Summary
इस प्रोटोकॉल मेजबान के रूप में लार्वा ज़ेब्राफ़िश का उपयोग कर एक वायरस आधारित दोहरी फ्लोरोसेंट लेबल ट्यूमर exograft मॉडल में अनुकूलन प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। इस विषम xenograft मॉडल vivo में अग्नाशय के कैंसर microenvironment के ऊतक संरचना mimics और व्यक्तिगत zPDX में दवा प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक और अधिक सटीक उपकरण के रूप में कार्य करता है (जेब्राफ़िश रोगी व्युत्पन्न xenograft) मॉडल.
Abstract
रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर xenograft (PDX) और सेल व्युत्पन्न ट्यूमर xenograft (CDX) पूर्व नैदानिक आकलन, दवा मार्गदर्शन और बुनियादी कैंसर शोध के लिए महत्वपूर्ण तकनीक हैं. पारंपरिक मेजबान चूहों में PDX मॉडल की पीढ़ियों समय लेने वाली हैं और केवल नमूनों का एक छोटा सा अनुपात के लिए काम कर रहे. हाल ही में, ज़ेब्राफ़िश PDX (zPDX) एक अद्वितीय मेजबान प्रणाली के रूप में उभरा है, छोटे पैमाने पर और उच्च दक्षता की विशेषताओं के साथ. यहाँ, हम zPDX मॉडल में तुलनात्मक रसायन चिकित्सा आकलन के लिए एक दोहरी फ्लोरोसेंट लेबल ट्यूमर xenograft मॉडल पैदा करने के लिए एक अनुकूलित पद्धति का वर्णन. ट्यूमर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स विभिन्न संस्कृति की स्थिति में ताजा फसल या जमे हुए अग्नाशय के कैंसर के ऊतकों से समृद्ध थे। दोनों कोशिका समूहों को lentivirus द्वारा हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के साथ-साथ एक एंटी-एपोप्टोसिस जीन BCL2L1द्वारा लेबल किया गया था। ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को पहले से मिश्रित किया गया था और 2 डीपीएफ लार्वा जेब्राफ़िश में सह-इंजेक्शन किया गया था जिसे तब संशोधित ई 3 माध्यम में 32 डिग्री सेल्सियस में पैदा किया गया था। xenograft मॉडल रसायन चिकित्सा दवाओं और / या BCL2L1 अवरोध करनेवाला द्वारा इलाज किया गया, और दोनों ट्यूमर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स की viabilities एक साथ जांच की गई. सारांश में, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को जल्दी से एक विषम ट्यूमर microenvironment के साथ zPDX मॉडल की एक बड़ी राशि उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है और एक लंबे समय तक अवलोकन खिड़की और दवा उम्मीदवारों की दक्षता का आकलन करने में एक और अधिक सटीक परिमाण प्रदान करता है.
Introduction
प्रेसिजन ऑन्कोलॉजी व्यक्तिगत रोगी1के लिए सबसे अधिक लाभकारी चिकित्सीय रणनीतियों को खोजने के लिए करना है। वर्तमान में, कई पूर्व नैदानिक मॉडल जैसे इन विट्रो प्राथमिक संस्कृति, इन विट्रो ऑर्गनॉइड संस्कृति2, और रोगी व्युत्पन्न जेनोग्रैफ्ट्स (पीडीएक्स) चूहों में पहले या बाद में ऑर्गनॉइड संस्कृति निदान के लिए और स्क्रीन/ चिकित्सीय विकल्प3| प्रतिरक्षा समझौता चूहों में मानव प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न PDX मॉडल, नैदानिक ऑन्कोलॉजी में व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग के लिए सबसे होनहार उपकरणों में से एक है3,4. इन विट्रो में सुसंस्कृत सेल लाइन के विपरीत, PDX मॉडल आमतौर पर अखंडता और विवो ट्यूमर वातावरण की विषमता की रक्षा, बेहतर विविधता और विभिन्न ट्यूमर रोगियों की विलक्षण विशेषताओं नकल, और इसलिए, भविष्यवाणी कर सकते हैं रोगियों के संभावित चिकित्सा परिणाम4| हालांकि, चूहों में PDX मॉडल की पीढ़ी उच्च गुणवत्ता रोगी के नमूने और समय के महीनों की आवश्यकता के लिए पर्याप्त कोशिकाओं और बहु समूह प्रयोगों के लिए मॉडल इकट्ठा, और विदेशी के सेलुलर / रोगीकी बायोप्सी . चूहों PDX मॉडल की स्थापना के लिए सफलता की दर भी कम है, यह मुश्किल मोटे तौर पर नैदानिक अभ्यास में लागू किया जा करने के लिए कर रही है. अग्नाशय के कैंसर की तरह तेजी से प्रगति कैंसर ले जाने के रोगियों के लिए, वे समय में PDX प्रयोगों से बहुमूल्य जानकारी प्राप्त करने में सक्षम नहीं हो सकता है.
पिछले कुछ वर्षों में, ज़ेब्राफ़िश न केवल CDX (सेल व्युत्पन्न ट्यूमर xenograft) मॉडल के लिए संभावित मेजबान होने की सूचना दी गई है, लेकिन यह भी PDX मॉडल5,6,7,8,9, 10.एक कशेरुकी मॉडल जानवर के रूप में, जेब्राफ़िश आनुवंशिकी और शरीर क्रिया विज्ञान दोनों में स्तनधारियों के साथ पर्याप्त समानताएं बंदरगाह, दो महत्वपूर्ण लाभ के साथ: पारदर्शिता और आकार11में छोटे . ज़ेब्राफ़िश भी अत्यधिक fecundity है, और वयस्कों की एक जोड़ी12से कुछ ही दिनों के भीतर inbred लार्वा के सैकड़ों प्राप्त किया जा सकता है. अनेक अध्ययनों में जेब्राफिश को कैंसर रोगों केट्रांसजेनिक और एक्सोग्रेफ्ट दोनों मॉडल तैयार करने के लिए नियुक्त किया गयाहै. चूहों की तुलना में xenografts, ज़ेब्राफ़िश xenografts एकल सेल संकल्प पर ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं. मानव ऊतकों की एक निश्चित राशि ज़ेब्राफ़िश PDX मॉडल (zPDXs) के सैकड़ों पैदा करने में सक्षम है, जबकि केवल चूहों PDX मॉडल15,16के एक जोड़े को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. इसके अलावा, 2-5 dpf पर ज़ेब्राफ़िश लार्वा पहले से ही पूर्ण संचार प्रणाली और यकृत और गुर्दे जैसे चयापचय अंगों का विकास, लेकिन प्रतिरक्षा प्रणाली17नहीं, जबकि शेष जर्दी थैली एक प्राकृतिक 3 डी माध्यम है, दवा स्क्रीनिंग के लिए आदर्श, दवा प्रतिरोध परीक्षण और ट्यूमर प्रवास टिप्पणियों6,18,19,20,21.
नैदानिक उपयोग के लिए एक स्क्रीनिंग / परीक्षण मंच के रूप में zPDX का उपयोग करने के लिए एक अंतिम प्रयास के साथ, यहाँ, हम अग्नाशय के कैंसर के zPDX मॉडल के लिए एक अनुकूलित प्रस्ताव का वर्णन है, जो एक कम समय के भीतर vivo उम्मीदवार दवा मूल्यांकन में कम लागत पर कम कोशिकाओं का उपयोग करने की अनुमति देता है. zPDX6,9,10के बारे में पिछले संदर्भ की तुलना में, हम प्रणाली और अधिक व्यावहारिक और नैदानिक व्यक्तिगत निदान के लिए विश्वसनीय बनाने के लिए कई अनुकूलन शुरू की: 1) पूर्व विभिन्न सेल की तरह प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों में समूहों और आगे के प्रयोगों से पहले एक सप्ताह के लिए प्राथमिक कोशिकाओं को स्थिर; 2) मानव कोशिकाओं लेबलिंग और lentivirus आधारित आनुवंशिक संशोधन के माध्यम से xenograft में सेल व्यवहार्यता बढ़ाने; 3) दोनों nutriment की खुराक (ग्लूकोज और glutamine) और तापमान में ज़ेब्राफ़िश संस्कृति हालत का अनुकूलन; 4) एक तुलनात्मक तरीके से विभिन्न सेल प्रकार की दवा प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित. हम भी कई अनुपूरक सामग्री जोड़कर इंजेक्शन समाधान करने के लिए परिवर्तन किए हैं। कुल मिलाकर, उन सुधारों को जल्दी से एक और अधिक रोगी की तरह ज़ेब्राफ़िश मेजबान है कि उम्मीदवार दवाओं की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है में xenograft उत्पन्न करने की संभावना प्रदान करते हैं.
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी और Fudan विश्वविद्यालय में पशु आचार समिति के दिशा निर्देशों का पालन किया और सभी अग्नाशय के कैंसर के नमूने Fudan विश्वविद्यालय शंघाई कैंसर केंद्र से प्राप्त किए गए थे. एथिकल अनुमोदन FUSCC आचार समिति से प्राप्त किया गया था, और लिखित सूचित सहमति प्रत्येक रोगी से प्राप्त किया गया था.
1. माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपकरण की तैयारी
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इंजेक्शन प्लेट की तैयारी.
- E3 घोल में घुले हुए 1% अगारोस का 50 एमएल घोल तैयार करें (0.6 ग्राम/L मछलीघर नमक डबल आसुत जल में + 0ण्01 मिलीग्राम/एल मेथिलीन नीला)। घोल को तब तक उबालें जब तक कि अगारोस घुल न जाए।
- एक 10 सेमी पेट्री डिश में agarose समाधान के 50 एमएल डालो और फिर सतह पर ज़ेब्राफ़िश भ्रूण निर्धारण मोल्ड जगह है। जब agarose समाधान ठोस हो जाता है मोल्ड निकालें.
- इंजेक्शन प्लेट के लिए E3 समाधान के 20 एमएल जोड़ें और लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के।
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इंजेक्शन सुइयों की तैयारी.
- सुई खींचने वाले पर दो सुइयों में 0ण्9 उउ के आंतरिक आयाम के साथ 10 सेमी कांच की केशिका खींचें।
- माइक्रोस्कोप के नीचे एक खोलने बनाने के लिए सुई के अंत में कटौती करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
2. प्रत्यारोपण के लिए भ्रूण की तैयारी
- 7-9 बजे एक संभोग टैंक में वयस्क जेब्राफ़िश के 1 से 2 जोड़े रखें और अगली सुबह लगभग 8 बजे निषेचित अंडे एकत्र करें।
- संभोग टैंक से निषेचित अंडे को एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 40 एमएल ताजा E3 समाधान और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होता है।
- E3 समाधान में ऊष्मायन के 8 ज के बाद, pigmentation को बाधित करने के लिए E3 समाधान में 0.03% 1-फेनिल-2-thiourea (पीटीयू) जोड़ें। ई3 घोल में भ्रूणों को 0.03% पीटीयू के साथ 28.5 डिग्री सेल्सियस पर 48 हपीएफ तक इन्क्यूबेट करें। इस कदम को छोड़ा जा सकता है अगर में नस्ल Casper उत्परिवर्ती ज़ेब्राफ़िश का उपयोग कर.
3. अलगाव और ताजा सर्जिकल अग्नाशय के कैंसर चश्मा या जमे हुए ऊतक से प्राथमिक मानव कोशिकाओं की संस्कृति
- एक पेट की सर्जरी के दौरान 1 सेमी3 के आसपास आकार के मानव अग्नाशय के कैंसर के ऊतकों के नमूने प्राप्त करें, और तुरंत विकास मीडिया में ऊतक हस्तांतरण (DMEM के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 10 $M Y-27632, 100 g/ डाइहाइड्रोक्लोराइड, 10 एमएम निकोटिनमाइड और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन)।
- अग्नाशय के कैंसर के नमूने को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और आसपास के नेक्रोटिक ऊतक, वसा ऊतक और संयोजी ऊतक को हटा दें।
- फॉस्फेट बफर (पीबीएस) के साथ 5-6 बार के लिए कैंसर के ऊतकों कुल्ला और scalpels का उपयोग कर 1 मिमी3 टुकड़ों में ऊतक में कटौती।
- कटे हुए ऊतकों को 50 एमएल ट्यूब में एचबीएसएस के 5 एमएल में स्थानांतरित करें और क्रमशः 200 इकाइयों/एमएल, 100 मिलीग्राम/एल और 20 मिलीग्राम/एल के अंतिम सांद्रता में कोलैजानाज प्रकार IV, हायलुरोनिडाज और डीनेस I जोड़ें। मिश्रण को अच्छी तरह मिला ने कर लिया।
- मिश्रण को 15-20 मिनट के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। मिश्रण को हर 5 मिनट में कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- पाचन पूरा होने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्यूब और अपकेंद्रित्र में DMEM के 7 एमएल जोड़ें।
- सुपरनेंट को निष्क्रिय करें और डीएमईएम में ट्यूमर मिश्रण को फिर से निलंबित करें।
- पूर्ण विकास मीडिया के 3 एमएल में एक 6 सेमी पेट्री डिश में मिश्रण प्लेट (DMEM के साथ 10% FBS, 20 डिग्री जी / एमएल इंसुलिन, 100 एनजी/एमएल BGF, 10 ng/mL EGF, 10M Y-27632, 100 g/mL primocin, 10g/ , 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन). कोशिकाओं को दो समूहों में विभाजित करें।
- समूह मैं में, 48 एच के बाद माध्यम में अग्नाशय के कैंसर फाइब्रोब्लास्ट्स के 100x अवरोध करनेवाला जोड़ने के लिए अति विकसित फाइब्रोब्लास्ट्स को दूर करने के लिए, प्रमुख सेल प्रकार के रूप में कैंसर की कोशिकाओं को छोड़ने;. समूह द्वितीय में, फाइब्रोब्लास्ट्स एक सप्ताह के भीतर कैंसर कोशिकाओं को आगे बढ़ाना होगा।
- संस्कृति दोनों सेल समूहों के लिए 1-2 सप्ताह सेल घनत्व के आधार पर / दोनों समूह मैं और द्वितीय में अपेक्षित सेल प्रकार एक typic सफल प्रयोग में अनुपात में 98% से अधिक पर कब्जा कर सकते हैं.
4. Lentivirus के साथ कोशिकाओं लेबलिंग एंटी-एपोप्टोसिस जीन BCL2L1 (BCL-XL) और विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन अलग से व्यक्त
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Lentivirus उत्पादन
- प्लेट 3 x 106 HEK 293T कोशिकाओं पूर्ण DMEM माध्यम के साथ (DMEM 10% FBS के साथ आपूर्ति की) 10 सेमी व्यंजन और संस्कृति में रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस में एक 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर. transfection से पहले सीरम मुक्त मीडिया के 6 एमएल के साथ माध्यम बदलें.
- तैयार समाधान ए: 8 डिग्री BCL2L1- युक्त lentiviral वेक्टर (pCDH-EF1]-mKate2-E2A-BCL2L1-WPRE या pCDH-EF$1-eGFP-E2A-BCL2L1-WPRE), pVSVG के 2.4 डिग्री, 4 ग्राम पीएमडीएल (गग/पोल), 1.6 ग्राम pREV और सीरम-मुक्त DMEM की कुल मात्रा में 500 $L. धीरे से पाइप मिश्रण कई बार, और यह कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए जगह है.
- समाधान बी तैयार करें: 460 डिग्री सेल्सियस सेकम-मुक्त डीएमईएम में पीईई (पॉलीथीनमीन) का 40 डिग्री सेल्सियस। इसे 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
- धीरे-धीरे विलयन ख को विलयन क में जोड़ें और ट्यूब को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए छोड़ दें।
- चरण 4.1.1 में तैयार एचईके 293T सेल कल्चर डिश में अंतिम मिश्रण जोड़ें और 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 12 ज के बाद, पूर्ण DMEM माध्यम का एक अतिरिक्त 5 एमएल जोड़ें। 48 ज के बाद, मसूरी वायरस वाले माध्यम को फसल करें।
- सुपरनेटेंट को 0.45 डिग्री बाँझ फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें, एक एकाग्रता कॉलम में सुपरनेट को जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 25-30 मिनट के लिए 6,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। प्रति ट्यूब 100 डिग्री सेल्सियस के मसूरी वायरस ऐलिकोट बनाए जाते हैं और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं।
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प्राथमिक कोशिकाओं का संक्रमण
- बीज कोशिकाओं (समूह मैं और द्वितीय) 30-40% घनत्व और संस्कृति के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली में संक्रमित होने के लिए कोशिकाओं को एक 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर.
- सीरम-मुक्त माध्यम के 500 डिग्री एल से माध्यम को प्रतिस्थापित करें जिसमें 4 ज के लिए पॉलीब्रेन के 8 ग्राम/एमएल शामिल हैं। उसके बाद, एक अतिरिक्त 100 $L lentivirus के माध्यम में जोड़ें (eGFP-E2A-BCL2L1 समूह I के लिए या समूह II के लिए mKate2-E2A-BCL2L1). 12 ज के बाद, माध्यम को 1 एमएल पूर्ण माध्यम से बदलें।
- 48 एच के बाद फ्लोरोसेंट मार्करों की जाँच करें।
- संक्रमित कोशिकाओं को फसल और उन्हें 1:1 अनुपात पर 106/
- 5 मिनट के लिए 110 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और 50 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन समाधान (1640 माध्यम के साथ 10% एफबीएस, 0.05% hyaluronic एसिड सोडियम नमक, 0.05% मिथाइलसेल्यूलोस) में सेल मिश्रण को फिर से निलंबित करें।
5. ज़ेब्राफ़िश में मिश्रित सेल निलंबन इंजेक्शन
- जेब्राफ़िश लार्वा एनेस्थेटाइज करने के लिए ई 3 पानी में 10x ट्राइकेन समाधान जोड़ें और लार्वा (चरण 2.3 से) को संशोधित E3 (ई3 के साथ 1 ग्राम/एल ग्लूकोज और 5 mmol/L-glutamine) द्वारा भरी इंजेक्शन प्लेट में स्थानांतरित करें।
- माइक्रो केशिकाओं सुई में मिश्रित सेल निलंबन के 25 डिग्री सेल्सियस भरें और सूक्ष्म इंजेक्शन manipulator में सुई डालने.
- इंजेक्शन दबाव और समय सेट करें। 48 hpf ज़ेब्राफ़िश की जर्दी थैली में 50-80 कोशिकाओं ($ 8 एनएल) इंजेक्शन।
6. Xenografted ज़ेब्राफ़िश की संस्कृति (zPDX मॉडल)
- पोस्ट-xenografted जेब्राफ़िश लार्वा मिश्रण समाधान के 40 एमएल में स्थानांतरण (ई 3 समाधान 1 g/L ग्लूकोज और 5 mmol/L-ग्लूटामाइन के साथ) 32 डिग्री सेल्सियस पर।
7. Xenografted ज़ेब्राफ़िश पर दवा प्रशासन और ट्यूमर कोशिकाओं के आकलन /
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gemcitabine/navitoclax के इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण.
- एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 48 hpf पर 10 wildtype ज़ेब्राफ़िश भ्रूण रखें।
- दो दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक अच्छी तरह से और इनक्यूबेट में gemcitabine या navitoclax के विभिन्न सांद्रता जोड़ें।
- 2 दिनों के बाद, gemcitabine और navitoclax की अधिकतम सहिष्णुता खुराक (एमटीडी) की गणना जिस पर ज़ेब्राफ़िश लार्वा महत्वपूर्ण कुरूपता और असामान्य व्यवहार नहीं दिखाया जाता है, और काम सांद्रता एमटीडी के नीचे सेट कर रहे हैं।
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gemcitabine के साथ zPDX मॉडल का उपचार /
- 12 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में 10 xenografted लार्वा रखें।
- लार्वा को चार समूहों में विभाजित करें, E3 में 0.1% DMSO युक्त नियंत्रण समूह का इलाज करें, और अन्य समूहों के साथ 5 डिग्री ग्राम/एमएल gemcitabine और/या 50 डिग्री सेल्सियस navitoclax, और दो दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट का इलाज करें।
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zPDX मॉडल में सेल viabilities और सेलुलर संरचना का आकलन.
- उपचार के बाद xenografted लार्वा एनेस्थेटाइज और उन्हें 3% मेथिलसेल्यूलोस में जगह।
- एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग पार्श्व दृश्य से लार्वा छवि.
- ImageJ और GraphPad सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लाल और हरे रंग की फ्लोरोसेंट संकेतों की तीव्रता को परिमाणित करें।
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Representative Results
प्रक्रिया की एक योजनाबद्ध रूपरेखा चित्र 1में प्रस्तुत की जाती है। संक्षेप में, प्राथमिक कैंसर ऊतक कोशिकाओं के साथ या अग्नाशय के कैंसर फाइब्रोब्लास्ट inhibitors के अलावा के बिना पाचन के बाद पूरा माध्यम में बीज थे. कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स दो अलग आबादी है कि फाइब्रोब्लास्ट्स inhibitors के बिना प्रभुत्व के रूप में समृद्ध थे, और कैंसर कोशिका विकास inhibitors के अलावा के बाद प्रबल (चित्र 2). दो मसूरी पैकेजिंग वेक्टरों का निर्माण किया गया, जिसमें हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन और BCL2L1 को व्यक्त किया गया, जैसा कि चित्र 3में दर्शाया गया है। वायरस आधारित फ्लोरोसेंट लेबलिंग भी कोशिकाओं के अस्तित्व की स्थिति का प्रतिनिधित्व किया. मिश्रित कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट ्स 48 एचपीएफ पर जेब्राफ़िश जर्दी थैली में इंजेक्ट किए गए थे और दो दिनों के लिए gemcitabine और / विभिन्न जनसंख्या में कोशिका क्षमताएँ तथा विदेशी ग्राफ्कोफ्ट की कोशिकीय संरचना को औषध उपचार के प्रक्रियाओं के रूप में परिवर्तित कर दिया गया था (चित्र 4) ।
चित्रा 1: अग्नाशय के कैंसर से व्युत्पन्न जेब्राफ़िश जेनोग्रैफ्ट मॉडल की पीढ़ी और दवा मूल्यांकन का Schematic आरेख. अग्नाशय के कैंसर के साथ रोगियों से शल्य चिकित्सा हटा ऊतकों को अलग और पचा रहे हैं, दो अलग अलग स्थितियों में संस्कृति के बाद, जिनमें से एक एक फाइब्रोब्लास्ट अवरोध करनेवाला द्वारा जोड़ा जाता है, और अन्य समूह नहीं है. 1-2 सप्ताह के बाद, प्राथमिक कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से एक विरोधी apoptotic प्रोटीन BCL2L1 और विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए संशोधित किया गया. उसके बाद, दो आबादी को मिलाया गया और रसायन चिकित्सा दवाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए 48 hpf ज़ेब्राफ़िश लार्वा में सह-इंजेक्शन किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: संस्कृति और अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स का संवर्धन. कैंसर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स की छवियाँ 10 दिन संस्कृति के बाद तीन अलग अग्नाशय के कैंसर रोगियों से समृद्ध. स्केल बार, 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र ााालक 3: उधारीवायरल वेक्टर की संरचना जिसमें BCL2L1 तथा विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन ों को व्यक्त किया गया है। दो lentiviral वैक्टर के Schematic आरेख लगातार mKate2-E2A-BCL2L1 या eGFP-E2A-BCL2L1, क्रमशः व्यक्त. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: gemcitabine द्वारा xenograft पर प्रभाव. (क) 3 ज पोस्ट ट्रांसप्लांटेशन (एचपीटी) में जेब्राफिश लार्वा की जर्दी थैली में जेरोफिश लार्वा की जर्दी के जेनोग्रैफ्ट का पार्श्व दृश्य। (बी) 60 एचपीटी पर जेब्राफिश लार्वा के प्रतिनिधि चित्र, जिसका उपचार डीएमएसओ या जेमिटिबिन द्वारा किया जाता है। (ग) प्रतिनिधि 3 डी 60 हप पर xenografts के प्रतिपादन. (घ) जेमसिटिबिन और/अथवा BCL2L1 अवरोधक उपचार से पहले और बाद में xenograft की फ्लोरोसेंट तीव्रता के आंकड़े। प्रत्येक परख के लिए प्रति समूह N $ 10. स्केल बार ] 100 डिग्री मी; एन एस, महत्वपूर्ण नहीं; *पी एंड एलटी; 0.05; पी एंड टी एल; 0.0001; एक तरह से ANOVA द्वारा निर्धारित सांख्यिकीय मतभेदों के साथ , एसडी मतलब है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
दोनों PDX और CDX मॉडल ट्यूमर जीव विज्ञान22के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्लेटफार्मों रहे हैं, और एक सफल अंतर प्रजातियों प्रत्यारोपण के महत्वपूर्ण कदम के लिए exograft के अस्तित्व में सुधार है. हाल ही में, कुछ अध्ययनों से पता चला है कि BCL2L1 (BCL-XL) या BCL2 के क्षणिक अभिव्यक्ति काफी सेल पहचान और भाग्य को प्रभावित किए बिना चूहों मेजबान में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की व्यवहार्यता में सुधार हो सकता है23 , 24 , 25.हमारी पांडुलिपि में, हमने lentivirus के साथ कोशिकाओं को लगातार एंटी-एपोप्टोसिस जीन BCL2L1 (BCL-XL)के साथ-साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त किया। BCL2L1 की शुरूआत बहुत अध्ययन के लिए अवलोकन खिड़की को लम्बा करने के लिए ज़ेब्राफ़िश में xenograft मानव कोशिकाओं के अस्तित्व के समय बढ़ाया है, जबकि फ्लोरोसेंट संकेतों न केवल कोशिकाओं लेबल, लेकिन यह भी रहने की स्थिति की रिपोर्ट कोशिकाओं, जैसा कि हमने पाया कि फ्लोरोसेंट कोशिका मृत्यु के साथ जल्दी से फीका. इस बीच, हम वर्तमान में मानव xenografts के लिए एक बेहतर मेजबान के रूप में ज़ेब्राफ़िश को संशोधित कर रहे हैं. एक तरफ, rag2 और prkdc CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी के माध्यम से बाहर खटखटाया जा रहा है एक संयुक्त प्रतिरक्षा कमी ज़ेब्राफ़िश तैयार करने के लिए, जो संयुक्त प्रतिरक्षा कमी चूहों के समान था, पुराने ज़ेब्राफ़िश लार्वा बनाने के लिए भी संगत मानव कोशिकाओं और ऊतकों के साथ26| दूसरी ओर, ज़ेब्राफ़िश भी बेहतर Tol2 ट्रांसपोसन मध्यस्थता ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकी का उपयोग करके प्रत्यारोपित मानव कोशिकाओं के अस्तित्व और प्रसार का समर्थन करने के लिए IGF1 और आईएनएस जैसे मानव प्रोटीन व्यक्त करने के लिए संशोधित किया गया था। इसके अलावा, zPDX भी एक मानव की तरह कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली का अभाव है, और मानव stromal कोशिकाओं और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच बातचीत, और भविष्य में, हम सह मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं इंजेक्शन की कोशिश कर सकते हैं एक अल्पकालिक humanized प्रतिरक्षा वातावरण के पुनर्निर्माण के लिए जेब्राफ़िश में.
चूहों PDX मॉडल में, xenograft शर्तों पारंपरिक रूप से दिखाई आकार के नोड्स पर प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा नजर रखी गई, जो विकसित करने के लिए एक लंबे समय की आवश्यकता होती है. तुलना के रूप में पारदर्शी zPDX मॉडल में, exograft वास्तविक समय में माइक्रोस्कोपी के तहत जांच की जा सकती है. हालांकि, यह एक उचित नियंत्रण के बिना एक एकल रंग की आबादी में सेल संख्या alternations का आकलन करने के लिए मुश्किल था, और विभिन्न फ्लोरोसेंट के दो सेल आबादी शुरू करने के विचार काफी सेल व्यवहार्यता की मात्रा में सुधार. मिश्रण और निश्चित अनुपात पर विभिन्न कोशिकाओं इंजेक्शन द्वारा, हम न केवल ट्यूमर microenvironment नकल, लेकिन यह भी सही दो सेल समूहों की तुलना करके दवा की प्रतिक्रिया मात्रा निर्धारित करने में सक्षम हैं. हालांकि प्राथमिक ऊतकों में फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए कैंसर कोशिकाओं का मूल अनुपात बहुत अलग है, यहां हमने 1:1 अनुपात के साथ शुरू किया, और एक अलग अनुपात के एक ही सेल संरचना पर दवा उपचार के प्रभाव की भविष्य में जांच की जाएगी। इसके अलावा, मानव कोशिकाओं के व्यवहार पर 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन ों के बजाय 32 डिग्री सेल्सियस के प्रभाव के लिए भी विस्तृत तुलनात्मक अध्ययन की आवश्यकता होती है। अंत में, तुलनात्मक दवा आकलन के लिए अग्नाशय के कैंसर के लिए रोगी व्युत्पन्न विषम xenograft मॉडल की रणनीति भी ठोस कैंसर के अन्य प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण मेजबान के रूप में जेब्राफ़िश लार्वा का उपयोग करके पीडीएक्स के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जो एकल-सेल संकल्प में विश्लेषण के लिए क्रिस्टल-स्पष्ट और संभव है।
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Disclosures
ब्याज के किसी भी संभावित संघर्ष का खुलासा नहीं किया गया।
Acknowledgments
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन 81402582, शंघाई 12D के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था 12D $2295100, 14YF1400600 और 18$R1404500
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| Penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| Phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| Collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| Dnase I | Sigma | D5025 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| Gemcitabine | Gemzan | ||
| Methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
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