Summary
Adipocyter finns i diskreta depåer och har olika roller inom sina unika mikromiljöer. Eftersom regionala skillnader i fettceller karaktär och funktion är avslöjade, standardiserad identifiering och isolering av depåer är avgörande för avancemang av området. Häri presenterar vi ett detaljerat protokoll för excision av olika mus fettdepåer.
Abstract
Fettvävnader är komplexa organ med ett brett spektrum av funktioner, inklusive lagring och mobilisering av energi som svar på lokala och globala behov, unkoppling av metabolism för att generera värme, och utsöndring av adipokines att reglera hela kroppen homeostas och immunsvar. Framväxande forskning identifierar viktiga regionala skillnader i utvecklingsmässiga, molekylära och funktionella profiler av adipocyter ligger i diskreta depåer i hela kroppen. Olika egenskaper hos depåerna är medicinskt relevanta eftersom metabola sjukdomar ofta visar Depot-specifika effekter. Detta protokoll kommer att ge utredare med en detaljerad anatomisk Atlas och dissektion guide för reproducerbara och korrekt identifiering och excision av olika mus fettvävnader. Standardiserad dissektion av diskreta fettdepåer kommer att möjliggöra detaljerade jämförelser av deras molekylära och metabola egenskaper och bidrag till lokala och systemiska patologiska tillstånd under olika närings-och miljöförhållanden.
Introduction
Adipose vävnader spelar kritiska roller i hela kroppen homeostas, inklusive lagring och frisättning av energi som svar på lokala och globala behov, termoreglering, och utsöndring av adipokines att reglera energibalansen, metabolism och immunsvar1 , 2. adipocyter fördelas i hela kroppen i diskreta depåer, och i vissa fall tjäna specialiserade roller inom deras mikromiljöer3,4,5. Historiskt har studiet av fettvävnad centrerad på vit fettvävnad (WAT), och dess roll i att upprätthålla energi homeostas. De flesta adipocyter fördelas i hela kroppen i subkutan och visceral WAT depåer. Egenskaperna hos dessa depåer är viktiga för differentiell känslighet för metabola sjukdomar. Subkutan adipocyter, ligger under huden, har förknippats med skyddande metabola effekter5. Visceral adipocyter, som omger vitala organ och ingår i gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental och perikardiell depåer, är ofta kopplade till metabola sjukdomar, inklusive typ 2 diabetes och hjärt-kärlsjukdom2 . Bruna fettvävnader (BAT) har också studerats utförligt. Brun och brun-liknande adipocyter Express unkoppling protein 1 (UCP1) och spela viktiga roller i adaptiv thermogenesis och glukos homeostas6,7. Klassiska bruna adipocyter ingår i interscapular BAT Depot8. Kluster av bruna adipocyter finns också på andra platser, inklusive supraclavicular, infra/subscapular, cervikal, paravertebral och periaortic depåer8,9.
Förutom deras placering i stora WAT och BAT depåer, adipocyter finns i diskreta nischer i hela kroppen4, där de kan utföra specialiserade funktioner inom sina respektive mikromiljöer. Till exempel, benmärg fettvävnad (BMAT) fungerar som en lipid reservoar, är en viktig källa till cirkulerande adiponectin, och nära interagerar med osteoblaster, osteoklaster, och hematopoietiska celler10,11. Dermal adipocyter bidra till utbredda processer, inklusive sårläkning, immunsvar, termoreglering, och hårfollikeltillväxt12,13. Ytterligare, epikardiell adipocyter kan producera flera adipokines och chemokines som utövar lokala och systemiska effekter på utveckling och progression av kranskärlssjukdom14. Expansion av Inter/intramuskulär WAT har varit positivt korrelerad med ökad Adiposity, systemisk insulinresistens, och minskad muskelstyrka och rörlighet15. Dessutom, popliteal adipocyter fungera som en lipid reservoar för lymfatiska expansion under infektion16. Medan de specifika rollerna för olika led depåer är i allmänhet okända, Hoffa Depot (infrapatellar) i knäet är nu tänkt att bidra till patologier, inklusive främre knäsmärta och artros17.
Medan regionala skillnader i fettceller-tecken och-funktion är under intensiv undersökning begränsas området för närvarande av avsaknaden av ett standardiserat protokoll för identifiering och dissektion av olika mus depåer. Tidigare publicerade metoder har typiskt beskrivit isoleringen av en eller två specifika depåer och saknar den detaljnivå som krävs för enhetlig excision18,19. Det protokoll som beskrivs i detta manuskript ger en omfattande guide för de specifika anatomiska platser och isolerings steg av många olika mus fettdepåer. Även om WAT depåer är den primära fokus för detta manuskript, excision av interscapular BAT beskrivs också i detalj. Fettvävnad som exciseras med detta protokoll kan användas för en mängd olika experimentella endpoints, inklusive explantstudier, histologi och gen uttrycks analyser.
Målet med detta manuskript är att förse utredarna med ett detaljerat protokoll för att tydligt och precist identifiera och isolera både framstående och mindre studerade mus-fett-depåer (figur 1). Denna resurs kommer att underlätta en mer fullständig utredning av de utvecklingsmässiga, molekylära och funktionella egenskaperna hos adipocyter inom olika nischer.
Figur 1: Schematisk avbildning av mus fettdepåer dissekeras i detta protokoll. Denna bild har anpassats från Bagchi et al., 20184. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utförs med godkännande av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Michigan.
1. euthanization
Anmärkning: Vid tillämpningen av detta video protokoll används 4 till 6 månader gamla C57BL/6J möss.
- Placera musen i en isofluran spridare kammare och justera isofluran flödet till 5% eller högre. Fortsätt exponeringen för isofluran till en minut efter att andningen har stannat. Ta sedan bort musen från spridare kammaren och bekräfta eutanasi med hjälp av en godkänd sekundär åtgärd.
Anmärkning: Godkända sekundära åtgärder kommer att variera beroende på institution och djur protokoll och kan innefatta cervikal dislokation eller halshuggning. - Placera den euthanized musen på dissektion Pan. Sterilisera den dorsala och ventrala yttre ytor av musen med 70% etanol. Se till att den yttre ytan av musen är tillräckligt våt för att minimera kontaminering från päls under dissektion.
2. identifiering och isolering av större subkutana fettdepåer (främre subkutan, Dorsolumbar, inguinal, gluteala) och interscapular brun Aadipose vävnad
- Identifiering och isolering av främre subkutana Wat
Anmärkning: Främre subkutan Wat ligger mellan scapulae, fallande från nacken av halsen till armhålor av musen7. Denna depå har alternativt beskrivits som suprascapular8 eller interscapular20 Wat och ligger direkt ovanpå interscapular bat Depot.- För att isolera den främre subkutan depå, låg musen på magen i en liggande position. Säkra de övre och nedre extremiteterna till dissektion Pan med dissektion stift.
- Använd tång för att lyfta den dorsala huden vid nacken. Använd Iris sax för att göra en liten (1 mm) skära i huden.
- Sätt in ett blad av Iris saxen i den ursprungliga snittet och göra en mittlinjen vertikala snitt (2-3 cm) genom huden, med början vid nacken och fallande längs ryggraden till mitten av ryggen.
- Gör två horisontella snitt (1 cm vardera) med Iris sax, som sträcker sig i sidled från mittlinjen, på toppen och botten av den initiala vertikala snittet.
- Använd tång för att försiktigt dra tillbaka huden och exponera den främre subkutana depån.
- Använd Iris sax för att ta bort depån efter de naturliga kanterna av vävnaden.
Anmärkning: Denna metod isolerar både främre subkutan WAT och interscapular BAT. - Placera dissekerade depån på dissektion pannan och försiktigt bort förorenande BAT med Iris sax.
- Identifiera och isolera c lassical bat
Anmärkning: Klassisk FLADDERMUS ligger under den främre subkutan WAT Depot.- För att isolera BAT, Använd Iris sax för att skära horisontellt längs den nedre kanten av den främre subkutan vävnad, efter den naturliga gränsen av depån.
- Använd sedan Iris sax för att göra två vertikala snitt längs de laterala kanterna av depån, efter de naturliga gränserna av vävnaden.
- Använd tång för att försiktigt vända depån upp och avslöja fjärilformade interscapular BAT inbäddade i WAT. Försiktigt dissekera BAT ut från den omgivande WAT.
- Identifiera och isolera posterior subkutan Wat,
- Lägg musen på ryggen i liggande läge.
- Efter säkring av övre och nedre extremiteterna med dissektion stift, använda pinpett för att lyfta upp huden vid basen av bröstbenet och göra en liten (1 mm) skära i huden.
- Sätt in ett blad av Iris saxen i den ursprungliga snittet och göra en mittlinjen snitt (4-5 cm) genom huden, med början vid basen av bröstbenet och fallande till basen av svansen. Var försiktig när du gör detta snitt eftersom ventrala huden är mycket tunn och är nära förknippad med den underliggande peritonealhålan väggen.
- Gör två horisontella snitt (1 cm vardera) med Iris sax, som sträcker sig i sidled från mittlinjen, på toppen av den initiala vertikala snittet.
- Använd tång för att försiktigt dra tillbaka huden från bukhålan och benet för att hitta bakre subkutan WAT, som bör förbli förknippade med huden. Säkra den utsträckta huden med dissekera stift för att underlätta fullständig excision av WAT.
Anmärkning: Även om den bakre subkutan WAT verkar vara kontinuerlig, det är faktiskt består av tre diskreta depåer: dorsolumbar, inguinal, och gluteala1. Dorsolumbar Depot sträcker sig från ländryggen till basen av bakbenen. Den triangulära ljumsk Depot sträcker sig från basen av bakbenet ventralt över ljumsk och innehåller en framträdande lymfkörtel. Den gluteala Depot sträcker inferiorly från basen av ljucka och sveper runt benet till basen av svansen.
3. identifiering och isolering av visceral fettdepåer (gonadala, perirenal, retroperitoneal, omental, perikardiell)
- Identifiera och isolera visceral Wat depåer
Anmärkning: WAT depåer, som till stor del ingår i bröstkorg och peritonealdialys håligheter, hålla musen i liggande läge. Säkra de övre och nedre extremiteterna till dissektion Pan med dissektion stift.- Använd tång för att lyfta upp den tunna peritoneala hålighet väggen vid basen av bröstbenet och göra en liten klippa (1 mm) med Iris sax.
- Sätt ett blad av Iris saxen i snittet och göra en fallande vertikal snitt (4-5 cm) från toppen av bukhålan (bas av bröstbenet) till ändtarmen.
- Gör två horisontella snitt (1 cm vardera) med Iris sax, sträcker sig i sidled från mittlinjen, på toppen och botten av det vertikala snittet.
- Använd tång för att skala tillbaka bukhinnan och exponera bukhålan innehållet. Fäst den utsträckta bukhinnan till dissektion Pan.
- Identifiera och isolera g onadal Wat
Anmärkning: Gonadal Wat omger livmodern och äggstockarna hos honor (äggstocks eller parametrial) och bitestiklarna och testiklarna hos män (epididymal). Äggstockarna WAT omger äggstockarna, livmodern, och urinblåsan. I feta djur, gonadala och perirenalt Wat kan tyckas vara kontinuerlig-i detta fall, separera depåer vid livmoder hornet och äggstockarna. Epididymal WAT hittas bunden till epididymis, testiklarna, och den framstående epididymal blodkärl.- Lokalisera könskörtlarnas (testiklarna eller äggstockarna) och Använd tång för att lyfta upp den tillhörande gonadala WAT.
- Använd Iris sax för att försiktigt punktskatter WAT från gonaderna.
- Identifiera och isolera p erirenal Wat
Anmärkning: Perirenal WAT omger njurarna bilateralt. Hos överviktiga djur, kan denna depå verkar utvidga inferiorly till toppen av livmoder hornet och äggstockarna. Även om perirenalt Wat traditionellt har klassificerats som en visceral Depot21, flera grupper har identifierat det som en brun Depot baserad på härstamning och radiomärkade glukos upptagningsstudier8,9, 20. histologiskt består den av en blandning av vita och bruna adipocyter.- Till punktskatter på perirenalt Depot, lokalisera njuren och använda pinkoppar för att lyfta upp den och dra den mittlinjen att se en tydlig uppdelning mellan perirenalt och retroperitoneal depåer.
- Punktskatter WAT direkt förknippade med njurarna. Se till att binjurarna, som ligger ovanför njurarna, avlägsnas från WAT.
- Identifiera och isolera r etroperitoneal Wat
Anmärkning: Retroperitoneal WAT ligger i en paravertebral position, längs gränsen mellan den bakre bukväggen och ryggmärgen.- Att accis denna depå, använda pinkoppar för att lyfta njuren upp och mot mittlinjen att tydligt se gränsen mellan perirenalt och retroperitoneal depåer.
Anmärkning: Hos överviktiga djur, identifiera denna gräns kan vara utmanande. - Använd sedan Iris sax för att noggrant dissekera retroperitoneal WAT från den bakre peritonealväggen.
- Att accis denna depå, använda pinkoppar för att lyfta njuren upp och mot mittlinjen att tydligt se gränsen mellan perirenalt och retroperitoneal depåer.
- Identifiera och isolera omental WAT
Anmärkning: Omental WAT ligger längs den större krökning av magen. Även omental fett är en viktig depå hos människor, det är i allmänhet närvarande endast i sjuklig feta möss.- För att identifiera visceral omental WAT, använda tång för att lyfta magen upp. Använd Iris sax för att ta bort den tillhörande fettvävnad längs den sämre gränsen av magen. Förväxla inte omental WAT med bukspottkörteln.
- Identifiera och isolera mesenterisk Wat
Anmärkning: Mesenteric WAT är en webb-liknande struktur som omger och förknippas med små och stora tarmarna.- Att accis denna depå, ta bort tarmarna från resten av mag-tarmkanalen genom att skära vid basen av magen och ändtarmen. Använd tång för att lyfta tarmen ur visceral hålighet och riva upp dem.
- Använd Iris sax för att noggrant dissekera den mesenterica Wat bort från tarmen, börjar vid tolvfingertarmen och fortsätter till slutet av tjocktarmen. Ta försiktigt bort lymfkörtlar som är nära förknippade med mesenterisk depå.
- Identifiera och isolera perikardiell WAT
Anmärkning: Perikardiell WAT ligger utanför visceral hjärtsäcken och på utsidan av Parietala Perikardium, ofta längs sämre aspekt av hjärtat14.- För att få tillgång till brösthålan, hålla musen i liggande läge. Säkra de övre och nedre extremiteterna till dissektion Pan med dissektion stift.
- Använd pinkoppar för att lyfta xyphoid processen (brosk vid basen av bröstbenet) och göra en liten (1 mm) skära i brösthålan väggen.
- Sätt ett blad av Iris saxen i snittet och göra två horisontella snitt (1 cm vardera) sträcker sig i sidled från basen av bröstbenet. Detta kommer att utsätta membranet och sämre gränsen av brösthålan.
- Använd dissekera sax för att göra två stigande vertikala snitt (3-4 cm) genom bröstkorgen, sträcker sig fint från de laterala gränserna för brösthålan till nyckelbenet.
- Använd pinproppar för att lyfta upp den ventrala halvan av bröstkorgen. Använd dissekera sax för att göra en slutlig cut (2 cm) längs den sämre längden på nyckelbenet att ta bort bröstkorgen och exponera brösthålan innehållet.
- Om det finns, noggrant dissekera perikardiell fett från den yttre ytan av hjärtsäcken.
4. identifiering och isolering av andra fettdepåer
- Identifiera och isolera epikardiell WAT
Anmärkning: Epikardiell WAT är innesluten i den visceral hjärtsäcken och är direkt förknippad med ytan av myocardium.- Om närvarande, epikardiell adipocyter kan observeras histologiskt efter isolering och fixering av det parfymera hjärtat i 10% neutral buffrad formalin för 24 h.
- Identifiera och isolera p opliteal Wat
Anmärkning: Popliteal WAT ligger i popliteal fossa i bakre knä och innehåller en stor lymfkörtel. Denna depå är vanligtvis inte synlig hos unga djur.- För att isolera popliteal WAT, Använd Iris sax för att försiktigt ta bort huden från basen av bakbenen till foten.
- Placera patella mot dissektion pannan och säkra den utsträckta benet med en nål i foten. Se till att popliteal fossa på baksidan av knäet är vänd uppåt.
- Använd Iris sax för att göra en nedskärning vid sämre gränsen för mediala och laterala huvuden av gastrocnemius muskeln. Använd tång för att lyfta upp muskeln och avslöja den triangulära popliteal Depot.
- Använd Iris sax för att punktskatter depån längs den naturliga vävnaden gränser.
- Identifiera och isolera dermal WAT
Anmärkning: Dermal WAT är ett tunt lager av adipocyter ligger mellan retikulära dermis och panniculus carnosus muskellagret.- För att identifiera dermal adipocyter av histologiska metoder, Placera musen på magen i en liggande position. Efter säkring av övre och nedre extremiteterna med dissektion stift, spraya den yttre ytan av musen med 70% etanol för att blöta huden.
- Använd en skalpell för att ta bort den fuktade pälsen från en fyrkantig del av huden på bak med musen.
- Använd Iris sax för att försiktigt punktskatter den rakade delen av huden, som kommer att omfatta retikulära dermis, dermal WAT, panniculus carnosus, och några subkutana WAT.
- Använd en skalpell för att skära den exciderade huden i tunna vertikala remsor.
- Placera tunna vertikala remsor med klibbiga subkutana WAT lager vänd nedåt.
- Starta i ena änden, rulla remsan på sig att bilda en spiral. Den klibbiga subkutana WAT skikt på utsidan av spiralen gör det möjligt för rullen att behålla sin form under fixering.
- Placera spiralen i en brunn av en 24 väl platta som innehåller 10% neutral buffrad formalin för 24 h före histologisk bearbetning22.
- Identifiera och isolera intermuskulös WAT
Anmärkning: Intermuskulös WAT är i stort sett definieras som adipocyter ligger under den djupa fascian av muskler. Denna term inkluderar adipocyter varvat mellan muskelfibrer av skelettmuskulaturen, även känd som intramuskulär WAT, och adipocyter ligger inom muskelbuntar själva. Wildtype möss har i allmänhet inte ett stort antal intermuskulös adipocyter. Emellertid, det är möjligt under vissa förutsättningar att identifiera intermuskulös WAT av histologiska metoder. Under vissa förhållanden, intermuskulös adipocyter kan också hittas i glatta muskler, såsom membranet.- För att isolera tibialis anterior (TA) muskler, till exempel, Placera musen på ryggen i liggande läge och säkra de nedre extremiteterna till dissektion Pan med dissektion stift. Fukta huden med 70% etanol för att minimera kontaminering med päls.
- Använd Iris sax för att försiktigt ta bort huden från benet och utsätta quadriceps muskelgrupp, som ligger ovanför knäet på lårbenet axeln, och TA ligger under knäet på den ventrala ytan av skenbenet.
Anmärkning: TA är tjock nära den proximala änden av skenbenet och mer tendinous nära distala änden. - Använd Iris sax för att punktskatter en bit av muskeln och Fix i 10% neutral buffrad formalin för 24 h före histologisk bearbetning22.
- Identifiera och isolera intra-artikulär WAT depåer
Anmärkning: Intra-artikulär Wat depåer ligger inom LED lederna.- För att identifiera infrapatellar WAT, till exempel, genom histologiska metoder, skörd ben ben som beskrivs i BMAT avsnitt.
- Efter avlägsnande av lårbenet-tibial komplex, Använd Iris sax och gasbinda kuddar för att ta bort så mycket muskler och bindväv som möjligt. Bryt inte den tibiofemorala leden.
- Fixera femur-tibial-komplexet i 10% neutral buffrad formalin under 24 timmar före avalskning och histologisk bearbetning (beskrivs nedan, steg 4.6.8).
- Identifiera och isolera benmärg fettvävnad
Anmärkning: Benmärg fettvävnad (BMAT) ingår i ben, varvade med hematopoietiska celler. Anatomiskt, BMAT kan klassificeras som konstitutiva (distala tibia och caudal Kotor) eller regleras (mitten-till-proximala Tibia, lårbenet, och ländryggen Kotor)10,11. Ren isolering av benmärg adipocyter för RNA och protein analyser är utmanande hos möss. Men, mus ben kan lätt skördas, fast, urkalkade permanenta och paraffin-inbäddade för histologiska analyser.- För att skörda ben ben, till exempel, först ta bort benen från musen. Använd dissektion sax för att skära acetabulofemoral gemensamma, hålla lårbenshuvudet intakt.
- Använd Iris sax för att försiktigt ta bort huden från benet, avslöjar benet muskler.
- Försiktigt dissekera bort de viktigaste musklerna från lårbenet och Tibia med Iris sax och gasbinda kuddar.
- När lårbenet är utsatt, följ kanten av benet till artikulation av bäckenet och lårbenet och försiktigt släppa lårbenshuvudet från acetabulofemoral gemensamma. Använd gasväv för att rengöra kvarvarande vävnad från lårbenet.
- Följ kanten av skenbenet till fotleden. Släpp försiktigt den mediala fotben, som ligger vid spetsen av skenbenet, från fotleden.
- När femur-tibial komplexet har isolerats, ta bort så mycket muskler och bindväv som möjligt med hjälp av Iris sax och/eller gasväv.
- Separera skenbenet från lårbenet genom att infoga ett blad av Iris saxen i hos gemensamma och försiktigt skära genom den mediala och laterala säkerheter ligament och främre och bakre korsligamenten. Ta inte bort kapseln i knäleden för att se till att skenbenet förblir intakt. Använd gasväv för att rengöra kvarvarande vävnad från skenbenet.
- Fix ben i 10% neutral buffrad formalin för 24 h vid rumstemperatur och sedan tvätta och förvara i enlighet med framtida behov.
- För att analysera ben parametrar med hjälp av mikrodatortomografi (μCT), lagra ben i Sorensen ' s fosfatbuffert, pH 7,423.
- För kvantifiering av bmat och histologiska analyser, avkalka ben i 14% EDTA, pH 7,4, för 10-14 dagar.
- Efter decalcification, Använd osmium grundämnetetroxide färgning och μCT analys för att kvantifiera BMAT24. Annars, process och paraffin-bädda ben för histologi23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik identifiering och isolering av olika mus fettdepåer kan uppnås med hjälp av protokollet som beskrivs ovan. De anatomiska brutto lägena för subkutan (A, E-F), brun (B), visceral (C, D, G-J) och popliteal (K) depåer visas i figur 2.
Figur 2: anatomiska brutto positioner av mus fettdepåer. Brutto anatomi (a) främre subkutan, (b) brun, (C) epididymalt (b, urinblåsa), (D) äggstockscancer (u, livmoder horn), (E) posterior subkutan (dorsolumbar (D), ljumsk (i), gluteala (g)), (F) inguinal, (G) mesenteric, (h) perirenalt (k, njure), (I) retroperitoneal (k, njure), (J) perikardiell (h, hjärta), och (k) popliteal fettdepåer i C57BL/6j vuxna möss. Pilar pekar på specifika depåer om flera depåer avbildas. Relevanta organ betecknas med lämpliga bokstäver. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Histologiska kännetecken av subkutant (A-D), brunt (E), visceral (F-K), popliteal (L), konstitutiv (M) och reglerat märg fett (N), intramuskulär (O) och infrapatellar (P) fettdepåer utvärderades av hematoxylin och eosin (H & E) färgning22 och visas i figur 3.
Figur 3: histologisk utvärdering av diskreta mus-fett-depåer. Histologi av (a) främre subkutan, (B) dorsolumbar, (C) inguinal, (D) gluteala, (E) Brown, (F) gonadal, (G) perirenal, (H) retroperitoneal, (I) omental, ( J) mesenteric, (K) perikardiell, (L) popliteal, (M) konstitutiv och (N) reglerad benmärg adipose, (O) intermuskulös, och (P) infrapatellar depåer i C57BL/6j vuxna möss. Vävnader isolerades enligt det givna protokollet, fast över natten i 10% neutral buffrad formalin, bearbetas och bäddas in i paraffin. 5 μm sektioner färgas med H & E. De flesta bilder togs på 100x förstoring; Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom betydelsen av de olika molekylära och funktionella egenskaperna hos diskreta fettceller-kluster blir alltmer erkänd, är det viktigt att utredarna inom området enhetligt identifierar och accis fettdepåer för ytterligare analyser. Hittills finns få protokoll för standardiserad lokalisering och isolering av det breda utbudet av mus fettdepåer. Tidigare publicerade metoder är främst inriktade på en eller två depåer och saknar de detaljer som behövs för enhetlig identifiering och excision av olika utredare18,19. Detta manuskript är en roman och viktigt bidrag till området fett biologi eftersom det ger en djupgående guide till anatomiska läge och exakt dissektion av vanliga studerade och mindre kända depåer hela musen. Brutto anatomisk lokalisering och histologiska analyser ges för att påvisa mångfalden av fettceller-nischer.
Lyckad isolering av diskreta fett-depåer med det här protokollet är beroende av flera kritiska steg. Underhåll av en ren dissektion miljö är avgörande; 70% etanol kan användas vid behov för att avlägsna kontaminerande hårstrån eller blod från dissektion bricka och verktyg. När isolera bakre subkutan WAT, det är absolut nödvändigt att den initiala snittet i huden inte penetrerar den nära associerade peritonealhålan så att de två lagren effektivt kan separeras för att exponera WAT. Likaså, när styckning genom peritonealväggen för att exponera bukhålan innehåll, snitt får inte perforera underliggande tarmarna för att förhindra kontaminering med matsmältningsorganen element. Interscapular BAT måste noggrant exciseras från den omgivande vävnaden för att förhindra WAT förorening, som kommer att skeva framtida analyser. Konsekvent identifiering av den bakre subkutana dorsolumbar, inguinal, och gluteala depåer beror på utnyttjandet av exakta anatomiska landmärken som beskrivs i protokollet. Skillnaden mellan dessa depåer är särskilt viktig; även om depåerna kan tyckas vara kontinuerlig, centralt belägna ljumsk adipocyter förvärva brun-liknande egenskaper mer lätt än sina omgivande motsvarigheter.
Fettvävnader isolerade med hjälp av detta protokoll kan analyseras med hjälp av en mängd olika tekniker. Förutom histologisk utvärdering (t. ex. H & E färgning, immunohistokemi) kan fettvävnader användas för ett brett spektrum av molekylära analyser, från reglering av transkription till posttranslationella proteinmodifieringar. Adipocyter och stromacellstumörer vaskulära celler inom enskilda depåer kan isoleras genom kollagenase matsmältning och differentiell centrifugering. Dessa fraktioner kan sedan användas för molekylära, metaboliska och cellkulturstudier. Depot djur kan också användas för ex vivo metaboliska och enzymatiska analyser.
Flera utmaningar och begränsningar uppstår under isolering och excision av mus fettvävnader. Först, vissa depåer som är fysiologiskt viktiga hos människor är inte vanligt förekommande i magra, vuxna möss. Till exempel, omental WAT, som är den stora visceral depå hos människor, kan endast ses i genetiskt eller diet-inducerad feta möss. Utbyggnaden av vissa depåer kan dock induceras av näringsmässiga utmaningar eller läkemedelsbehandlingar. Till exempel kan fettrik kost utfodring orsaka expansion av omental och perikardiell WAT. Intermuskulös Wat kan induceras av skelettmuskel skada25,26 eller fettrik diet27. Reglerad bmat expanderar som svar på olika utmaningar, inklusive fettrik kost, kalorirestriktion och tiazolidinedione behandling11,28. För det andra, på grund av den lilla storleken på möss, att få tillräckligt med prov för molekylära eller metaboliska analyser kan vara svårt. Till exempel, isolering av tillräckligt med ren benmärg adipocyter för efterföljande analyser är utmanande, även efter poolning ben från flera möss. För det tredje kan det vara svårt att exakt definiera gränser för vissa depåer. Till exempel, posterior subkutan WAT verkar vara en kontinuerlig depå men är faktiskt består av diskreta dorsolumbar, inguinal, och gluteala depåer. Dessutom, den perirenalt kan verkar vara smält till både gonadala och retroperitoneal depåer i mycket feta djur. Avsaknaden av skilda gränser mellan intilliggande depåer kan göra ren isolering av dessa vävnader utmanande. Men denna dissektion protokoll ger utredare med en detaljerad Atlas och steg-för-steg vägledning för korrekt och reproducerbar dissektion av ett brett spektrum av mus fettdepåer. Fält-wide standardisering av identifiering och isolering av diskreta mus fettdepåer som beskrivs ovan kommer utan tvekan att bidra till att ytterligare belysa skillnader i utveckling, genuttryck, och lokala och systemiska funktioner av tidigare under studerade fettceller nischer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
O.A.M. stöds av NIH Grants DK062876 och DK092759; D.P.B. stöds av University of Michigan medicinsk vetenskapsman Training program (T32GM007863), University of Michigan utbildningsprogram i organogenes (T32HD007605), University of Michigan Rackham merit Fellowship, och Tylenol Future Care Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 inch x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
- Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocyte lineages: tracing back the origins of fat. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (3), 340-351 (2014).
- Bagchi, D. P., Forss, I., Mandrup, S., MacDougald, O. A. SnapShot: Niche Determines Adipocyte Character I. Cell Metabolism. 27 (1), 264-264 (2018).
- Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Frontini, A., Cinti, S. Distribution and development of brown adipocytes in the murine and human adipose organ. Cell Metabolism. 11 (4), 253-256 (2010).
- Zhang, F., et al. An Adipose Tissue Atlas: An Image-Guided Identification of Human-like BAT and Beige Depots in Rodents. Cell Metabolism. 27, 252-262 (2018).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocytes arise from multiple lineages that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications. 5, 4099 (2014).
- Li, Z., Hardij, J., Bagchi, D. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Development, regulation, metabolism and function of bone marrow adipose tissues. Bone. 110, 134-140 (2018).
- Scheller, E. L., Cawthorn, W. P., Burr, A. A., Horowitz, M. C., MacDougald, O. A. Marrow Adipose Tissue: Trimming the Fat. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (6), 392-403 (2016).
- Alexander, C. M., et al. Dermal white adipose tissue: a new component of the thermogenic response. The Journal of Lipid Research. 56 (11), 2061-2069 (2015).
- Kruglikov, I. L., Scherer, P. E. Dermal Adipocytes: From Irrelevance to Metabolic Targets? Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (1), 1-10 (2016).
- Iacobellis, G. Local and systemic effects of the multifaceted epicardial adipose tissue depot. Nature Reviews Endocrinology. 11 (6), 363-371 (2015).
- Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular Fat: A Review of the Consequences and Causes. International Journal of Endocrinology. 2014, 1-11 (2014).
- Pond, C. M. Adipose tissue and the immune system. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 17-30 (2005).
- Kloppenburg, A. I. -F. M. An emerging player in knee osteoarthritis: the infrapatellar fat pad. Arthritis Research & Therapy. 15 (225), 1-9 (2013).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (94), e52174 (2014).
- Casteilla, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods in Molecular Biology. 155, 1-22 (2008).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Cinti, S.
- Parlee, S. D., Lentz, S. I., Mori, H., MacDougald, O. A. Quantifying size and number of adipocytes in adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 93-122 (2014).
- Scheller, E. L., et al. Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues. Nature Communications. 6, 7808 (2015).
- Scheller, E. L., et al. Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo. Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), e71084 (2013).
- Pagano, A. F., et al. Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints. PLoS One. 10 (12), e0144230 (2015).
- Khan, I. M., et al. Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance. International Journal of Obesity. 39 (11), 1607-1618 (2015).
- Sulston, R. J., et al. Increased Circulating Adiponectin in Response to Thiazolidinediones: Investigating the Role of Bone Marrow Adipose Tissue. Frontiers in Endocrinology. 7, 128 (2016).
