Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59507
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 2,3, 1, 1, 2,3, 2,4,5,6, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Key Laboratory of Metabolism and Molecular Medicine, Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, 2National Human Genetic Resources Sharing Service Platform (2005DKA21300), 3Fudan University Shanghai Cancer Center, 4Department of Pancreatic Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, 5Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, 6Pancreatic Cancer Institute, Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליכי אופטימיזציה במודל האנטי-וירוס מבוסס-פלואורסצנטית כפול שכותרתו הגידול מודל באמצעות זחל דג זברה כמארחים. מודל זה הטרוגנית מבע מחקה את הרכב הרקמה של מיקרוסביבה סרטן הלבלב ב vivo ומשמש ככלי מדויק יותר להערכת תגובות סמים בהתאמה אישית zpdx (zebrafish החולה נגזר מודלים מבע).

Abstract

החולה-נגזר הגידול מבע (pdx) ו-cell נגזר הגידול מבע (cdx) הם שיטות חשובות להערכת טרום קלינית, תרופות הדרכה ומחקרים סרטן בסיסיים. דורות של מודלים PDX בעכברים מארחים מסורתיים הם לגזול זמן ועובד רק עבור חלק קטן של דגימות. לאחרונה, דג זברה pdx (zpdx) התפתחה כמערכת מארח ייחודי, עם המאפיינים של בקנה מידה קטן ויעילות גבוהה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה אופטימיזציה ליצירת מודל כפול בעלי התווית של זריחה כפולה להערכת כימותרפיה השוואתית בדגמי zPDX. תאים סרטניים ופיברותקיעות היו מועשר מרקמת סרטן הלבלב שנקטפו או קפוא בתנאי תרבות שונים. שתי קבוצות התא היו מסומנים על ידי וירוס המבטא ירוק או אדום חלבונים פלורסנט, כמו גם BCL2L1גן אנטי אפופטוזיס. התאים המוזרקים היו מעורבים מראש ומוזרק לתוך 2 הזחל בדגים שהיו לאחר מכן ב E3 בינוני שונה ב 32 ° c. מודלים מבע טופלו על ידי תרופות כימותרפיה ו/או BCL2L1 מעכב, ואת היכולות של תאי הגידול הן והפיברוביטים נחקרו בו זמנית. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להפיק במהירות כמות גדולה של מודלים zPDX עם מיקרוסביבה גידול הטרוגנית ומספק חלון התבוננות ארוכה יותר בכמויות מדויקות יותר בהערכת היעילות של מועמדים לסמים.

Introduction

האונקולוגיה בדיוק שואפת למצוא את האסטרטגיות הטיפוליות המועילה ביותר עבור המטופל היחיד1. כיום, מודלים רבים פרה-קליניים כגון בתרבות הראשית מחוץ לעולם, בתרבות הארגונית מחוץ לחוק2, והמטופל נגזר xenografts (pdx) בעכברים לפני או אחרי תרבות ארגונית מוצעים לאבחון ולמסך/להעריך את הפוטנציאל אפשרויות טיפוליות3. Pdx מודל שנוצר על ידי ההזרקה של התאים האנושיים הראשוניים לתוך עכברים החיסונית פרוצים, הוא אחד הכלים המבטיחים ביותר עבור הקרנת תרופות אישית באונקולוגיה קלינית3,4. שלא כמו קו התאים התרבותי בתחום החוץ, מודלים PDX בדרך כלל לשמר את היושרה ואת טרוגניות של סביבת הגידול vivo, טוב יותר לחקות את המאפיינים מגוון וייחודית של חולי גידולים שונים, ולכן, עשוי לנבא את תוצאה רפואית פוטנציאלית של חולים4. עם זאת, הדור של מודלים pdx בעכברים דורש באיכות גבוהה דגימות המטופל וחודשים של זמן לאסוף תאים מספיקים ומודלים עבור ניסויים קבוצה מרובת, ואת היצירות הסלולר/גנטי של השתל מבע להיסחף מאלה של המקורי ביופסיהשל המטופלת שיעור ההצלחה של הקמת עכברים מודל PDX הוא גם נמוך, מה שמקשה להיות מיושם באופן נרחב בפרקטיקה הקלינית. עבור המטופלים שנשאו במהירות סרטן התקדמה כמו סרטן הלבלב, הם לא יכולים לקבל מידע חשוב מניסויים PDX בזמן.

בשנים האחרונות, דג זברה דווחו להיות מארחים פוטנציאליים עבור לא רק cdx (תא נגזר הגידול xenograft) מודלים, אבל גם pdx מודלים5,6,7,8,9 , 10. כבעל חיים במודל בעלי חוליות, הנמלים בעלי דמיון מספיק עם יונקים בגנטיקה ופיזיולוגיה, עם שני יתרונות משמעותיים: שקיפות קטן בגודל11. זברפיש הוא גם מאוד פוריות, ומאות הזחלים המאוזיים יכולים להיות מתקבלים תוך כמה ימים מזוג אחד של מבוגרים12. מספר מחקרים המועסקים דג זברה כדי ליצור הן מודלים הטרנסגניים ו מבע מחלות סרטן13,14. בהשוואה לעכברים xenografts, דג זברה מאפשר מעקב ברזולוציה תא בודד. כמות מסוימת של רקמות האדם הוא מסוגל לייצר מאות דג זברה מודלים pdx (zpdxs), בעוד יכול להיות מספיק רק כדי ליצור כמה עכברים pdx מודלים15,16. חוץ מזה, הזחלים דג זברה ב 2-5 dpf כבר לפתח מערכות הדם המלא איברים מטבוליים כגון כבד וכליות, אבל לא את המערכת החיסונית17, בעוד שק החלמון הנותרים הוא בינונית 3d טבעי, אידיאלי עבור הקרנת סמים, סמים בדיקות התנגדות ותצפיות הגירה לגידול6,18,19,20,21.

עם ניסיון אולטימטיבי להשתמש zPDX כפלטפורמת הקרנה/בדיקה לשימוש קליני, כאן, אנו מתארים הצעה ממוטבת עבור מודל zPDX של סרטן הלבלב, אשר מאפשר את הערכת הסמים vivo המועמד תוך זמן קצר באמצעות פחות תאים בעלויות נמוכות. לעומת ההפניות הקודמות על zpdx6,9,10, הצגנו מספר אופטימיזציות כדי להפוך את המערכת יותר ריאלי ואמין עבור אבחון מותאם אישית קליני: 1) טרום מיון תא אחר קבוצות ברקמות הגידול הראשיות וייצוב תאים ראשוניים לשבוע אחד לפני ניסויים נוספים; 2) מתייג את התאים האנושיים ומשפר את הכדאיות התאית ב-מבע באמצעות שינוי גנטי מבוסס-וירוס; 3) מיטוב מצבם של תרבות הדגים בתוספי התזונה (גלוקוז ו גלוטמין) ובטמפרטורה; 4) מכמת את תגובות הסמים של סוגי תאים שונים באופן השוואתי. כמו כן עשינו שינויים בפתרון ההזרקה על ידי הוספת מספר חומרים משלימים. בסך הכל, שיפורים אלה מספקים את האפשרות לייצר במהירות יותר מטופל כמו מבע במארחים דג זברה שיכול לשמש ככלי אמין כדי להעריך את התגובה של תרופות המועמדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בעלי חיים אושרו ובעקבות ההנחיות של ועדת האתיקה בעלי חיים באוניברסיטת Fudan וכל הדגימות סרטן הלבלב התקבלו מאוניברסיטת Fudan שנגחאי מרכז הסרטן. אישור אתי התקבל מוועדת האתיקה של FUSCC, והסכמה מושכלת בכתב הושגה מכל מטופל.

1. הכנת ציוד להזרקות

  1. . מכין את לוחית ההזרקה
    1. הכנת פתרון 50 mL של 1% העלה התפרקה בפתרון E3 (0.6 g/L אקווריום מלח במים מזוקקים כפולים + 0.01 mg/L מתילן blue). מרתיחים את הפתרון עד הצמח מתמוסס.
    2. יוצקים 50 מ ל של הפתרון agarose לתוך צלחת 10 ס מ פטרי ולאחר מכן למקם את כתבנית העובר על פני המים דג זברה על פני השטח. להסיר את העובש כאשר הפתרון צמח הופך מתחזק.
    3. הוסיפו 20 מ ל של הפתרון E3 לצלחת ההזרקה ושמרו אותו ב -4 ° c לאחסון לטווח ארוך.
  2. . מכין את מחטי ההזרקה
    1. למשוך 10 ס מ זכוכית נימי עם ממד פנימי של 0.9 מ"מ לתוך שתי מחטים על פולר מחט.
    2. מלקחיים להשתמש כדי לחתוך את הקצה של המחט כדי ליצור פתח מתחת למיקרוסקופ.

2. הכנת עוברים להשתלה

  1. מניחים 1 עד 2 זוגות של מבוגרים בתוך מיכל ההזדווגות ב 7-9 ולאסוף את הביצים מופרות בסביבות 8 בבוקר למחרת.
  2. העבירו את הביציות המוופרות ממיכל ההזדווגות לצלחת פטרי המכילה 40 mL של פתרון חדש E3 ו-דגירה ב 28.5 ° c.
  3. לאחר 8 h של דגירה ב-E3 פתרון, להוסיף 0.03% 1-פניקסיל-2-thiourea (PTU) לתוך E3 פתרון לעכב פיגמנטציה. דגירה העוברים בפתרון E3 עם 0.03% PTU ב 28.5 ° צ' עד 48 hpf. ניתן להשמיט שלב זה אם נעשה שימוש ב-מוטציה של קספר.

3. בידוד ותרבות של תאים אנושיים הראשי מפני כירורגי סרטן הלבלב דגימה או רקמות קפואות

  1. להשיג דגימות של רקמת סרטן הלבלב האנושי בגודל סביב 1 ס מ3 במהלך ניתוח בבטן, ומיד להעביר את הרקמה לתוך מדיה הצמיחה (DMEM זיכרון עם 10% סרום העוברי (fbs), 10 Μm Y-27632, 100 μg/ml primocin, 10 μg/ml ריקבון דיהידרוטסטוסטרון, 10 מילימטר ניקטיאמיד ו 1% פניצילין סטרפטומיצין).
  2. להעביר את דגימת סרטן הלבלב לתוך צלחת פטרי ולהסיר את רקמת נמק שמסביב, רקמת השומן ורקמת החיבור.
  3. לשטוף את רקמת הסרטן עבור 5-6 פעמים עם מאגר פוספט (PBS) וחותכים את הרקמה 1 מ"מ3 חתיכות באמצעות אזמלים.
  4. העברת רקמות מגורדות לתוך 5 מ ל של HBSS בצינור 50 mL ולהוסיף קולגן סוג IV, hyaluronidase ו DNase I בריכוזים הסופי של 200 יחידות/mL, 100 mg/L ו 20 מ"ג/L, בהתאמה. מערבבים את התערובת למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.
  5. מודקון את התערובת ב 37 ° c בחממה 5% פחמן דו חמצני עבור 15-20 דקות. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כמה פעמים כל 5 דקות.
  6. הוסף 7 מ ל של DMEM לצינור ולצנטריפוגה ב 110 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' כאשר העיכול יושלם.
  7. Decant הסופר ולהשעות מחדש את תערובת הגידול ב-DMEM.
  8. צלחת התערובת לתוך צלחת פטרי בגודל 6 ס"מ ב 3 מ ל של מדיית גדילה מלאה (dmem עם 10% FBS, 20 μg/mL אינסולין, 100 ng/mL bFGF, 10 ng/mL EGF, 10 μM Y-27632, 100 μg/mL מprimocin, 10 μg/מ"ל ריקבון דיהידרוטסטוסטרון, 10 מילימטר ניטינאמיד , 1% פניצילין סטרפטומיצין). הפרד בין התאים לשתי קבוצות.
  9. בקבוצה אני, להוסיף 100x מעכב של סרטן הלבלב פיברותקיעות לתוך המדיום לאחר 48 h כדי להסיר את הפיברוכדורים מגודלים, לעזוב את התאים הסרטניים כמו הסוגים העיקריים של תאים;. בקבוצה II, הפיברופיצוצים יהיה לעבור את התאים הסרטניים בתוך שבוע.
  10. תרבות הן קבוצות תאים עבור שבוע 1-2 בהתאם לצפיפות התא/purities ולשנות את המדיה כל שלושה ימים. סוגי התא הצפויים בשתי הקבוצות I & II יכולים לכבוש מעל 98% בפרופורציה בניסוי מוצלח שף.

4. מתייג את התאים עם וירוס ביטוי אנטי ואפופטוזיס BCL2L1 (BCL-XL) ו חלבונים פלורסנט שונים בנפרד

  1. הפקת וירוס
    1. צלחת 3 x 106 Hek 293t תאים עם מדיום dmem מלאה (dmem שסופקו עם 10% fbs) ב 10 ס מ מנות ותרבות הלילה ב 37 ° c בחממה 5% פחמן דו חמצני. החליפו את המדיום עם 6 מ ל של מדיה נטולת סרום לפני החצייה.
    2. הכנת פתרון: 8 μg של BCL2L1המכיל וקטורים מכילים ויראליות (Pcdh-EF1α-MKATE2-E2A-BCL2L1-wpre או Pcdh-EF1α-egfp-E2A-BCL2L1-wpre), 2.4 Μg של pvsvg, 4 Μg pmdl (מחסום/פול), 1.6 ΜG של Dמ1 הקודם ו-סרום חינם בנפח כולל של 500 μl. בעדינות pipet התערובת מספר פעמים, ולמקם אותו בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
    3. הכנת פתרון B: 40 μL של פיי (פוליאתילן) ב 460 μL סרום-ללא זיכרון. מניחים אותו בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
    4. לאט להוסיף פתרון B לתוך פתרון A ולהשאיר את הצינור בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
    5. הוסף את התערובת הסופית לתוך הצלחת תרבות התאים HEK 293T הכין בשלב 4.1.1 ו דגירה ב 37 ° c בחממה 5% פחמן דו חמצני. לאחר 12 שעות, הוסיפו עוד 5 מ ל של המדיום המלא של DMEM. לאחר 48 h, לקצור את המדיום המכיל את הנגיף.
    6. לסנן את supernatant באמצעות מסנן סטרילי 0.45 יקרומטר, להוסיף את supernatant לתוך עמודת ריכוז, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 25-30 דקות ב 4 ° c. את הנגיף הליווירוס של 100 μL לכל צינור נעשים ומאוחסנים ב-80 ° c.
  2. זיהום של התאים העיקריים
    1. זרע את התאים (קבוצה אני & II) להידבק בצלחת 12-היטב עם 30-40% צפיפות ותרבות התאים לילה ב 37 ° c בחממה 5% פחמן דו חמצני.
    2. החלף את המדיום עם 500 μL של מדיום ללא סרום המכיל 8 μg/mL של polybrene עבור 4 h. לאחר מכן, להוסיף 100 μL נוסף של הווירוס לתוך המדיום (eGFP-E2A-BCL2L1 עבור קבוצה I או mKate2-E2A-BCL2L1 עבור קבוצה II). לאחר 12 h, להחליף את המדיום עם 1 מ ל של בינוני שלם.
    3. בדוק את סמני הקרינה הפלואורסצנטית אחרי 48 h.
    4. לקצור את התאים הנגועים ולערבב אותם ביחס 1:1 עם ריכוז סופי של 106/Ml.
    5. צנטריפוגה את התאים ב 110 x g עבור 5 דקות ו-להשעות מחדש את התערובת התא 50 μl של פתרון הזרקה (1640 בינונית עם 10% fbs, 0.05% חומצה היאלורונית נתרן מלח, 0.05% מתילתאית).

5. הזרקת מתלה תאים מעורבים לתוך דגי הזברה

  1. הוסף פתרון של 10x tricaine לתוך E3 מים כדי לכפיש את הזחלים דג זברה ולהעביר את הזחלים (משלב 2.3) לצלחת הזריקה מילא על ידי e3 שונה (e3 עם 1 g/L גלוקוז ו 5 מ מול/l ל-גלוטמין).
  2. מילוי 25 μL של השעיית תא מעורב לתוך מחט נימי מיקרו ולהכניס את המחט לתוך מניפולטור מיקרו הזרקה.
  3. . הגדר לחץ וזמן להזרקה הכנס 50-80 תאים (~ 8 nL) לתוך שק החלמון של 48 hpf zebrafish.

6. תרבות של דגי מדבר בדג (zPDX מודל)

  1. העבר את הזחלים הפוסט-מושתלים של הרימות לתוך 40 mL של פתרון ערבול (E3 פתרון עם 1 g/L גלוקוז ו 5 ממול/L ל-גלוטמין) ב 32 ° c.

7. מינהל התרופות בנושא דגי האקווריום והערכת תאים סרטניים

  1. קביעת הריכוז האופטימלי של גיציבטין/navitoclax.
    1. מקום 10 מסוג wildzefish עוברים ב 48 hpf לתוך כל טוב של הצלחת 12-היטב.
    2. הוסף ריכוזים שונים של gemcitabine או navitoclax בכל היטב הדגירה ב 32 ° c עבור יומיים.
    3. לאחר יומיים, לחשב את מינון הסובלנות המקסימלית (mtd) של gemcitabine ו navitoclax שבו הזחלים דג זברה לא הראו מומים משמעותיים התנהגות חריגה, ואת ריכוזי העבודה מוגדרים מתחת mtd.
  2. טיפול של מודלים zPDX עם gemcitabine/navitoclax.
    1. מניחים 10 הזחלים המושתלים. בכל באר של 12 מיטב הצלחות
    2. לחלק את הזחלים לארבע קבוצות, לטפל בקבוצת הביקורת ב E3 המכיל 0.1% DMSO, ולטפל בקבוצות אחרות עם 5 μg/mL gemcitabine ו/או 50 μM navitoclax, ו דגירה ב 32 ° c עבור יומיים.
  3. הערכה של כישורי התא והרכב הסלולר בדגמי zPDX.
    1. שלאחר הטיפול ומניחים אותם. ב -3% מתילצלולוזה
    2. התמונה הזחלים מהנוף לרוחב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית או מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.
    3. מכמת את עוצמת אותות הזריחה האדומה והירוקה באמצעות התוכנה ImageJ ו-גראפד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חלוקה לרמות של השגרה מיוצגת באיור 1. בקיצור, התאים העיקריים רקמת סרטן שופרה לתוך המדיום המלא לאחר העיכול עם או בלי תוספת של סרטן הלבלב מעכבי פיברוהפיצוץ. תאים סרטניים ופיברותקיעות היו מועשר כמו שתי אוכלוסיות נפרדות כי שולט שולט ללא מעכבי, ואת הצמיחה תאים סרטניים שעבר לאחר הוספת מעכבי (איור 2). שני וקטורי אריזה מסוגים שנבנו, אשר הביעו חלבונים בצבע ירוק או אדום ו BCL2L1 כמוצג באיור 3. תיוג פלורסנט מבוסס וירוס גם ייצג את מצב ההישרדות של התאים. תאים סרטניים מעורבים ופיברופיצוצים הוזרקו לתוך שק חלמון דג זברה ב 48 hpf וטופלו על ידי gemcitabine ו/או navitoclax במשך יומיים. הviabilities תא באוכלוסיות שונות הרכב הסלולר של מבע שונו כתגובות לטיפול בסמים (איור 4).

Figure 1
איור 1: תרשים סכמטי של הערכה והערכת תרופות של המודל הזינושתל של הדגים נגזר מסרטן הלבלב. רקמות הוסרו בניתוח מחולים עם סרטן הלבלב מתעכלים ומתעכל, ואחריו תרבות בשני תנאים שונים, אחד מהם מתווסף על ידי מעכב פיברובלסט, והקבוצה האחרת היא לא. לאחר 1-2 שבועות, התאים העיקריים שונו גנטית כדי לבטא חלבון אנטי אפוטוטיק BCL2L1 וחלבונים פלורסנט שונים. לאחר מכן, שתי האוכלוסיות היו מעורבים ושיתוף מוזרק לתוך 48 hpf דג זברה הזחלים כדי להעריך את ההשפעות של תרופות כימותרפיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תרבות והעשרה של תאים סרטניים בלבלב ופיברופיצוצים. תמונות של תאים סרטניים ופיברופיצוצים מועשר שלושה חולים שונים בסרטן הלבלב לאחר תרבות 10 ימים. סרגל בקנה מידה, 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: המבנה של המבטא וקטור לויראלי BCL2L1 וחלבונים פלורסנט שונים. תרשים סכמטי של שני וקטורים לנטינגיים מבטאים כל הזמן mKate2-E2A-BCL2L1 או eGFP-E2A-BCL2L1, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אפקטים על מבע על ידי gemcitabine. (א) מבט לרוחב של השתלת מבע שק החלמון של הזחלים דג זברה ב 3 h פוסט השתלת (hpt). (ב) דמויות מייצגות של הרימות של הזחלים בזייבפיש ב-60 hpt, שטופלו על ידי dmso או gemcitabine. (ג) נציג 3d של הרינדור של xenografts ב 60 hpt. (ד) סטטיסטיקה של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של מבע לפני ואחרי gemcitabine ו/או BCL2L1 מעכב טיפול. N = 10 לכל קבוצה עבור כל שיטת המשך. סרגל קנה מידה = 100 μm; NS, לא משמעותי; *P < 0.05; P < 0.0001; אומר ± SD, עם הבדלים סטטיסטיים הנקבעים על-ידי ANOVA בכיוון אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הן PDX ו-CDX מודלים הם פלטפורמות חיוניות בתחום של ביולוגיה של הגידול22, ואת הצעד הקריטי של השתלת בין זנים מוצלחת היא לשפר את ההישרדות של xenograft.  לאחרונה, מחקרים מסוימים הראו כי ביטוי חולף של BCL2L1 (BCL-XL) או BCL2 עשוי לשפר באופן משמעותי את הכדאיות של תאים גזע האדם מתחלקים במחשבים מארחים מבלי להשפיע על זהויות התאים וגורלם23 , בת 24 , 25. בכתב היד שלנו, אנו לתייג את התאים עם הנגיף כל הזמן לבטא anti-אפופטוזיס גן BCL2L1 (BCL-XL), כמו גם חלבונים פלורסנט. המבוא של BCL2L1 מאוד השתפר את זמן ההישרדות של תאים אנושיים של xהשתל ב-דג זברה כדי להאריך את חלון התצפית למחקרים, בעוד אותות פלורסנט לא רק תווית את התאים, אלא גם לדווח על מצב החיים של ה תאים, כפי שגילינו כי הזריחה דוהה במהירות עם מוות התאים.  בינתיים, אנחנו כרגע משנה את דג דג זברה מארח טוב יותר לשתלים אנושיים. מצד אחד, rag2 ו prkdc הם להיות הפיל דרך crispr/Cas9 הטכנולוגיה כדי להכין החיסונית משולב החיסון לקויה, אשר היה דומה בשילוב עכברים לקוי החיסון, כדי להפוך את הזחלים דג זברה בוגרים תואם גם עם תאים אנושיים ורקמות26. מצד שני, הדגים שונו גם כדי לבטא חלבונים אנושיים כגון IGF1 ו-INS כדי לתמוך טוב יותר את ההישרדות והתפשטות של תאים אנושיים מושתל באמצעות הטכנולוגיה Tol2 טרנספסון-תיווך הטרנסגניים. יתר על כן, zPDX חסרה גם מערכת החיסון דמויי אדם כמו, ואת האינטראקציות בין תאים סטרומה האדם ואת המערכת החיסונית, ובעתיד, אנחנו עשויים לנסות להזריק שותף לתאי החיסון האנושיים כדי לבנות מחדש את סביבת החיסון לטווח קצר הומניזציה ב-zebrafish.

בתוך העכברים pdx מודלים, התנאים מבע היו מנוטרים באופן מסורתי על ידי התבוננות ישירה על צמתים של גודל גלוי, אשר דורשים זמן רב להתפתח. במודלים zpdx שקופים כהשוואה, ניתן לחקור את מבע תחת מיקרוסקופ בזמן אמת. עם זאת, היה קשה להעריך את מספר האלאומות התאים באוכלוסיה בעלת צבע יחיד ללא שליטה מתאימה, והרעיון להציג שני אוכלוסיית תאים בעלי זריחה שונה משפרת באופן משמעותי את כימות הכדאיות בתאים. על ידי ערבוב והזרקת תאים שונים ביחס קבוע, אנחנו לא רק לחקות את מיקרוסביבה הגידול, אלא גם מסוגלים במדויק לכמת את תגובת התרופה על ידי השוואת שתי קבוצות התא. למרות היחס המקורי של תאים סרטניים לפיברותקיעות ברקמות הראשיות הוא שונה מאוד, כאן התחלנו עם 1:1 יחס, ואת ההשפעות של טיפול תרופתי על אותו הרכב התא של יחס אחר יהיה נחקר בעתיד. חוץ מזה, ההשפעות של 32 ° c במקום 37 ° צ' incubations על התנהגויות של תאים אנושיים גם דורשים מחקרים השוואתיים מפורט. לבסוף, את האסטרטגיה של החולה-נגזר הטרוגנית מודל מבע לסרטן הלבלב עבור הערכת סמים השוואתי יכול להיות גם להחיל על סוגים אחרים של סרטן מוצק. גישה זו שימושית במיוחד עבור pdx באמצעות הזחלים דג זברה כמו מארחים, אשר הם ברורים ביותר וריאלי לניתוח ברזולוציה תא בודד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא נחשפו קונפליקטים פוטנציאליים של עניין.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין 81402582, הקרן המדע הטבעי של שנגחאי 12DZ2295100, 14YF1400600 ו 18ZR1404500

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO C11995500BT
FBS Hyclone sv30087.03
Y-27632 Cliniscience Y0503 Rho kinase inhibitor
Primocin invivogen ant-pm-1 an antibiotic for primary cell cultures
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Nicotinamide Sigma N3376
Penicillin streptomycin GIBCO 15140122.00
Phosphate buffer (PBS) GIBCO C10010500CP
HBSS GIBCO 14170112.00
Collagenase type IV GIBCO 17104019.00
Hyaluronidase Sigma H3884
Dnase I Sigma D5025
Insulin Sigma I9278
b-FGF GIBCO PHG0264
EGF GIBCO PHG0314
Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor CHI Scientific FibrOUT
0.45 μm sterile filter Millipore SLHV033RB
Concentration column Millipore Millipore UFC910008 Concentrate the virus
Polybrene Sigma H9268
Hyaluronic Acid Sodium Salt Sigma H7630
L-glutamine GIBCO 21051024.00
Gemcitabine Gemzan
Methylcellulose Sigma M0262
Navitoclax(ABT-263) Selleck S1001 Bcl-xL inhibitor
Equipment
Microinjector NARISHIGE
Stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Confocal Microscope LEICA SP8 0.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
  2. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  3. Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  4. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
  5. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
  6. Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
  7. Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
  8. Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
  9. Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
  10. Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
  11. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  12. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  13. Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
  14. Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).
  15. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
  16. Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
  17. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
  18. Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
  19. Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
  20. Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
  21. Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
  22. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
  23. Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).
  24. Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
  25. Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
  26. Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 146 מחקר הסרטן xenograft הגידול zebrafish קרצינומה של הלבלב בהערכת הסמים vivo BCL2L1
מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Chen, H., Fei, F., He, X., … More

Wang, L., Chen, H., Fei, F., He, X., Sun, S., Lv, K., Yu, B., Long, J., Wang, X. Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment. J. Vis. Exp. (146), e59507, doi:10.3791/59507 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter