Summary
توجد الخلايا الأديبية في مستودعات منفصلة ولها أدوار متنوعة داخل بيئاتها الدقيقة الفريدة. ومع الكشف عن الاختلافات الإقليمية في طابع ووظيفة الخلايا الأديبية، فإن تحديد المستودعات وعزلها بشكل موحد أمر حاسم للنهوض بالميدان. هنا، نقدم بروتوكول مفصل للختان من مختلف مستودعات الماوس الدهنية.
Abstract
الأنسجة الدهنية هي أعضاء معقدة مع مجموعة واسعة من الوظائف، بما في ذلك تخزين وتعبئة الطاقة استجابة للاحتياجات المحلية والعالمية، وفصل التمثيل الغذائي لتوليد الحرارة، وإفراز adipokines لتنظيم التوازن الجسم كله و الاستجابات المناعية. البحوث الناشئة هو تحديد الاختلافات الإقليمية الهامة في الملامح التنموية والجزيئية والوظيفية للخلايا الأديبية الموجودة في مستودعات منفصلة في جميع أنحاء الجسم. خصائص مختلفة من المستودعات ذات الصلة طبيا منذ الأمراض الأيضية غالبا ما تظهر آثار مستودع محددة. وسيوفر هذا البروتوكول للمحققين أطلسا تشريحيا مفصلا ودليلا تشريحيا لتحديد الأنسجة الدهنية المتنوعة واستئصالها. وسيسمح تشريح موحد للمستودعات الدهنية المنفصلة بإجراء مقارنات مفصلة لخصائصها الجزيئية والأيضية ومساهماتها في الحالات المرضية المحلية والمنهجية في ظل مختلف الظروف التغذوية والبيئية.
Introduction
تلعب الأنسجة الدهنية أدوارًا حاسمة في التوازن في الجسم كله، بما في ذلك تخزين الطاقة وإطلاقها استجابة للاحتياجات المحلية والعالمية، والتنظيم الحراري، وإفراز الأديبوكينات لتنظيم توازن الطاقة، والتمثيل الغذائي، والاستجابات المناعية1 , 2.يتم توزيع Adipocytes في جميع أنحاء الجسم في مستودعات منفصلة، وفي بعض الحالات تخدم أدوارمتخصصة داخل البيئات الدقيقة 3،4،5. تاريخيا، تركزت دراسة الأنسجة الدهنية على الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT)، ودورها في الحفاظ على التوازن الطاقة. يتم توزيع معظم الخلايا الأديبية في جميع أنحاء الجسم في مستودعات وات تحت الجلد والحشوية. خصائص هذه المستودعات مهمة للقابلية التفاضلية للأمراض الأيضية. وقد ارتبطت الخلايا الأديبية تحت الجلد، وتقع تحت الجلد، مع الآثار الأيضية واقية5. ترتبط الخلايا الأديبية الحشوية، التي تحيط بالأعضاء الحيوية والواردة داخل مستودعات الغدد التناسلية، المحيطة بالكلى، خلف المستقيم، الأورام، التامور، التامور، بالاضطرابات الأيضية، بما في ذلك مرض السكري من النوع 2 وأمراض القلب والأوعية الدموية2 . كما تمت دراسة الأنسجة الدهنية البني (BAT) على نطاق واسع. البني والبني مثل adipocytes التعبير عن فصل البروتين 1 (UCP1) ولعب أدوار هامة في توليد الحرارة التكيفية والجلوكوز التوازن6،7. وترد الخلايا الأديبية البنية الكلاسيكية في مستودع أفضل التقنيات المتاحة interscapular8. كما توجد مجموعات من الخلايا الأديبية البنية في مواقع أخرى، بما في ذلك المستودعات فوق الكلاف، والأشعة تحت الحمراء/تحت غطاء، وعنق الرحم، والفقرات، والمستودعات المحيطية بالأشعة فوق الحمراء8،و9.
بالإضافة إلى موقعها في مستودعات WAT الرئيسية وBAT، توجد الخلايا الأديبية في محاريب منفصلة في جميع أنحاء الجسم4، حيث يمكن أن تؤدي وظائف متخصصة داخل البيئات الدقيقة الخاصة بها. على سبيل المثال، نخاع العظام الأنسجة الدهنية (BMAT) بمثابة خزان الدهون، هو مصدر رئيسي من تعميم أديبونكتين، ويتفاعل بشكل وثيق مع osteoblasts، osteoclasts، والخلايا المكونة للدم10،11. تساهم الخلايا الأديبسية الجلدية في عمليات واسعة النطاق، بما في ذلك التئام الجروح، والاستجابة المناعية، والتنظيم الحراري، ونمو بصيلات الشعر12،13. وعلاوة على ذلك، قد تنتج الخلايا الأديبية الظهارية العديد من الأديبوكينات والكيماويات التي تمارس تأثيرات محلية ومنهجية على تطور وتطور مرض الشريان التاجي14. وقد ارتبط توسع WAT بين / العضل بشكل إيجابي مع زيادة الدهنية, مقاومة الأنسولين النظامية, وانخفاض القوة العضلية والتنقل15. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا الأديبية البوبليتية بمثابة خزان للدهون للتوسع اللمفاوي أثناء العدوى16. في حين أن الأدوار المحددة لمختلف المستودعات المفصلية غير معروفة عموما، ويعتقد الآن مستودع هوفا (الأشعة تحت الرضفة) داخل الركبة للمساهمة في الأمراض، بما في ذلك آلام الركبة الأمامية وهشاشة العظام17.
وفي حين أن الاختلافات الإقليمية في طابع ووظيفة الخلايا الأديبية قيد الدراسة المكثفة، فإن هذا المجال محدود حالياً بعدم وجود بروتوكول موحد لتحديد وتشريح مستودعات الماوس المتنوعة. وقد وصفت الأساليب المنشورة سابقا عادة عزل واحد أو اثنين من مستودعات محددة وتفتقر إلى مستوى التفاصيل المطلوبة للختان موحدة18،19. يوفر البروتوكول الموضح في هذه المخطوطة دليلاً شاملاً للمواقع التشريحية المحددة وخطوات العزل للعديد من مستودعات الماوس المختلفة. على الرغم من أن مستودعات WAT هي المحور الرئيسي لهذه المخطوطة، إلا أن استئصال أفضل التقنيات المتاحة بين التقنيات المتاحة هو أيضا ً وصف تفصيلي. يمكن استخدام الأنسجة الدهنية المقتطعة باستخدام هذا البروتوكول لمجموعة واسعة من نقاط النهاية التجريبية، بما في ذلك الدراسات الاستئصالية، وعلم الأنسجة، وتحليلات التعبير الجيني.
والهدف من هذه المخطوطة هو تزويد المحققين ببروتوكول مفصل لتحديد وعزل كل من مستودعات الماوس البارزة والأقل دراسة (الشكل 1). هذا المورد سوف يسهل التحقيق أكثر اكتمالا من الخصائص التنموية والجزيئية والوظيفية للخلايا الأديبية داخل منافذ متنوعة.
الشكل 1: تصوير تخطيطي لمستودعات الماوس الدهنية التي تم تشريحها في هذا البروتوكول. تم تكييف هذه الصورة من Bagchi وآخرون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة ميشيغان.
1- القتل الرحيم
ملاحظة: لأغراض بروتوكول الفيديو هذا، يتم استخدام الفئران C57BL/6J البالغة من العمر 4 إلى 6 أشهر.
- ضع الماوس في غرفة مرذاذ الأيسوفلوران واضبط معدل تدفق الأيسوفلوران إلى 5% أو أكثر. استمر في التعرض للأيسوفلوران حتى دقيقة واحدة بعد توقف التنفس. ثم إزالة الماوس من غرفة المرذاذ وتأكيد القتل الرحيم باستخدام تدبير الثانوية المعتمدة.
ملاحظة: وتختلف التدابير الثانوية المعتمدة باختلاف المؤسسات والبروتوكول الحيواني، وقد تشمل خلع عنق الرحم أو قطع رأسه. - ضع الماوس الرحيم على مقلاة التشريح. تعقيم الأسطح الخارجية الظهرية والبطنية للماوس باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪. تأكد من أن السطح الخارجي للماوس رطب بما فيه الكفاية لتقليل التلوث من الفراء أثناء تشريح.
2- تحديد وعزل المستودعات الرئيسية تحت الجلد (الأنسجة الأمامية تحت الجلد، والظهر، والأربية، والجلوتال) والأنسجة البادية البنية البينية
- تحديد وعزل تحت الجلد الأمامي WAT
ملاحظة: يقع WAT تحت الجلد الأمامي بين الكتف، وينحدر من مؤخر الرقبة إلى الإبطمن الماوس7. وقد وصف هذا المستودع بدلا من ذلك بأنه فوق الغطاء8 أو interscapular20 WAT ويقع مباشرة على رأس مستودع أفضل التقنيات المتاحة interscapular.- لعزل مستودع تحت الجلد الأمامي ، ضع الماوس على معدته في وضع عرضة. تأمين الأطراف العلوية والسفلية إلى عموم تشريح مع دبابيس تشريح.
- استخدام ملقط لرفع الجلد الظهري في مؤخر الرقبة. استخدام مقص قزحية لجعل صغيرة (1 ملم) قطع في الجلد.
- أدخل شفرة واحدة من مقص القزحية في القطع الأولي واصنع شقًا عموديًا خط الوسط (2-3 سم) من خلال الجلد، بدءًا من مؤخر الرقبة والنزول على طول العمود الفقري إلى منتصف الظهر.
- قم بإجراء شقين أفقيين (1 سم لكل منهما) باستخدام مقص القزحية، وتمتد أفقياً من خط الوسط، في الجزء العلوي والسفلي من الشق الرأسي الأولي.
- استخدام ملقط لقشر بعناية مرة أخرى الجلد وفضح مستودع تحت الجلد الأمامي.
- استخدام مقص قزحية لإزالة مستودع بعد الحدود الطبيعية للأنسجة.
ملاحظة: هذا الأسلوب يعزل كل من WAT تحت الجلد الأمامي وBAT interscapular. - ضع المستودع المعقم على مقلاة التشريح وإزالة أفضل التقنيات المتاحة الملوثة بعناية باستخدام مقص القزحية.
- تحديد وعزل (ج) أفضل التقنيات المتاحة
ملاحظة: يقع BAT الكلاسيكي تحت مستودع WAT تحت الجلد الأمامي.- لعزل أفضل التقنيات المتاحة، استخدم مقص قزحية القزحية لقطع أفقيا على طول الحافة السفلية من الأنسجة تحت الجلد الأمامية، بعد الحدود الطبيعية للمستودع.
- ثم، استخدم مقص قزحية القزحية لجعل شقين عموديين على طول الحواف الجانبية للمستودع، بعد الحدود الطبيعية للأنسجة.
- استخدم الملقط لقلب المستودع بعناية وكشف أفضل التقنيات المتاحة على شكل فراشة والمدمجة في WAT. تشريح بعناية أفضل التقنيات المتاحة للخروج من WAT المحيطة بها.
- تحديد وعزل تحت الجلد الخلفي وات,
- وضع الماوس على ظهره في موقف supine.
- بعد تأمين الأطراف العلوية والسفلية مع دبابيس تشريح، استخدم ملقط لرفع الجلد في قاعدة القص وجعل صغيرة (1 ملم) قطع في الجلد.
- أدخل شفرة واحدة من مقص القزحية في القطع الأولي واصنع شقًا في خط الوسط (4-5 سم) من خلال الجلد، بدءًا من قاعدة القص والنزول إلى قاعدة الذيل. توخي الحذر عند إجراء هذا الشق لأن الجلد البطني رقيقة جدا ويرتبط ارتباطا وثيقا مع جدار تجويف العضد الكامنة.
- قم بإجراء شقين أفقيين (1 سم لكل منهما) باستخدام مقص قزحية العين، وتمتد أفقياً من خط الوسط، في الجزء العلوي من الشق الرأسي الأولي.
- استخدام ملقط لقشر بعناية مرة أخرى الجلد من تجويف العضد والساق للعثور على وات تحت الجلد الخلفي، والتي ينبغي أن تبقى مرتبطة مع الجلد. تأمين الجلد الممدودة مع دبابيس تشريح لتخفيف الختان الكامل من WAT.
ملاحظة: على الرغم من أن وات تحت الجلد الخلفي يبدو أن تكون مستمرة، وتتألف في الواقع من ثلاثة مستودعات منفصلة: الظهر، الأربية، والجلوتية1. يمتد مستودع الظهر من العمود الفقري القطني إلى قاعدة الطرف الخلفي. يمتد المستودع الأربي الثلاثي من قاعدة البطين الخلفي عبر الفخذ ويحتوي على عقدة لمفية بارزة. يمتد مستودع الغلوتين بشكل أدنى من قاعدة الفخذ ويلف حول الساق إلى قاعدة الذيل.
3. تحديد وعزل مستودعات الدهنية الحشوية (الغدد التناسلية، حول البيريكل، الرجعية، أومينتال، بيريكارديال)
- تحديد وعزل مستودعات وات الحشوية
ملاحظة: مستودعات WAT، التي ترد إلى حد كبير داخل تجاويف الصدر وسوريكون، والحفاظ على الماوس في موقف supine. تأمين الأطراف العلوية والسفلية إلى عموم تشريح مع دبابيس تشريح.- استخدام ملقط لرفع جدار تجويف العضد رقيقة في قاعدة القص وجعل قطع صغيرة (1 ملم) باستخدام مقص قزحية العين.
- أدخل شفرة واحدة من مقص القزحية في القص واصنع شقًا عموديًا تنازليًا (4-5 سم) من أعلى التجويف الصفابي (قاعدة القص) إلى المستقيم.
- قم بإجراء شقين أفقيين (1 سم لكل منهما) مع مقص قزحية العين، وتمتد أفقيا من خط الوسط، في الجزء العلوي والسفلي من الشق الرأسي.
- استخدام ملقط لقشر مرة أخرى نفاذية وفضح محتويات تجويف البطن. دبوس peritoneum الممدودة إلى عموم تشريح.
- تحديد وعزل ز محمد الكان WAT
ملاحظة: يحيط Gonadal WAT الرحم والمبايض في الإناث (المبيض أو الباراتوميتريل) والبربخ والخصيتين في الذكور (البر ديميديمال). يحيط المبيض وات المبيض، الرحم، الرحم، والمثانة. في الحيوانات البدناء، يمكن أن يبدو الغدد التناسلية ووات المحيط بالعين مستمرين — في هذه الحالة، فصل المستودعات في قرن الرحم والمبايض. تم العثور على وات البربخ ملزمة لالبربخ، الخصيان، والأوعية الدموية البربخية البارزة.- حدد موقع الغدد التناسلية (الخصيتين أو المبيضين) واستخدام ملقط لرفع WAT الغدد التناسلية المرتبطة بها.
- استخدام مقص قزحية لاستئصال بعناية WAT من الغدد التناسلية.
- تحديد وعزل ع النرالة WAT
ملاحظة: يحيط حول الكلى ثنائياً. في الحيوانات البدناء، يمكن أن يبدو هذا المستودع لتمتد أقل إلى الجزء العلوي من القرن الرحم يُمْبِنُدُ. على الرغم من أن وات حول الكلى قد تم تصنيفها تقليديا كمستودع الحشوية21، وقد حددت عدة مجموعات على أنها مستودع البني على أساس تتبع النسب والدراسات امتصاص الجلوكوز المسمى لاسلكيا8،9، 20.الأنسجة يتكون من خليط من الخلايا البيضاء والبني.- لاستئصال مستودع حول الكلى، وتحديد موقع الكلى واستخدام ملقط لرفعه وسحبخط الوسط لرؤية تقسيم واضح بين مستودعات حول الفرج وخلف الصفاق.
- استئصال WAT المرتبطة مباشرة مع الكلى. تأكد من إزالة الغدد الكظرية، الموجودة فوق الكلى، من WAT.
- تحديد وعزل (ص) التبره الكبية WAT
ملاحظة: يقع WAT خلف الصفرافي في موقع فقري، على طول الحدود بين جدار البطن الخلفي والحبل الشوكي.- لاستئصال هذا المستودع، استخدم ملقط لرفع الكلى صعودا ونحو خط الوسط لرؤية بوضوح الحدود بين مستودعات حول النقبة وخلف الصفاق.
ملاحظة: في الحيوانات البدناء، وتحديد هذه الحدود يمكن أن يكون تحديا. - ثم، استخدم مقص قزحية العين لتشريح بعناية WAT خلف الفرج من الجدار العضد الخلفي.
- لاستئصال هذا المستودع، استخدم ملقط لرفع الكلى صعودا ونحو خط الوسط لرؤية بوضوح الحدود بين مستودعات حول النقبة وخلف الصفاق.
- تحديد وعزل أومينتال وات
ملاحظة: يقع Omental WAT على طول انحناء أكبر من المعدة. على الرغم من أن الدهنية omental هو مستودع مهم في البشر، فإنه موجود عموما فقط في الفئران البدناء.- لتحديد وات omental الحشوية، واستخدام ملقط لرفع المعدة. استخدام مقص القزحية لإزالة الأنسجة الدهنية المرتبطة بها على طول الحدود السفلية للمعدة. لا تخلط بين أومينتال وات والبنكرياس.
- تحديد وعزل الـ mesenteric WAT
ملاحظة: MESENTERIC WAT هو هيكل يشبه الويب المحيطة والمرتبطة الأمعاء الصغيرة والكبيرة.- لاستئصال هذا المستودع ، قم بإزالة الأمعاء من بقية الجهاز الهضمي عن طريق القطع في قاعدة المعدة والمستقيم. استخدام ملقط لرفع الأمعاء من تجويف الحشوية وكشف لهم.
- استخدام مقص قزحية لتشريح بعناية WAT mesenteric بعيدا عن الأمعاء، بدءا من الاثني عشر والاستمرار حتى نهاية القولون. إزالة بعناية الغدد الليمفاوية التي ترتبط ارتباطا وثيقا مع مستودع mesenteric.
- تحديد وعزل وات التامور
ملاحظة: يقع حول القلب وات خارج التامور الحشوي وعلى السطح الخارجي للالتاميرة الجدارية، وغالبا ما يكون ذلك على طول الجانب السفلي من القلب14.- للوصول إلى تجويف الصدر، والحفاظ على الماوس في موقف supine. تأمين الأطراف العلوية والسفلية إلى عموم تشريح مع دبابيس تشريح.
- استخدام ملقط لرفع عملية xyphoid (غضروف في قاعدة القص) وجعل صغيرة (1 ملم) قطع في جدار تجويف الصدر.
- أدخل شفرة واحدة من مقص القزحية في القص واصنع شقين أفقيين (1 سم لكل منهما) يمتدان أفقياً من قاعدة القص. وهذا سوف يعرض الحجاب الحاجز والحدود السفلية من تجويف الصدر.
- استخدم مقص تشريح لإجراء شقين عموديين تصاعديين (3-4 سم) عبر القفص الصدري، وتمتد بشكل متفوق من الحدود الجانبية للتجويف الصدري إلى الترقوة.
- استخدام ملقط لرفع النصف البطني من القفص الصدري. استخدام مقص تشريح لجعل قطع النهائي (2 سم) على طول أدنى من الترقوة لإزالة القفص الصدري وفضح محتويات تجويف الصدر.
- إذا كان موجودا، تشريح بعناية الدهنية التامور من السطح الخارجي للالتامور.
4 - تحديد وعزل المستودعات الأخرى للمواد الدهنية
- تحديد وعزل الـ WAT
ملاحظة: يحتوي Epicardial WAT داخل التامور الحشوي ويرتبط مباشرة بسطح عضلة القلب.- إذا كانت موجودة، يمكن ملاحظة الخلايا الأديبية الظهارية من الناحية النسيجية بعد عزل وتثبيت القلب الممزوج في 10٪ محايدة المخزنة الرسمية لمدة 24 ساعة.
- تحديد وعزل ع اةي ؛ س من WAT
ملاحظة: يقع Popliteal WAT في الفوسا البوبليتيال في الركبة الخلفية ويحتوي على عقدة لمفية كبيرة. هذا المستودع غير مرئي عادة في الحيوانات الصغيرة.- لعزل WAT popliteal، استخدم مقص قزحية القزحية لإزالة الجلد بعناية من قاعدة الطرف الخلفي إلى القدم.
- ضع الرضفة على مقلاة التشريح واضمن الساق الممدودة بدبوس في القدم. تأكد من أن الفوسا البوبليتيال في الجزء الخلفي من الركبة يواجه صعودا.
- استخدام مقص القزحية لجعل قطع على الحدود السفلية من رؤساء الوسيطة والجانبية للعضلة المعدية. استخدام ملقط لرفع العضلات وتكشف عن مستودع popliteal الثلاثي.
- استخدام مقص القزحية لاستئصال مستودع على طول حدود الأنسجة الطبيعية.
- تحديد وعزل وات الجلدية
ملاحظة: ووات الجلدية هي طبقة رقيقة من الخلايا الأديبية تقع بين الأدمة الشبكية وطبقة العضلات الكارنوس.- لتحديد الخلايا الأديبية الجلدية بالطرق النسيجية ، ضع الماوس على معدته في وضع عرضة للخطر. بعد تأمين الأطراف العلوية والسفلية مع دبابيس تشريح، رش السطح الخارجي للماوس مع الإيثانول 70٪ لترطيب الجلد.
- استخدام مشرط لإزالة الفراء مبللة من جزء مربع من الجلد على الجزء الخلفي من الماوس.
- استخدام مقص قزحية لاستئصال بعناية الجزء حلق من الجلد، والتي سوف تشمل الأدمة الشبكية، وات الجلد، كارنوسالبانكولوس، وبعض WAT تحت الجلد.
- استخدم مشرط ًا لقطع الجلد المقتطع إلى شرائح عمودية رفيعة.
- ضع الشرائط العمودية الرقيقة مع طبقة WAT اللزجة تحت الجلد التي تواجه الأسفل.
- بدءا من نهاية واحدة، لفة الشريط على نفسه لتشكيل دوامة. طبقة وات تحت الجلد لزجة على الجزء الخارجي من دوامة تسمح لفة للحفاظ على شكلها أثناء التثبيت.
- وضع دوامة في بئر من 24 لوحة جيدا تحتوي على 10٪ محايدة المخزنة الرسمية لمدة 24 ساعة قبل المعالجة النسيجية22.
- تحديد وعزل وات العضلي
ملاحظة: ويعرف على نطاق واسع WAT بين العضل كما adipocytes تقع تحت اللفافة العميقة للعضلات. ويشمل هذا المصطلح adipocytes تتخللها بين ألياف العضلات من العضلات والهيكل العظمي، والمعروف أيضا باسم WAT العضلي، وadipocytes تقع داخل حزم العضلات أنفسهم. الفئران من النوع البري عموما ليس لديها أعداد كبيرة من الخلايا الأديبية العضلية. ومع ذلك، فمن الممكن في ظل ظروف معينة لتحديد WAT بين العضلات من خلال الأساليب النسيجية. في بعض الحالات، يمكن العثور على الخلايا الأديبية العضلية في العضلات الملساء، مثل الحجاب الحاجز.- لعزل عضلة الساقية الأمامية (TA)، على سبيل المثال، ضع الماوس على ظهره في وضع السوبين وتأمين الأطراف السفلية إلى مقلاة التشريح باستخدام دبابيس تشريح. بلل البشرة مع الإيثانول 70٪ للحد من التلوث مع الفراء.
- استخدام مقص قزحية لإزالة الجلد بعناية من الساق وفضح مجموعة العضلات quadriceps، وتقع فوق الركبة على رمح عظم الفخذ، وTA تقع تحت الركبة على السطح البطني من الساق.
ملاحظة: TA سميكة بالقرب من نهاية قريبة من الساق وأكثر وترية بالقرب من نهاية القاصي. - استخدام مقص قزحية لاستئصال قطعة من العضلات وإصلاح في 10٪ محايدة المخزنة الرسمية المخزنة لمدة 24 ساعة قبل المعالجة النسيجية22.
- تحديد وعزل مستودعات WAT داخل المفصل
ملاحظة: تقع مستودعات WAT داخل المفصل داخل المفاصل الزليلية.- لتحديد وات تحت الرضفة، على سبيل المثال، عن طريق الأساليب النسيجية، حصاد عظام الساق على النحو المفصل في قسم BMAT.
- بعد إزالة مجمع عظم الفخذ والساقية، استخدم مقص قزحية العين ومنصات الشاش لإزالة أكبر قدر ممكن من العضلات والأنسجة الضامة. لا تكسر المفصل الظنبي.
- إصلاح مجمع عظم الفخذ الساقية في 10٪ محايدة المخزنة الرسمية لمدة 24 ساعة قبل الشارات والمعالجة النسيجية (الموضحة أدناه، الخطوة 4.6.8).
- تحديد وعزل الأنسجة الدهنية نخاع العظم
ملاحظة: يتم احتواء الأنسجة الدهنية نخاع العظام (BMAT) داخل العظام، تتخللها خلايا المكونة للدم. تشريحيا، يمكن تصنيف BMAT على أنها تأسيسية (الأوبطي القاصي والفقرات الصدوفية) أو منظمة (منتصف إلى ما قبل الأوجاق، عظم الفخذ، والفقرات القطنية)10،11. العزلة النظيفة لنخاع العظام adipocytes لتحليل الحمض النووي الريبي والبروتين هو التحدي في الفئران. ومع ذلك، يمكن حصاد عظام الماوس بسهولة، ثابتة، صائق وجزءا لا يتجزأ من البارافين للتحليلات النسيجية.- لحصاد عظام الساق، على سبيل المثال، قم أولاً بإزالة الساقين من الماوس. استخدام مقص تشريح لقطع المفصل الأسيتابولوفيمورال، والحفاظ على الرأس الفخذسليمة.
- استخدام مقص القزحية لإزالة الجلد بعناية من الساق، وكشف عضلات الساق.
- تشريح بعناية بعيدا العضلات الرئيسية من عظم الفخذ والساق باستخدام مقص القزحية ومنصات الشاش.
- عندما يتعرض عظم الفخذ ، اتبع حافة العظام إلى صياغة الحوض وعظم الفخذ والإفراج بعناية عن الرأس الفخذي من المفصل الأسيتابولوفيأخلاقي. استخدام الشاش لتنظيف أي الأنسجة المتبقية من عظم الفخذ.
- اتبع حدود الساق إلى مفصل الكاحل. قم بالإفراج بعناية عن المولى الوسيط، الموجود في طرف الساق، من مفصل الكاحل.
- بمجرد عزل مركب عظم الفخذ والساقية، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من العضلات والأنسجة الضامة باستخدام مقص قزحية و/أو شاش.
- فصل الساق من عظم الفخذ عن طريق إدخال شفرة واحدة من مقص القزحية في المفصل الظنبي وقطع بلطف من خلال الأربطة الجانبية الوسطى والجانبية والأربطة الصليبية الأمامية والخلفية. لا تقم بإزالة كبسولة مفصل الركبة للتأكد من أن الساق لا تزال سليمة. استخدام الشاش لتنظيف أي الأنسجة المتبقية من الساق.
- إصلاح العظام في 10٪ محايدة المخزنة الرسمية لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة ومن ثم غسل وتخزين وفقا للاحتياجات المستقبلية.
- لتحليل المعلمات العظام باستخدام التصوير المقطعي المجهري (μCT)، تخزين العظام في المخزن الاحتياطي الفوسفات سورنسن، درجة الحموضة 7.423.
- بالنسبة للكم الكمي BMAT والتحليلات النسيجية، والشارات العظام في 14٪ EDTA، درجة الحموضة 7.4، لمدة 10-14 يوما.
- بعد الشارات، استخدم تلطيخ تزاز اتسيد أوزميوم وتحليل الـ μCT لتحديد BMAT24. خلاف ذلك، عملية والبارافين تضمين العظام لعلم الأنسجة23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن تحقيق النجاح في تحديد وعزل مختلف مستودعات الماوس الدهنية باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه. وترد في الشكل 2المواقع التشريحية الإجمالية لمستودعات تحت الجلد (ألف وهاء - واو) والبني (باء) والحشوي (C وD وG-J) ومستودع البوبليتال (K).
الشكل 2: المواقع التشريحية الإجمالية لمستودعات الماوس الدهنية. تشريح إجمالي (A) تحت الجلد الأمامي، (ب) بني،(ج)من البربخ (ب، المثانة)، (د) المبيض (ش، قرون الرحم)، (E) تحت الجلد الخلفي (الظهر القطني (د)، الأربية (ط)، الدبق (ز))، (F) الأربية،(ز) mesenteric، (H) حول الكلى (ك، الكلى)، (I) خلف الظهور (ك، الكلى)، (ي) حول القلب (ح، القلب)، و (ك) مستودعات الدهنية البوبليتيفية في الفئران الكبار C57BL/6J. تشير الأسهم إلى مستودعات محددة إذا تم تصوير مستودعات متعددة. وتعين الأجهزة ذات الصلة بالرسائل المناسبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تقييم الخصائص النسيجية لمستودعات تحت الجلد (A-D) والبني (E) والحشوي (F-K) وpopliteal (L) والمكونة (M) والنخاع المنظم (N) والعضلي (O) ومستودعات الدهنية تحت الرضفة (P) من قبل هيماتوكسيلين وإيوسين (H&E) تلطيخ22 وتظهر في الشكل 3.
الشكل 3: التقييم النسيجي لمستودعات الماوس الدهنية المنفصلة. علم الأنسجة من (A) تحت الجلد الأمامي ، (ب) الظهر ، (C) النوجدال ، (D) البني ، (F) الغدد التناسلية ، (ز) حول الولادة ، (H) خلف الصفراء ، (أولا) أومينتال ، ( J)mesenteric،(K) التامور،(L) popliteal، (M) المكونة و (N) تنظيم نخاع العظام الدهنية، (O) بين العضلات، و (P) مستودعات الأشعة تحت الرضفة في الفئران الكبار C57BL/6J. تم عزل الأنسجة وفقا للبروتوكول المحدد، ثابتة بين عشية وضحاها في 10٪ محايدة المخزنة الرسمية المخزنة، ومعالجتها، وجزءا لا يتجزأ من البارافين. كانت 5 أقسام ميكرومتر ملطخة H & E. تم التقاط معظم الصور في التكبير 100x; شريط مقياس = 100 درجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ومع تزايد الاعتراف بأهمية الخصائص الجزيئية والوظيفية المتنوعة للمجموعات المنفصلة من الخلايا الأديبية، من الأهمية بمكان أن يقوم المحققون في الميدان بتحديد المستودعات الدهنية واستئصالها بشكل موحد لإجراء مزيد من التحليلات. وحتى الآن، لا توجد سوى بروتوكولات قليلة للتوطين الموحد وعزل مجموعة واسعة من مستودعات الماوس الدهنية. وتتركز الأساليب المنشورة سابقا في المقام الأول على واحد أو اثنين من المستودعات وتفتقر إلى التفاصيل اللازمة لتحديد الهوية الموحدة والختان من قبل مختلف المحققين18،19. هذه المخطوطة هي مساهمة جديدة وهامة في مجال البيولوجيا الدهنية لأنها توفر دليلاً متعمقاً للموقع التشريحي وتشريحاً دقيقاً للمستودعات التي يشيع دراستها وأقل شهرة في جميع أنحاء الفأر. يتم توفير الموقع التشريحي الإجمالي والتحليلات النسيجية لإظهار تنوع محاريب الخلايا الأديبية.
تعتمد العزلة الناجحة للمستودعات الدهنية المنفصلة التي تستخدم هذا البروتوكول على عدة خطوات هامة. الحفاظ على بيئة تشريح نظيفة أمر بالغ الأهمية; يمكن استخدام الإيثانول بنسبة 70٪ حسب الضرورة لإزالة الشعر الملوث أو الدم من صينية التشريح والأدوات. عند عزل وات تحت الجلد الخلفي ، من الضروري أن الشق الأولي في الجلد لا تخترق تجويف العضد المرتبطة ارتباطا وثيقا بحيث يمكن فصل الطبقتين بكفاءة لفضح WAT. وبالمثل ، عند قطع من خلال الجدار العضد لفضح محتويات تجويف البطن ، يجب أن لا تثقب الشقوق الأمعاء الكامنة لمنع التلوث بالعناصر الهضمية. يجب أن يتم استئصال أفضل التقنيات المتاحة من الأنسجة المحيطة بعناية لمنع تلوث WAT، مما سيحرف التحليلات المستقبلية. يعتمد التحديد المتسق للمستودعات الظهرية تحت الجلد والأربية والغلوتينية على استخدام المعالم التشريحية الدقيقة الموصوفة في البروتوكول. ويتسم التمييز بين هذه المستودعات بأهمية خاصة؛ على الرغم من أن المستودعات يمكن أن يبدو أن تكون مستمرة، وتقع مركزيا adipocytes الأربية اكتساب خصائص تشبه البني بسهولة أكبر من نظرائهم المحيطة بها.
يمكن تحليل الأنسجة الدهنية المعزولة باستخدام هذا البروتوكول باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات. بالإضافة إلى التقييم النسيجي (مثل تلطيخ H&E، الكيمياء المناعية)، يمكن استخدام الأنسجة الدهنية لمجموعة واسعة من التحليلات الجزيئية، من تنظيم النسخ حتى تعديلات البروتين ما بعد الترجمة. يمكن عزل الخلايا الأديبية وخلايا الأوعية الدموية السترومال داخل المستودعات الفردية عن طريق هضم الكولاجين والطرد المركزي التفاضلي. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الكسور للدراسات الجزيئية، والتمثيل الغذائي، وثقافة الخلايا. ويمكن أيضا أن تستخدم explants مستودع لاختبارات التمثيل الغذائي في الجسم الحي السابق والأنزيمية.
تنشأ العديد من التحديات والقيود أثناء عزل وختان الأنسجة الدهنية الماوس. أولا، بعض المستودعات التي هي مهمة من الناحية الفسيولوجية في البشر ليست موجودة عادة في الفئران العجاف، والكبار. على سبيل المثال، أومينتال وات، وهو مستودع الحشوية الرئيسية في البشر، لا يمكن أن ينظر إليها إلا في الفئران البدناء الناجمة عن علم الوراثة أو النظام الغذائي. غير أن توسيع بعض المستودعات يمكن أن يحدث بسبب التحديات التغذوية أو العلاجات الدوائية. على سبيل المثال, تغذية النظام الغذائي عالية الدهون يمكن أن يسبب توسع WAT omental والتام. يمكن أن يسببها WAT بين العضل ة إصابة العضلات الهيكلية25،26 أو حمية عالية الدهون27. ينظم BMAT يوسع استجابة لمختلف التحديات، بما في ذلك النظام الغذائي عالية الدهون، وتقييد السعرات الحرارية والعلاج ثيازوليدينديون11،28. ثانيا، بسبب صغر حجم الفئران، يمكن أن يكون من الصعب الحصول على عينة كافية للتحليلات الجزيئية أو الأيضية. على سبيل المثال، عزل ما يكفي من نخاع العظم النقي adipocytes للتحليلات اللاحقة أمر صعب، حتى بعد تجميع العظام من الفئران متعددة. ثالثا، يمكن أن يكون من الصعب تحديد حدود بعض المستودعات بدقة. على سبيل المثال، يبدو أن WAT تحت الجلد الخلفي هو مستودع واحد مستمر ولكنه يتكون في الواقع من مستودعات الظهرية المنفصلة، والأربية، والجلوتجية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يبدو أن حول التناظر تنصهر على حد سواء الغدد التناسلية ومستودعات خلف الحالب في الحيوانات السمنة المفرطة جدا. عدم وجود حدود متميزة بين المستودعات المجاورة يمكن أن تجعل العزلة النظيفة لهذه الأنسجة صعبة. ومع ذلك، يوفر بروتوكول التشريح هذا للمحققين أطلسا مفصلا وإرشادات خطوة بخطوة لتشريح دقيق وقابل للاستنساخ لمجموعة واسعة من مستودعات الماوس الدهنية. ومما لا شك فيه أن توحيد تحديد وعزل مستودعات الفئران المنفصلة الموصوفة أعلاه سيساعد على زيادة توضيح الاختلافات في تطوير المهام التي كانت تُعنى بالتطوير والتعبير الجيني والوظائف المحلية والمنهجية التي كانت تُعد في السابق. المنافذ التي لم تدرس بشكل كاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
O.A.M. مدعوم ة من قبل المعهد الوطني للصحة المنح DK062876 و DK092759; ويدعم برنامج تدريب العلماء الطبيين في جامعة ميشيغان (T32GM007863)، وبرنامج التدريب في تكوين الأعضاء بجامعة ميشيغان (T32HD007605)، وزمالة جامعة ميشيغان راكهام للجدارة، وزمالة تايلينول للرعاية المستقبلية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
- Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocyte lineages: tracing back the origins of fat. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (3), 340-351 (2014).
- Bagchi, D. P., Forss, I., Mandrup, S., MacDougald, O. A. SnapShot: Niche Determines Adipocyte Character I. Cell Metabolism. 27 (1), 264-264 (2018).
- Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Frontini, A., Cinti, S. Distribution and development of brown adipocytes in the murine and human adipose organ. Cell Metabolism. 11 (4), 253-256 (2010).
- Zhang, F., et al. An Adipose Tissue Atlas: An Image-Guided Identification of Human-like BAT and Beige Depots in Rodents. Cell Metabolism. 27, 252-262 (2018).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocytes arise from multiple lineages that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications. 5, 4099 (2014).
- Li, Z., Hardij, J., Bagchi, D. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Development, regulation, metabolism and function of bone marrow adipose tissues. Bone. 110, 134-140 (2018).
- Scheller, E. L., Cawthorn, W. P., Burr, A. A., Horowitz, M. C., MacDougald, O. A. Marrow Adipose Tissue: Trimming the Fat. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (6), 392-403 (2016).
- Alexander, C. M., et al. Dermal white adipose tissue: a new component of the thermogenic response. The Journal of Lipid Research. 56 (11), 2061-2069 (2015).
- Kruglikov, I. L., Scherer, P. E. Dermal Adipocytes: From Irrelevance to Metabolic Targets? Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (1), 1-10 (2016).
- Iacobellis, G. Local and systemic effects of the multifaceted epicardial adipose tissue depot. Nature Reviews Endocrinology. 11 (6), 363-371 (2015).
- Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular Fat: A Review of the Consequences and Causes. International Journal of Endocrinology. 2014, 1-11 (2014).
- Pond, C. M. Adipose tissue and the immune system. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 17-30 (2005).
- Kloppenburg, A. I. -F. M. An emerging player in knee osteoarthritis: the infrapatellar fat pad. Arthritis Research & Therapy. 15 (225), 1-9 (2013).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (94), e52174 (2014).
- Casteilla, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods in Molecular Biology. 155, 1-22 (2008).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).
- Parlee, S. D., Lentz, S. I., Mori, H., MacDougald, O. A. Quantifying size and number of adipocytes in adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 93-122 (2014).
- Scheller, E. L., et al. Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues. Nature Communications. 6, 7808 (2015).
- Scheller, E. L., et al. Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo. Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), e71084 (2013).
- Pagano, A. F., et al. Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints. PLoS One. 10 (12), e0144230 (2015).
- Khan, I. M., et al. Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance. International Journal of Obesity. 39 (11), 1607-1618 (2015).
- Sulston, R. J., et al. Increased Circulating Adiponectin in Response to Thiazolidinediones: Investigating the Role of Bone Marrow Adipose Tissue. Frontiers in Endocrinology. 7, 128 (2016).
