Summary
Adipozyten gibt es in diskreten Depots und haben unterschiedliche Rollen in ihren einzigartigen Mikroumgebungen. Da regionale Unterschiede in Adipozytencharakter und Funktion aufgedeckt werden, ist eine standardisierte Identifizierung und Isolierung von Depots entscheidend für die Weiterentwicklung des Feldes. Hierin stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Exzision verschiedener Mausfettdepots vor.
Abstract
Adipose Gewebe sind komplexe Organe mit einer breiten Palette von Funktionen, einschließlich Speicherung und Mobilisierung von Energie als Reaktion auf lokale und globale Bedürfnisse, Entkopplung des Stoffwechsels, um Wärme zu erzeugen, und Sekretion von Adipokinen, um Ganzkörperhomöostase zu regulieren und Immunantworten. Neue Forschung identifiziert wichtige regionale Unterschiede in den Entwicklungs-, molekularen und funktionellen Profilen von Adipozyten, die sich in diskreten Depots im ganzen Körper befinden. Unterschiedliche Eigenschaften der Depots sind medizinisch relevant, da Stoffwechselerkrankungen oft depotspezifische Effekte aufweisen. Dieses Protokoll wird den Forschern einen detaillierten anatomischen Atlas und eine Dissektionsanleitung für die reproduzierbare und genaue Identifizierung und Exzision verschiedener Mausfettgewebe zur Verfügung stellen. Die standardisierte Zerlegung diskreter Fettdepots ermöglicht detaillierte Vergleiche ihrer molekularen und metabolischen Eigenschaften und Beiträge zu lokalen und systemischen pathologischen Zuständen unter verschiedenen Ernährungs- und Umweltbedingungen.
Introduction
Adipose Gewebe spielen eine entscheidende Rolle in ganzer Körper Homöostase, einschließlich Speicherung und Freisetzung von Energie als Reaktion auf lokale und globale Bedürfnisse, Thermoregulation, und Sekretion von Adipokinen Energiebilanz, Stoffwechsel und Immunantworten regulieren1 , 2. Adipozyten werden im ganzen Körper in diskreten Depots verteilt und dienen in einigen Fällen spezialisierten Rollen innerhalb ihrer Mikroumgebungen3,4,5. Historisch gesehen konzentrierte sich die Untersuchung des Fettgewebes auf weißes Fettgewebe (WAT) und seine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Energiehomöostase. Die meisten Adipozyten werden im ganzen Körper in subkutanen und viszeralen WAT-Depots verteilt. Die Eigenschaften dieser Depots sind wichtig für die differenzielle Anfälligkeit für Stoffwechselerkrankungen. Subkutane Adipozyten, die sich unter der Haut befinden, wurden mit schützenden metabolischen Effekten in Verbindung gebracht5. Viszerale Adipozyten, die die lebenswichtigen Organe umgeben und in den Depots für Gonaden, Perirenale, Retroperitoneale, Omentale und Perikardsaugen enthalten sind, sind häufig mit Stoffwechselstörungen verbunden, einschließlich Typ-2-Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen2 . Braunes Fettgewebe (BAT) wurde ebenfalls ausgiebig untersucht. Braune und braune Adipozyten drücken entkoppelndes Protein 1 (UCP1) aus und spielen eine wichtige Rolle bei der adaptiven Thermogenese und Glukosehomöostase6,7. Klassische braune Adipozyten sind im interscapularen BAT-Depot8enthalten. Cluster von braunen Adipozyten sind auch an anderen Orten zu finden, einschließlich supklavikuläre, infra/subscapular, zervikale, paravertebrale und periaortische Depots8,9.
Zusätzlich zu ihrer Lage in großen WAT- und BAT-Depots gibt es Adipozyten in diskreten Nischen im gesamten Körper4, wo sie spezielle Funktionen innerhalb ihrer jeweiligen Mikroumgebungen ausführen können. Zum Beispiel, Knochenmark Fettgewebe (BMAT) dient als Lipid-Reservoir, ist eine Hauptquelle des zirkulierenden Adiponectin, und interagiert eng mit Osteoblasten, Osteoklasten, und hämatopoetischen Zellen10,11. Dermale Adipozyten tragen zu weit verbreiteten Prozessen bei, einschließlich Wundheilung, Immunantwort, Thermoregulation und Haarfollikelwachstum12,13. Darüber hinaus können epikardiale Adipozyten mehrere Adipokine und Chemokine produzieren, die lokale und systemische Auswirkungen auf die Entwicklung und das Fortschreiten der koronaren Herzkrankheit ausüben14. Die Ausweitung der inter-/intramuskulären WAT wurde positiv mit erhöhter Fettleibigkeit,systemischer Insulinresistenz und verminderter Muskelkraft und Beweglichkeit 15 korreliert. Darüber hinaus dienen popliteale Adipozyten als Lipidreservoir für lymphatische Expansion während der Infektion16. Während die spezifischen Rollen der verschiedenen Gelenkdepots im Allgemeinen unbekannt sind, wird das Hoffa-Depot (Infrapatellar) innerhalb des Knies nun gedacht, um zu Pathologien beizutragen, einschließlich vorderer Knieschmerzen und Arthrose17.
Während regionale Unterschiede in Adipozytencharakter und Funktion intensiv untersucht werden, wird das Feld derzeit durch das Fehlen eines standardisierten Protokolls zur Identifizierung und Zerlegung verschiedener Mausdepots eingeschränkt. Zuvor veröffentlichte Methoden haben in der Regel die Isolierung von einem oder zwei spezifischen Depots beschrieben und es fehlt die Detailgenauigkeit, die für eine gleichmäßige Exzision erforderlich ist18,19. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll bietet eine umfassende Anleitung für die spezifischen anatomischen Standorte und Isolationsschritte vieler verschiedener Mausfettdepots. Obwohl WAT-Depots im Mittelpunkt dieses Manuskripts stehen, wird auch die Exzision der interskapulierten BVT ausführlich beschrieben. Adipose Gewebe, die mit diesem Protokoll ausgeschnitten werden, kann für eine Vielzahl von experimentellen Endpunkten verwendet werden, einschließlich Explant-Studien, Histologie und Genexpressionsanalysen.
Das Ziel dieses Manuskripts ist es, den Ermittlern ein detailliertes Protokoll zur eindeutigen und präzisen Identifizierung und Isolierung sowohl prominenter als auch weniger untersuchter Mausfettdepots zur Verfügung zu stellen (Abbildung 1). Diese Ressource wird eine umfassendere Untersuchung der Entwicklungs-, molekularen und funktionellen Eigenschaften von Adipozyten in verschiedenen Nischen ermöglichen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung von Mausfettdepots, die in diesem Protokoll seziert werden. Dieses Bild wurde von Bagchi et al., 20184adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Protocol
Alle tierischen Verfahren werden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Michigan durchgeführt.
1. Euthanisierung
HINWEIS: Für die Zwecke dieses Videoprotokolls werden 4 bis 6 Monate alte C57BL/6J-Mäuse verwendet.
- Legen Sie die Maus in eine Isofluran-Verdampferkammer und stellen Sie den Isofluran-Durchfluss auf 5% oder mehr ein. Setzen Sie die Isofluran-Exposition bis eine Minute nach dem Anhalten der Atmung fort. Entfernen Sie dann die Maus aus der Verdampferkammer und bestätigen Sie die Euthanasie mit einer zugelassenen sekundären Maßnahme.
HINWEIS: Die genehmigten sekundären Maßnahmen variieren je nach Institution und Tierprotokoll und können zervikale Dislokation oder Enthauptung umfassen. - Legen Sie die eingeschläferte Maus auf die Sezierpfanne. Sterilisieren Sie die dorsalen und ventralen Außenflächen der Maus mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, dass die Außenfläche der Maus ausreichend nass ist, um die Kontamination durch Fell während der Zerlegung zu minimieren.
2. Identifizierung und Isolierung von wichtigen subkutanen Adipose-Ddepots (Anterior Subkutane, Dorsolumbar, Leistenförmig, Gluteal) und interscapulares braunes Aadiposegewebe
- Identifizieren und Isolieren von vorderem Subkutanen WAT
HINWEIS: Anterior subkutan WAT befindet sich zwischen den Schulterblatt, absteigend vom Nacken des Halses bis zur Achselhöhle der Maus7. Dieses Depot wurde alternativ als suprascapular8 oder interscapular20 WAT beschrieben und liegt direkt auf dem interscapularen BAT-Depot.- Um das vordere subkutane Depot zu isolieren, legen Sie die Maus auf ihren Magen in eine anfällige Position. Befestigen Sie die oberen und unteren Gliedmaßen mit Sezierstiften an der Sezierpfanne.
- Verwenden Sie Zangen, um die rückende Haut am Nacken zu heben. Verwenden Sie Irisschere, um einen kleinen (1 mm) Schnitt in der Haut zu machen.
- Legen Sie eine Klinge der Irisschere in den ersten Schnitt ein und machen Sie einen vertikalen Mittellinienschnitt (2–3 cm) durch die Haut, beginnend am Nacken und absteigend entlang der Wirbelsäule bis zur Mitte des Rückens.
- Machen Sie zwei horizontale Einschnitte (jeweils 1 cm) mit der Irisschere, die sich seitlich von der Mittellinie, oben und unten des anfänglichen vertikalen Schnitts erstreckt.
- Verwenden Sie Zangen, um die Haut vorsichtig zurückzuziehen und das vordere subkutane Depot freizulegen.
- Verwenden Sie Irisschere, um das Depot nach den natürlichen Grenzen des Gewebes zu entfernen.
HINWEIS: Diese Methode isoliert sowohl vordere subkutane WAT als auch interskapulierliche BAT. - Legen Sie das sezierte Depot auf die Sezierpfanne und entfernen Sie den kontaminierenden BAT vorsichtig mit einer Irisschere.
- Identifizieren und Isolieren c lassical BAT
HINWEIS: Classical BAT befindet sich unter dem vorderen subkutanen WAT-Depot.- Um BAT zu isolieren, verwenden Sie die Irisschere, um horizontal entlang der unteren Kante des vorderen Unterhautgewebes nach der natürlichen Grenze des Depots zu schneiden.
- Verwenden Sie dann die Irisschere, um zwei vertikale Einschnitte entlang der seitlichen Ränder des Depots zu machen, die den natürlichen Grenzen des Gewebes folgen.
- Verwenden Sie Zangen, um das Depot vorsichtig umzudrehen und die schmetterlingsförmige zwischensakuläre BAT in den WAT eingebettet zu offenbaren. Sezieren Sie die BVT vorsichtig aus dem umliegenden WAT.
- Identifizieren und Isolieren posterior subkutan WAT,
- Legen Sie die Maus auf den Rücken in eine Supine-Position.
- Nach der Sicherung der oberen und unteren Gliedmaßen mit Sezierstiften, verwenden Sie Zangen, um die Haut an der Basis des Brustbeins zu heben und einen kleinen (1 mm) Schnitt in die Haut zu machen.
- Legen Sie eine Klinge der Irisschere in den ersten Schnitt ein und machen Sie einen Mittellinienschnitt (4–5 cm) durch die Haut, beginnend an der Basis des Brustbeins und absteigend zur Basis des Schwanzes. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie diesen Schnitt machen, da die ventrale Haut sehr dünn ist und eng mit der darunter liegenden Peritonealhöhlenwand verbunden ist.
- Machen Sie zwei horizontale Einschnitte (jeweils 1 cm) mit einer Irisschere, die sich seitlich von der Mittellinie aus erstreckt, an der Spitze des anfänglichen vertikalen Schnitts.
- Verwenden Sie Zangen, um die Haut vorsichtig von der Peritonealhöhle und dem Bein zurückzuziehen, um hintere subkutane WAT zu finden, die mit der Haut verbunden bleiben sollte. Sichern Sie die ausgestreckte Haut mit Sezierstiften, um die vollständige Exzision des WAT zu erleichtern.
HINWEIS: Obwohl die hintere subkutane WAT kontinuierlich zu sein scheint, besteht sie tatsächlich aus drei diskreten Depots: Dorsolumbar, Leistenförmigkeit und Gesäß1. Das Dorsolumbar-Depot erstreckt sich von der Lendenwirbelsäule bis zur Basis des Hinterglieds. Das dreieckige Leistendepot erstreckt sich von der Basis des Hinterbleibs ventral über die Leistengegend und enthält einen markanten Lymphknoten. Das Gesäßdepot erstreckt sich minderwertig von der Basis der Leistengegend und wickelt sich um das Bein bis zur Basis des Schwanzes.
3. Identifizierung und Isolierung von viszeralen Adipose Depots (Gonadal, Perirenal, Retroperitoneal, Omental, Pericardial)
- Identifizieren und Isolieren viszerale WAT-Depots
HINWEIS: WAT-Depots, die größtenteils in den Brust- und Peritonealhöhlen enthalten sind, halten die Maus in einer Supine-Position. Befestigen Sie die oberen und unteren Gliedmaßen mit Sezierstiften an der Sezierpfanne.- Verwenden Sie Zangen, um die dünne Peritonealhohlraumwand an der Basis des Brustbeins zu heben und einen kleinen Schnitt (1 mm) mit einer Irisschere zu machen.
- Legen Sie eine Klinge der Irisschere in den Schnitt ein und machen Sie einen absteigenden vertikalen Schnitt (4–5 cm) von der Oberseite der Peritonealhöhle (Basis des Brustbeins) zum Rektum.
- Machen Sie zwei horizontale Einschnitte (jeweils 1 cm) mit iris Schere, die sich seitlich von der Mittellinie, an der Ober- und Unterseite des vertikalen Schnitts erstreckt.
- Verwenden Sie Zangen, um das Peritoneum zurückzuziehen und den Bauchhöhleninhalt freizulegen. Stecken Sie das ausgestreckte Peritoneum an die Sezierpfanne.
- Identifizieren und Isolieren g onadal WAT
HINWEIS: Gonadal WAT umgibt die Gebärmutter und Eierstöcke bei Weibchen (Ovarial- oder Parametrial) und die Epididymis und Hoden bei Männchen (epididymal). Ovarial WAT umgibt Eierstöcke, Gebärmutter und Blase. Bei übergewichtigen Tieren können Gonaden und Perirenal WAT kontinuierlich erscheinen – in diesem Fall trennen Sie die Depots am Gebärmutterhorn und an den Eierstöcken. Epididymal WAT wird an die Epididymis, Hoden und das prominente epididymale Blutgefäß gebunden gefunden.- Suchen Sie die Gonaden (Hoden oder Eierstöcke) und verwenden Sie Zangen, um den zugehörigen Gonaden WAT zu heben.
- Verwenden Sie Irisschere, um den WAT sorgfältig aus den Gonaden zu verbrauchen.
- Identifizieren und Isolieren p erirenal WAT
HINWEIS: Perirenal WAT umgibt die Nieren bilateral. Bei übergewichtigen Tieren kann dieses Depot minderwertig bis zur Spitze des Gebärmutterhorns und der Eierstöcke zu reichen scheinen. Obwohl die perirenale WAT traditionell als viszerales Depot klassifiziert wurde21, haben mehrere Gruppen es als ein braunes Depot identifiziert, das auf der Abstammungsverfolgung und radioaktiv markierten Glukoseaufnahmestudien8,9 , 20. Histologisch besteht es aus einer Mischung aus weißen und braunen Adipozyten.- Um das Perirenaldepot zu verbrauchen, lokalisieren Sie die Niere und verwenden Sie Zangen, um sie zu heben und ziehen Sie es in die Mittellinie, um eine klare Trennung zwischen den perirenalen und retroperitonealen Depots zu sehen.
- Verbrauchen Sie die WAT direkt mit den Nieren verbunden. Stellen Sie sicher, dass die Nebennieren, die sich oberhalb der Nieren befinden, aus dem WAT entfernt werden.
- Identifizieren und Isolieren r etroperitoneal WAT
HINWEIS: Retroperitoneal WAT befindet sich in einer paravertebralen Position, entlang der Grenze zwischen der hinteren Bauchwand und dem Rückenmark.- Um dieses Depot zu verbrauchen, verwenden Sie Zangen, um die Niere nach oben und in Richtung Mittellinie zu heben, um die Grenze zwischen den perirenalen und retroperitonealen Depots deutlich zu sehen.
HINWEIS: Bei übergewichtigen Tieren kann es schwierig sein, diese Grenze zu identifizieren. - Verwenden Sie dann eine Irisschere, um den retroperitonealen WAT sorgfältig von der hinteren Peritonealwand zu sezieren.
- Um dieses Depot zu verbrauchen, verwenden Sie Zangen, um die Niere nach oben und in Richtung Mittellinie zu heben, um die Grenze zwischen den perirenalen und retroperitonealen Depots deutlich zu sehen.
- Identifizieren und Isolieren von omentaler WAT
HINWEIS: Omental WAT befindet sich entlang der größeren Krümmung des Magens. Obwohl omentale Adipose ein wichtiges Depot beim Menschen ist, ist es in der Regel nur bei krankhaft fettleibigen Mäusen vorhanden.- Um viszerale omentale WAT zu identifizieren, verwenden Sie Zangen, um den Magen nach oben zu heben. Verwenden Sie Irisschere, um das zugehörige Fettgewebe entlang der unteren Grenze des Magens zu entfernen. Verwechseln Sie omentalWAT nicht mit der Bauchspeicheldrüse.
- Identifizieren und Isolieren von Mesenterischen WAT
HINWEIS: Mesenteric WAT ist eine webartige Struktur, die den Kleinen und Großen Darm umgibt und mit ihr in Verbindung gebracht wird.- Um dieses Depot zu verbrauchen, entfernen Sie den Darm aus dem Rest des Verdauungstraktes, indem Sie an der Basis des Magens und des Rektums schneiden. Verwenden Sie Zangen, um den Darm aus der viszeralen Höhle zu heben und sie zu entwirren.
- Verwenden Sie Irisschere, um die mesenterische WAT vorsichtig vom Darm weg zu sezieren, beginnend am Zwölffingerdarm und bis zum Ende des Dickdarms. Entfernen Sie vorsichtig Lymphknoten, die eng mit dem mesenterischen Depot verbunden sind.
- Identifizieren und Isolieren von Perikardial WAT
HINWEIS: Perikardial WAT befindet sich außerhalb des viszeralen Perikards und auf der Außenseite des parietalen Perikards, oft entlang des unteren Aspekts des Herzens14.- Um Zugang zur Brusthöhle zu erhalten, halten Sie die Maus in einer Supine-Position. Befestigen Sie die oberen und unteren Gliedmaßen mit Sezierstiften an der Sezierpfanne.
- Verwenden Sie Zangen, um den xyphoiden Prozess (Knorpel an der Basis des Brustbeins) zu heben und einen kleinen (1 mm) Schnitt in die Brusthöhlenwand zu machen.
- Legen Sie eine Klinge der Irisschere in den Schnitt ein und machen Sie zwei horizontale Einschnitte (jeweils 1 cm), die sich seitlich von der Basis des Brustbeins erstrecken. Dadurch wird die Membran und die untere Grenze der Brusthöhle freizulegen.
- Verwenden Sie eine Sezierenderinze, um zwei aufsteigende vertikale Einschnitte (3–4 cm) durch den Brustkorb zu machen, die sich überlegen von den seitlichen Rändern der Brusthöhle bis zum Schlüsselbein erstrecken.
- Verwenden Sie Zangen, um die ventrale Hälfte des Brustkorbs zu heben. Verwenden Sie eine Sezierendereine, um einen letzten Schnitt (2 cm) entlang der unteren Länge des Schlüsselbeins zu machen, um den Brustkorb zu entfernen und den Brusthöhleninhalt freizulegen.
- Wenn vorhanden, sezieren Sie vorsichtig die Perikardfette von der äußeren Oberfläche des Perikards.
4. Identifizierung und Isolierung anderer Adipose-Depots
- Identifizieren und Isolieren von Epikardial WAT
HINWEIS: Epikardial WAT ist im viszeralen Perikard enthalten und direkt mit der Oberfläche des Myokards verbunden.- Wenn vorhanden, können epikardiale Adipozyten histologisch nach Isolation und Fixierung des durchgeflossenen Herzens in 10% neutral gepuffertem Formalin für 24 h beobachtet werden.
- Identifizieren und Isolieren p opliteal WAT
HINWEIS: Popliteal WAT befindet sich in der poplitealen Fossa im hinteren Knie und enthält einen großen Lymphknoten. Dieses Depot ist bei Jungtieren in der Regel nicht sichtbar.- Um popliteal WAT zu isolieren, verwenden Sie Irisschere, um die Haut vorsichtig von der Basis der Hintergliedmaße bis zum Fuß zu entfernen.
- Legen Sie die Patella gegen die Sezierpfanne und sichern Sie das ausgestreckte Bein mit einem Stift im Fuß. Stellen Sie sicher, dass die popliteale Fossa an der Rückseite des Knies nach oben zeigt.
- Verwenden Sie Irisschere, um einen Schnitt an der unteren Grenze des medialen und seitlichen Kopfes des Magen-Darm-Muskels zu machen. Verwenden Sie Zangen, um den Muskel zu heben und das dreieckige popliteale Depot zu enthüllen.
- Verwenden Sie Irisschere, um das Depot entlang der natürlichen Gewebegrenzen zu verbrauchen.
- Identifizieren und Isolieren dermalWAT
HINWEIS: Dermal WAT ist eine dünne Schicht von Adipozyten, die sich zwischen der Netzhautdermis und der Panniculus carnosus Muskelschicht befindet.- Um dermale Adipozyten mit histologischen Methoden zu identifizieren, legen Sie die Maus auf ihren Magen in eine anfällige Position. Nach der Sicherung der oberen und unteren Gliedmaßen mit Sezierstiften, sprühen Sie die Außenfläche der Maus mit 70% Ethanol, um die Haut zu befeuchten.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um das benetzte Fell von einem quadratischen Teil der Haut auf der Rückseite der Maus zu entfernen.
- Verwenden Sie Irisschere, um den rasierten Teil der Haut sorgfältig zu verbrauchen, die die netzförmige Dermis, dermale WAT, Panniculus carnosus und einige subkutane WAT umfassen wird.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um die ausgeschnittene Haut in dünne vertikale Streifen zu schneiden.
- Positionieren Sie die dünnen vertikalen Streifen mit der klebrigen subkutanen WAT-Schicht nach unten.
- Ab einem Ende rollen Sie den Streifen auf sich selbst, um eine Spirale zu bilden. Die klebrige subkutane WAT-Schicht an der Außenseite der Spirale ermöglicht es der Rolle, ihre Form während der Fixierung beizubehalten.
- Legen Sie die Spirale in einen Brunnen einer 24 Wellplatte mit 10% neutral gepuffertem Formalin für 24 h vor der histologischen Verarbeitung22.
- Identifizieren und Isolieren von intermuskulären WAT
HINWEIS: Intermuskuläre WAT ist weit als Adipozyten unter der tiefen Faszien der Muskeln definiert. Dieser Begriff umfasst Adipozyten zwischen Muskelfasern des Skelettmuskels, auch bekannt als intramuskuläre WAT, und Adipozyten innerhalb der Muskelbündel selbst. Wildtyp-Mäuse haben in der Regel keine große Anzahl von intermuskulären Adipozyten. Unter bestimmten Bedingungen ist es jedoch möglich, intermuskuläre WAT durch histologische Methoden zu identifizieren. Unter bestimmten Bedingungen, intermuskuläre Adipozyten können auch in glatten Muskeln gefunden werden, wie das Zwerchfell.- Um beispielsweise den Tibialis-Anterior(TA) Muskel zu isolieren, legen Sie die Maus auf den Rücken in eine Rückenposition und sichern Sie die unteren Gliedmaßen mit Sezierstiften an der Sezierform. Befeuchten Sie die Haut mit 70% Ethanol, um die Kontamination mit Fell zu minimieren.
- Verwenden Sie Irisschere, um sorgfältig die Haut aus dem Bein zu entfernen und die Quadrizeps-Muskelgruppe, die sich über dem Knie auf dem Oberschenkelknochenbefindetdel befindet, und die TA unterhalb des Knies auf der ventralen Oberfläche der Tibia auszusetzen.
HINWEIS: Die TA ist dick in der Nähe des proximalen Endes der Tibia und mehr Tendenz in der Nähe des distalen Endes. - Verwenden Sie Irisschere, um ein Stück des Muskels zu verbrauchen und fixieren in 10% neutral gepuffertes Formalin für 24 h vor der histologischen Verarbeitung22.
- Identifizierung und Isolierung intraartikulärer WAT-Depots
HINWEIS: Intraartikuläre WAT-Depots befinden sich in Synovialgelenken.- Um infrapatellar WAT zu identifizieren, z.B. durch histologische Methoden, Ernten Beinknochen, wie im BMAT-Abschnitt beschrieben.
- Nach dem Entfernen des Oberschenkelknochen-Tibial-Komplexes verwenden Sie Irisschere und Gaze-Pads, um so viel Muskel- und Bindegewebe wie möglich zu entfernen. Brechen Sie das tibiofemorale Gelenk nicht.
- Fixieren Sie den Oberschenkelknochen-Tibial-Komplex in 10% neutral gepuffertem Formalin für 24 h vor der Entkalkung und histologischen Verarbeitung (siehe unten, Schritt 4.6.8).
- Identifizieren und Isolieren von Knochenmarkfettgewebe
HINWEIS: Knochenmarkfettgewebe (BMAT) ist in Knochen enthalten, durchsetzt mit hämatopoetischen Zellen. Anatomisch kann BMAT als konstitutiv (distale Tibia und kaudalen Wirbel) oder reguliert (Mittel-bis-proximale Tibia, Oberschenkelknochen und Lendenwirbel)10,11klassifiziert werden. Eine saubere Isolierung von Knochenmark-Adipozyten für RNA- und Proteinanalysen ist bei Mäusen eine Herausforderung. Mausknochen können jedoch leicht geerntet, fixiert, entkalkt und paraffin-eingebettet für histologische Analysen sein.- Um zum Beispiel Beinknochen zu ernten, entfernen Sie zuerst die Beine von der Maus. Verwenden Sie Eine Sezierschere, um das Acetabulofemoralgelenk zu schneiden und den Oberschenkelkopf intakt zu halten.
- Verwenden Sie Irisschere, um die Haut vorsichtig vom Bein zu entfernen, was die Beinmuskulatur offenbart.
- Sezieren Sie vorsichtig die Hauptmuskeln von der Femur und Tibia mit Irisschere und Gaze-Pads.
- Wenn der Oberschenkelknochen freigelegt wird, folgen Sie dem Rand des Knochens bis zur Artikulation des Beckens und des Oberschenkelknochens und lassen Sie den Oberschenkelkopf vorsichtig aus dem Acetabulofemoralgelenk frei. Verwenden Sie Gaze, um das verbleibende Gewebe aus dem Oberschenkelzupfen zu reinigen.
- Folgen Sie der Grenze der Tibia bis zum Sprunggelenk. Lösen Sie den medialen Malleolus, der sich an der Spitze der Tibia befindet, vorsichtig aus dem Sprunggelenk.
- Sobald der Oberschenkel-Tibial-Komplex isoliert wurde, entfernen Sie so viel Muskel- und Bindegewebe wie möglich mit Irisschere und/oder Gaze.
- Trennen Sie die Tibia vom Oberschenkelknochen, indem Sie eine Klinge der Irisschere in das tibiofemorale Gelenk einlegen und sanft durch die medialen und seitlichen Kollateralbänder und die vorderen und hinteren Kreuzbänder schneiden. Entfernen Sie nicht die Kapsel des Kniegelenks, um sicherzustellen, dass die Tibia intakt bleibt. Verwenden Sie Gaze, um das verbleibende Gewebe von der Tibia zu reinigen.
- Fix knochen in 10% neutral gepuffertem Formalin für 24 h bei Raumtemperatur und dann waschen und lagern nach zukünftigen Bedürfnissen.
- Um Knochenparameter mittels mikrocomputedtomographie (CT) zu analysieren, speichern Sie Knochen im Sorensen-Phosphatpuffer, pH 7,423.
- Für BMAT-Quantifizierung und histologische Analysen entkalken Knochen in 14% EDTA, pH 7,4, für 10-14 Tage.
- Verwenden Sie nach der Entkalkung Osmiumtetroxidfärbung und die CT-Analyse, um BMAT24zu quantifizieren. Andernfalls verarbeiten und paraffin-einbettende Knochen für die Histologie23.
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Representative Results
Mit dem oben beschriebenen Protokoll kann eine erfolgreiche Identifizierung und Isolierung verschiedener Mausfettdepots erreicht werden. Die brutto anatomischen Positionen der subkutanen (A, E-F), braunen (B), viszeralen (C, D, G-J) und poplitealen (K) Depots sind in Abbildung 2dargestellt.
Abbildung 2: Brutto anatomische Standorte von Maus-Adipose-Depots. Bruttoanatomie von (A) vordere subkutane, (B) braun, (C) epididymale (b, Blase), (D) Eierstock (u, Uterushörner), (E) posterior subkutan (dorsolumbar (d), inguinal (i), gluteal (g)), (F) Leistenbildung, (G) mesenteric, (H) perirenal (k, kidney), (I) retroperitoneal (k, kidney), (J) pericardial (h, heart) und (K) popliteal adipose depots in C57BL/6J adult mäuse. Pfeile zeigen auf bestimmte Depots, wenn mehrere Depots dargestellt werden. Relevante Organe werden durch entsprechende Buchstaben bezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Histologische Merkmale von subkutanen (A-D), braunen (E), viszeralen (F-K), poplitealen (L), konstitutiven (M) und regulierten Markfett (N), intramuskulären (O) und infrapatellaren (P) Fettdepots wurden von Hämatoxylin und Eosin (H&E) bewertet Färbung22 und sind in Abbildung 3dargestellt.
Abbildung 3: Histologische Auswertung diskreter Mausfettdepots. Histologie von (A) vordere subkutane, (B) dorsolumbar, (C) leisten, (D) gesäß, (E) braun, (F) gonagisch, (G) perirenal, (H) retroperitoneal, (I) omental, ( J) mesenteric, (K) pericardial, (L) popliteal, (M) konstitutive und (N) regulierte Knochenmark fett, (O) intermuskulär, und (P) infrapatellar Depots in C57BL/6J erwachsenen Mäusen. Gewebe wurden nach dem gegebenen Protokoll isoliert, über Nacht in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert, verarbeitet und in Paraffin eingebettet. 5 m Abschnitte wurden mit H&E befleckt. Die meisten Bilder wurden mit 100-facher Vergrößerung aufgenommen; Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Da die Bedeutung der vielfältigen molekularen und funktionellen Eigenschaften diskreter Adipozytencluster zunehmend erkannt wird, ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Forscher vor Ort für weitere Analysen Wertdepots einheitlich identifizieren und verbrauchen. Bis heute gibt es nur wenige Protokolle für die standardisierte Lokalisierung und Isolierung der breiten Palette von Maus-Fettdepots. Zuvor veröffentlichte Methoden konzentrieren sich in erster Linie auf ein oder zwei Depots und fehlen die Details für eine einheitliche Identifizierung und Exzision durch verschiedene Ermittler18,19. Dieses Manuskript ist ein neuartiger und wichtiger Beitrag auf dem Gebiet der Fettbiologie, da es eine ausführliche Anleitung zur anatomischen Lage und präzise Nezierung von allgemein untersuchten und weniger bekannten Depots in der Maus bietet. Großanatomische Standorte und histologische Analysen werden zur Veranschaulichung der Vielfalt von Adipozytennischen bereitgestellt.
Die erfolgreiche Isolierung diskreter Adipose-Depots mit diesem Protokoll hängt von mehreren kritischen Schritten ab. Die Aufrechterhaltung einer sauberen Sezierumgebung ist von entscheidender Bedeutung; 70% Ethanol kann bei Bedarf verwendet werden, um kontaminierende Haare oder Blut aus dem Seziertablett und den Werkzeugen zu entfernen. Bei der Isolierung der subkutanen WAT nachträglich ist es zwingend erforderlich, dass der anfängliche Schnitt in der Haut nicht in die eng verbundene Peritonealhöhle eindringt, so dass die beiden Schichten effizient getrennt werden können, um den WAT freizulegen. Ebenso dürfen Schnitte beim Durchschneiden der Peritonealwand, um den Inhalt der Bauchhöhle freizulegen, den darunter liegenden Darm nicht perforieren, um eine Kontamination mit Verdauungselementen zu verhindern. Interscapular BAT muss sorgfältig aus dem umgebenden Gewebe entfernt werden, um WAT-Kontamination zu verhindern, was zukünftige Analysen verzerren wird. Die konsequente Identifizierung der hinteren subkutanen Dorsolumbar-, Leisten- und Gesäßdepots hängt von der Verwendung präziser anatomischer Landmarken ab, die im Protokoll beschrieben sind. Die Unterscheidung zwischen diesen Depots ist besonders wichtig; Obwohl die Depots kontinuierlich erscheinen können, erhalten zentral gelegene Tintenförmige Adipozyten eher braune Eigenschaften als ihre umgebenden Gegenstücke.
Die mit diesem Protokoll isolierten Fettgewebe können mit einer Vielzahl von Techniken analysiert werden. Neben der histologischen Bewertung (z.B. H&E-Färbung, Immunhistochemie) können Fettgewebe für eine Vielzahl molekularer Analysen verwendet werden, von der Regulierung der Transkription bis hin zu posttranslationalen Proteinmodifikationen. Adipozyten und stromale Gefäßzellen in einzelnen Depots können durch Kollagennaseverdauung und Differentialzentrifugation isoliert werden. Diese Fraktionen können dann für molekulare, metabolische und Zellkulturstudien verwendet werden. Depot-Explants können auch für ex vivo metabolische und enzymatische Assays verwendet werden.
Bei der Isolierung und Exzision von Mausfettgeweben ergeben sich mehrere Herausforderungen und Einschränkungen. Erstens sind einige Depots, die beim Menschen physiologisch wichtig sind, bei mageren, erwachsenen Mäusen nicht häufig vorhanden. Zum Beispiel ist omental WAT, das wichtigste viszerale Depot beim Menschen, nur bei genetisch oder ernährungsinduzierten adipösen Mäusen zu sehen. Die Erweiterung einiger Depots kann jedoch durch Ernährungsherausforderungen oder medikamentöse Behandlungen induziert werden. Zum Beispiel kann eine fettreiche Diätfütterung die Ausdehnung von omentaler und perikardischer WAT verursachen. Intermuskuläre WAT kann durch Skelettmuskelverletzung induziert werden25,26 oder fettreiche Diät27. Reguliertes BMAT erweitert als Reaktion auf verschiedene Herausforderungen, einschließlich fettreicher Ernährung, Kalorienrestriktion und Thiazolidinedion-Behandlung11,28. Zweitens kann es aufgrund der geringen Größe von Mäusen schwierig sein, genügend Proben für molekulare oder metabolische Analysen zu erhalten. Zum Beispiel ist die Isolierung von genügend reinen Knochenmark-Adipozyten für nachfolgende Analysen eine Herausforderung, selbst nach der Bündelung von Knochen von mehreren Mäusen. Drittens kann es schwierig sein, die Grenzen bestimmter Depots genau zu definieren. Zum Beispiel scheint der hintere subkutane WAT ein kontinuierliches Depot zu sein, besteht aber tatsächlich aus diskreten Dorsolumbar-, Leisten- und Gesäßdepots. Darüber hinaus kann die Perirenal emolz sowohl mit dem Gonaden als auch mit retroperitonealen Depots bei sehr fettleibigen Tieren verschmolzen werden. Das Fehlen unterschiedlicher Grenzen zwischen benachbarten Depots kann eine saubere Isolierung dieser Gewebe erschweren. Dieses Sezierprotokoll bietet den Forschern jedoch einen detaillierten Atlas und eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für eine genaue und reproduzierbare Zerlegung einer Vielzahl von Mausfettdepots. Die feldweite Standardisierung der Identifizierung und Isolierung von diskreten Fettdepots für Die Maus wird zweifellos dazu beitragen, Unterschiede in der Entwicklung, Genexpression und lokalen und systemischen Funktionen früherer unterstudierte adipozyten Nischen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
O.A.M. wird durch NIH-Zuschüsse DK062876 und DK092759 unterstützt; D.P.B. wird vom University of Michigan Medical Scientist Training Program (T32GM007863), dem University of Michigan Training Program in Organogenesis (T32HD007605), dem University of Michigan Rackham Merit Fellowship und dem Tylenol Future Care Fellowship unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
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