Summary
Ce protocole décrit des procédures d'optimisation dans un modèle de xénogreffe de tumeur à base de virus à double fluorescence utilisant le poisson zèbre larvaire comme hôtes. Ce modèle hétérogène de xénogreffe imite la composition tissulaire du microenvironnement pancréatique de cancer in vivo et sert d'outil plus précis pour évaluer des réponses de drogue dans les modèles personnalisés de zPDX (xénogreffe patient-dérivé de zèbre).
Abstract
Le xénogreffe de tumeur patient-dérivé (PDX) et le xénogreffe de tumeur cell-dérivé (CDX) sont des techniques importantes pour l'évaluation préclinique, le guidage de médicament et les recherches fondamentales de cancer. Des générations de modèles PDX chez les souris hôtes traditionnelles prennent beaucoup de temps et ne fonctionnent que pour une petite proportion d'échantillons. Récemment, le poisson zèbre PDX (zPDX) est apparu comme un système d'accueil unique, avec les caractéristiques de petite échelle et de haute efficacité. Ici, nous décrivons une méthodologie optimisée pour produire un modèle de xénogreffe de tumeur à double fluorescence-étiqueté pour l'évaluation comparative de chimiothérapie dans les modèles de zPDX. Les cellules tumorales et les fibroblastes ont été enrichis à partir de tissus du cancer du pancréas fraîchement récoltés ou congelés à différentes conditions de culture. Les deux groupes cellulaires ont été étiquetés par lentivirus exprimant des protéines fluorescentes vertes ou rouges, ainsi qu'un gène anti-apoptose BCL2L1. Les cellules transfectées ont été prémélangées et co-injectées dans le poisson zèbre larvaire à 2 dpfs qui a ensuite été élevé dans un milieu E3 modifié à 32 oC. Les modèles de xénogreffe ont été traités par des drogues de chimiothérapie et/ou l'inhibiteur de BCL2L1, et les viabilities des cellules de tumeur et des fibroblastes ont été étudiées simultanément. En résumé, ce protocole permet aux chercheurs de générer rapidement une grande quantité de modèles zPDX avec un microenvironnement hétérogène de tumeur et fournit une fenêtre d'observation plus longue et une quantitation plus précise dans l'évaluation de l'efficacité des candidats-médicaments.
Introduction
L'oncologie de précision vise à trouver les stratégies thérapeutiques les plus bénéfiques pour chaque patient1. Actuellement, de nombreux modèles précliniques tels que la culture primaire in vitro, la culture organoïde in vitro2, et les xénogreffes dérivées du patient (PDX) chez la souris avant ou après la culture organoïde sont proposés pour le diagnostic et pour dépister/évaluer le potentiel choix thérapeutiques3. Le modèle PDX généré par l'injection de cellules cancéreuses primaires humaines chez des souris immunodéprimées est l'un des outils les plus prometteurs pour le dépistage personnalisé des médicaments en oncologie clinique3,4. Contrairement à la lignée cellulaire cultivée in vitro, les modèles PDX préservent habituellement l'intégrité et l'hétérogénéité de l'environnement tumoral in vivo, imitant mieux la diversité et les caractéristiques idiosyncrasiques de différents patients tumoraux, et donc, peuvent prédire le résultats médicaux potentiels des patients4. Cependant, la génération de modèles PDX chez la souris nécessite des échantillons de patients de haute qualité et des mois de temps pour recueillir suffisamment de cellules et de modèles pour des expériences multigroupes, et les compositions cellulaires/génétiques du xénogreffe peuvent dériver de celles de l'original biopsiedu patient. Le taux de réussite pour l'établissement du modèle PDX souris est également faible, ce qui rend difficile d'être largement mis en œuvre dans la pratique clinique. Pour les patients porteurs de cancers rapidement progressés comme le cancer du pancréas, ils peuvent ne pas être en mesure d'obtenir des informations précieuses à partir des expériences PDX à temps.
Au cours des dernières années, le poisson zèbre a été signalé pour être des hôtes potentiels non seulement CDX (tumeur dérivée de cellules xénogreffe) modèles, mais aussi pDX modèles5,6,7,8,9, 10. En tant qu'animal modèle vertébré, le poisson zèbre présente des similitudes suffisantes avec les mammifères en génétique et en physiologie, avec deux avantages importants : la transparence et la petite taille11. Le poisson zèbre est également très fécondé, et des centaines de larves consanguines peuvent être obtenues en quelques jours à partir d'une seule paire d'adultes12. Plusieurs études ont utilisé le poisson zèbre pour générer à la fois des modèles transgéniques et xénogreffes des maladies cancéreuses13,14. Comparé aux xénogreffes de souris, les xénogreffes de poisson zèbre permettent le suivi à la résolution simple de cellules. Une certaine quantité de tissus humains est capable de générer des centaines de modèles de poissons zèbres PDX (zPDX), alors que peut seulement être suffisant pour générer un couple de souris Modèles PDX15,16. En outre, les larves de poisson zèbre à 2-5 dpf développent déjà des systèmes circulatoires complets et des organes métaboliques tels que le foie et les reins, mais pas le système immunitaire17, tandis que le sac jaune restant est un milieu 3D naturel, idéal pour le dépistage des médicaments, médicament tests de résistance et observations de migration tumorale6,18,19,20,21.
Avec une tentative ultime d'utiliser zPDX comme une plate-forme de dépistage / test pour une utilisation clinique, ici, nous décrivons une proposition optimisée pour le modèle zPDX du cancer du pancréas, qui permet l'évaluation in vivo candidat médicament dans un court laps de temps en utilisant moins de cellules à moindre coût. Par rapport aux références précédentes sur zPDX6,9,10, nous avons introduit plusieurs optimisations pour rendre le système plus faisable et fiable pour le diagnostic clinique personnalisé: 1) pré-triant différentes cellules groupes dans les tissus tumorales primaires et la stabilisation des cellules primaires pendant une semaine avant d'autres expériences; 2) l'étiquetage des cellules humaines et l'amélioration de la viabilité cellulaire dans le xénogreffe par la modification génétique basée sur le lentivirus; 3) l'optimisation de l'état de culture de poisson zèbre dans les suppléments de nutriment (glucose et glutamine) et la température ; 4) quantifier les réponses de drogue de différents types de cellules d'une manière comparative. Nous avons également apporté des modifications à la solution d'injection en ajoutant plusieurs matériaux supplémentaires. Au total, ces améliorations offrent la possibilité de générer rapidement un xénogreffe plus patient-comme dans les hôtes de poissons zèbres qui peuvent être utilisés comme un outil fiable pour évaluer la réponse des médicaments candidats.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été approuvées et ont suivi les directives du Comité d'éthique animale de l'Université DeFuan et tous les spécimens de cancer du pancréas ont été obtenus auprès du Fudan University Shanghai Cancer Center. L'approbation éthique a été obtenue du Comité d'éthique de la FUSCC, et le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque patient.
1. Préparation de l'équipement pour la microinjection
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Préparation de la plaque d'injection.
- Préparer une solution de 50 ml d'agarose de 1 % dissous dans la solution E3 (0,6 g/L de sel d'aquarium dans de l'eau distillée double , 0,01 mg/L bleu méthylène). Faire bouillir la solution jusqu'à ce que l'agarose se dissolve.
- Verser 50 ml de la solution d'agarose dans un plat Petri de 10 cm, puis placer le moule de fixation d'embryon de poisson zèbre sur la surface. Retirez le moule lorsque la solution d'agarose se solidifie.
- Ajouter 20 ml de solution E3 à la plaque d'injection et la maintenir à 4 oC pour un stockage à long terme.
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Préparation des aiguilles d'injection.
- Tirez un capillaire en verre de 10 cm avec une dimension intérieure de 0,9 mm dans deux aiguilles sur un pulleur d'aiguille.
- Utilisez des forceps pour couper l'extrémité de l'aiguille pour créer une ouverture sous le microscope.
2. Préparation d'embryons pour la transplantation
- Placer 1 à 2 paires de poissons zèbres adultes dans un réservoir d'accouplement de 19 h à 21 h et recueillir les œufs fécondés vers 8 h le lendemain matin.
- Transférer les œufs fécondés du réservoir d'accouplement dans un plat Petri contenant 40 ml de solution E3 fraîche et incuber à 28,5 oC.
- Après 8 h d'incubation dans la solution E3, ajouter 0,03% 1-phényl-2-thiourea (PTU) dans la solution E3 pour inhiber la pigmentation. Incuber les embryons dans la solution E3 avec 0,03% De PTU à 28,5 oC jusqu'à 48 hpf. Cette étape peut être omise si vous utilisez du poisson zèbre mutant Casper.
3. Isolement et culture des cellules humaines primaires du spécimen chirurgical frais de cancer pancréatique ou du tissu congelé
- Obtenir des spécimens de tissu cancéreux pancréatique humain de la taille d'environ 1 cm3 lors d'une chirurgie abdominale, et transférer immédiatement le tissu dans les médias de croissance (DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 10 M Y-27632, 100 'g/mL primocin, 10 'g/mL putrescine dihydrochlorure, 10 mM de nicotinamide et 1 % de pénicilline streptomycine).
- Transférer l'échantillon de cancer du pancréas dans un plat Petri et enlever le tissu nécrotique environnant, le tissu adipeux et le tissu conjonctif.
- Rincer le tissu cancéreux 5 à 6 fois à l'aide d'un tampon de phosphate (PBS) et couper le tissu en morceaux de 1 mm3 à l'aide de scalpels.
- Transférer les tissus déchiquetés dans 5 ml de HBSS dans un tube de 50 ml et ajouter le collagène de type IV, l'hyaluronidase et le DNase I à des concentrations finales de 200 unités/mL, 100 mg/L et 20 mg/L, respectivement. Pipette le mélange de haut en bas pour bien mélanger.
- Incuber le mélange à 37 oC dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % pendant 15 à 20 min. Pipette le mélange de haut en bas quelques fois toutes les 5 minutes.
- Ajouter 7 ml de DMEM au tube et centrifugeuse à 110 x g pendant 5 min à 4 oC lorsque la digestion est terminée.
- Décant le supernatant et re-suspendre le mélange de tumeur dans DMEM.
- Déposer le mélange dans un plat Petri de 6 cm dans 3 ml de support de pleine croissance (DMEM avec 10% FBS, 20 x g/mL d'insuline, 100 ng/mL bFGF, 10 ng/mL EGF, 10 M Y-27632, 100 'g/mL primocin, 10 'g/mL putrescine dihydrochlorure, 10 mM nicotinamide , 1% de pénicilline streptomycine). Séparer les cellules en deux groupes.
- Dans le groupe I, ajouter 100x inhibiteur des fibroblastes du cancer du pancréas dans le milieu après 48 h pour enlever les fibroblastes envahis, laissant les cellules cancéreuses comme les principaux types de cellules;. Dans le groupe II, les fibroblastes dépasseront les cellules cancéreuses en une semaine.
- Culture les deux groupes cellulaires pendant 1-2 semaines en fonction des densités/puretés cellulaires et changer les médias tous les trois jours. Les types de cellules attendus dans les deux groupes I et II peuvent occuper plus de 98% en proportion dans une expérience typic réussie.
4. Étiquetage des cellules avec lentivirus Exprimant anti-apoptose Gène BCL2L1 (BCL-XL) et Différentes protéines fluorescentes séparément
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Production de lentivirus
- Plaque 3 x 106 cellules HEK 293T avec milieu DMEM complet (DMEM fourni avec 10% FBS) dans des plats de 10 cm et la culture pendant la nuit à 37 oC dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5%. Remplacer le milieu par 6 ml de milieu sans sérum avant la transfection.
- Préparer la solution A : 8 g de vecteurs lentiviraux contenant BCL2L1(pCDH-EF1-mKate2-E2A-BCL2L1-WPRE ou pCDH-EF1-eGFP-E2A-BCL2L1-WPRE), 2,4 g de pVSVG, 4 g pMDL (Gag/Pol), 1,6 g de pREV et DMEM sans sérum dans un volume total de 500 euros L. Doucement pipet le mélange plusieurs fois, et le placer à température ambiante pendant 5 min.
- Préparer la solution B : 40 l de l'Ile-du-Prince-Édouard (polyéthylèneimine) dans un DMEM sans sérum de 460 l. Placez-le à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter lentement la solution B dans la solution A et laisser le tube à température ambiante pendant 30 min.
- Ajouter le mélange final dans le plat de culture cellulaire HEK 293T préparé à l'étape 4.1.1 et incuber à 37 oC dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 %. Après 12 h, ajouter 5 ml supplémentaires du milieu DMEM complet. Après 48 h, récolter le milieu contenant le lentivirus.
- Filtrer le supernatant à l'aide d'un filtre stérile de 0,45 m, ajouter le supernatant dans une colonne de concentration, centrifugeuse à 6 000 x g pendant 25 à 30 min à 4 oC. Les aliquots lentivirus de 100 L par tube sont fabriqués et stockés à -80 oC.
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Infection des cellules primaires
- Ensemencez les cellules (groupe I et II) pour être infectées dans une plaque de 12 puits avec une densité de 30-40% et la culture des cellules pendant la nuit à 37 oC dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5%.
- Remplacer le milieu par 500 oL de milieu sans sérum contenant 8 g/mL de polybrene pendant 4 h. Ensuite, ajoutez 100 l de l'il supplémentaire du lentivirus dans le milieu (eGFP-E2A-BCL2L1 pour le groupe I ou mKate2-E2A-BCL2L1 pour le Groupe II). Après 12 h, remplacer le milieu par 1 ml de milieu complet.
- Vérifiez les marqueurs de fluorescence après 48 h.
- Récoltez les cellules infectées et mélangez-les à un ratio de 1:1 avec une concentration finale de 106/mL.
- Centrifuger les cellules à 110 x g pendant 5 min et re-suspendre le mélange cellulaire dans 50 L de solution d'injection (1640 milieu avec 10% FBS, 0,05% acide hyaluronique sel de sodium, 0,05% méthylcellulose).
5. Injecter la suspension de cellules mélangées dans le poisson zèbre
- Ajouter la solution de tricaine 10x dans l'eau de l'E3 pour anesthésier les larves de poissons zèbres et transférer les larves (de l'étape 2.3) à la plaque d'injection remplie par l'E3 modifié (E3 avec 1 g/L de glucose et 5 mmol/L L-glutamine).
- Remplir 25 ll de suspension de cellules mixtes dans une aiguille micro capillaires et insérer l'aiguille dans le manipulateur de micro-injection.
- Définir la pression d'injection et le temps. Injecter 50-80 cellules (8 nL) dans le sac jaune de 48 hpf de poisson zèbre.
6. Culture du poisson zèbre xénoffé (modèle zPDX)
- Transférer les larves de poissons zèbres post-xenografted dans 40 ml de solution mixte (solution E3 avec 1 g/L de glucose et 5 mmol/L L-glutamine) à 32 oC.
7. Drug Administration on the Xenografted Zebrafish and the Assessment of Tumor Cells/Fibroblasts Viabilities 7. Drug Administration on the Xenografted Zebrafish and the Assessment of Tumor Cells/Fibroblasts Viabilities
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Déterminer la concentration optimale de gemcitabine/navitoclax.
- Placer 10 embryons de poissons zèbres de type sauvage à 48 hpf dans chaque puits d'une plaque de 12 puits.
- Ajouter différentes concentrations de gemcitabine ou de navitoclax dans chaque puits et incuber à 32 oC pendant deux jours.
- Après 2 jours, calculez la dose maximale de tolérance (MTD) de gemcitabine et de navitoclax à laquelle les larves de poissons zèbres ne montrent pas de malformation significative et un comportement anormal, et les concentrations de travail sont fixées en dessous du MTD.
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Traitement des modèles zPDX avec gemcitabine/navitoclax.
- Placer 10 larves xénogres dans chaque puits d'une plaque de 12 puits.
- Divisez les larves en quatre groupes, traitez le groupe témoin en E3 contenant 0,1 % de DMSO et traitez les autres groupes avec une gemcitabine de 5 g/mL et/ou 50 millions de navitoclax, et incubez à 32 oC pendant deux jours.
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Évaluation des probabilités cellulaires et de la composition cellulaire dans les modèles zPDX.
- Anesthésiez les larves xénogres après le traitement et placez-les en 3 % de méthylcellulose.
- Imagez les larves de la vue latérale à l'aide d'un microscope à fluorescence ou d'un microscope confocal.
- Quantifier l'intensité des signaux de fluorescence rouge et vert à l'aide des logiciels ImageJ et GraphPad.
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Representative Results
Un plan schématisé de la procédure est représenté à la figure 1. En bref, les cellules primaires de tissu de cancer ont été ensemencées dans le milieu complet après digestion avec ou sans l'addition des inhibiteurs pancréatiques de fibroblaste de cancer. Les cellules cancéreuses et les fibroblastes ont été enrichis en deux populations distinctes que les fibroblastes dominaient sans inhibiteurs, et la croissance des cellules cancéreuses a prévalu après l'ajout d'inhibiteurs (figure 2). Deux vecteurs d'emballage lentiviral ont été construits, qui exprimaient des protéines fluorescentes vertes ou rouges et BCL2L1 comme le montre la figure 3. L'étiquetage fluorescent à base de virus représentait également l'état de survie des cellules. Les cellules cancéreuses mixtes et les fibroblastes ont été injectés dans le sac de jaune de poisson zèbre à 48 hpf et ont été traités par gemcitabine et/ou navitoclax pendant deux jours. Les probabilités cellulaires dans différentes populations et la composition cellulaire du xénogreffe ont été modifiées au fur et à mesure que les réponses au traitement médicamenteux (figure 4).
Figure 1 : Diagramme schématique de la génération et de l'évaluation de drogue du modèle de xénogreffe de poisson zèbre dérivé du cancer pancréatique. Les tissus enlevés chirurgicalement des patients présentant le cancer pancréatique sont cisaison s'ils sont cisaisons et digérés, suivis par la culture à deux conditions différentes, dont l'une est ajoutée par un inhibiteur de fibroblaste, et l'autre groupe n'est pas. Après 1-2 semaines, les cellules primaires ont été génétiquement modifiées pour exprimer une protéine anti-apoptotic BCL2L1 et différentes protéines fluorescentes. Après cela, les deux populations ont été mélangées et co-injectées dans 48 larves de poissons zèbres hpf pour évaluer les effets des médicaments chimiothérapeutiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Culture et enrichissement des cellules cancéreuses pancréatiques et des fibroblastes. Les images des cellules cancéreuses et des fibroblastes enrichies de trois patients différents de cancer pancréatique après culture de 10 jours. Barre à l'échelle, 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Structure du vecteur lentiviral exprimant BCL2L1 et différentes protéines fluorescentes. Diagramme schématique de deux vecteurs lentiviraux exprimant constamment mKate2-E2A-BCL2L1 ou eGFP-E2A-BCL2L1, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Effets sur le xénogreffe par gemcitabine. (A) Vue latérale du xénogreffe dans le sac jaune des larves de poisson zèbre à 3 h après la transplantation (hpt). (B) Images représentatives des xénogreffes chez les larves de poissons zèbres à 60 cht, traitées par DMSO ou gemcitabine. (C) Rendu 3D représentatif des xénogreffes à 60 cht. (D) Statistiques de l'intensité de fluorescence du xénogreffe avant et après le traitement inhibiteur de la gemcitabine et/ou BCL2L1. N - 10 par groupe pour chaque match. Barre d'échelle de 100 m; N.-É., ce qui n'est pas significatif; P et lt; 0,05; P et lt; 0,0001; sD, avec des différences statistiques déterminées par ANOVA à sens unique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les deux modèles PDX et CDX sont des plates-formes vitales dans le domaine de la biologie tumorale22, et l'étape critique d'une transplantation inter-espèces réussie est d'améliorer la survie du xénogreffe. Récemment, certaines études ont montré que l'expression transitoire de BCL2L1 (BCL-XL) ou BCL2 peut améliorer considérablement la viabilité des cellules souches embryonnaires humaines chez les hôtes de souris sans affecter l'identité cellulaire et les destins23 , 24 Ans, états-unis , 25. Dans notre manuscrit, nous avons étiqueté les cellules avec le lentivirus exprimant constamment le gène d'anti-apoptosis BCL2L1 (BCL-XL), aussi bien que des protéines fluorescentes. L'introduction de BCL2L1 a considérablement amélioré le temps de survie des cellules humaines xénogreffes chez le poisson zèbre pour prolonger la fenêtre d'observation des études, tandis que les signaux fluorescents non seulement étiquetent les cellules, mais signalent également l'état de vie de la cellules, comme nous l'avons constaté que la fluorescence s'estompe rapidement avec la mort cellulaire. Pendant ce temps, nous sommes en train de modifier le poisson zèbre comme un meilleur hôte pour les xénogreffes humaines. D'une part, le rag2 et le prkdc sont assommés par la technologie CRISPR/Cas9 pour préparer un poisson zèbre immunodéficient combiné, qui était semblable aux souris immunodéficientes combinées, pour rendre les larves plus âgées de poisson zèbre également compatibles avec des cellules et des tissus humains26. D'autre part, le poisson zèbre a également été modifié pour exprimer des protéines humaines telles que l'IGF1 et l'INS afin de mieux soutenir la survie et la prolifération des cellules humaines implantées en utilisant la technologie transgénique à médiation transposon Tol2. En outre, zPDX manque également d'un système immunitaire fonctionnel de l'homme, et les interactions entre les cellules stromales humaines et le système immunitaire, et à l'avenir, nous pouvons essayer de co-injecter des cellules immunitaires humaines pour reconstruire un environnement immunitaire humanisé à court terme chez le poisson zèbre.
Chez les souris modèles PDX, les conditions de xénogreffe ont été traditionnellement surveillés par l'observation directe sur les nœuds de taille visible, qui nécessitent beaucoup de temps pour se développer. Dans les modèles zPDX transparents comme comparaison, le xénogreffe peut être étudié sous microscopie en temps réel. Cependant, il était difficile d'évaluer les alternances de nombre de cellules dans une population d'une seule couleur sans un contrôle approprié, et l'idée d'introduire deux populations cellulaires de fluorescence différente améliore considérablement la quantitation de la viabilité cellulaire. En mélangeant et en injectant différentes cellules à des rapports fixes, nous imitons non seulement le microenvironnement tumoral, mais nous sommes également en mesure de quantifier avec précision la réponse médicamenteuse en comparant les deux groupes cellulaires. Bien que le rapport original des cellules cancéreuses aux fibroblastes dans les tissus primaires soit très différent, ici nous avons commencé avec le rapport 1:1, et les effets du traitement de drogue sur la même composition cellulaire d'un rapport différent seront étudiés à l'avenir. En outre, les effets de l'incubation de 32 oC au lieu de 37 oC sur les comportements des cellules humaines nécessitent également des études comparatives détaillées. Enfin, la stratégie du modèle hétérogène de xénogreffe dérivé du patient pour le cancer pancréatique pour l'évaluation comparative des médicaments peut également être appliquée à d'autres types de cancers solides. Cette approche est particulièrement utile pour PDX en utilisant des larves de poissons zèbres comme hôtes, qui sont limpides et réalisables pour l'analyse à résolution unicellulaire.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêts potentiel n'a été divulgué.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China 81402582, Natural Science Foundation of Shanghai 12DZ295100, 14YF1400600 et 18ZR1404500
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| Penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| Phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| Collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| Dnase I | Sigma | D5025 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| Gemcitabine | Gemzan | ||
| Methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
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