Summary
Gli adipociti esistono in depositi discreti e hanno ruoli diversi all'interno dei loro microambienti unici. Poiché vengono scoperte le differenze regionali nel carattere e nella funzione degli adipociti, l'identificazione standardizzata e l'isolamento dei depositi sono fondamentali per l'avanzamento del campo. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'escissione di vari depositi adiposi del topo.
Abstract
I tessuti adipose sono organi complessi con una vasta gamma di funzioni, tra cui lo stoccaggio e la mobilitazione dell'energia in risposta alle esigenze locali e globali, il disaccoppiamento del metabolismo per generare calore e la secrezione di adipochine per regolare l'omeostasi di tutto il corpo e risposte immunitarie. La ricerca emergente sta identificando importanti differenze regionali nei profili di sviluppo, molecolari e funzionali degli adipociti situati in depositi discreti in tutto il corpo. Diverse proprietà dei depositi sono rilevanti dal punto di vista medico poiché le malattie metaboliche spesso dimostrano effetti specifici del deposito. Questo protocollo fornirà agli sperimentatori una dettagliata guida anatomica dell'atlante e di dissezione per l'identificazione e l'escissione riproducibili e accurate di diversi tessuti adipose del topo. La dissezione standardizzata dei depositi adipose discreti consentirà di confrontare dettagliatamente le loro caratteristiche molecolari e metaboliche e i contributi agli stati patologici locali e sistemici in varie condizioni nutrizionali e ambientali.
Introduction
I tessuti adipose svolgono un ruolo fondamentale nell'omeostasi di tutto il corpo, compreso lo stoccaggio e il rilascio di energia in risposta alle esigenze locali e globali, alla termoregolazione e alla secrezione di adipochine per regolare l'equilibrio energetico, il metabolismo e le risposte immunitarie1 , 2. Gli adipociti sono distribuiti in tutto il corpo in depositi discreti, e in alcuni casi svolgono ruoli specializzati all'interno dei loro microambienti3,4,5. Storicamente, lo studio del tessuto adiposo si è centrato sul tessuto adiposo bianco (WAT), e il suo ruolo nel mantenimento dell'energia omeostasi. La maggior parte degli adipociti sono distribuiti in tutto il corpo in depositi WAT sottocutanei e viscerali. Le caratteristiche di questi depositi sono importanti per la suscettibilità differenziale alle malattie metaboliche. Gli adipociti sottocutanei, situati sotto la pelle, sono stati associati a effetti metabolici protettivi5. Gli adipociti viscerali, che circondano gli organi vitali e sono contenuti all'interno dei depositi gonadi, perirenali, retroperitoneali, omentali e pericardiali, sono comunemente legati a disturbi metabolici, tra cui il diabete di tipo 2 e le malattie cardiovascolari2 . Anche i tessuti adiposi bruni (BAT) sono stati studiati a fondo. Gli adipociti marroni e marroni esprimono la proteina disaccoppiamento 1 (UCP1) e svolgono un ruolo importante nella termostasi adattiva e nell'omeostasi del glucosio6,7. Gli adipociti bruni classici sono contenuti nel deposito BAT interscapular8. Grappoli di adipociti bruni si trovano anche in altri luoghi, tra cui supraclavicolari, infra/subscapular, cervicale, paravertebrali e depositi periaortici8,9.
Oltre alla loro posizione nei principali depositi WAT e BAT, gli adipociti esistono in nicchie discrete in tutto il corpo4, dove possono svolgere funzioni specializzate all'interno dei loro rispettivi microambienti. Ad esempio, il tessuto adiposo del midollo osseo (BMAT) funge da serbatoio lipidico, è una fonte importante di adipologina circolante e interagisce strettamente con osteoblasti, osteoclasti e cellule ematopoietiche10,11. Gli adipociti dermici contribuiscono a processi diffusi, tra cui la guarigione delle ferite, la risposta immunitaria, la termoregolazione e la crescita del follicolo pilifero12,13. Inoltre, gli adipociti epicardici possono produrre diverse adipochine e chemiochine che esercitano effetti locali e sistemici sullo sviluppo e la progressione della malattia coronarica14. L'espansione del WAT inter/intramuscolare è stata positivamente correlata con una maggiore adiposità, resistenza all'insulina sistemica, e diminuzione della forza muscolare e della mobilità15. Inoltre, gli adipociti poplyali servono come serbatoio lipidico per l'espansione linfatica durante l'infezione16. Mentre i ruoli specifici di diversi depositi articolari sono generalmente sconosciuti, il deposito di Hoffa (infrapatellar) all'interno del ginocchio è ora pensato per contribuire alle patologie, tra cui dolore al ginocchio anteriore e osteoartrite17.
Mentre le differenze regionali nel carattere e nella funzione degli adipociti sono oggetto di intenso studio, il campo è attualmente limitato dalla mancanza di un protocollo standardizzato per l'identificazione e la dissezione di diversi depositi di topi. I metodi pubblicati in precedenza hanno tipicamente descritto l'isolamento di uno o due depositi specifici e non hanno il livello di dettaglio richiesto per l'escissione uniforme18,19. Il protocollo descritto in questo manoscritto fornisce una guida completa per le posizioni anatomiche specifiche e le fasi di isolamento di molti diversi depositi adiposi del topo. Anche se i depositi WAT sono l'obiettivo principale di questo manoscritto, l'escissione di BAT interscapular è anche descritta in dettaglio. I tessuti Adipose ascisi utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per un'ampia varietà di endpoint sperimentali, tra cui studi sulle espiante, istologia e analisi dell'espressione genica.
L'obiettivo di questo manoscritto è quello di fornire agli investigatori un protocollo dettagliato per identificare e isolare in modo chiaro e preciso sia i depositi adiposi del topo prominenti che quelli meno studiati (Figura 1). Questa risorsa faciliterà un'indagine più completa delle caratteristiche dello sviluppo, molecolari e funzionali degli adipociti all'interno di nicchie diverse.
Figura 1: Rappresentazione schematica dei depositi adiposi del topo sezionati in questo protocollo. Questa immagine è stata adattata da Bagchi et al., 20184. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali vengono eseguite con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.
1. Eutanasia
NOT: Ai fini di questo protocollo video, vengono utilizzati mouse C57BL/6J di 4-6 mesi.
- Posizionare il mouse in una camera vaporizzatore isoflurane e regolare la portata dell'isoflurane al 5% o superiore. Continuare l'esposizione agli isoflurani fino a un minuto dopo che la respirazione si ferma. Quindi rimuovere il mouse dalla camera vaporizzatore e confermare l'eutanasia utilizzando una misura secondaria approvata.
NOT: Le misure secondarie approvate variano a seconda del protocollo istituzionale e animale e possono includere la dislocazione o la decapitazione cervicale. - Posizionare il mouse eutanasia sulla teglia di dissezione. Sterilizzare le superfici esterne dorsali e ventrali del topo utilizzando il 70% di etanolo. Assicurarsi che la superficie esterna del mouse sia sufficientemente umida per ridurre al minimo la contaminazione da pelliccia durante la dissezione.
2. Identificazione e isolamento dei principali Ddepots Adipose Sottocutaneo (Sottocutaneo anteriore, Dorsolumbar, Inguinal, Gluteal) e Aadipose Marrone Interscapitolare
- Identificazione e isolamento sottocutaneo anteriore WAT
NOT: WAT sottocutaneo anteriore si trova tra le scapole, scendendo dalla nuca all'ascellare del topo7. Questo deposito è stato in alternativa descritto come suprascapular8 o interscapular20 WAT e si trova direttamente in cima al deposito BAT interscapular.- Per isolare il deposito sottocutaneo anteriore, posare il topo sullo stomaco in una posizione prona. Fissare la parte superiore e inferiore degli arti nella teglia di dissezione con perni di dissezione.
- Utilizzare le pinze per sollevare la pelle dorsale alla nuca. Utilizzare le forbici da bagno per fare un piccolo taglio (1 mm) nella pelle.
- Inserire una lama delle forbici dell'iride nel taglio iniziale e fare un'incisione verticale media (2-3 cm) attraverso la pelle, iniziando dalla nuca e scendendo lungo la colonna vertebrale a metà schiena.
- Fare due incisioni orizzontali (1 cm ciascuna) utilizzando le forbici dell'iride, che si estendono lateralmente dalla linea mediana, nella parte superiore e inferiore dell'incisione verticale iniziale.
- Utilizzare le pinze per staccare con cura la pelle ed esporre il deposito sottocutaneo anteriore.
- Utilizzare le forbici da iride per rimuovere il deposito seguendo i bordi naturali del tessuto.
NOT: Questo metodo isola sia il WAT sottocutaneo anteriore che il BAT interscapolare. - Posizionare il deposito sezionato sulla padella di dissezione e rimuovere con cura il BAT contaminante utilizzando le forbici da iride.
- Identificazione e isolamento c lasso BAT
NOT: Bat classico si trova sotto il deposito subcutaneo WAT anteriore.- Per isolare BAT, utilizzare le forbici da iride per tagliare orizzontalmente lungo il bordo inferiore del tessuto sottocutaneo anteriore, seguendo il bordo naturale del deposito.
- Quindi, utilizzare le forbici per fare due incisioni verticali lungo i bordi laterali del deposito, seguendo i bordi naturali del tessuto.
- Utilizzare le pinze per capovolgere con attenzione il deposito e rivelare la BAT interscaplare a forma di farfalla incorporata all'interno del WAT. Sezionare attentamente il BAT fuori dal WAT circostante.
- Identificazione e isolamento posteriore sottocutaneo WAT,
- Posare il mouse sulla schiena in una posizione supina.
- Dopo aver assicurato gli arti superiori e inferiori con perni di dissezione, utilizzare le pinze per sollevare la pelle alla base dello sterno e fare un piccolo (1 mm) tagliato nella pelle.
- Inserire una lama delle forbici dell'iride nel taglio iniziale e fare un'incisione mediana (4-5 cm) attraverso la pelle, iniziando dalla base dello sterno e scendendo alla base della coda. Prestare attenzione quando si effettua questa incisione perché la pelle ventrale è molto sottile ed è strettamente associata alla parete della cavità peritoneale sottostante.
- Fare due incisioni orizzontali (1 cm ciascuna) utilizzando le forbici dell'iride, estendendosi lateralmente dalla linea mediana, nella parte superiore dell'incisione verticale iniziale.
- Utilizzare pinze per staccare con cura la pelle dalla cavità peritoneale e dalla gamba per trovare il WAT sottocutaneo posteriore, che dovrebbe rimanere associato alla pelle. Fissare la pelle tesa con perni di dissezione per facilitare l'escissione completa del WAT.
NOT: Anche se il WAT sottocutaneo posteriore sembra essere continuo, in realtà è composto da tre depositi discreti: dorsolumbar, inguinal e gluteo1. Il deposito di dorsospatosi si estende dalla colonna lombare alla base dell'arto posteriore. Il deposito inguinale triangolare si estende dalla base dell'arto posteriore vensalendo attraverso l'inguine e contiene un linfonodo prominente. Il deposito gluteo si estende meno lontano dalla base dell'inguine e avvolge la gamba alla base della coda.
3. Identificazione e isolamento dei depositi Adipose Viscerali (Gonadal, Perirenal, Retroperitoneal, Omental, Pericardial)
- Identificazione e isolamento viscerali depositi WAT
NOT: I depositi WAT, che sono in gran parte contenuti all'interno delle cavità toraciche e peritoneali, mantengono il topo in posizione supina. Fissare la parte superiore e inferiore degli arti nella teglia di dissezione con perni di dissezione.- Utilizzare le pinze per sollevare la sottile parete della cavità peritoneale alla base dello sterno e fare un piccolo taglio (1 mm) utilizzando forbici da iride.
- Inserire una lama delle forbici dell'iride nel taglio e fare un'incisione discendente verticale (4-5 cm) dalla parte superiore della cavità peritoneale (base dello sterno) al retto.
- Fare due incisioni orizzontali (1 cm ciascuna) con forbici da iride, che si estendono lateralmente dalla linea mediana, nella parte superiore e inferiore dell'incisione verticale.
- Utilizzare pinze per staccare il peritoneo ed esporre il contenuto della cavità addominale. Pin il peritoneo teso alla padella di dissezione.
- Identificazione e isolamento g onadal WAT
NOT: Gonadal WAT circonda l'utero e le ovaie nelle femmine (ovariche o parametriali) e l'epididymis e testicoli nei maschi (epididymal). Il WAT ovarico circonda le ovaie, l'utero e la vescica. Negli animali obesi, la WAT gonadal e perirenale può sembrare continua- in questo caso, separare i depositi al corno uterino e alle ovaie. Il WAT epididymal si trova legato all'epididymis, ai testicoli e al vaso sanguigno epididymal.- Individuare le gonadi (teste o ovaie) e utilizzare pinze per sollevare il WAT gonadale associato.
- Utilizzare le forbici per accisare con attenzione il WAT dalle gonadi.
- Identificazione e isolamento p erirenale WAT
NOT: Perirenal WAT circonda i reni bilateralmente. Negli animali obesi, questo deposito può sembrare estendersi meno alla parte superiore del corno uterino e delle ovaie. Sebbene la WAT perirenale sia stata tradizionalmente classificata come deposito viscerale21, diversi gruppi lo hanno identificato come un deposito bruno basato sul tracciamento del lignaggio e studi di assorbimento del glucosio radioetichettati8,9, 20. Istologicamente è costituito da una miscela di adipociti bianchi e marroni.- Per accisare il deposito perirenale, individuare il rene e usare le pinze per sollevarlo e tirarlo in linea mediana per vedere una chiara divisione tra i depositi perirenali e retroperitoneali.
- Accisa il WAT direttamente associato ai reni. Assicurarsi che le ghiandole surrenali, situate sopra i reni, vengano rimosse dal WAT.
- Identificazione e isolamento r etroperitoneal WAT
NOT: Il WAT retroperitoneale si trova in una posizione paravertebrale, lungo il confine tra la parete addominale posteriore e il midollo spinale.- Per accise questo deposito, utilizzare le pinze per sollevare il rene verso la linea mediana per vedere chiaramente il confine tra i depositi perirenali e retroperitoneali.
NOT: Negli animali obesi, identificare questo confine può essere difficile. - Quindi, utilizzare le forbici da iride per sezionare attentamente il WAT retroperitoneale dalla parete peritoneale posteriore.
- Per accise questo deposito, utilizzare le pinze per sollevare il rene verso la linea mediana per vedere chiaramente il confine tra i depositi perirenali e retroperitoneali.
- Identificazione e isolamento di WAT omentali
NOT: Omental WAT si trova lungo la maggiore curvatura dello stomaco. Anche se l'adiposo omentale è un deposito importante negli esseri umani, è generalmente presente solo nei topi morbosamente obesi.- Per identificare il WAT omentale viscerale, utilizzare le pinze per sollevare lo stomaco. Utilizzare le forbici da iride per rimuovere il tessuto adiposo associato lungo il bordo inferiore dello stomaco. Non confondere la WAT omentale con il pancreas.
- Identificare e isolare i mesenterici WAT
NOT: Mesenteric WAT è una struttura web-like che circonda e associato con l'intestino piccolo e grande.- Per accise questo deposito, rimuovere l'intestino dal resto del tratto digestivo tagliando alla base dello stomaco e del retto. Utilizzare le pinze per sollevare l'intestino dalla cavità viscerale e svelarli.
- Utilizzare le forbici per sezionare attentamente il messente WAT lontano dall'intestino, iniziando dal duodenum e continuando fino alla fine del colon. Rimuovere con attenzione i linfonodi che sono strettamente associati con il deposito mesenterico.
- Identificazione e isolamento della WAT pericardiale
NOT: La WAT pericardiale si trova al di fuori del pericardio viscerale e sulla superficie esterna del pericardio parietale, spesso lungo l'aspetto inferiore del cuore14.- Per ottenere l'accesso alla cavità toracica, mantenere il mouse in posizione supina. Fissare la parte superiore e inferiore degli arti nella teglia di dissezione con perni di dissezione.
- Utilizzare pinze per sollevare il processo xifoideo (cartilagine alla base dello sterno) e fare un piccolo (1 mm) taglio nella parete della cavità toracica.
- Inserire una lama delle forbici dell'iride nel taglio e fare due incisioni orizzontali (1 cm ciascuna) che si estendono lateralmente dalla base dello sterno. Questo esporrà il diaframma e il bordo inferiore della cavità toracica.
- Utilizzare forbici dissetanti per fare due incisioni verticali ascendenti (3-4 cm) attraverso la gabbia toracica, estendendosi in modo superiore dai bordi laterali della cavità toracica alla clavicola.
- Utilizzare pinze per sollevare la metà ventrale della gabbia toracica. Utilizzare forbici dissetanti per fare un taglio finale (2 cm) lungo la lunghezza inferiore della clavicola per rimuovere la gabbia toracica ed esporre il contenuto della cavità toracica.
- Se presente, sezionare attentamente l'adiposo pericardio dalla superficie esterna del pericardio.
4. Identificazione e isolamento di altri depositi adipose
- Identificazione e isolamento della WAT epicardica
NOT: La WAT epicardiale è contenuta nel pericardio viscerale ed è direttamente associata alla superficie del miocardio.- Se presenti, gli adipociti epicardicipossono possono essere osservati istologicamente dopo l'isolamento e la fissazione del cuore perfuso nella formalina tampone neutra al 10% per 24 h.
- Identificazione e isolamento p opliteale WAT
NOT: La WAT popliteale si trova nella fossa popliteale del ginocchio posteriore e contiene un grande linfonodo. Questo deposito non è tipicamente visibile nei giovani animali.- Per isolare la WAT popliteale, utilizzare le forbici dell'iride per rimuovere con attenzione la pelle dalla base dell'arto posteriore al piede.
- Posizionare la rotula contro la teglia di dissezione e fissare la gamba tesa con uno spillo nel piede. Assicurarsi che la fossa popliteale nella parte posteriore del ginocchio sia rivolta verso l'alto.
- Utilizzare forbici iride per fare un taglio al bordo inferiore delle teste mediali e laterali del muscolo gastrocnemio. Utilizzare pinze per sollevare il muscolo e rivelare il deposito popliteale triangolare.
- Utilizzare le forbici da iride per accise il deposito lungo i bordi dei tessuti naturali.
- Identificazione e isolamento di WAT dermici
NOT: Dermal WAT è un sottile strato di adipociti situato tra il derma reticolare e lo strato muscolare panniculus carnosus.- Per identificare gli adipociti dermici con metodi istologici, posizionare il mouse sullo stomaco in una posizione prona. Dopo aver protetto gli arti superiori e inferiori con i perni di dissezione, spruzzare la superficie esterna del mouse con 70% di etanolo per umidare la pelle.
- Utilizzare un bisturi per rimuovere la pelliccia bagnata da una porzione quadrata di pelle sul retro del mouse.
- Utilizzare le forbici da iride per accise con attenzione la porzione rasata della pelle, che includerà il derma reticolare, il Dermal WAT, il panniculus carnosus e qualchecutaneo WAT sottocutaneo.
- Utilizzare un bisturi per tagliare la pelle eccitata in sottili strisce verticali.
- Posizionare le sottili strisce verticali con lo strato WAT sottocutaneo appiccicoso rivolto verso il basso.
- Partendo da un'estremità, rotolare la striscia su se stessa per formare una spirale. Lo strato WAT sottocutaneo appiccicoso all'esterno della spirale permetterà al rotolo di mantenere la sua forma durante la fissazione.
- Posizionare la spirale in un pozzo di un pozzo 24 pozzo contenente 10% neutro buffered formalina per 24 h prima della lavorazione istologica22.
- Identificazione e isolamento della WAT intermuscolare
NOT: WAT intermuscolare è ampiamente definito come adipociti situati sotto la fascia profonda dei muscoli. Questo termine include adipociti intervallati tra le fibre muscolari del muscolo scheletrico, noto anche come WAT intramuscolare, e adipociti situati all'interno di fasci muscolari stessi. I topi selvatici generalmente non hanno un gran numero di adipociti intermuscolari. Tuttavia, in determinate condizioni è possibile identificare la WAT intermuscolare con metodi istologici. In alcune condizioni, gli adipociti intermuscolari possono essere trovati anche nei muscoli lisci, come il diaframma.- Per isolare il muscolo tibialis anteriore (TA), ad esempio, posizionare il mouse sulla schiena in una posizione supina e fissare gli arti inferiori alla tesse di dissezione utilizzando perni di dissezione. Sorrida la pelle con il 70% di etanolo per ridurre al minimo la contaminazione da pelliccia.
- Utilizzare forbici da iride per rimuovere con attenzione la pelle dalla gamba ed esporre il gruppo muscolare del quadricipite, situato sopra il ginocchio sull'albero del femore, e la TA situata sotto il ginocchio sulla superficie ventrale della tibia.
NOT: La TA è spessa vicino all'estremità prossimale della tibia e più tendinosa vicino all'estremità distale. - Utilizzare le forbici per accisare un pezzo del muscolo e fissare in formalina tampone neutra al 10% per 24 h prima dell'elaborazione istologica22.
- Identificazione e isolamento dei depositi WAT intra-articolari
NOT: I depositi WAT intraarticolari si trovano all'interno dei giunti sinoviali.- Per identificare l'infrastruttura di WAT infrapatellar, ad esempio con metodi istologici, raccogliere le ossa delle gambe come descritto nella sezione BMAT.
- Dopo la rimozione del complesso femorale-tibiale, utilizzare forbici iride e pastiglie di garza per rimuovere il più muscolo e tessuto connettivo possibile. Non rompere l'articolazione tibiofemorale.
- Fissare il complesso femorale-tibiale in formalina tamponata neutra del 10% per 24 h prima della decalcificazione e dell'elaborazione istologica (descritta di seguito, passo 4.6.8).
- Identificazione e isolamento del tessuto adiposo del midollo osseo
NOT: Il tessuto adiposo del midollo osseo (BMAT) è contenuto all'interno delle ossa, intervallato da cellule ematopoietiche. Anatomicamente, BMAT può essere classificato come constitutivo (tibia distale e vertebre caudale) o regolato (tibia medio-prossimale, femore e vertebre lombari)10,11. Un pulito isolamento degli adipociti del midollo osseo per l'analisi dell'RNA e delle proteine è impegnativo nei topi. Tuttavia, le ossa del topo possono essere prontamente raccolte, fisse, decalcolate e incorporate in paraffina per le analisi istologiche.- Per raccogliere le ossa delle gambe, per esempio, prima rimuovere le gambe dal mouse. Utilizzare le forbici di dissezione per tagliare l'articolazione acetabulofemorale, mantenendo la testa femorale intatta.
- Utilizzare forbici da iride per rimuovere con attenzione la pelle dalla gamba, rivelando i muscoli delle gambe.
- Sezionare con attenzione i muscoli principali del femore e della tibia utilizzando forbici da iride e cuscinetti di garza.
- Quando il femore è esposto, seguire il bordo dell'osso fino all'articolazione del bacino e del femore e rilasciare con attenzione la testa femorale dall'articolazione acetabulofemorale. Utilizzare la garza per pulire qualsiasi tessuto rimanente dal femore.
- Seguire il bordo della tibia all'articolazione della caviglia. Rilasciare con attenzione il malleolo mediale, situato sulla punta della tibia, dall'articolazione della caviglia.
- Una volta che il complesso femorale-tibiale è stato isolato, rimuovere il più muscolo e tessuto connettivo possibile utilizzando forbici iride e /o garza.
- Separare la tibia dal femore inserendo una lama delle forbici dell'iride nell'articolazione tibiofemorale e tagliare delicatamente attraverso i legamenti collaterali mediali e laterali e i legamenti crociati anteriori e posteriori. Non rimuovere la capsula dell'articolazione del ginocchio per garantire che la tibia rimanga intatta. Utilizzare la garza per pulire qualsiasi tessuto rimanente dalla tibia.
- Fissare le ossa in formalina tampone neutra al 10% per 24 h a temperatura ambiente e poi lavare e conservare in base alle esigenze future.
- Per analizzare i parametri ossei utilizzando la tomografia microcalcolata , conservare le ossa nel buffer di fosfato di Sorensen, pH 7.423.
- Per la quantificazione BMAT e le analisi istologiche, decalcificare le ossa nel 14% EDTA, pH 7,4, per 10-14 giorni.
- Dopo la decalcificazione, utilizzare la colorazione del tetrossido di osmio e l'analisi del CT per quantificare BMAT24. In caso contrario, elaborare e paraffina-incorporare le ossa per l'istologia23.
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Representative Results
L'identificazione e l'isolamento di vari depositi adipose del topo possono essere raggiunti utilizzando il protocollo descritto in precedenza. Le posizioni anatomiche lorde dei depositi sottocutanei (A, E-F), marrone (B), viscerali (C, D, G-J) e popliteal (K) sono mostrate nella Figura 2.
Figura 2: Posizioni anatomiche lorde dei depositi adiposi del topo. Anatomia lorda di (A) sottocutaneo anteriore, (B) marrone, (C) epididymal (b, vescica), (D) ovarico (u, corna uterino), (E) sottocutaneo posteriore (dorsolumbar (dorsolumbar (d), inguinale (i), gluteo (g)), (F) inguinale, (G) mesenterico, (H) perirenale (k, rene), (I) retroperitoneal (k, rene), (J) pericardial (h, cuore) e (X) depositi popliteali adipose in topi adulti C57BL/6J. Le frecce indicano depositi specifici se sono raffigurati più depositi. Gli organi pertinenti sono designati da lettere appropriate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le caratteristiche istologiche dei depositi sottocutanei (A-D), marrone (E), viscerale (F-K), popliteal (L), costituzionali e regolati del midollo adiposo (N), intramuscolare (O) e infrapatellar (P) sono stati valutati da Hematoxylin ed Eosin (H&E) colorazione22 e sono mostrati in Figura 3.
Figura 3: valutazione istologica dei depositi discreti di adiposi del topo. Istoologia di (A) sottocutaneo anteriore, (B) dorsolumbar, (C) inguinale, (D) gluteo, (E) marrone, (F) gonadal, (G) perirenale, (H) retroperitoneale, (I) omental, ( J) mesenterico, (K) pericardiale, (L) popliteal,(M) regolato marrow osseo adiposo, (O) intermuscolare, e (P) depositi infrapalebra nei topi adulti C57BL/6J. I tessuti sono stati isolati in base al protocollo specificato, fissati durante la notte in formalina, elaborata e incorporata nella paraffina. 5 sezioni di zm sono state macchiate con H&E. La maggior parte delle immagini sono state scattate con ingrandimento 100x; Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Poiché l'importanza delle diverse caratteristiche molecolari e funzionali dei cluster di adipociti discreti è sempre più riconosciuta, è fondamentale che i ricercatori all'interno del campo identifichino uniformemente ed estincano depositi adiposi per ulteriori analisi. Ad oggi, esistono pochi protocolli per la localizzazione standardizzata e l'isolamento della vasta gamma di depositi adiposi del topo. I metodi pubblicati in precedenza si concentrano principalmente su uno o due depositi e mancano dei dettagli necessari per l'identificazione uniforme e l'escissione da parte di diversi ricercatori18,19. Questo manoscritto è un nuovo e importante contributo al campo della biologia adiposa in quanto fornisce una guida approfondita alla posizione anatomica e alla dissezione precisa dei depositi comunemente studiati e meno conosciuti in tutto il mouse. La posizione anatomica lorda e le analisi istologiche sono fornite per dimostrare la diversità delle nicchie adipociti.
Il successo dell'isolamento dei depositi adiposi discreti che utilizzano questo protocollo dipende da diversi passaggi critici. Il mantenimento di un ambiente di dissezione pulito è fondamentale; 70% di etanolo può essere utilizzato come necessario per rimuovere peli o sangue contaminati dal vassoio di dissezione e strumenti. Quando si isola il WAT sottocutaneo posteriore posteriore, è imperativo che l'incisione iniziale nella pelle non penetri nella cavità peritoneale strettamente associata in modo che i due strati possano essere separati in modo efficiente per esporre il WAT. Allo stesso modo, quando si taglia attraverso la parete peritoneale per esporre il contenuto della cavità addominale, le incisioni non devono perforare l'intestino sottostante per prevenire la contaminazione con elementi digestivi. La BAT interscapolare deve essere accuratamente asportata dal tessuto circostante per evitare la contaminazione da WAT, che distorce le analisi future. L'identificazione coerente dei depositi sottocutanei, inguinali e glutei posteriori dipende dall'utilizzo di precisi punti di riferimento anatomici descritti nel protocollo. La distinzione tra questi depositi è particolarmente importante; anche se i depositi possono sembrare continui, gli adipociti inguinali situati in posizione centrale acquisiscono caratteristiche simili al marrone più facilmente rispetto alle loro controparti circostanti.
I tessuti adiposi isolati utilizzando questo protocollo possono essere analizzati utilizzando una varietà di tecniche. Oltre alla valutazione istologica (ad esempio colorazione H&E, immunohistochimica), i tessuti adiposi possono essere utilizzati per una vasta gamma di analisi molecolari, dalla regolazione della trascrizione fino alle modifiche post-traduzionale delle proteine. Gli adipociti e le cellule vascolari stromali all'interno dei singoli depositi possono essere isolati dalla digestione del collagenae e dalla centrifugazione differenziale. Queste frazioni possono quindi essere utilizzate per studi di coltura molecolare, metabolica e cellulare. Gli espianti dei depositi possono essere utilizzati anche per saggi metabolici ed ezimatici ex vivo.
Diverse sfide e limitazioni sorgono durante l'isolamento e l'escissione dei tessuti adiposi del topo. In primo luogo, alcuni depositi che sono fisiologicamente importanti negli esseri umani non sono comunemente presenti nei topi magri e adulti. Per esempio, il WAT omentale, che è il principale deposito viscerale negli esseri umani, può essere visto solo nei topi obesi geneticamente o indotti dalla dieta. L'espansione di alcuni depositi può, tuttavia, essere indotta da sfide nutrizionali o trattamenti farmacologici. Ad esempio, l'alimentazione ad alto contenuto di grassi può causare l'espansione della WAT omentale e pericardiale. WAT intermuscolare può essere indotta da lesioni muscolari scheletriche25,26 o dieta ad alto contenuto di grassi27. Regolato BMAT si espande in risposta a varie sfide, tra cui dieta ad alto contenuto di grassi, restrizione calorica e trattamento di tiazolidineone11,28. In secondo luogo, a causa delle piccole dimensioni dei topi, ottenere un campione sufficiente per le analisi molecolari o metaboliche può essere difficile. Ad esempio, l'isolamento di abbastanza adipociti del midollo osseo puro per le analisi successive è impegnativo, anche dopo aver raggruppato le ossa di più topi. In terzo luogo, la definizione accurata dei confini di alcuni depositi può essere difficile. Ad esempio, il WAT sottocutaneo posteriore sembra essere un deposito continuo, ma in realtà è costituito da depositi discreti dorsolumbar, inguinali e glutei. Inoltre, il perirenale può sembrare fuso sia ai depositi gonadali che retroperitoneali in animali molto obesi. La mancanza di confini distinti tra depositi adiacenti può rendere difficile l'isolamento pulito di questi tessuti. Tuttavia, questo protocollo di dissezione fornisce agli sperimentatori un atlante dettagliato e una guida passo-passo per una dissezione accurata e riproducibile di una vasta gamma di depositi adiposi del topo. La standardizzazione a livello di campo dell'identificazione e dell'isolamento dei depositi adiposi discreti del topo descritti in precedenza contribuirà senza dubbio a chiarire ulteriormente le differenze nello sviluppo, nell'espressione genica e nelle funzioni locali e sistemiche di un tempo nicchie adipociti poco studiati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
O.A.M. è supportato da sovvenzioni NIH DK062876 e DK092759; D.P.B. è supportato dal programma di formazione per gli scienziati medici dell'Università del Michigan (T32GM007863), dal programma di formazione dell'Università del Michigan in Organogenesi (T32HD007605), dalla borsa di studio per il merito di Rackham e dalla Tylenol Future Care Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
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