.
- Identificeren en isoleren g onadal Wat
Opmerking: Gonadale WAT omringt de baarmoeder en eierstokken bij vrouwtjes (ovariële of parametetrial) en de epididymis en testes bij mannen (epididymale). Ovariële WAT omringt de eierstokken, baarmoeder en blaas. Bij zwaarlijvige dieren, gonadale en perirenale wat kan lijken te zijn continu-in dit geval, scheiden de depots bij de baarmoeder hoorn en eierstokken. Epididymale wat wordt gevonden gebonden aan de epididymis, teelballen, en de prominente epididymale bloedvat.- Zoek de geslachtsklieren (teelballen of eierstokken) en gebruik de tang om de bijbehorende gonadale WAT op te heffen.
- Gebruik Iris schaar om de WAT van de geslachtsklieren zorgvuldig te accijnzen.
- Identificeren en isoleren p erirenal Wat
Opmerking: Perirenal WAT omringt de nieren bilateraal. Bij zwaarlijvige dieren, kan dit depot lijken te verlengen ondeugdelijkheid naar de top van de baarmoeder hoorn en eierstokken. Hoewel de perirenale wat traditioneel is geclassificeerd als een visceraal depot21, hebben verschillende groepen het geïdentificeerd als een bruin depot op basis van Lineage tracing en radioolabeled glucose opname studies8,9, 20. histologisch bestaat het uit een mengsel van witte en bruine adipocytes.- Om de perirenale depot, zoek de nier en gebruik de tang om het op te heffen en trek het middelpunt om een duidelijke scheiding tussen de perirenale en retroperitoneale depots te zien.
- Accijnzen de WAT direct geassocieerd met de nieren. Zorg ervoor dat de bijnieren, gelegen boven de nieren, worden verwijderd uit de WAT.
- Identificeren en isoleren r etroperitoneale Wat
Opmerking: Retroperitoneale WAT bevindt zich in een paravertebrale positie, langs de grens tussen de achterste buikwand en het ruggenmerg.- Om dit depot te accijnzen, gebruik je de tang om de nier op te tillen en naar de middellijn om de grens tussen de perirenale en retroperitoneale depots duidelijk te zien.
Opmerking: Bij zwaarlijvige dieren kan het identificeren van deze grens een uitdaging zijn. - Gebruik vervolgens de Iris-schaar om de retroperitoneale WAT van de achterste peritoneale wand zorgvuldig te ontleden.
- Om dit depot te accijnzen, gebruik je de tang om de nier op te tillen en naar de middellijn om de grens tussen de perirenale en retroperitoneale depots duidelijk te zien.
- Identificeren en isoleren van omental WAT
Opmerking: Omental WAT is gelegen langs de grotere kromming van de maag. Hoewel omental vetweefsel een belangrijk depot bij mensen is, is het meestal alleen aanwezig in morbide zwaarlijvige muizen.- Om viscerale omental WAT te identificeren, gebruik je de tang om de maag op te tillen. Gebruik Iris schaar om het bijbehorende vetweefsel langs de inferieure grens van de maag te verwijderen. Niet verwarren omental WAT met de alvleesklier.
- Identificeren en isoleren van mesenterische Wat
Opmerking: Mesenteric WAT is een web-achtige structuur rondom en geassocieerd met de kleine en grote darmen.- Om dit depot accijns, verwijder de darmen uit de rest van het spijsverteringskanaal door snijden aan de basis van de maag en het rectum. Gebruik de tang om de darmen uit de viscerale holte te tillen en ze te ontrafelen.
- Gebruik Iris schaar om zorgvuldig te ontleden de mesenteriale wat weg van de darmen, beginnend bij de twaalfvingerige darm en verder tot het einde van de dikke darm. Verwijder zorgvuldig lymfeklieren die nauw samenhangen met het mesenterische depot.
- Identificeren en isoleren van pericardiale wat
Opmerking: Pericardial wat is gelegen buiten het viscerale hartzakje en op het buitenoppervlak van het pariëtale hartzakje, vaak langs het inferieure aspect van het hart14.- Om toegang te krijgen tot de thoracische Holte, houd de muis in een liggende positie. Bevestig de bovenste en onderste ledematen aan de dissectie pan met dissectie pinnen.
- Gebruik de tang om het xyphoid-proces op te heffen (kraakbeen aan de basis van het sternum) en maak een kleine (1 mm) snede in de thoracische holte wand.
- Steek een lemmet van de Iris schaar in de snede en maak twee horizontale incisies (elk 1 cm) lateraal vanaf de basis van het borstbeen. Dit zal het diafragma en de inferieure grens van de thoracische holte blootstellen.
- Gebruik ontleed schaar om twee stijgende verticale incisies (3 – 4 cm) door de ribcage te maken, die superieur zijn van de laterale grenzen van de thoracale Holte tot de clavicle.
- Gebruik de tang om de ventrale helft van de ribcage op te tillen. Gebruik de ontleed schaar om een laatste snede (2 cm) langs de inferieure lengte van de sleutelbeen te maken om de ribbenkast te verwijderen en de inhoud van de thoracische holte bloot te leggen.
- Indien aanwezig, zorgvuldig ontleden de pericardiale vetweefsel van het buitenoppervlak van het pericardium.
4. identificatie en isolatie van andere Vetweefdepots
- Identificeren en isoleren van epicarbel WAT
Opmerking: Epicardial wat is opgenomen in het viscerale hartzakje en wordt direct geassocieerd met het oppervlak van het myocardium.- Indien aanwezig, kunnen epicarbel adipocytes histologisch worden waargenomen na isolatie en fixatie van het geperfectionde hart in 10% neutrale gebufferde formaline gedurende 24 uur.
- Identificeren en isoleren p opliteale Wat
Opmerking: Popliteale wat is gelegen in de popliteale Fossa in de achterste knie en bevat een grote lymfeklier. Dit depot is niet typisch zichtbaar bij jonge dieren.- Om popliteale wat te isoleren, gebruikt u de Iris-schaar om de huid voorzichtig van de onderkant van het achterdeel naar de voet te verwijderen.
- Plaats de Patella tegen de dissectie pan en bevestig de uitgestrekte poot met een speld in de voet. Zorg ervoor dat de popliteale Fossa aan de achterkant van de knie naar boven is gericht.
- Gebruik Iris schaar om een snede te maken op de inferieure grens van de mediale en laterale koppen van de gastrocnemius-spier. Gebruik de tang om de spier op te tillen en het driehoekige popliteale depot te onthullen.
- Gebruik de Iris schaar om het depot langs de natuurlijke weefsel grenzen te accijnzen.
- Identificeren en isoleren van de huid WAT
Opmerking: Dermale WAT is een dun laagje adipocytes gelegen tussen de reculaire dermis en de panniculus Carnosus spier laag.- Om dermale adipocytes te identificeren met histologische methoden, plaats de muis op zijn buik in een liggende positie. Na het vastzetten van de bovenste en onderste ledematen met dissectie pinnen, spray het buitenoppervlak van de muis met 70% ethanol om de huid nat te maken.
- Gebruik een scalpel om de bevoafde vacht te verwijderen uit een vierkant gedeelte van de huid op de achterkant van de muis.
- Gebruik Iris schaar om zorgvuldig te accijnzen het geschoren gedeelte van de huid, die zal omvatten de reculaire dermis, dermale WAT, panniculus Carnosus, en sommige subcutane WAT.
- Gebruik een scalpel om de huid te snijden in dunne verticale stroken.
- Plaats de dunne verticale stroken met de kleverige, subcutane WAT laag naar beneden gericht.
- Begin aan één uiteinde en rol de strook op zichzelf om een spiraal te vormen. De kleverige onderhuidse WAT laag aan de buitenkant van de spiraal zorgt ervoor dat de rol zijn vorm behoudt tijdens fixatie.
- Plaats de spiraal in een put van een 24-pits bord met 10% neutrale gebufferde formaline voor 24 uur vóór de histologische verwerking22.
- Identificeren en isoleren van intermusculaire WAT
Opmerking: Intermusculaire WAT is breed gedefinieerd als adipocytes gelegen onder de diepe fascia van spieren. Deze term omvat adipocytes afgewisseld tussen spiervezels van skeletspieren, ook bekend als intramusculaire WAT, en adipocytes gelegen binnen spierbundels zelf. Wild type muizen hebben over het algemeen geen grote aantallen intermusculaire adipocyten. Echter, het is mogelijk onder bepaalde voorwaarden om te identificeren van intermusculaire WAT door histologische methoden. Onder sommige omstandigheden, intermusculaire adipocytes kan ook worden gevonden in gladde spieren, zoals het diafragma.- Om de tibialis voorste (TA) spier te isoleren, bijvoorbeeld, plaats de muis op zijn rug in rugligging en bevestig de onderste ledematen aan de dissectie pan met behulp van dissectie pinnen. Bevochtig de huid met 70% ethanol om besmetting met bont te minimaliseren.
- Gebruik de Iris-schaar om de huid voorzichtig van het been te verwijderen en de spiergroep quadriceps boven de knie op de dijbeen schacht en de ta onder de knie op het ventrale oppervlak van de Tibia te blootstellen.
Opmerking: De ta is dik in de buurt van het proximale uiteinde van de tibia en meer tendineuze in de buurt van het distale uiteinde. - Gebruik Iris schaar om een stukje van de spier te accijnzen en fixeer in 10% neutraal gebufferde formaline voor 24 uur voorafgaand aan histologische verwerking22.
- Identificeren en isoleren van intra-articulaire WAT depots
Opmerking: Intra-articulaire WAT depots bevinden zich binnen synoviale gewrichten.- Om te identificeren infrapatellar WAT, bijvoorbeeld, door histologische methoden, oogst been botten zoals beschreven in de BMAT sectie.
- Na het verwijderen van de femur-tibiale complex, gebruik Iris schaar en gaas pads te verwijderen zo veel spier en bindweefsel mogelijk. Breek het tibiofemorale gewricht niet.
- Bevestig het femur-tibiale complex in 10% neutraal gebufferde formaline voor 24 uur voorafgaand aan de decalcificatie en histologische verwerking (hieronder beschreven, stap 4.6.8).
- Identificeren en isoleren van beenmerg vetweefsel
Opmerking: Beenmerg vetweefsel (BMAT) is opgenomen in de botten, afgewisseld met hematopoietische cellen. Anatomisch kan BMAT worden geclassificeerd als constitutief (distale tibia en caudale wervels) of gereguleerd (middel-tot-proximale tibia, femur en lumbale wervels)10,11. Schone isolatie van beenmerg adipocyten voor RNA en eiwit analyses is uitdagend bij muizen. Muis botten kunnen echter gemakkelijk worden geoogst, vastgezet, gedecalcificeerd en paraffineingebed voor histologische analyses.- Om been botten te oogsten, bijvoorbeeld, Verwijder eerst de benen van de muis. Gebruik dissectie schaar om het acetabulofemorale gewricht te snijden, waarbij de femur hoofd intact blijft.
- Gebruik de Iris-schaar om de huid voorzichtig van het been te verwijderen en de beenspieren te onthullen.
- De hoofd spieren van het dijbeen en de Tibia voorzichtig weglopen met Iris schaar en gaas pads.
- Wanneer het dijbeen wordt blootgesteld, volgt u de rand van het bot tot de articulatie van het bekken en het dijbeen en laat u de dijbeenkop voorzichtig los van de acetabulofemorale verbinding. Gebruik gaas om alle overgebleven weefsels van het dijbeen te reinigen.
- Volg de rand van de Tibia tot het enkelgewricht. Laat de mediale malleolus, die zich op het puntje van de tibia bevindt, voorzichtig los van het enkelgewricht.
- Zodra het femur-tibiale complex is geïsoleerd, Verwijder zoveel mogelijk spieren en bindweefsel met Iris schaar en/of gaas.
- Scheid de Tibia van het dijbeen door een lemmet van de Iris-schaar in het tibiofemorale gewricht te steken en zachtjes door de mediale en laterale neven ligamenten en de ligamenten van voorste en posterieure kruislingen te snijden. Verwijder de capsule van het kniegewricht niet om ervoor te zorgen dat het Tibia intact blijft. Gebruik gaas om achtergebleven weefsel van de Tibia te reinigen.
- Repareer de botten in 10% neutrale gebufferde formaline voor 24 uur bij kamertemperatuur en was en bewaar ze op basis van toekomstige behoeften.
- Om botparameters te analyseren met behulp van microcomputer tomografie (μCT), slaat u botten op in de fosfaatbuffer van Sorensen, pH 7,423.
- Voor BMAT kwantificering en histologische analyses, decalcify botten in 14% EDTA, pH 7,4, voor 10-14 dagen.
- Na de decalcificatie, gebruik osmium tetroxide kleuring en μCT analyse om BMAT24te kwantificeren. Anders, verwerken en paraffine-insluiten botten voor histologie23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle identificatie en isolatie van verschillende muis vetweefdepots kan worden bereikt met behulp van het hierboven beschreven protocol. De bruto anatomische locaties van subcutane (A, E-F), bruin (B), viscerale (C, D, G-J) en popliteale (K) depots worden weergegeven in Figuur 2.
Figuur 2: bruto anatomische locaties van muis adipedepots. Grove anatomie van (A) anterieure subcutane, (b) bruin, (C) epididymale (b, blaas), (D) ovariële (u, baarmoeder hoorns), (E) posterieure subcutane (dorsolumbar (D), inguinale (i), bilspieren (g)), (F) inguinaal, (G) mesenteric, (h) perirenale (k, nier), (I) retroperitoneale (k, nier), (J) pericardiale (H, hart), en (k) popliteale adipedepots in C57BL/6j volwassen muizen. Pijlen wijzen naar specifieke depots als meerdere depots worden afgebeeld. Relevante organen worden aangewezen met passende letters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Histologische kenmerken van subcutaan (A-D), bruin (E), visceraal (F-K), popliteale (L), constitutief (M) en gereguleerd merg vetweefsel (N), intramusculaire (O) en infrapatellar (P) vetweefdepots werden geëvalueerd door hematoxyline en eosine (H & E kleuring22 en worden weergegeven in Figuur 3.
Figuur 3: histologische evaluatie van discrete muis vetweefdepots. Histologie van (a) anterieure subcutane, (B) dorsolumbar, (C) inguinale, (D) Gluteaal, (E) bruin, (F) gonadale, (G) Perirenal, (H) retroperitoneale, (I) omental, ( J) mesenteric, (K) Pericardial, (L) Popliteal, (M) constitutief en (N) gereguleerd beenmerg vetweefsel, (O) intermusculaire, en (P) infrapatellaire depots in C57BL/6j volwassen muizen. Weefsels werden geïsoleerd volgens het gegeven protocol, vaste nacht in 10% neutrale gebufferde formaline, verwerkt, en ingebed in paraffine. 5 μm secties werden gekleurd met H & E. De meeste beelden werden genomen bij 100x vergroting; Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aangezien het belang van de diverse moleculaire en functionele kenmerken van afzonderlijke adipocyten clusters steeds meer wordt erkend, is het van cruciaal belang dat onderzoekers binnen het veld uniforme depots voor verdere analyses identificeren en accijnzen. Tot op heden bestaan er weinig protocollen voor gestandaardiseerde lokalisatie en isolatie van het brede scala aan muis vetweefdepots. Eerder gepubliceerde methoden zijn voornamelijk gericht op een of twee depots en missen de details die nodig zijn voor uniforme identificatie en excisie door verschillende onderzoekers18,19. Dit manuscript is een nieuwe en belangrijke bijdrage aan het gebied van adipeus biologie, omdat het een diepgaande gids biedt voor de anatomische locatie en nauwkeurige dissectie van algemeen bestudeerde en minder bekende depots in de muis. Bruto anatomische locatie en histologische analyses worden verstrekt om de diversiteit van adipocyten niches aan te tonen.
Een geslaagde isolatie van afzonderlijke vetweefdepots met dit protocol is afhankelijk van een aantal kritieke stappen. Onderhoud van een schone dissectie omgeving is cruciaal; 70% ethanol kan zo nodig worden gebruikt om verontreinigende haren of bloed uit de dissectie lade en gereedschappen te verwijderen. Bij het isoleren van posterieure subcutane WAT, is het noodzakelijk dat de initiële incisie in de huid niet doordringen in de nauw geassocieerde peritoneale Holte, zodat de twee lagen efficiënt kunnen worden gescheiden om de WAT te blootstellen. Evenzo, bij het snijden door de peritoneale wand om de inhoud van de buikholte bloot te leggen, mogen incisies de onderliggende darmen niet perforeren om besmetting met spijsverterings elementen te voorkomen. Interscapular BAT moet zorgvuldig worden uitblinken uit het omringende weefsel om WAT besmetting te voorkomen, die toekomstige analyses zal scheeftrekken. Een consistente identificatie van de achterste subcutane dorsolumbar, inguinale en bilspieren depots is afhankelijk van het gebruik van precieze anatomische monumenten die in het protocol worden beschreven. Het onderscheid tussen deze depots is bijzonder belangrijk; Hoewel de depots kan lijken te zijn continue, centraal gelegen inguinale adipocytes verwerven bruin-achtige kenmerken gemakkelijker dan hun omringende tegenhangers.
De vetweefsels geïsoleerd met behulp van dit protocol kunnen worden geanalyseerd met behulp van een verscheidenheid van technieken. Naast histologische evaluatie (bijv. H & E kleuring, immunohistochemie), kunnen vetweefsel worden gebruikt voor een breed scala aan moleculaire analyses, van regulering van transcriptie tot posttranslationele eiwit modificaties. Adipocytes en stromale vasculaire cellen binnen individuele depots kunnen worden geïsoleerd door Collagenase spijsvertering en differentieel centrifugeren. Deze fracties kunnen vervolgens worden gebruikt voor moleculaire, metabole en celkweek studies. Depot explantaten kan ook worden gebruikt voor ex vivo metabole en enzymatische testen.
Verschillende uitdagingen en beperkingen ontstaan tijdens de isolatie en excisie van muis vetweefsel. Ten eerste zijn sommige depots die fysiologisch belangrijk zijn bij de mens niet vaak aanwezig in mager, volwassen muizen. Bijvoorbeeld, omental WAT, dat is de belangrijkste viscerale depot bij de mens, kan alleen worden gezien in genetisch of dieet-geïnduceerde zwaarlijvige muizen. De uitbreiding van sommige depots kan echter worden geïnduceerd door voedings uitdagingen of medicamenteuze behandelingen. Bijvoorbeeld, vetrijke dieetvoeding kan leiden tot de uitbreiding van omental en pericardiale wat. Intermusculaire wat kan worden geïnduceerd door skeletspier letsel25,26 of hoog vet dieet27. Gereguleerde bmat breidt uit in reactie op verschillende uitdagingen, waaronder vetrijke voeding, calorie beperking en behandeling met thiazolidinedion11,28. Ten tweede kan, vanwege de geringe omvang van muizen, het verkrijgen van voldoende monster voor moleculaire of metabole analyses moeilijk zijn. Isolatie van voldoende zuivere beenmerg adipocyten voor daaropvolgende analyses is bijvoorbeeld uitdagend, zelfs na het poolen van botten van meerdere muizen. Ten derde kan het moeilijk zijn om de grenzen van bepaalde depots nauwkeurig te definiëren. Bijvoorbeeld, posterieure subcutane wat lijkt een continu depot te zijn, maar bestaat eigenlijk uit discrete dorsolumbar, inguinale en bilspieren depots. Bovendien, de perirenale kan lijken te worden gesmolten zowel de gonadale en retroperitoneale depots in zeer zwaarlijvige dieren. Het ontbreken van duidelijke grenzen tussen aangrenzende depots kan schone isolatie van deze weefsels uitdagend maken. Dit dissectie protocol biedt onderzoekers echter een gedetailleerde atlas en stapsgewijze begeleiding voor een nauwkeurige en reproduceerbare dissectie van een breed scala aan muis vetweefdepots. Het in het hele veld standaardiseren van de identificatie en isolatie van discrete muizen vetweeftjes die hierboven zijn beschreven, zal ongetwijfeld helpen om verschillen in ontwikkeling, genexpressie en lokale en systemische functies van eerder onderbestudeerde adipocyte niches.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
O.A.M. wordt ondersteund door NIH grants DK062876 en DK092759; D.P.B. wordt ondersteund door de University of Michigan Medical Scientist Training Program (T32GM007863), het opleidingsprogramma van de Universiteit van Michigan in organogenese (T32HD007605), University of Michigan Rackham Merit Fellowship en Tylenol Future Care Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
- Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocyte lineages: tracing back the origins of fat. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (3), 340-351 (2014).
- Bagchi, D. P., Forss, I., Mandrup, S., MacDougald, O. A. SnapShot: Niche Determines Adipocyte Character I. Cell Metabolism. 27 (1), 264-264 (2018).
- Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Frontini, A., Cinti, S. Distribution and development of brown adipocytes in the murine and human adipose organ. Cell Metabolism. 11 (4), 253-256 (2010).
- Zhang, F., et al. An Adipose Tissue Atlas: An Image-Guided Identification of Human-like BAT and Beige Depots in Rodents. Cell Metabolism. 27, 252-262 (2018).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocytes arise from multiple lineages that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications. 5, 4099 (2014).
- Li, Z., Hardij, J., Bagchi, D. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Development, regulation, metabolism and function of bone marrow adipose tissues. Bone. 110, 134-140 (2018).
- Scheller, E. L., Cawthorn, W. P., Burr, A. A., Horowitz, M. C., MacDougald, O. A. Marrow Adipose Tissue: Trimming the Fat. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (6), 392-403 (2016).
- Alexander, C. M., et al. Dermal white adipose tissue: a new component of the thermogenic response. The Journal of Lipid Research. 56 (11), 2061-2069 (2015).
- Kruglikov, I. L., Scherer, P. E. Dermal Adipocytes: From Irrelevance to Metabolic Targets? Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (1), 1-10 (2016).
- Iacobellis, G. Local and systemic effects of the multifaceted epicardial adipose tissue depot. Nature Reviews Endocrinology. 11 (6), 363-371 (2015).
- Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular Fat: A Review of the Consequences and Causes. International Journal of Endocrinology. 2014, 1-11 (2014).
- Pond, C. M. Adipose tissue and the immune system. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 17-30 (2005).
- Kloppenburg, A. I. -F. M. An emerging player in knee osteoarthritis: the infrapatellar fat pad. Arthritis Research & Therapy. 15 (225), 1-9 (2013).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (94), e52174 (2014).
- Casteilla, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods in Molecular Biology. 155, 1-22 (2008).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).
- Parlee, S. D., Lentz, S. I., Mori, H., MacDougald, O. A. Quantifying size and number of adipocytes in adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 93-122 (2014).
- Scheller, E. L., et al. Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues. Nature Communications. 6, 7808 (2015).
- Scheller, E. L., et al. Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo. Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), e71084 (2013).
- Pagano, A. F., et al. Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints. PLoS One. 10 (12), e0144230 (2015).
- Khan, I. M., et al. Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance. International Journal of Obesity. 39 (11), 1607-1618 (2015).
- Sulston, R. J., et al. Increased Circulating Adiponectin in Response to Thiazolidinediones: Investigating the Role of Bone Marrow Adipose Tissue. Frontiers in Endocrinology. 7, 128 (2016).
