Summary
Bu protokol, ev sahibi olarak larva zebra balığı kullanarak virüs tabanlı çift floresan etiketli tümör xenograft modelinde optimizasyon prosedürlerini açıklar. Bu heterojen xenograft modeli Pankreatik kanser mikroçevre in vivo doku bileşimi taklit ve kişiselleştirilmiş zPDX içinde ilaç yanıtlarını değerlendirmek için daha hassas bir araç olarak hizmet vermektedir (zebrafish hasta tarafından türetilen xenograft) modelleri.
Abstract
Hasta türevi tümör xenograft (PDX) ve hücre türevi tümör xenograft (CDX) preklinik değerlendirme, ilaç rehberlik ve temel kanser araştırmaları için önemli tekniklerdir. Geleneksel ana fareler içinde PDX modellerinin nesiller zaman alıcı ve sadece numunelerin küçük bir oranı için çalışıyor. Son zamanlarda, zebra balığı PDX (zpdx), küçük ölçekli ve yüksek verimlilik özellikleri ile benzersiz bir ana bilgisayar sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Burada, zPDX modellerinde karşılaştırmalı kemoterapi değerlendirmesi için çift floresan etiketli bir tümör xenograft modeli oluşturmak için optimize edilmiş bir metodolojisi tarif ediyoruz. Tümör hücreleri ve fibroblastlar, farklı kültür koşullarında taze hasat edilen veya dondurulmuş pankreas kanseri dokusundan zenginleştirilmiştir. Her iki hücre grubu, yeşil veya kırmızı floresan proteinlerin yanı sıra bir anti-apoptozis geni BCL2L1ifade eden Lentivirus tarafından etiketlenmiştir. Transferleştirilmiş hücreler, 32 °c ' de modifiye E3 ortamında yetiştirilen 2 DPF larva zebra balığı içine önceden karıştırılmış ve ortak enjekte edildi. Xenograft modelleri kemoterapi ilaçları ve/veya BCL2L1 inhibitörü ile tedavi edildi ve hem tümör hücrelerinin hem de fibroblastların canları aynı anda incelenmiştir. Özetle, bu protokol, araştırmacılar hızlı bir şekilde heterojen bir tümör mikroçevre ile zPDX modelleri büyük miktarda oluşturmak için izin verir ve daha uzun bir gözlem penceresi ve ilaç adaylarının verimliliğini değerlendirirken daha hassas bir nicel sağlar.
Introduction
Hassas Onkoloji bireysel hasta için en yararlı terapötik stratejileri bulmayı amaçlamaktadır1. Şu anda, in vitro primer kültür, in vitro nevuslardır kültür2gibi sayısız preklinik model ve nevuslardır kültürden önce veya sonra farelerde hasta türevi xenograflar (PDX) teşhis için önerilen ve potansiyel olarak ekran/değerlendirme terapötik seçimler3. İnsan primer kanser hücrelerinin bağışıklık tehlikeye fareler içine enjeksiyon tarafından oluşturulan PDX modeli, klinik Onkoloji kişiselleştirilmiş ilaç taraması için en umut verici araçlardan biridir3,4. İn vitro kültürlü hücre hattının aksine, PDX modelleri genellikle in vivo tümör ortamının bütünlüğünü ve heterojenliğini korur, farklı tümör hastalarının çeşitliliğini ve idosynkratik özelliklerini daha iyi taklit eder ve bu nedenle Hastaların potansiyel tıbbi sonucu4. Ancak, fareler PDX modellerinin nesil yüksek kaliteli hasta örnekleri ve çoklu grup deneyleri için yeterli hücre ve model toplamak için ay zaman gerektirir ve xenograft hücresel/genetik kompozisyonlar orijinal bu drift olabilir hastanınbiyopsisi. Fare PDX modeli kurulması için başarı oranı da düşük, zor geniş klinik uygulamada uygulanması için yapma. Pankreas kanseri gibi hızla ilerlemiştir kanserleri taşıyan hastalar için, zaman içinde PDX deneylerinden değerli bilgiler elde etmek mümkün olmayabilir.
Son birkaç yıl içinde, zebra balığı sadece CDX (hücre türetilen tümör xenograft) modelleri için potansiyel ev sahipleri olduğu bildirilmiştir, aynı zamanda PDX modelleri5,6,7,8,9, 10. vertebral model hayvan olarak, zebra balığı hem genetik hem de fizyolojide memeliler ile yeterli benzerlikleri vardır, iki önemli avantajı vardır: şeffaflık ve küçük boyutu11. Zebrafish de son derece saflık, ve yüzlerce doğuştan larva birkaç gün içinde yetişkin12tek bir çift elde edilebilir. Çeşitli çalışmalar kanser hastalıkları hem transjenik ve xenograft modelleri oluşturmak için zebra balığı istihdam var13,14. Farexenografts ile karşılaştırıldığında, zebra balığı ksenogreft tek hücreli çözünürlükte izlemeyi sağlar. İnsan dokularının belirli bir miktar zebra balığı PDX modelleri yüzlerce üretebilmek yeteneğine sahiptir (zpdxs), sadece fare PDX modelleri bir çift oluşturmak için yeterli olabilir iken15,16. Ayrıca, 2-5 DPF 'de zebra balığı larvalar zaten tam dolaşım sistemleri ve karaciğer ve böbrek gibi metabolik organları geliştirmek, ancak bağışıklık sistemi17, kalan sarısı sac doğal bir 3D orta iken, ilaç taraması için ideal, ilaç direnç testleri ve tümör göç gözlemleri6,18,19,20,21.
Klinik kullanım için bir tarama/test platformu olarak zPDX kullanmak için nihai bir girişim ile, burada, pankreas kanseri zPDX modeli için optimize edilmiş bir öneri açıklamak, hangi izin verir in vivo aday ilaç değerlendirme kısa bir süre içinde düşük maliyetlerde daha az hücre kullanarak. Zpdx6,9,10hakkında önceki referanslar ile karşılaştırıldığında, biz sistem daha uygun ve güvenilir klinik kişiselleştirilmiş tanı için yapmak için birkaç optimizasyonlar tanıttı: 1) farklı hücre ön sıralama primer tümör dokularında gruplar ve daha fazla deneylerden önce bir hafta boyunca primer hücreleri stabilize; 2) insan hücrelerini etiketleme ve Lentivirus tabanlı genetik modifikasyon ile xenograft hücre canlılığı artırılması; 3) hem besin takviyeleri (glikoz ve glutamin) ve sıcaklık zebra balığı kültür durumu optimize; 4) farklı hücre türlerinin ilaç yanıtlarının karşılaştırmalı bir şekilde ölçülme. Ayrıca birkaç ek malzeme ekleyerek enjeksiyon çözümünde değişiklik yaptık. Tamamen, bu iyileştirmeler hızlı bir şekilde daha fazla hasta-xenograft zebra balığı hosts bu güvenilir bir araç olarak aday ilaçların tepkisi değerlendirmek için kullanılabilir oluşturmak için imkanı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri onaylanmış ve Fudan Üniversitesi 'nde hayvan etiği Komitesi kuralları takip ve tüm pankreas kanseri numuneleri Fudan Üniversitesi Şangay Kanser Merkezi 'nden elde edildi. FUSCC Etik Komitesi 'nden etik onay alındı ve her hastada yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.
1. mikroenjeksiyon için ekipman hazırlanması
-
Enjeksiyon plakasını hazırlıyorum.
- E3 solüsyonu (0,6 g/l akvaryum tuzu çift distile su + 0,01 mg/l metilen mavi) çözülmüş% 1 agaroz 50 ml solüsyonu hazırlayın. Agaroz çözülür kadar çözelti kaynatın.
- 10 cm Petri çanak içine agaroz çözeltisi 50 ml dökün ve sonra yüzey üzerinde zebra balığı embriyo fikyasyon kalıp yerleştirin. Agaroz çözeltisi katılaştırılmış hale geldiğinde kalıbı çıkarın.
- Enjeksiyon plakasına 20 mL E3 çözeltisi ekleyin ve uzun süreli depolama için 4 °C ' de koruyun.
-
Enjeksiyon iğneler hazırlanıyor.
- 0,9 mm iç boyutu olan 10 cm 'lik cam kapiller, iğne çektirme üzerine iki iğne içine çekin.
- Mikroskop altında bir açılış oluşturmak için iğne ucunu kesmek için forseps kullanın.
2. embriyoların transplantasyon için hazırlanması
- 7-9 at bir çiftleşme tankında yetişkin zebra balığı 1 için 2 çift yer ve yaklaşık 8 ertesi sabah döllenmiş yumurta toplamak.
- Döllenmiş yumurtaları çiftleşme tankından 40 mL 'Lik yeni E3 çözeltisi içeren bir petri tabağına aktarın ve 28,5 °C ' de inküye yapın.
- E3 çözümünde inkübasyon 8 h sonra, pigment inhibe E3 çözüm içine 0,03% 1-fenil-2-Thiourea (PTU) ekleyin. Embriyoları E3 çözeltisi ile 0,03% PTU ile 28,5 °C ' de 48 HPF 'ye kadar kulbe etme. Bu adım, içinde yetiştirilen Casper mutant zebrafish kullanıldığında atlanabilir.
3. taze cerrahi pankreas kanseri numune veya dondurulmuş doku primer ınsan hücrelerinin yalıtım ve kültür
- Abdominal cerrahi sırasında 1 cm3 civarında boyuttaki insan pankreas kanseri dokusunun örneklerini alın ve dokuyu hemen büyüme ortamına aktarın (dmem ile% 10 fetal sığır serumu (FBS), 10 μM Y-27632, 100 μg/ml primocin, 10 μg/ml putresin Dihidroklorür, 10 mM nikotinamid ve% 1 penisilin streptomisin).
- Pankreas kanseri örneğini bir petri tabağına aktarın ve çevredeki nekrotik dokusu, adipoz dokusu ve bağ dokusunu çıkarın.
- Fosfat tampon (PBS) ile 5-6 kez kanser dokusu durulayın ve 1 mm3 adet neşter kullanarak doku kesti.
- 50 ml 'lik bir tüpte 5 ml HBSS içine rendelenmiş dokuları aktarın ve sırasıyla 200 birimler/ml, 100 mg/l ve 20 mg/l son konsantrasyonlarda kolajenaz tip IV, hyaluronidaz ve DNase ı ekleyin. Karışımı yukarı ve aşağı pipette iyi karıştırın.
- Karışımı 37 ° c 'de% 5 karbondioksit kuluçside, 15-20 dk. kadar her 5 dakikada bir birkaç kez aşağı ve aşağı karışımı pipette.
- 7 mL DMEM tüpüne ekleyin ve 110 x g 'de santrifüjte 4 °c ' de sindirim tamamlandığında 5 dk.
- Süpernatant decant ve yeniden dmem içinde tümör karışımı askıya.
- 3 ml tam büyüme medyasında 6 cm Petri tabak karışımı plaka (% 10 FBS ile dmem, 20 μg/ml insülin, 100 ng/ml bFGF, 10 ng/ml EGF, 10 μM Y-27632, 100 μg/ml primocin, 10 μg/ml putresin Dihidroklorür, 10 mm nikotinamid , 1% penisilin streptomisin). Hücreleri iki gruba ayırın.
- Grup ı, 48 sonra orta pankreas kanseri fibroblastlar 100x inhibitörü eklemek büyüyen fibroblastları kaldırmak için, büyük hücre türleri olarak kanser hücrelerini bırakarak;. Grup II 'de fibroblastlar bir hafta içinde kanser hücrelerini büyütecek.
- Kültür hücre yoğunlukları/purities bağlı olarak 1-2 hafta için her iki hücre grupları ve her üç günde bir medya değiştirin. Her iki grupta beklenen hücre türleri ı & II üzerinde işgal edebilir 98% bir heterojenlik başarılı deney orantılı olarak.
4. Lentivirus Ifade Anti-apoptozis gene BCL2L1 (BCL-XL) ve farklı floresan proteinleri ayrı hücreler etiketleme
-
Lentivirus üretimi
- Plaka 3 x 106 HEK 293T hücreleri Ile tam dmem Orta (dmem ile birlikte 10% FBS) 10 cm yemekler ve kültür gecede 37 °c yılında% 5 karbondioksit kuluçside. Transfeksiyondan önce 6 mL serum içermeyen medya ile ortamı değiştirin.
- A çözeltisi hazırlayın: 8 μg BCL2L1içeren lentiviral vektörler (Pcdh-EF1α-MKATE2-E2A-BCL2L1-wpre veya pCDH-EF1α-EGFP-E2A-BCL2L1-wpre), 2,4 μg pvsvg, 4 μg pmdl (gag/pol), 1,6 μg önceki ve serum-ücretsiz dmem toplam hacmi 500 μL. hafifçe pipet karışımı birkaç kez ve 5 dakika oda sıcaklığında yerleştirin.
- B: 40 μL (polileneimine) 460 μL serum-ücretsiz DMEM solüsyonu hazırlayın. Oda sıcaklığında 5 dakika yerleştirin.
- B çözümünü yavaşça çözüm A 'ya ekleyin ve tüpü 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakın.
- 4.1.1 adımda hazırlanan HEK 293T hücre kültürü çanak içine son karışımı ekleyin ve% 5 karbondioksit kuluçside 37 °C ' de inkük. 12 saat sonra, tam DMEM orta ek bir 5 mL ekleyin. 48 sonra h, Lentivirus içeren orta hasat.
- Bir 0,45 μm steril filtre kullanarak süpernatant filtre, bir konsantrasyon sütunu içine süpernatant eklemek, 4 °c ' de 25-30 dakika için 6.000 x g Santrifüjü. Tüp başına 100 μL Lentivirus plakaya yapılır ve-80 °c saklanır.
-
Primer hücrelerin enfeksiyonu
- Tohum hücreleri (Grup ı & II) bir 12-kuyu plaka ile enfekte olmak 30-40% yoğunluk ve kültür hücreleri bir gecede 37 °C ' de% 5 karbondioksit kuluçside.
- 4 h için 8 μg/mL polybrene içeren serum içermeyen orta 500 μL ile ortamı değiştirin. Daha sonra bir ek 100 μL Lentivirus Orta (eGFP-E2A-BCL2L1 grubu ı veya mKate2-E2A-BCL2L1 Grup II için) ekleyin. 12 h sonra, tam orta 1 mL orta değiştirin.
- 48 sonra floresans işaretleyicilerini kontrol edin.
- Enfekte hücreleri hasat ve 106/ml. son konsantrasyon ile 1:1 oranı onları karıştırın
- 110 x g 'deki hücreleri 5 dakika boyunca santrifüjle ve 50 μL enjeksiyon çözeltisi (1640 orta,% 10 FBS,% 0,05 hyaluronik asit sodyum tuzu,% 0,05 metilselüloz) ile hücre karışımını yeniden askıya alın.
5. zebrafish içine karışık hücre süspansiyon enjekte
- Zebra balığı larvaları anestezize etmek ve larvaları (adım 2,3) modifiye E3 (1 g/l glikoz ve 5 mmol/l l-glutamin ile E3) ile doldurulmuş enjeksiyon plakasına aktarmak için E3 suyuna 10X tricaine çözüm ekleyin.
- 25 μL karışık hücreli süspansiyonu mikro kılcal iğneye doldurun ve iğneyi mikro enjeksiyon manipülatörünün içine takın.
- Enjeksiyon basıncını ve zamanını ayarlayın. 48 HPF zebrafish 'in sarısı sac içine 50-80 hücre (~ 8 nL) enjekte.
6. Xenografted zebrafish kültürü (zPDX modeli)
- 32 °c ' de 1 g/l glikoz ve 5 mmol/l l-glutamin içeren E3 solüsyonu (40 ml) Mix çözeltisi üzerine xenografya sonrası zebra balığı larvaları aktarın.
7. Xenografted zebrafish üzerinde ilaç yönetimi ve tümör hücrelerinin/fibroblastlar yeteneklerinin değerlendirilmesi
-
Gemcitabine/navitoclax optimum konsantrasyon belirlenmesi.
- Yer 10 wildtype zebra balığı embriyo at 48 HPF her iyi bir 12-kuyu plaka içine.
- Her bir kuyunda gemcitabin veya navitoclax farklı konsantrasyonları ekleyin ve iki gün boyunca 32 °C ' de inküyeyin.
- 2 gün sonra, zebra balığı larvaların önemli malformasyon ve anormal davranışlar göstermez ve çalışma konsantrasyonları MTD altında ayarlanır gemsitabin ve navitoclax maksimal tolerans dozu (MTD) hesaplayın.
-
Gemcitabine/navitoclax ile zPDX modellerinin tedavisi.
- 12 kuyu plakasının her bir kuyunda 10 xenografted larva yerleştirin.
- Larvayı dört gruba ayırın, kontrol grubunu% 0,1 DMSO içeren E3 'de tedavi edin ve diğer grupları 5 μg/ml gemsitabin ve/veya 50 μM navitoclax ile tedavi edin ve iki gün boyunca 32 °c ' de inküye yapın.
-
ZPDX modellerinde hücre yeteneklerini ve hücresel bileşiminin değerlendirilmesi.
- Xenografted larvaları tedavi sonrası anestezize edin ve onları% 3 metilselüloz içine yerleştirin.
- Floresans mikroskop veya Konfokal mikroskop kullanarak larvaları lateral görünümden görüntü.
- Imagej ve GraphPad yazılımını kullanarak kırmızı ve yeşil floresan sinyallerinin yoğunluğunu ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prosedür şemalandırılmış bir anahat Şekil 1' de temsil edilir. Kısacası, primer kanser dokusu hücreleri pankreas kanseri fibroblast inhibitörleri ilavesi ile veya olmadan sindirim sonra tam orta içine tohumlama edildi. Kanser hücreleri ve fibroblastlar, fibroblastların inhibitörler olmaksızın hakim olduğu iki farklı nüfus olarak zenginleştirilmiştir ve inhibitörlerin eklenmesinden sonra kanser hücresi büyümesi galip gelmiştir (Şekil 2). Şekil 3' te gösterildiği gibi yeşil veya kırmızı floresan PROTEINLERI ve BCL2L1 ifade eden iki lentiviral ambalaj vektörler yapılmıştır. Virüs bazlı floresan etiketleme de hücrelerin hayatta kalma durumunu temsil etti. Karışık kanser hücreleri ve fibroblastlar 48 HPF 'de zebra balığı sarısı kesenin içine enjekte edildi ve iki gün boyunca gemcitabin ve/veya navitoclax tarafından tedavi edildi. Farklı nüfuslarda hücre yeteneklerini ve xenograft hücresel bileşimi ilaç tedavisi için yanıtlar olarak değiştirildi (Şekil 4).
Şekil 1: pankreas kanserinden elde edilen zebra balığı xenograft modelinin nesil ve ilaç değerlendirmesinin şematik şeması. Pankreas kanseri olan hastalarda cerrahi olarak çıkarılan dokular yamultulmuş ve sindirilmiş, iki farklı koşullarda kültür izledi, biri bir fibroblast inhibitörü tarafından eklenir, ve diğer grup değildir. 1-2 hafta sonra, Primer hücreler genetik olarak bir anti-apoptotik protein BCL2L1 ve farklı floresan proteinleri ifade etmek için değiştirildi. Bundan sonra, iki nüfus karışık ve 48 HPF zebra balığı larvaları içine kemoterapötik ilaçların etkilerini değerlendirmek için ortak enjekte edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: pankreas kanseri hücrelerinin kültür ve zenginleştirme ve fibroblastlar. Kanser hücrelerinin görüntüleri ve fibroblastlar üç farklı pankreas kanseri hastalarından zenginleştirilmiş 10 günlük kültür sonra. Ölçek çubuğu, 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: lentiviral vektörünün yapısı BCL2L1 ve farklı floresan proteinlerini ifade ediyor. İki lentiviral vektörler sürekli mKate2-E2A-BCL2L1 veya eGFP-E2A-BCL2L1, sırasıyla ifade Şematik diyagramı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Gemcitabine tarafından xenograft üzerindeki etkileri. (A) 3 saat sonrası transplantasyon (HPT) zebra balığı larvaları sarısı sac xenograft lateral görünümü. (B) DMSO veya Gemcitabine tarafından tedavi 60 HPT, zebra balığı larvaları ksenogreft temsili görüntüler. (C) 60 HPT 'de ksenogreft temsilcisi 3D rendering. (D) gemsitabin ve/veya BCL2L1 inhibitörü tedavisinden önce ve sonra xenograft 'ın floresan yoğunluğunun istatistikleri. Her tahlil için Grup başına N = 10. Ölçek çubuğu = 100 μm; NS, önemli değil; *P < 0,05; P < 0,0001; tek yönlü ANOVA tarafından belirlenen istatistiksel farklılıklar ile ortalama ± SD. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hem PDX hem de CDX modelleri tümör biyoloji22alanında hayati platformlar ve başarılı bir türler arası transplantasyonun kritik adımı xenograft 'in hayatta kalmasının geliştirilmesi. Son zamanlarda, bazı çalışmalar göstermiştir ki BCL2L1 geçici ifade (BCL-XL) veya BCL2 önemli ölçüde hücre kimliklerini etkilemeden fare ev sahibi insan embriyonik kök hücrelerinin canlılığı artırabilir ve kaderlerde23 , 24 , 25. bizim makalemiz, biz Lentivirus sürekli Anti-apoptoz geni BCL2L1 (BCL-XL), hem de floresan proteinleri ifade hücreleri etiketli. BCL2L1 tanıtımı büyük ölçüde zebra balığı içinde xenograft insan hücrelerinin hayatta kalma süresini gelişmiş çalışmalar için gözlem penceresini uzatmak için, floresan sinyalleri sadece hücreleri etiketlerken değil, aynı zamanda yaşam durumunu rapor hücreler, biz floresan hücre ölümü ile hızlı bir şekilde kaybolur bulduk. Bu arada, biz şu anda insan xenografts için daha iyi bir ev sahibi olarak zebra balığı değiştiriyoruz. Bir yandan, rag2 ve prkdc Crispr/Cas9 teknolojisi ile kombine bağışıklık eksiklik fareler benzer bir kombine bağışıklık eksikliği zebra balığı hazırlamak için, eski zebra balığı larvaları aynı zamanda uyumlu hale getirmek insan hücreleri ve dokuları ile26. Öte yandan, zebra balığı de IGF1 ve INS gibi insan proteinlerini ifade etmek için, Tol2 transposon aracılı transgenik teknolojiyi kullanarak implante edilmiş insan hücrelerinin hayatta kalmasının ve proliferasyonu daha iyi desteklemesi için değiştirildi. Dahası, zpdx da insan gibi fonksiyonel bağışıklık sistemi yoksun, ve insan stromal hücreleri ve bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimler, ve gelecekte, biz zebrafish kısa vadeli insanlaşmış bağışıklık ortamını yeniden oluşturmak için insan immün hücreleri enjekte deneyebilirsiniz.
Faredeki PDX modellerinde, xenograft koşulları geleneksel olarak görülebilir boyuttaki düğümleri üzerinde doğrudan gözlem ile izleniyor, bu da uzun süre geliştirilmesi gerekir. Saydamlık zPDX modellerinde karşılaştırma olarak, xenograft gerçek zamanlı olarak mikroskobik olarak incelenebilir. Ancak, uygun bir kontrol olmadan tek renkli bir nüfus hücre numarası değişim değerlendirmek zordur, ve fikir farklı floresan iki hücre nüfus tanıtmak için önemli ölçüde hücre viability nicesleştirilmesini geliştirir. Farklı hücreleri sabit oranlarda karıştırarak ve enjekte ederek, sadece tümör mikroortamını taklit etmiyoruz, aynı zamanda iki hücre grubunu karşılaştırarak ilaç yanıtını doğru şekilde ölçebiliriz. Primer dokularda fibroblastlar için kanser hücrelerinin orijinal oranı son derece farklı olmasına rağmen, burada 1:1 oranı ile başladı, ve farklı bir oran aynı hücre bileşimi üzerinde ilaç tedavisinin etkileri gelecekte incelenecektir. Bunun yanı sıra 32 °C ' nin 37 °C ' nin yerine insan hücrelerinin davranışlarına karşı etkileri de ayrıntılı karşılaştırmalı çalışmalar gerektirir. Son olarak, karşılaştırmalı ilaç değerlendirmesi için pankreas kanseri için hasta türeyen heterojen xenograft modelinin stratejisi de katı kanserlerin diğer türlerine uygulanabilir. Bu yaklaşım, tek hücreli çözünürlükte analiz için kristal berraklığında ve uygulanabilir olan ev sahipleri olarak zebra balığı larvaları kullanan PDX için özellikle yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir potansiyel ilgi çakışması açıklanmamıştır.
Acknowledgments
Bu iş Çin 81402582 Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Şanghay 12DZ2295100, 14YF1400600 ve 18ZR1404500 doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| Penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| Phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| Collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| Dnase I | Sigma | D5025 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| Gemcitabine | Gemzan | ||
| Methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
- Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
- Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
- Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
- Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
- Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
- Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
- Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).
- Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
- Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
