Summary
여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.
Abstract
아닌, 캘리포니아 (C.엘 레 강 스)는 전체 신 경계의 세포 기원을 이해 하는 도전이 생체 내에서 단일 세포 분해능과 함께 관찰 될 수 있는 유일한 유기 체로 서 두드러집니다. 여기서 우리는 c. 엘 레 강 스 배아에서 신경 발달 검사를 위한 통합 프로토콜을 제시 합니다. 우리의 프로토콜은 개발 배아에서 단일 세포의 이미징, 선 노화 및 신경 해부학 적 추적을 결합 합니다. 살아있는 C. 이중 보기 반전 선택적인 평면 조명 현미경 검사 법 (diSPIM)을 사용 하 여 거의 등방성 공간 해상도를 가진 엘 레 건스 배아의 장기, 4 차원 (4d) 이미지를 얻습니다. 선 충 배아의 핵 및 뉴런 구조는 3 차원 모두에서 ~ 330 nm의 분해능으로 이미지를 산출 하 고이에이 트로피 칼 융합을 이미지화 한다. 이 분 별 고 분해능 4D 데이터 세트는 단일 셀 및 하위 셀룰러 수준의 세부 수준에서 유전자 발현 및 형태학 적 역학과 함께 확실 한 세포 계보 정체성을 연관 시키기 위해 분석 됩니다. 당사의 프로토콜은 설명 된 각 단계의 모듈식 구현을 가능 하 게 하 고 배아 발생, 유전자 발현 또는 신경 발달에 대 한 연구를 강화 하도록 구성 되어 있습니다.
Introduction
C. 엘 레 강 스는 배아의 모든 세포가 신경 발달을 통해 관찰 될 수 있는 유일한 유기 체로 서 두드러집니다. 전체 세포-계보 알려진 불변1, 그리고 배아에서 단일 세포의 라벨링 및 연속 이미징을 허용 하는 새로운 도구의 개발과 함께, 생물학자는 이제 신경 세포의 개발에 다른 단계를 검토 시작할 수 있습니다 긴장 모든 각도에서 시스템-세포 출생; 이주 및 분화; 신경 돌기 형성, 표적으로 한 성장 및 근 막; 시 냅 스 형성; 및 기능 회로의 튜닝. 안정적으로 발현 된 기자와 형광 현미경을 결합 하 여 c. 엘 레 강 스 배아에서 뉴런의 성장 역학을 포착 하는 것은 과학적 공동체에 게 가치가 있습니다.
C. 엘 레 강 스에서의 발달 연구는 무 손상 유기 체1내의 단일 세포 수준에서 문맥 이해를 증강 하기 위하여 수시로이 종의 불변 세포-혈통 그리고 세포 운명 지도를 활용 합니다. 자동 라인 에이징 분석-starrynite2,3,4 및 아 세 리5,6,7,8 소프트웨어 사용-고대비, 고해상도의 이점 형광 핵의 이미지. 최적으로 작동 하려면, 스타 린 트/아 세토 또한 개발 중에 이미지 배아의 예측 가능한 제한 방향에 따라 달라 집니다. 두 커버 슬립 사이에 압축 된 c. 엘 레 강 트 배아에서 수행 된 공초점 현미경 검사 법은 고 콘트라스트/고 분해능과 예측 가능한 제약을 모두 제공 하기 때문에 10 년 이상 표준 자동 라인 에이징 현미경 법입니다. 배아의 방향7,8. 우리는 이전에 신규 한 광 시트 기반의 이중 보기 거꾸로 선택적 평면 조명 현미경 (dispim)의 건설 및 사용을 설명 하는 등의 라이브 샘플 이미징 c. 엘 더 니스 배아 발생 발생9,10 , 11 , 12 , 13. 가벼운 시트 현미경은 일반적으로 라이브 3d 표본14,15의 낮은 광 독성, 고속 및 장기 이미징 기능을 제공 합니다. DiSPIM 방법은 특히 거의 등방성 공간 해상도가 약 330 nm9의 4 차원 (4d) 이미지를 생성 합니다.
DiSPIM은 공초점 현미경과 비교 하 여 더 높은 신호 대 잡음비와 속도, 등방성 공간 분해능을 제공 하며 장기 생체 이미징16에 더 적합 합니다. 따라서 우리는 StarryNite/아 세이 어에 입력을 위한 diSPIM 데이터를 조정 하 고 이것이 선 에이징 분석을 향상 시킬 수 있는지 여부를 조사 했습니다. 주요 장애물은 diSPIM 표본이 StarryNite/비구에 대 한 예상 방향을 채택 하기 위해 계란-압축에 의해 쉽게 구속 될 수 없다는 것입니다. 분석 중인 볼륨에서 셀 위치의 임의 방향은 자동 라인 에이징 분석의 정확도를 저하 시킵니다.
따라서 사용자가 diSPIM 이미지의 전처리 중에 배아의 정확한 3D 방향을 선택할 수 있는 뷰어 안내 사용자 인터페이스인 사이토 쇼를 채택 하 여 품질에 최적화 된 이미지 데이터를 산출 하 고 StarryNite에 입력을 위한 상황 인식 /비구. 이미지 배아의 사용자 선택에 따라, 사이토 쇼는 자동화 된 데이터 처리 파이프라인을 조율 합니다. 자른 및 배경 뺀 배아 이미지는 각 위치, 타임 포인트 및 보기에 대 한 TIFF 스택 파일 내에 저장 됩니다. 그런 다음, 사이토 쇼는 프로그램 spimfusion을 반복적으로 호출 하 여, 리차드 슨-루시17,18 알고리즘을 사용 하 여 등방성 고해상도 체적 이미지를 산출 하는 두 개의 사전 처리 된 뷰를 공동 등록 하 고 공동으로 해체 합니다. DiSPIM 특정 매개 변수 집합은 이미지 세분화 및이에이 트로피 칼 융합 이미지의 핵 추적 중에 동작을 제어 하기 위해 StarryNite에 최적화 되었습니다. 융합 된 이미지와 lineaging 결과는 사용자가 StarryNite에 의해 생성 된 자동 계보 추적의 오류를 식별 하 고 수정할 수 있는 아 세 트리를 사용 하 여 편집 됩니다. 아 세토 트리는 또한 배아에서 추적 된 핵의 계보 트리와 3D 모델링 렌더링을 제시할 수 있습니다. 우리는 자동 라인 에이징 속도와 정확도가 모두 SPIM 카메라의 raw 이미지와 비교할 때이 트로피 칼 융합 이미지를 사용 하 여 현저 하 게 향상 된 것을 발견 합니다. 여기에 설명 된 c. 엘 더 스 응용 프로그램에 최적화 된 우리의 프로토콜은 일반적으로 다른 종이나 표본에 대해 생성 된 diSPIM 데이터의 자동 라인 에이징에 적합 할 수 있습니다. 이 프로토콜이 의도 된 용도로 사용 되는 경우에는3,4와 같이 새 표본에 starrynite 매개 변수의 추가 조정이 필요할 수 있음을 유의 하십시오.
이 프로토콜의 성공적인 구현은 4D 등방성 해상도로 이미지를 구현 하 고 생물학자가 세포 라인을 추적 할 수 있게 하는 동시에 개발 C. 엘 레 강 스 배아에서 뉴런을 식별 하 고 분석 합니다. 또한, 몇 가지 후 처리 알고리즘을 병합 하 여 하드웨어 가속이 가장 많은 시간을 소비 하는-우리는 이제 본질적으로 실시간으로 미세 세포의 세부 사항과 살아있는 배아 세포의 운명 모두를 분석 할 수 있습니다. 이 새로운 프로토콜은 생체 내에서 분화 및 형태 형성을 연구 하는 동안 세포 거동을 정확 하 고 정보에 입각 한 조작 및 관찰을 가능 하 게 합니다. 이 원고에서 우리는 선 노화 및 세포 추적을 위해 개발 된 개선 된 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제시 합니다 c. 엘 레 강 스 배아를 개발, 배아 발생의 연구를 향상 시키기 위해, 유전자 발현 또는 신경 개발.
Protocol
1. diSPIM 스틸 이미징 챔버를 폴 리-L-라이 신 코팅 커버 슬립으로 조립
참고: 아래 단계는 모두 StarryNite/아 세토에의 한 네 마 충 배아의 연계 분석을 최적화 하 고 자동화 하는 데 필요 합니다. 여러 옵션 (이와 같이 표시 됨)은 C. 엘 더 스 세포의 추적을 필요로 하는 실험을 위해 생략 될 수 있다.
- 샤 프 파이 (또는 이와 유사한 펜)를 사용 하 여 깨끗 한 직사각형 커버 슬립 (1.5, 24mm×50 mm)의 중앙에 작은 직사각형 (2mm x 5mm)을 그립니다.
- 커버 슬립을 뒤집어 놓고 잠복 한 쪽으로 10 μ l의 폴 리 신 (고양이. P1524) 표시 된 사각형 위에 있습니다.
참고: 여과 된 물에 녹여 1 mg/mL 폴 리-L-라이 신의 작동 농도를 확인 하십시오 (또는이에 상응 하는). 장기 보관 시에는 5 ~ 10 mL의 알리 쿠오를 준비 하 고-20°c에 보관 하십시오. 해 동 한 후에는 3 ~ 4 주 동안 상 온 (23°c)에서 알 취 액을 보관할 수 있습니다. - 폴 리-L-라이 신이 커버 슬립을 5 분 동안 코팅 할 수 있도록 한다 (도 1a). 폴 리-L-라이 신은 배아가 장착 되는 유리 커버 전표를 코팅 하는 데 사용 되며, 목적을 이미징 매체에 침 지 하는 경우에도 배아 달걀 껍질이 커버 슬립에 단단히 고정 될 수 있도록 합니다.
- 폴 리-L-라이 신 코팅 커버 슬립을 스틸 이미징 챔버의 하단 절반에 놓습니다.
- 커버 슬립으로 강철 이미징 챔버의 상단 절반을 아래쪽 절반에 놓고 챔버와 연결 된 4 개의 나사로 조입니다. 측면에서 육안으로 확인 하 여 상단 반이 아래쪽 절반에 고르게 장착 되도록 합니다 (그림 1b).
- 초기 단계의 배아를 비정상적인 삼 투 압으로 굴복 예방 하는 데 도움이 되는 등 장성 완충 액 인 7 ~ 8 mL의 M9 버퍼19로 챔버를 채웁니다. 1-세포, 심지어 2 세포 배아는 삼 투 적 민감하고이 등장 완충 액에 있지 않다면 비정상적으로 발전할 수 있다. 또한 M9이 물로 치환 된 경우 배아는 3 배 단계에서 정지 하는 경향이 있습니다.
2. 준비 c. 엘 더 스 배아 설치를 위한 샘플
참고: 이미징 하기 약 18 시간 전, 5 명의 영 (최종 탈피 이후 1 일) 성인과 10 명의 라 발의 스테이지 4 (L4) c. 엘 레 강 스는 대장균 균 주 OP50로 시 딩 된 한 천 판으로 선별 됩니다 . 백 금 철사 후비는 동물을 해치지 않고 애벌레와 청년 성인 c. 엘 더를 이동 하는 데 사용 됩니다19.
- 1% 메 틸 셀 룰로 오 스를 제조 한다 (고양이. H7509) M9 버퍼에 있는 용액.
참고: 메 틸 셀 룰로 오 스는 용 해 될 때까지 따뜻한 M9에서 교 반 해야 합니다. 일단 준비 되 면,이 용액은 실 온에서 보관할 수 있다. - 오목 현미경 슬라이드의 우울증에 1% 메 틸 셀 룰로 오 스 인 M9 용액 500 µ L을 추가 합니다. 이 점성 완충 제는 2 가지 경우에 사용 됩니다: 1) 말기 배아를 NGM 플레이트에서 직접 고른 세척 할 때 성인 웜 및 2의 해 부에 의해 초기 배아를 수확 할 때.
참고: 메 틸 셀 룰로 오 스는 배아가 현미경 슬라이드에 들러붙는 것을 막기 위해 사용 됩니다. - 후반 단계 배아를 이미징 하는 경우에는 속눈썹을 선택 하 고, 배아를 1% 메 틸 셀 룰로 오 스를 오목 현미경 슬라이드에 이동 시켜 서 (바람직하게는 젊은 성인과 함께 NGM 플레이트에서 존재 하는), 선택 된 다이 요 로 배아를 선정 한다. 속눈썹 선택은 힘을 감소 시키고 따라서 취급 도중 배아에 대 한 스트레스 또는 손상을 최소화 하는 데 도움이 됩니다. 속눈썹을 선택 하는 절차는 Hart에 의해 덮여 있다20.
- 두 번째 속눈썹 선택으로 (반대 손에), 메 틸 셀 룰로 오 스에 배아를 일시 중단 하는 두 속눈썹을 함께 부드럽게 누릅니다.
- 선택 사항: StarryNite와 계보 배아 세포를 계획 하는 경우, 하나는 4 세포 배아에 1 세포를 탑재 해야 합니다. 이렇게 하려면 먼저 NGM 플레이트에서 젊은 성인을 선택 하 고 백 금 와이어 선택을 사용 하 여 오목한 현미경 슬라이드에 있는 M9 메 틸 셀 룰로 오 스 용액으로 옮깁니다.
- 선택 사항: 피하 주사 바늘 (no. 18G x 1 ½)의 날카로운 팁을 사용 하 여 중간 몸체에 있는 동물을 슬라이스 하 여 1 세포를 4 세포 배아에 방출 하십시오.
3. 입 피 펫: 미세 모 세관 피 펫으로 흡 기 튜브를 조립
참고: 우리는 튜브의 고무 가스 켓에 삽입 된 손으로 뽑아 마이크로 모 세관 파이 펫과 함께 흡 기 튜브를 사용 합니다. 이것은 우리가 버퍼 채워진 영상 챔버에 있는 폴 리-L-라이 신 코팅 표면에 해 부 슬라이드에서 배아를 전달 하는 것을 허용 한다.
- 열린 불꽃 위에 미세 모 세관 파이 펫을 수동으로 당겨 뻗어 있는 팁으로 두 반쪽을 만듭니다.
- 미세 모 세관 파이 펫의 1/2을 취하고 흡 인기 튜브의 고무 개스킷에 무딘 단 부를 삽입 합니다 (그림 1c). 나중에 사용 하기 위해 미세 모 세관 파이 펫의 나머지 절반을 따로 설정 하십시오 (필요한 경우).
- 미세 모 세관 파이 펫이 장착 된 조립 된 흡 기 튜브를 사용 하 여 미세 모 세관 팁을 부드럽게 분리 하 고 약 1 ~ 2 개의 배아를 넣을 수 있는 개 구를 만듭니다 (여기에서이 계측기는 "입 파이 펫" 이라고 함).
4. 폴 리 신 코팅 커버 슬립에 c. 엘 더 란 트 배아를 장착
- 흡 인기의 마우스 피스를 치아 사이에 부드럽게 고정 한 채 미세 모 세관에 10 ~ 15 µ L의 M9 완충 액을 미리 채우고 오목 슬라이드에서 모 세관으로 여러 배아를 부드럽게 빨 아 줍니다.
- 배아를 M9 버퍼로 채워진 스틸 이미징 챔버로 전달 하 고 모 세관 팁의 위치를 조정 하 여 배아가 커버 슬립의 중앙 직사각형에 들어갈 수 있도록 합니다.
- 배아에 대 한 부상을 방지 하 고, 속눈썹을 선택 하거나 구강 피 펫을 사용 하 여 배아를 수직으로 위치 시키거나, 배아의 긴 축이 커버 슬립의 장 축에 수직이 되도록 배아를 방향으로 이동 시킵니다 (도 1b 삽입 하단 패널).
참고: 배아를이 방향으로 배치 하면 이미지의 슬라이스 수가 최소화 되어 광 량 및 데이터 처리 시간이 줄어들어 획득 속도가 향상 됩니다. - 현미경 스테이지의 샘플 홀더에 스틸 이미징 챔버를 놓습니다 (그림 1d).
5. diSPIM을 사용 하 여 배아 이미징에 대 한 조립, 소프트웨어 설정 및 레이저 최적화
- 쿠마 르 외10,11 및 http://www.dispim.org에서 상업적으로 이용 가능한 부품에서 전체 섬유 결합 dispim을 조립 하는 방법에 대 한 단계별 지침을 참조 하십시오. DiSPIM을 조립 하는 방법의 비디오 프로토콜은 또한 ASI 웹 사이트 (http://www.asiimaging.com)에서 사용할 수 있습니다.
참고:이 프로토콜에 대 한 기기 설치는 이미징 용 40x 0.8 NA 물 침수 렌즈를 사용 하는 쿠마 르 외10,11 dispim과 동일 합니다. 이 프로토콜의 설정과 쿠마 르 외10,11 의 유일한 차이점은이 색 거울 (560 nm에서 분할) 및 적색 및 녹색의 영상 분할 장치 내부 필터 (모델 A12801)에 설치 된 모두 diSPIM 이미징 암. 이미지 분할 광학 장치를 추가 하면 두 개의 뚜렷한 형광 색 단 (561 nm 및 488 nm 레이저)에서 이미지를 동시에 캡처할 수 있으므로 방출 밴드를 동일한 카메라 칩의 두 반쪽으로 분리 합니다. - 계측기 조립 후 이미징 전에 diSPIM의 광학 정렬을 확인 하십시오.
참고: diSPIM을 제대로 정렬 하려면 https://youtu.be/qnOrg30NNuE를 참조 하 고 하드웨어 정보에 대해서는 http://dispim.org/hardware/objectives 및 http://www.asiimaging.com. - 고 처리량 셀룰러 이미징22를 위한 라이트 시트 현미경의 작동에 최적화 된 오픈 소스 플랫폼 마이크로 관리자 (https://micro-manager.org/)21을 사용 하십시오. 최대 30 개의 배아를 동시에 이미징 할 수 있는 다중 위치 수집을 위해 ASI diSPIM 플러그인을 사용 하는 것이 좋습니다 (23).
- 마이크로 관리자를 열고 488 nm 및 79 µW 0.25 (그림 2a, 빨간색 직사각형)에 대 한 179 µW 0.5)로 레이저 강도를 설정 합니다.
참고: 이들은 1 분 간격을 사용 하 여 c. 엘 더 스 배아의 장기 이미징에 대 한 권장 설정입니다. 장기 듀얼 컬러 이미징 동안, 561 nm 레이저는 배아가 빈 단계에 있을 때까지 핵 (Mcherry:: Histone)을 이미지 하는 데 사용 되며,이 시점에서 488 nm 레이저는 또한 GFP 표지 뉴런을 이미지화 합니다. 이러한 이미징 조건은 광 독성을 최소화 하 고 배아의 생존과 부 화를 보장 하는 동시에 신경 발달 및 선 노화 데이터를 장기간 (12 ~ 14 시간) 연속으로 획득할 수 있도록 최적화 되어 있습니다. - 마이크로 관리자에서 메뉴 플러그인 ≫ 장치 제어 ≫ asi dispim 을 선택 하 여 asi Dispim 창을 엽니다 (그림 2b). 획득 탭을 선택 합니다. 이 탭의 데이터 저장 설정 섹션 (녹색 직사각형), 볼륨 설정 섹션 (파란색 정사각형) 및 슬라이스 설정 섹션 (주황색 정사각형)에서 각 매개 변수가 그림 2b에 표시 된 대로 설정 되었는지 확인 합니다.
참고: 우리의 이미지 분석 소프트웨어 사이토 쇼는 마이크로 관리자에 내장 된 내보내기 기능의 사용을 통해 획득 후 대량 연결 오메-TIFF 파일 시리즈 및 TIFF 스택 파일 시리즈와 같은 다른 옵션 출력 데이터 형식으로 작동 하도록 구성 되어 있습니다. 일반적으로 원시 데이터를 획득 하는 즉시 이미지 볼륨을 실시간으로 보고 처리할 수 있기 때문에 단일 시간 포인트 스택 데이터 정렬 기능을 사용 합니다.
6. c. 강 장 배아의 장기 이미징에 최적화 된 자동 초점 매개 변수
- C. 엘 더 스 배아의 장기적인 계보 품질 diSPIM 이미징에 최적화 된 설정으로 마이크로 관리자 자동 초점 매개 변수를 설정 합니다. ASI diSPIM 창에서 자동 초점 탭을 클릭 합니다 (그림 2c). 일반 자동 초점 옵션 섹션 (검정색 정사각형)에서 표시 된 대로 정확 하 게 매개 변수를 지정 합니다. 자동 초점 채널 (빨간색 정사각형)은 lineaging 실험에서 핵 채널 형광 채널을 지정 해야 합니다.
참고: 최대 오프셋이 5 µm 보다 크면 이미지의 초점이 맞지 않는 경향이 있습니다. - 클릭, 플러그인 ≫ 수집 도구 > 패턴 오버레이.
- 패턴 오버레이 창에서 그리드 표시를 클릭 합니다.
- ASI diSPIM 창에서 탐색 탭을 클릭 합니다.
- 경로 A 또는 B의 빔 및 시트 에 대 한 확인란을 클릭 한 다음 라이브를 클릭 합니다. 이미지 수집이 시작 됩니다. 라이브 뷰 창이 열립니다. 6.1에서 선택 된 채널에 배아 주위에 상자를 그려 배아의 자동 초점 분석 영역을 선택 합니다.
참고: 일반적으로 이미징 세션 당 10 태아에 대 한 420 시간 포인트를 캡처합니다. 이미지 세션 당 원시 데이터는 일반적으로 1.7tb 이며, 해체 및 StarryNite 처리 된 데이터는 1.4tb(9 단계 및 10 참조)입니다. 이미지 수집을 위해 대용량 HDD (현재 시스템에 18TB)를 사용 하 고 이미지 저장을 위한 클라우드 플랫폼을 사용할 것을 권장 합니다. - "획득 탭에서 획득 시작 을 클릭 하 여 장기 다차원 이미지 캡처를 개시 합니다 (그림 2b).
7. 세포 쇼에서 원시 마이크로 관리자 이미지 열기
- Http://dispimlineage.wormguides.org에서 소프트웨어 번들을 다운로드 합니다.
참고: 소프트웨어 번들은 .zip 파일로 다운로드 되며 "c: \"로 추출 해야 합니다. 사용 하기 전에 디렉터리를 설치에 대 한 자세한 내용은 http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm에서 제공 됩니다. - 파일 C:\CytoSHOWextrasForC\CytoSHOW_APP.jnlp 를 두 번 클릭 하 여 사이토 쇼 실행을 시작 합니다.
- 새 ≫ Dispim 모니터 (마이크로 관리자)> 메뉴 파일 을 선택 합니다. 획득 timepoint 폴더가 저장 된 루트 데이터 세트 폴더를 찾습니다. Timepoint 폴더를 선택 하 고 열기를 클릭 합니다. Dispim 모니터 창 이라고 하는 다차원 탐색 창은 spima 및 SPIMB 모두에 대해 자동으로 열립니다 (그림 3a).
참고:이 창은 새로 저장 된 원시 timepoint 스택에 대 한 루트 데이터 폴더를 모니터링 합니다 (시 편이 여전히 기록 되 고 있는 경우). 각각의 새로운 timepoint가 획득 되 면 각각의 배아에 대 한 전체 멀티 채널 4D 데이터 셋을 표시 하기 위해 각각의 윈도우에서 뚜렷한 SPIM 암과 샘플 위치를 모니터링 하 게 됩니다.
8. 사이토 쇼로 최대 프로젝션 이미지 생성
심지어 해체 하기 전에 원시 데이터를 신속 하 게 처리 하 여 표본의 글로벌 기능을 칭찬 할 수 있습니다.
- 이미지 창의 왼쪽 패널에 있는 Z-MIP 버튼 (그림 3a, 빨간색 직사각형)을 클릭 하 여 주어진 위치 또는 spim 암의 전체 깊이 및 풀 타임 코스를 통해 최대 광도 투영을 만듭니다. Z 프로젝션 하이퍼스택 창이 표시 됩니다.
- Z 프로젝션 하이퍼스택 창에서 프로젝션 유형을 최대 강도로설정 합니다. 사용자 기본 설정에 따라 처리할 채널, 슬라이스 및 시간 포인트 프레임을 지정 합니다.
- 완료 되 면 확인을 클릭 합니다.
- 파일 대화 창에서 최대 광도 출력을 저장할 폴더 위치를 선택한 다음 확인을 클릭 합니다. 데이터 세트의 크기와 컴퓨터의 처리 능력에 따라 15 ~ 20 분 정도 시간을 두고 프로젝션 이미지를 생성 합니다.
9. 등방성 고 분해능 체적 데이터에서 셀 라인 분석
- 선택 사항: 세포 쇼에서 Dispim 모니터 를 통해 원시 데이터를 열면 다각형 선택 도구 (그림 3a, 검은 색 화살표)를 선택 하 고 배아의 전방, 후방, 등 쪽 및 아랫 배 가장자리의 바로 바깥을 클릭 하 여 배아 위에 "보우 타이" 패턴을 생성 합니다. 두 뷰 모두에 대해 수행 합니다 (SPIM 및 SPIM, 그림 3a).
주:이 선택은 배아가 중심에 있는 타원형 관심 영역 (ROI)을 지정 하 고 배아의 전방 후부 축을 기록 합니다. 보 타이 패턴 큐 토시 쇼는 사용자가 더 나아가 최종이 소부 트로피가 융합 된 체적의 정확한 회전을 StarryNite/비구에의 한 선 에이징 분석에 최적인 방향으로 지정할 계획입니다. StarryNite lineaging가 실험적 계획의 일부가 아닌 경우에는 이미지 처리를 위해 ROI를 설정 하기 위해 다른 선택 도구와 모양을 선택할 수 있습니다. - 다중 배아를 다 위치 획득 옵션을 이용 하 여 동시에 이미지화 한 경우, 모든 배아에 대해 9.1 단계를 열고 수행 한다. 이렇게 하면 한 세션에서 모든 배아에 대 한 향후 단계의 병렬 실행이 가능 합니다. 처리 하 고 싶지 않은 배아에 대해서는 SIMA 및 SPIMB 창을 닫으십시오.
- DiSPIM 모니터 창의 왼쪽 패널에 있는 dispim 버튼을 클릭 합니다 (그림 3a, 노란색으로 강조 표시 됨). 이는 diSPIM 처리와 관련 된 컨트롤의 하위 패널을 나타냅니다.
- 각 SPIM 암에 대해 녹색과 적색 채널을 정렬 합니다. 방출 채널 스플리터는 동일한 카메라에서 동시에 뚜렷한 적색 및 녹색 이미지를 캡처하는 데 사용 되기 때문에,이 두 개의 물리적으로 인접 한 이미지 필드의 정확한 픽셀 정합이 오버레이될 때 시각적으로 정렬 하는 것이 중요 합니다. 동일한 정렬 조정의 재사용은 일반적으로 많은 연속적인 이미징 세션에서 가능 하지만 9.4.1-9.4.5 단계에서와 같이 확인 해야 합니다.
- SPIMA 패널로 시작 하 여 CM 스크롤 막대를 왼쪽으로 이동 하 여 빨간색 채널을 선택 합니다 (그림 3a, 주황색 화살표, 왼쪽 패널).
- X, y 및 z 조정기 (그림 3a, 주황색 정사각형)를 사용 하 여 빨간색 채널을 녹색에 맞게 이동 합니다.
- Dispim 버튼 (그림 3a, 노란색으로 강조 표시 됨)을 클릭 하 여 하위 패널을 닫고 다른 모든 위치 창으로 동일한 교대조의 전파를 트리거합니다.
- "Z" 스크롤 막대를 이동 하 여 다른 프레임과 시간 지점으로 올바른 정렬이 전파 되었는지 확인 합니다(그림 3a, 파란색 화살표, 왼쪽 패널) 및/또는 "t" 스크롤 막대 (그림 3a, 녹색 화살표, 왼쪽 패널). 다중 위치 획득이 수행 되었고 여러 배아 들이 이미지화 된 경우 (단계 5.3), 정렬은 그 배아 들에도 전파 되어야 한다. X, y 및 z-스 터 드의 숫자를 검토 하 여 확인 합니다 (그림 3a, 주황색 정사각형은 모든 배아의 spima 패널에 대해 동일 해야 합니다).
- 9.4.1 단계를 반복 하 여 SPIMB diSPIM 모니터 창 (그림 3a, 오른쪽 패널)에 대해 9.4.4 합니다.
- "Dispim" 버튼을 클릭 한 다음 "퓨즈" 버튼 (그림 3a, 파란색 직사각형)을 눌러 "디스피브/퓨즈 dispim 원시 데이터 볼륨" 이라는 대화 상자를 엽니다. 그림 3b와 같이 매개 변수를 설정 합니다. 이러한 매개 변수는 다음 하위 단계에서 간략하게 다룹니다.
- 채널 1(488 nm 레이저) 또는 2(561 nm 레이저)에 키 등록 을 설정 합니다. 밀도가 크거나 더 많은 유비쿼터스 신호가 있는 채널을 선택 합니다. Lineaging 실험을 위해 항상 유비쿼터스 핵 히스톤 형광을 이미지 하는 데 사용 되는 채널을 선택 합니다.
- 입력 볼륨 상대 방향을 + 1 또는-1로 설정 합니다. 올바른 방향 인덱스는 특정 diSPIM의 카메라 배치에 따라 달라 집니다 (그림 4).
참고: 불확실 한 경우에는 9.1 – 9.12 단계에 따라 각 옵션을 SPIM A 및 B Dispim 모니터 창에서 복제 하 여 테스트에 대 한 상대 방향 입력 볼륨 을 임의로 선택 합니다. 방향이 잘못 된 경우 아티팩트를 사용 하 여 흐릿한 이미지가 생성 되지만 올바른 방향은 선명한 이미지를 생성 합니다. 그런 다음 명확한 이미지를 생성 하는 입력 볼륨 상대 방향 값을 지정 된 diSPIM 계측기의 모든 향후 데이터에 재사용할 수 있습니다. - 융합 볼륨을 사용자 기본 설정에 따라 A 또는 B 입력 볼륨과 동일한 방향으로 설정할지 여부를 선택 합니다.
- "모든 볼륨에 대해 새로 등록"을 선택 합니다. 이 옵션은 SpimFusion에서 각 timepoint의 각 볼륨 쌍에 대 한 등록 행렬을 계산 하는 방법을 제어 합니다. "Fresh" 옵션을 사용 하면 알고리즘이 각 타임 포인트에서 등록을 최적화할 수 있습니다.
- 1 번의 분해 반복 횟수를 10으로 설정 합니다. 이 숫자는 시간 효율적인 방식으로 원하는 높은 해상도를 안정적으로 산출 하는 경향이 있습니다.
- 선택 사항: 자동 라인 에이징 (적극 권장)이 필요한 경우 퓨즈 볼륨의 자동 발사 StarryNite 라인 에이징을 선택 하십시오. 이 옵션은 StarryNite를 자동으로 시작 하 여 SpimFusion에 의해 생성 된 이미지 볼륨의 셀을 세분화 하 고 추적 합니다.
- 선택 사항: 자동화 된 선 에이징에서 가장 높은 정확도를 위해이 소 트로피 칼 융합 배아 볼륨을 표준 "ADL" (nterior[x-y], [y-북쪽], 왼쪽에서 z 부근) 방향으로 재배치 하는 것이 가장 좋습니다. 이 선택 항목을 나타내려면 미리 보기에서 볼륨 출력 방향 정의 옵션을 선택 합니다. 사이토 쇼는 사용자가 밀접 하 게 관찰 하 고 ADL 등록을 달성 하는 데 필요한 회전을 지정할 수 있도록, 초기에이 트로픽 융합 볼륨의 쌍을 처리 하 여 응답 할 것 이다.
- 모든 매개 변수가 선택 되 면 예 를 클릭 합니다.
- 처리 된 파일을 저장할 출력 디렉터리 를 지정 합니다. 확인을클릭 합니다.
- 선택 사항: 미리 보기에서 볼륨 출력 방향 정의 옵션을 선택한 경우에는 ABa 및 ABp 셀이 비유에 도달한 초기 timepoint에 대 한 창 (그림 3a, 녹색 화살표, 왼쪽 패널)을 설정 합니다. SPIM-B 창의 t 스크롤 막대를 개발의 이후 쉼표 단계에 설정 합니다. 이는 ADL 방향을 지정 하는 데 도움이 됩니다.
- 선택 사항: 준비가 되 면 확인을 클릭 합니다. 위의 9.5.7 미리 보기 옵션을 선택한 경우 두 개의 미리 보기 볼륨만 SPIM A 및 SPIM 이미지 창의 t 슬라이더로 표시 되는 timepoints에 대해 동일 하 게 융합 됩니다. 이 두 미리 보기 timepoints는 아래에 설명 된 대로 ADL 방향에 대 한 출력 배아 볼륨의 정확한 재배치를 지정 하는 데 사용할 수 있습니다.
- 새로 표시 된 3DProjY_Decon-를 찾습니다. 창. T 스크롤 막대를이 미리 보기 창의 시간 지점 2로 이동 합니다. 배아의 긴 축이 바로 아래에 표시 될 때까지 Z 슬라이더를 이동 합니다.
- T 스크롤 막대를 3DProjY_Decon의 타임 포인트 1로 다시 이동 합니다. 창. 선 선택 도구를 선택 하 고 AB 셀은 유 세 플레이트의 평면을 통해 EMS 셀 (가장 둥근 핵)에서 선 선택을 그립니다.
- 3DProjY_Decon에서 주황색 diSPIM 미리 보기 버튼을 클릭 합니다. 창. 미리 보기 이미지 볼륨의 방향에 대 한 미세 조정은 전체 데이터 세트를 처리 하는 데 사용 하기 위해 저장 됩니다.
- 선택 사항: 위의 9.5 단계에서와 마찬가지로 디 스피브/퓨즈 diSPIM 원시 데이터 볼륨 대화 상자가 다시 나타납니다. 미리 보기에서 볼륨 출력 방향 정의 옵션을 선택 하지 않고 예를 클릭 합니다. 전체 데이터 처리 실행에 대 한 출력 폴더를 지정 합니다.
- DiSPIM 모니터 윈도우의 t 스크롤 막대 (그림 3a, 녹색 화살표, 왼쪽 패널)를 시작 타임 포인트 (spima)로 설정 하 고 전체 이미지 범위의 타임 포인트 (spimb)를 처리 합니다. 한 다음 확인을클릭 합니다.
- SpimFusion이 진행 됨에 따라, 세포 쇼는 각 배아에 대 한 슬라이스-4D 등방성 융합 체적을 나타내는 다차원 윈도우 뿐만 아니라 등방성 체적의 회전-4D 최대 강도 돌출부가 있는 두 개의 창을 새로 고칩니다. 이 시간 동안 등방성 융합 및 계보 추적이 완료 될 때까지 모든 사이토 쇼 창을 방해 하거나 닫지 마십시오 .
- 선택 사항: StarryNite 스플래시 화면이 나타난 후 나중에 사라진 경우 전체 데이터 처리 파이프라인이 완료 되었다는 점에 유의 하십시오. 이 창은 처리 중에 닫히지 않아야 하거나 StarryNite가 중단 됩니다.
10. 아 세 트리 (선택 사항)의 오프닝 StarryNite 계보 추적 시리즈
- 제공 된 "AceTree_16BitCompat"의 사용자 지정 버전을 엽니다.
- 메뉴 파일 > 파일 구성 열기를 선택 합니다. 이전에 사이토 쇼에 표시 된 출력 디렉토리 를 찾습니다. 배아 [n]에 대 한 Decon_Fuse_ _Pos [n] 하위 폴더를 엽니다. Aaa_edited 를 선택 하 고 엽니다.
- 비구 메뉴 편집 > 편집 도구 를 사용 하 여 트랙 편집 및 셀 조정 또는 삭제 창을 엽니다.
- 빨간색과 초록색 농도를 조정 하려면 반음영 원 그림 5b, 빨간색 정사각형 을 클릭 합니다.
- 계보 시각화 및 편집 앞에서 설명한 대로5,6,8 (원고도 우리의 다운로드 번들에 포함 되어 있습니다)로 진행 합니다.
Representative Results
우리는 먼저 diSPIM 취득을 위한 프로토콜의 매개 변수를 사용 하 여 이미지 된 배아의 생존 가능성을 검증 (섹션 1-6). 10 개의 배아는 2-세포 단계에서 2 배 단계 (7.5 시간, 451 부피/배아)로 20°c, 1 부피/배아에서 동시에 영상 촬영 하였다. 배아 발생 전반에 걸쳐 세포 분열을 모니터링 하기 위해 우리는 Mcherry를 표현 하는 UBIQUITOUSLY 스트레인 BV514를 사용 했습니다:: ujIs11324통합 된 이식 유전자 배열에서histone 리포터 구조. 도 6 은 이미지 된 배아 중 하나에 대 한 배아 개발의이 상반기의 타임 라인을 보여준다. 각 이미지는 이미지화 된 배아의 단일 뷰 최대 강도 투영 (7-8 단계에서 생성)을 나타냅니다. 우리는 최적화 된 프로토콜이 세포 분열 (도시 되지 않음)의 타이밍, 부 화 시간 및 발달 이정표와 관련 된 타이밍에 의해 평가 됨에 따라 배아에 대 한 검출 가능한 광 독성을 유발 하지 않는다는 것을 발견 했습니다 (그림 6 및 참조1 , 25 , 26).
그런 다음이 프로토콜을 적용 하 여 배아 발병에서 단일 뉴런의 성장 동력을 분석 했습니다. 우리는 DCR7692 (olaex4655), 정체 불명의 세포의 서브 세트에서의 neuropeptide flp-19 프로모터 떨어져 GFP를 표현 하는 형질 전환 된 네 마 충 균 주를 이미지화 하였다 (DACR2819, pflp- 199K(3.6KB)::: caax::p 10 3 ' UTR) . 여기에 설명 된 프로토콜의 단계에 따라, 우리는 알 수 없는 세포가 운동 뉴런 RMDDL 및 RMDDL, 배설물 운하 세포 및 2 개의 근육 세포에 상응 하는 것으로 판단 하였다 (도 7). 그런 다음 RMDDL 및 RMDDL 뉴런의 성장 동력을 검사 하 고 정량화 했습니다. 우리는 RMDDL 및 RMDDL 뉴런을 360 분 후에 경사지 게 형성 하는 것을 관찰 했 고,이는 신경 세포의 성장에 대 한 후속 축을 나타내는 더 긴 셀룰러 축 (그림 7 및 영화 S1)입니다. 피지의 "단순 신경 테 추적" 플러그인을 사용 하 여이 등 트로피 칼 융합 볼륨의 3d 재구성에 적용, 우리는 6 개의 배아에 대 한 rmddl 및 rmddl 신경의 입체 파생물을 정량화. 우리는 배아에 걸쳐 RMDDL과 RMDDL에 대 한 성장 역학이 입체 형식 이라고 결정 했습니다 (여기에 Rmddl 라고 함). 385-410 분부터 수정 후, RMDDs 신경은 6.0 ± 0.5 µm 확장 (평균 ± SEM; 세포 체의 전방 (도 7b, c1). 415-445 분부터 게시물 수정, 두 신경은도 마를 확장 하 고 추정 신경 링 ( 그림 7d에서 별표) 주위. 평균적으로 각각의 RMDD 신경은 확장 11.0 ± 0.6 µm (평균 ± SEM; n = 12 신경 세포)에서 링의 정점에서의 반대편 대응을 동기적으로 충족 시키기 전에 (그림 7i). 중요 한 것은, 우리의 대표적인 결과는 우리의 통합 프로토콜을 사용 하 여 단일 식별 가능한 세포에 대 한 신경 발달 기능을 검사, 비교 및 정량화 할 수 있다는 것을 입증 합니다 (그림 7 및 그림 8).
그림 1: diSPIM 샘플 장착 설정 (A) 폴 리 신을 사용한 커버 슬립의 제조. 인 셋에서, 10 µ L의 폴 리 라이 신은 커버 슬립을 5 분 동안 코팅 하는 데 사용 되었다. 폴 리-L-라이 신은 배아에 그 쉘이 직사각형의 커버 슬립에 단단히 붙어 있습니다. (B) 스틸 이미징 챔버와 조립 된 챔버의 개략도. 인 삽입에서, 대표적인 배아는 커버 슬립 상의 장 축에 수직인 전방 후방 축으로 지향 된다. (C) 미세 모 세관 파이 펫과 함께 조립 된 흡 기 튜브. (D) diSPIM 40x 대물 렌즈의 샘플 홀더에 장착 된 스틸 이미징 챔버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 마이크로 관리자의 장기 diSPIM 이미징 설정 (A) 광 독성을 줄이면서 장기간 이미징에 최적화 된 권장 diSPIM 레이저 전력 매개 변수 (적색 직사각형). 561 nm 레이저를 79 µW 0.25) 및 488 nm 레이저를 179 µW (0.5)로 설정 합니다. 레이저 전력에 대 한 소프트웨어 설정의 정확한 교정은 diSPIM 설치에 따라 다릅니다. 79 µW 561 nm) 및 179 488 µW 레이저 파워를 달성 하기 위해 사용자가 레이저 파워를 측정 하 고 교정 하는 것이 좋습니다. (B) 데이터 저장을 위한 dispim 매개 변수 (녹색 직사각형), 볼륨 설정 (파란색 정사각형) 및 슬라이스 설정 (주황색 정사각형) C.dispim af의 장기 이미징에 대 한 자동 초점 매개 변수 (6.1 ~ 6.6 단계 참조) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 사이토 쇼를 사용 하 여 이미지 시각화 및 데이터 처리 설정. (A) 사이토 쇼에 의해 열린 원시 diSPIM 이미지. 사이토 쇼는 두 카메라 경로 (SPIM A와 B)에 의해 캡처된 이미지를 열 수 있습니다. 이러한 raw 이미지는 Dispim 모니터라는 다차원 창에서 열립니다. Dispim 모니터에서 "보 타이 패턴"은 배아의 전방, 후방, 등 쪽 및 복 부 가장자리를 선택 하기 위해 생성 됩니다 (9.1 단계 참조). 리본 타이 선택은 해체 및 StarryNite 지원 lineaging 추적을 위한 배아 방향을 나타냅니다. (B) 등방성 이미지를 생성 하는 데 사용 되는 최적화 된 매개 변수입니다. 윈도우를 가져오는 동안 해체 에서 9.5.1-9.5.8 단계에 지정 된 매개 변수를 설정 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: diSPIM 카메라 구성 (A) diSPIM 카메라 배치 및 방향에 대 한 사진. (B) 수집 된 spim 이미지와 일치 하도록 Spim A의 90도 회전을 묘사 합니다. (C) diSPIM의 카메라 구성에 따라 방향 인덱스 + 1에 상대적인 입력 볼륨 (9.5.2 단계 참조) 스 핌 B 이미지에 맞추기 위해, 등록 전에 스 핌 이미지 (들) + 90도를 Y 축 주위로 회전 시킵니다. 축척 막대 = 10 µm 이미지는 대표 단일 뷰, 최대 강도 프로젝션 및 1.5-표시 핵 (561-nm, 빨간색) 및 뉴런 (488-nm, 녹색)을 가진 배아의 해체 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 큐 레이 션 및 편집 c. 아 세토에서의 배아 혈통. (A) 아세 트리를 사용 하 여 starrynite의 계보 흔적을 편집 합니다 (참고 문헌5,6,8참조). 원고는 또한 우리의 다운로드 번들에 포함 되어 있습니다. 그는 10.1-10.2 단계 완료 시 각 핵 (녹색 직사각형)에 대 한 체계적인 이름을 표시 합니다 . 이 창 (A)는 계보 추적을 추적 하 고 편집할 때 사용자에 게 도움이 되는 정보 (ABa, 파란색으로 강조 표시 됨)의 각 셀에 대 한 정보가 제공 됩니다. 사용자가 확인 하 고 선 세 셀과 그 위치를 비교 하는 것이 좋습니다 c. 엘 레 강 스 배아 세포 혈통은 이전에 술 스턴에 의해 보고 된.1 또한, 사용자가 특정 셀의 위치를 찾는 데 관심이 있는 경우 데이터 시리즈의 해체 (아래 참조, B)는 검색 바 (주황색 직사각형)에서 c. 엘 레 강 스 체계적인 이름을 입력 합니다. (B) 사용자의 자동 완성 된 데이터 계열은 10.1 ~ 10.2 단계를 완료 하는 즉시 열립니다. 빨간색으로 표시 된 핵이 있는 4 세포 단계 배아의이 트로피 칼 융합 이미지가 여기에 표시 됩니다. 핵을 추적 하는 동안 사용자는 이미지의 강도 (빨간색 정사각형)를 변경 하 고 키보드의 화살표 키 (왼쪽/오른쪽, z 위/아래)를 사용 하 여 시간과 z를 탐색 해야 합니다. (C) 회전 가능한 3d 시각화를 가능 하 게하는 특정 기능 (보라색 직사각형)의 timepoint의 3d 만화. 비구와 3d 기능에 대 한 개요는 참조5,6,8을 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: diSPIM에 대한 c. 엘 더 스 배아의 시간 개발 역학. 상부 패널은, 이미지 된 배아 중 하나에 대 한 배아 개발의 상반기를 보여주는 diSPIM 영상 (스트레인 BV514 ujIs11324). 배아는 7.5 시간 (20°c에서) 동안 매 분 마다 연속적으로 이미지화 되었다. 상단 패널의 처음 두 이미지는 핵 (빨간색)과 극성 체의 위치 (파란색 별표로 표시 된 짙은 빨간색 구형)와 4 및 8 셀 배아를 나타냅니다. 각 이미지는 이미지화 된 배아의 단일 뷰 최대 강도 프로젝션을 나타냅니다. 축척 막대 = 10 µm. 타임 라인 (가로 막대)은 c. 엘 더 란 스 배아의 개발의 포스트 시비 (m.p.f.) 분을 나타낸다. 우리는 diSPIM 취득에 대 한 우리의 프로토콜의 매개 변수는 생존, 세포 분열의 타이밍, 개발 이정표의 해칭 및 타이밍에 의해 평가 되는 이미지 배아에 대 한 검출 가능한 광 독성을 유도 하지 않았다 검증 (참조 1 , 25 , 26). 우리는 개발 이정표의 타이밍은 우리의 이미징 매개 변수와 배아에 걸쳐 재현할 수 있었다 (6.4 시간 긴 이미징 세션에 대 한 SEM ± 8.174 분; = 10). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7입니다. C. 엘 레 강 스 배아를 개발 하는 신경 세포의 성장 역학의 셀룰러 식별 및 단일 세포 특성화. BV514 ujIs113를 교차 하 여 만든 균 주의 이중 색 이미징 (선 노화 용) 및 DCR7692 (olaex4655), 알 수 없는 세포의 서브 세트에서 neuropeptide FLP-19 프로모터 떨어져 GFP를 표현 하는 형질 전환 네 마 충 균 주. (-H) 여기에 설명 된 프로토콜의 단계에 따라, 우리는 알 수 없는 세포가 배설물 운하 세포 (파란색 화살표)에, 그리고 두 개의 근육 세포 (백색 화살표)에 게 RMDDL 및 RMDDL (노란 화살)에 상응 하는 모터 뉴런에 대응 한다고 결정 했습니다. (I) 피지 플러그인을 사용 하 여 RMDDL 및 RMDDL 뉴런의 성장 역학의 정량화 "간단한 신경 테 추적" 및이 소부 트로피 칼 융합 볼륨의 3d 재구성에 적용. RMDDL과 RMDDL이 모두 전체 길이 11.0 ± 0.6 µm (평균 ± SEM) 동안 동기적으로 확장 되는 입체 형의 비 성장 역학을 보여 줍니다. 신경 링의 등 쪽 꼭대기에서 회합 하는 것이 가능 합니다 ( 영화 S1참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 8: c. 엘 레 강 스 배아에서의 신경 형태에 대 한 등방성 디 스 핌 이미지의 검사. AVHL 및 AVHL 뉴런 (노란색 화살표)의 등방성 시각화. DiSPIM을 사용 하 여, 뉴런 형태는 약 330 nm의 등방성 공간 분해능을 갖는 4 차원 (4d) 이미지를 산출 할 수 있다. DiSPIM을 사용 하면 사용자가 모든 방향에서 동일한 해상도로 이미지 볼륨을 사실상 회전할 수 있습니다. A-D 의 이미지는 배아의 긴 축을 중심으로 별개의 회전에서 동일한이 소 트로피 칼 융합 dispim 이미지 볼륨의 최대 강도 투영입니다. 축척 막대 = 5 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 동영상 S1: 280에서 434 분 후에 개발 된 엘 더 스 배아. 등방성의 변형 DCR7692 (olaex4655)는 rmdd 신경에 DACR2819 희소 하 게 라벨링 된 ujIs113 ubiquitously를 발현 합니다 (그림 7a, 노란색 화살표). DACR2819는 또한 배아 개발 중에 두 개의 근육 세포 (그림7a-d, 흰색 화살표) 및 배설 운하 세포 (그림 7A-d, 파란색 화살표)를 레이블 합니다 (그림 7a-d). 축척 막대 = 10 µm 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
C. 엘 더는 각 성인 뉴런의 최종 위치 및 연결성을 가진 유일한 유기 체로 서27개의 알려진 것으로 눈에 띈다. 그러나, C 를 구성 하는 작업 회로 및 네트워크의 조직으로 이어지는 발달 역학은 커넥터는 알 수 없는 남아. 빛 현미경의 진보에서 떠오르는 기회에 기초 하 여, 우리는 지금 포착 하 고 C 에 걸쳐 세포 위치, 형태 형성 및 신경 형성을 분석할 수 있습니다.
우리가 설명 하 고 우리가 일상적으로 실험실에서 사용 하는 절차는 C 에서 세포 선 노화에 대 한 레이블이 있는 뉴런 및 핵의 4d 등방성 이미지를 산출 합니다. 더 중요 한 것은 분석의 속도와 정밀도를 향상 시키기 위해 diSPIM과 결합 된 반자동 라인 에이징 기능과 고해상도 이미지를 사용 하 여 장기적인 이미징 조건을 최적화 하 여 C. 엘 레 강 스 배아 발생을 개선 하는 것입니다. 이 통합 프로토콜은 사용자가 세포를 시각화 하 고 식별 하 고 초기 경련의 발병을 통해 신경 테 이주 및 축 삭 파스 트와 같은 3 차원 기능을 정량화 할 수 있게 합니다. 이 절차는 ASI diSPIM 시스템으로 모든 시설에 쉽게 적용 할 수 있으며이 프로토콜을 위해 특별히이 시스템을 권장 합니다. 상업적으로 제공 되는 다른 SPIM 제형은 샘플 챔버 및 광학 특성에서 ASI 구성과 다를 수 있다. 그러나 다른 플랫폼에서 내보낸 데이터는 데이터 파이프라인을 통해 넣을 수도 있습니다. 따라서 선 에이징에서의 가치 평가, 이미지 품질 및 기기 안정성에 대 한 까다로운 테스트가 가능 합니다. 우리가 적극적으로 다른 표본을 정기적으로 이미지 (예: 드로 소 필 라 및 제 브라 피쉬 배아)를 사용 하지만, 설명 된 배아의 포괄적 인 선 노화 분석은 여전히 현재 마 테 오드 종으로 제한 된다. 더 크거나 두꺼운 샘플의 경우, 우리는 고정 된 라이트 시트를 통해 샘플을 스캔 하는 단계 스캐닝 접근법을 사용 하도록 선택 합니다. 쿠마 르 외. 이전에는 diSPIM10에 추가 수정 없이 두꺼운 샘플에서 고품질 이미지를 생성 하기 위해 개선 된 dispim 단면을 시연 했습니다.
프로토콜 내의 중요 한 단계에는 폴 리-L-라이 신 코팅 커버 슬립, 데이터 수집 및 데이터 처리에 대 한 c. 엘 더 란 트 배아가 포함 됩니다. 유리 커버 슬립의 수확 및 장착 c. 엘 더 란 스 배아는 미숙한 사용자에 게 어려울 수 있지만 여기에서는 학습을 촉진 하기 위한 주요 단계의 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 장기 화상 진 찰이 요구 되는 경우에, 우리는 8-10 청년 성인28에서 4 세포 또는 초기 배아를 수확 하는 최상의 결과를 얻습니다. 오래 된 성인은 자 궁과 수정 되지 않은 계란에 있는 이전 배아를 포함 하는 경향이 있기 때문에 초기 단계 배아를 수확 하는 것이 덜 바람직합니다. 배아를 장착 하는 것과 관련 하 여 조립 된 흡 인기 (입 피 펫)의 막힘 또는 미세 모 세관 파이 펫의 개 구 부의 너무 큰 등의 문제는 배아의 적절 한 장착 및 배 향을 방해할 수 있습니다. 최적의 이미징에 대비 하기 위해, 우리는 초기 및 후반 사전 경련 배아에 대 한 사전 획득 테스트를 수행 하 여 라이트 시트, 카메라, 목표 및 자동 초점의 성능을 확인 합니다. 우리는 이러한 모든 작업을 테스트 하 고 우리의 사전 획득 테스트 중에 높은 품질의 이미지를 얻을 때 최상의 결과를 얻을. 이는 등방성 공간 해상도로 이미지를 생성 하는 데 특히 적합 하며 두 뷰 (목표)에서 획득 한 raw 이미지는 고품질 이어야 합니다. 획득 후 각 뷰에 대해 획득 된 볼륨이 등방성 이미지를 생성 하도록 처리 됩니다. 이 프로토콜에 설명 된 대로 적절 한 GPU (그래픽 처리 장치) 카드를 사용 하는 것이 중요 합니다 (아래 참조). 이를 통해이 트로피 칼 융합 이미지가 생성 되는 처리 속도가 향상 되어 데이터 분석 시간이 단축 됩니다. 또한 사용자가 최신 버전의 사이토 쇼를 실행 하 고 StarryNite 자동 라인 에이징에 대 한 우리의 다운로드 번들과 함께 제공 되는 매개 변수를 사용 하는 것이 필수적 이다. 사용자가 다른 샘플에 대해 자동 라인 에이징 (예: 제 브라 피시, 초파리 등)을 사용 하려는 경우 starrynite에 사용 되는 매개 변수에 대 한 추가 최적화가 필요 합니다 (참조3,4참조).
우리의 통합 프로토콜은 사전 경련 배아에 이미지와 선 노화 결과를 제공 하지만, 사용자는 포스트 경련 배아의 자동화 된 선 노화가 현재 실현 가능 하지 않다는 것을 알고 있어야 합니다: 핵 위치는 초 단위로 변경 됩니다. 후 경련 배아, 너무 빠르게 계보 추적을 허용 합니다. 그러나, dispim은 실제로 신경 발달 사건을 포착 하 고 배아 발생23,29의 포스트 경련 단계에서 일부 세포 위치를 추적 할 수 있는 유망한 능력을 입증 했습니다. 사용자가 포스트 경련 배아를 검사 하는 데 관심이 있다면 diSPIM은 빠른 속도로 움직이는 배아에서 체적 스냅샷을 얻고 신경 근 성장 등의 미세 신경 발달 사건을 추적 하는 속도를 제공 합니다.
이 프로토콜은 WormGUIDES atlas30의 셀 바이 셀 완성을 위한 기초가 되며,이는 고해상도 등방성 이미지와 통합 된 접근법을 제공 하 여 표시 된 뉴런의 3d 형태학을 식별 하 고 포착 합니다. 첫 번째 430 분의 배아 발생. 그것은 스탠드, 프로토 타입 WormGUIDES atlas 개발 배아 세포의 핵 위치를 제공 하 고 배아 뉴런의 하위 집합의 발달 역학을 캡처하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 추가 개발 뉴런을 WormGUIDES atlas30으로 통합 하기 위한 열쇠가 될 것입니다.
당사의 통합 프로토콜은 또한 c. 엘 레 강 스 배아에서 새로운 유전자 발현 프로필을 탐색 하는 것을 단순화 합니다. 형질 전환 c.엘 레 강 스에서, 많은 세포 특이 적 프로모터는 공간적으로 및 시간적으로 이식 유전자 발현을 조절 한다. 대부분의 유전자의 발현 패턴은 성인 동물 (31),32,33,34등을 광범위 하 게 특징으로 하는 반면에, 거의 모든 것이 아직 개발 (특히 후반 단계) 배아. C. 엘에이 칸의 상태 올리기형은 세포 특유의 이식 유전자 발현을 촉진 하 고, 유전자 기능이 세포 자치 또는 비 자율적 인지 여부를 결정할 수 있도록 웜 커뮤니티에 유용한 자원이 되었습니다. 유전자의 등방성 고 분해능 및 동적 발현 패턴을 포착 하 고, 선 노화를 통해 발현 세포를 정확 하 게 식별 하는 것은 과학계의 많은 사람들에 게 가치가 있습니다.
배아 발생은 두 가지 주요 과정, 세포 분화 및 조직 형태 형성을 포함 한다. 큰 거래는 메커니즘 및 C의 개발 하는 동안 고유 세포 유형을 정의 하는 분자에 대 한 알려져 있다. 그러나 c. 엘 레 강 스 배아에서 세포 이동, 세포 부착 및 세포 형태에 중요 한 메카니즘에 대해 거의 알려지지 않았다. 알려진 c. 엘 더 린 불변 세포 혈통으로, 우리의 프로토콜은 우리가 쉽게 새로운 세부 수준에서 형태학 상 동안 배아의 카탈로그 된 3d-미세 해부학을 분별 할 수 있습니다: 예를 들어, 축 삭 파스, synaptogenesis 및 신경 활동. 디스트 렐 외. 이전에는 C 에서 단일 뉴런의 수준에서 칼슘 과도 상태를 포착 하기 위해 diSPIM의 힘을 입증 했습니다. 엘 레 강 스 배아23. 발달 생리학의 그밖 많은 양상은이 방법에 의하여 조회를 위해 익은 다.
마지막으로,이 프로토콜은 주로 자동화 되 고 체계적으로 해체 이미지를 생성 하 고 StarryNite 및 비구를 통해 세포 라인 노화를 수행 하는 데 걸리는 시간을 줄입니다. 이 프로토콜에 사용 되는 소프트웨어 전략은 우리가 여기에서 보여준 매우 특정 분야에서 멀리 떨어진 생물학의 많은 질문에 적용 될 수 있습니다.
소프트웨어 호환성 및 다운로드 액세스에 대 한 세부 정보
DiSPIM 이미징 용 마이크로 관리자 및 플러그인에 대 한 정보는 http://dispim.org/software/micro-manager 및 https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin에서 확인할 수 있습니다.
데이터 처리 파이프라인에는 현재 Windows 운영 체제가 필요 합니다. 우리는 모든 필요한 데이터 처리 프로그램 및 지원 파일의 설치를 단순화 하기 위해 단일 아카이브 파일을 번들로 제공 하 고 있습니다. 그것은 http://dispimlineage.wormguides.org에서 다운로드 할 수 있습니다.
사이토 쇼 (http://run.cytoshow.org/)는 널리 사용 되 고 오픈 소스 이미지 분석 플랫폼을 기반으로, ImageJ (v1). Java는 사이토 쇼를 사용 하는 컴퓨터에 최신 설치 되어 있어야 하며, 사이토 쇼에 대 한 업데이트는 자바 웹 시작을 통해 자동으로 배포 됩니다. 사이토 쇼의 많은 ImageJ 기반 기능은 https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html에서 설명 되 고 도시 된 바와 같다. 사이토 쇼는 TIFF 출력을 생성 하는 다른 이미징 소프트웨어 뿐만 아니라 ASI diSPIM에서 다차원 원시 데이터를 표시 하도록 사용자 정의 되었습니다. 원칙적으로 다른 다중 뷰 SPIM 이미징 시스템은이 프로토콜이 다른 현미경 시스템에서 수행 될 수 있도록 사이토 쇼의 사소한 수정에 의해 지원 될 수 있습니다.
SpimFusion은 cuda 툴킷 v 7.5와 함께 Visual Studio 2013을 사용 하 여 CUDA/c + +로 작성 되었습니다. SpimFusion 실행에는 특정 컴퓨터 하드웨어가 필요 합니다: CUDA 컴퓨팅 기능이 1.0 이상인 NVIDIA 그래픽 처리 장치 (GPU) 카드 및 최소 2gb의 그래픽 카드 메모리. 우리의 프로토콜의 출판 시점에서 SpimFusion은 미 출간 (분 궈와 하 리 Shroff) 하지만 위에서 언급 한 소프트웨어 번들 아카이브에서 사용할 수 있습니다.
StarryNite의 특수 제작 된 명령줄 기반 버전을 사용 하려면 자유롭게 사용할 수 있는 MATLAB 컴파일러 런타임이 설치 되어 있어야 하지만 상업용 MATLAB 소프트웨어에 대 한 라이센스가 필요 하지 않습니다. MATLAB 컴파일러 런타임은 위에서 언급 한 소프트웨어 번들 아카이브에 포함 되어 있습니다. 이 프로토콜에서 사용 되는 StarryNite에 대 한 코드는 기본적으로 공초점 이미지6에 사용 되는 것과 변경 되지 않습니다. 그러나, StarryNite 처리 및 StarryNite 결과의 처리를 위한 입력 이미지의 생성에 몇 가지 운영 문제는 융합 등방성 diSPIM에 대 한 연속 데이터 처리 파이프 라인을 가능 하 게 하는 세포 쇼의 방법으로 여기에서 해결 되었습니다 볼륨. 이러한 변경 사항은 이러한 전처리 및 후 처리 단계를 처리 하는 사이토 쇼 코드에 의해 자동화 됩니다. 또한 사이토 쇼는 미리 최적화 된 diSPIM 특정 템플릿을 편집 하 여 이미지 데이터에서 핵의 형광 강도로 세그먼트 알고리즘을 자동으로 조정 하는 StarryNite 매개 변수를 설정 합니다. 각 diSPIM 데이터 세트에서 StarryNite가 사용 하는 고유한 매개 변수는 출력 이미지 및 lineaging 데이터와 함께 파일에 저장 됩니다.
16 비트 이미지와 함께 작동 하 고 Java3D 렌더링과의 호환성을 유지 하는 사용자 지정 버전의 비구는이 프로토콜에 가장 적합 합니다. 또한 위에서 언급 한 소프트웨어 번들 아카이브에 포함 되어 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 통합 된 스트레인에 대 한 존 머 레이 감사, ujIs113, 선 에이징 스트레인 BV514를 생성 하; 브 랜던 하 비 (NIBIB) 프로토콜 테스트에 대 한 도움; 존 다니엘 스와 게리 르노 (응용 과학 계측) 마이크로 관리자 및 diSPIM 악기에 대 한 지원을 위해; 그리고 앤드류 요크와 행 크 에덴은 diSPIM 시스템에 대 한 그들의 중요 한 피드백. 우리는 또한 회의 및 브레인스토밍 플랫폼을 제공 하기 위해 소수 기관 프로그램에 대 한 연구 센터와 Neurobiología 호세 델 카스 티 요 (Universidad 데 푸에르토 리코)에 게 감사를 드립니다. 이 작업의 대부분은 위트 먼 프로그램을 통해 우즈 홀에서 해양 생물 실험실에서 실시 되었다. 이 작업은 생물 의학 영상 및 생물 공학의 NIH 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 및 NIH 보조금 No. U01-HD075602 및 아니오. R24-OD016474 마크 w. Moyle는 F32-NS098616에 의해 지원 되었고, 레이 턴 h. 던컨는 R24 OD016474에 다양성 보충에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steps 1-4 | |||
| Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
| Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
| M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
| Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
| Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
| NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
| O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
| Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
| Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
| Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
| Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
| Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steps 5-6 | |||
| 488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
| 561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
| BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
| Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
| diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
| diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
| diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
| FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
| FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
| Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
| Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
| Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
| Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
| Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steps 7-10 | |||
| Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
| Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
| Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
| Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |
References
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