Summary
De recente epidemie van het Zikavirus wijst op het belang van het opzetten van omgekeerde genetische benaderingen om vaccins en/of therapeutische strategieën te ontwikkelen. Hier beschrijven we het protocol om een infectieus recombinant Zikavirus te redden van een volledige cDNA-kloon, geassembleerd in een bacterieel kunstmatig chromosoom onder controle van het humaan cytomegalovirus onmiddellijk-vroege promotor.
Abstract
De associatie van zikavirus (ZIKV) infectie met neurologische complicaties tijdens de recente wereldwijde uitbraak en het ontbreken van goedgekeurde vaccins en/of antivirale middelen hebben de dringende noodzaak onderstreept om ZIKV reverse genetische systemen te ontwikkelen om de studie van de ZIKV-biologie en de ontwikkeling van therapeutische en/of profylactische benaderingen. Echter, net als bij andere flavivirussen is de generatie ZIKV infectieuze cDNA-klonen belemmerd door de toxiciteit van virale sequenties tijdens de versterking van bacteriën. Om dit probleem op te lossen, hebben we een niet-traditionele aanpak ontwikkeld op basis van het gebruik van bacteriële kunstmatige chromosomen (BACs). Met behulp van deze aanpak wordt de volledige cDNA-kopie van de ZIKV-stam Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) gegenereerd uit vier synthetische DNA-fragmenten en samengevoegd tot de single-copy pBeloBAC11 plasmide onder de controle van het humaan cytomegalovirus (CMV) onmiddellijk-vroege promotor. De verzamelde BAC cDNA-kloon is stabiel tijdens vermeerdering in bacteriën, en infectieuze recombinant (r) ZIKV wordt teruggevonden in Vero-cellen na transfectie van de BAC cDNA-kloon. Het hier beschreven protocol biedt een krachtige techniek voor het genereren van infectieuze klonen van flavivirussen, waaronder zikv, en andere positieve-streng RNA-virussen, met name die met grote genomen die stabiliteitsproblemen hebben tijdens bacteriële vermeerdering.
Introduction
ZIKV is een muskietenlid van het geslacht Flavivirus in de familie van de Flaviviridae . Net als andere flavivirussen, ZIKV is een omhuld RNA-virus met een icosahedrale-achtige structuur die een positief gevoel bevat, enkel-streng RNA-molecuul van ongeveer 10,8 KB (Figuur 1)2. Het virale genoom codeert een groot poly eiwit van ongeveer 3.423 aminozuren die worden verwerkt door virale en cellulaire proteasen in drie structurele eiwitten (capsid [C], premembraan/membraan [prM/M], en envelop [E]) die betrokken zijn bij de vorming van de virale deeltjes en zeven niet-structurele (NS) eiwitten (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B en NS5) die deelnemen aan genoom replicatie, virus assemblage en ontduiking van de immuunrespons van de gastheer (Figuur 1)3.
Historisch, zikv infectie is in verband gebracht met een milde febriele ziekte4,5. Echter, de explosieve recente pandemie van zikv infecties in heel Zuid-en Midden-Amerika, de zuidelijke Stille Oceaan, en de Caraïben6,7,8, en de associatie met het optreden van Guillain-Barré syndroom en microcefalie9,10,11,12,13, hebben de historische perceptie veranderd en versterkt de relevantie van zikv als een belangrijk menselijk pathogeen. In deze zin zal de ontwikkeling van moleculaire instrumenten, zoals infectieuze cDNA-klonen, de studie van virale pathogenese en de ontwikkeling van genetisch bepaalde vaccins en de identificatie van antivirale geneesmiddelen voor de behandeling van ZIKV-infectie vergemakkelijken. Zoals beschreven voor andere flavivirussen, is de aanmaak van zikv infectieuze klonen moeilijk te wijten aan de aanwezigheid van cryptische bacteriële promotors in het virale genoom14 , die de lekkende expressie van toxische virale eiwitten mogelijk maken tijdens de vermeerdering van de cDNA klonen in bacteriën met behulp van standaard High-Copy-nummer plasmiden15,16,17. Om dit toxiciteits probleem te overwinnen, zijn verschillende niet-traditionele benaderingen met succes uitgevoerd in de afgelopen twee jaar18. Deze omvatten het gebruik van laag-Copy-nummer plasmiden19,20, het inbrengen van INTRON om de giftige gebieden21,22,23te verstoren, de in-vitro ligatie van cDNA-fragmenten 24 , 25, mutatie uitschakeling van cryptische bacteriële promotors aanwezig in het virale genoom26,27, infectieuze subgenomische amplicons (ISA)28,29, de Gibson assembly methode30 , en het gebruik van circulaire polymerase-uitbreidings reactie (CPER)31.
Hierin beschrijven we het gedetailleerde protocol voor de engineering van een volledige cDNA-kloon van de ZIKV-stam ZIKV-RGN13, met behulp van een BAC om het toxiciteits probleem te overwinnen en de redding van infectieuze rzikv door directe transfectie van de Bac cDNA-kloon in Vero cellen32, een cellijn goedgekeurd door de Food and Drug ADMINISTRATION (FDA) voor de ontwikkeling van menselijke vaccins33. In dit systeem wordt de volledige cDNA-kopie van het virale genoom geassembleerd in de BAC plasmide pBeloBAC1134 (Figuur 2a), een laag-kopie-aantal plasmide (één tot twee kopieën per cel) afgeleid van de Escherichia coli F-factor35, die de toxiciteit van Flavivirus sequenties tijdens de voortplanting bij bacteriën minimaliseert. Het cDNA van het ZIKV genoom wordt geassembleerd in pBeloBAC11 onder de controle van de humane CMV onmiddellijk-vroege promotor, om de uitdrukking van het virale (v) RNA in de kern van getransfunteerde cellen mogelijk te maken door cellulaire RNA-polymerase II, en geflankeerd aan de 3 '-end door de hepatitis Delta virus (HDV) ribozyme (RZ), gevolgd door de sequenties van de beëindiging van het boviene groeihormoon (BGH) en polyadenylatie signalen om synthetische rna's te produceren met authentieke 5 '-en 3 '-uiteinden van het virale genoom, respectievelijk (Figuur 2b). Dit cDNA-gelanceerd systeem resulteert in de intracellulaire expressie van afgetopte virale RNA, waardoor het herstel van infectieuze ZIKV zonder de noodzaak voor een in vitro transcriptie stap. De Bac-aanpak biedt een krachtige methodologie die van toepassing is op de bouw van stabiele en volledig functionele infectieuze cDNA-klonen voor andere flavivirussen, evenals andere positief-gestrande RNA-virussen36,37, 38,39,40,41.
Protocol
1. bouw van een ZIKV infectieuze cDNA kloon in een BAC
Opmerking: De strategie voor de assemblage van ZIKV in BACs wordt beschreven voor de RGN stam13 (TOETREDINGS nummer KU527068) (Figuur 2).
- Selecteer unieke beperkings sites die op de juiste afstand van het virale genoom staan die afwezig zijn in de plasmide pBeloBAC11 (Figuur 2a).
Opmerking: Voor ZIKV-RGN werden de beperkings sites PML I, AFE I en BstB I (genomische posities 3.347, 5.969 en 9.127) geselecteerd. In het geval dat er geen geschikte beperkings sites beschikbaar zijn in het virale genoom, genereert u nieuwe beperkings sites door de invoering van stille nucleotide-mutaties in het virale genoom tijdens het ontwerp van het cDNA-fragment. - Genereer door chemische synthese vier cDNA-fragmenten over het volledige genoom (Z1 tot Z4), geflankeerd door de promotor CMV op de 5 '-end en de HDV rz, de BGH-beëindiging en polyadenylatie sequenties aan de 3 '-end ( Figuur 2b). Elk fragment moet worden geflankeerd door de geselecteerde beperkings sites (stap 1,1).
Opmerking: Fragment Z1 wordt gebruikt als ruggengraat voor het klonen van de rest van de fragmenten in de pBeloBac11. Daartoe moet het de menselijke CMV-promotor bevatten en moet het worden geflankeerd aan de 5 '-end door ApaL I (om dit fragment in pBeloBAC11 te klonen) en ASC I (afwezig in het virale genoom) en op de 3 '-end door de beperkingsgebieden geselecteerd voor de assemblage van de infectieuze kloon (PML I , AFE I, en BstB I) gevolgd door MLU I (afwezig in het virale genoom) en BamH I (om dit fragment te klonen in pBeloBAC11). Fragment Z4 moet de genomische regio bevatten van de laatste beperkings site geselecteerd (BstB I) tot het einde van het virale genoom, gevolgd door de HDV RZ, de BGH-beëindiging en polyadenylatie sequenties, en de MLU I-beperkings site (Figuur 2b). Als alternatief kunnen de cDNA-fragmenten (Z1-Z4) worden gegenereerd door een combinatie van standaard reverse transcriptase-polymerase kettingreacties (RT-PCRs) en overlappende PCRs met behulp van specifieke oligonucleotiden. - Monteer de infectieuze cDNA-kloon door sequentieel klonen van fragmenten Z1 naar Z4 in pBeloBAC11 (Figuur 2b).
- Verteren de pBeloBAC11 plasmide en de Z1 fragment met ApaL I en BamH I. Meng hiervoor 2 μg pBeloBAC11 plasmide of 1 μg Z1-fragment met 10 μL 10x-reactiebuffer, 20 eenheden van elk enzym en water om een eindvolume van 100 μL te bereiken. Inbroed bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Defosforylaat de BAC vector met behulp van garnalen alkalische fosfatase (SAP). Voeg daartoe 2,5 μL (2,5 eenheden) SAP toe aan het verteerde BAC en inbroed bij 37 °C gedurende 1 uur. Verwarm het SAP door gedurende 15 minuten te incuberen bij 75 °C.
- Reinig de gedefosforyleerd BAC vector en fragment Z1 door agarose gel elektroforese met behulp van een commerciële gel clean-up Kit geoptimaliseerd voor de zuivering van DNA-fragmenten groter dan 10 kB (Zie de tabel van de materialen).
- Voer de ligatie reactie uit om het plasmide (p) BAC-Z1 te genereren. Meng hiertoe 150 ng van gezuiverde, verteerde BAC-vector met de gezuiverde wisselplaat met behulp van een molaire verhouding van vector-naar-insert van 1:3, 1,5 μL van 10x T4 DNA-ligase buffer met 10 mM ATP, één eenheid T4 DNA ligase, en water tot een eindvolume van 15 μL.
- Inbroed het ligatie mengsel gedurende 20 uur bij 16 °C. Als controle van de ligatie reactie, presteren parallel een ligatie reactie zonder invoegen. Warmte-inactiveren van de ligase door incubatie bij 65 °C gedurende 15 minuten.
Opmerking: In het geval van stompe-ended Dna's, incuberen de ligatie reactie voor 20 uur bij 14 °C. Vanwege de grote grootte van de BAC vector (Figuur 2a), is het essentieel om grotere hoeveelheden vector en insert dan ligaties met behulp van conventionele plasmiden gebruiken om de ligatie-efficiëntie te verhogen. - Transformeer 50 μL E. coli DH10B elektrocompetente cellen met 2 μL van de ligatie reactie (stap 1.3.5) door middel van elektroporation (25 μf capaciteit, 2,5 kV en 100 Ω weerstand), met behulp van electroporatie cuvettes uitgerust met elektroden met tussenpozen van 0,2 cm, volgens de standaardprotocollen.
- Breng de cellen over naar een polypropyleen buis met 1 mL SOC medium (2% Tryptone, 0,5% gistextract, 0,05% NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mm MgSO4, 20 mm glucose [pH 7,0]) en inbroed ze bij 37 °c gedurende 1 uur met zacht schudden (200-250 rpm). Plaat de cellen op de Luria Bouillon (LB) agar-platen met 12,5 μg/mL chlooramfenicol en incuberen ze bij 37 °C gedurende 16 uur.
- Kies 8 tot 12 bacteriële kolonies, maak een replica op een verse LB agar-plaat met 12,5 μg/mL chlooramfenicol, en test of ze de juiste wisselplaat door directe PCR-analyse met specifieke oligonucleotiden bevatten.
- Kies een positieve kolonie van de replica plaat, groeien in 100 mL LB bevattende 12,5 μg/mL chlooramfenicol, en isoleren van de BAC cDNA door de alkalische lysis methode met behulp van een commerciële plasmide MIDI Kit, na de aanbeveling voor de zuivering van grote laag-Copy plasmiden (Zie de tabel met materialen).
Opmerking: BAC cDNA bereid door deze methode kan worden verontreinigd met maximaal 30% van bacteriële genomisch DNA, maar het is geschikt in kwaliteit voor het uitvoeren van restrictie analyse, sequencing en klonen. Afhankelijk van de grootte van het BAC, kunnen opbrengsten van 4-6 μg van het BAC plasmide worden verkregen. - Controleer de genetische integriteit van de gekloonde cDNA door restrictie analyse. Digest 500 ng van het pBAC-Z1 plasmide met ASC I en PML I bij 37 °C gedurende 1 uur en bevestig de aanwezigheid van het fragment Z1 door gel elektroforese. Om verder te bevestigen dat ongewenste mutaties niet zijn geïntroduceerd, volg de sequentie de wisselplaat met specifieke oligonucleotiden.
- Beginnend bij de plasmide pBAC-Z1 met de geselecteerde beperkings plaatsen (PML I, AFE I, BstB I en MLU I), kloon fragmenten Z2 tot Z4 sequentieel om de volledige infectieuze cDNA-kloon pBAC-ZIKV (Figuur 2b) te genereren, volgende soortgelijke experimentele benaderingen zoals hierboven beschreven voor fragment Z1 (stappen 1.3.1-1.3.10).
2. bereiding van hoogzuivere pBAC-ZIKV voor de redding van infectieuze rZIKV
Opmerking: De grootschalige bereiding van een ultrapuur pBAC-ZIKV infectieuze kloon, geschikt voor de transfectie en redding van infectieuze virussen, wordt uitgevoerd door alkalische lyse met een commerciële Kit die speciaal is ontwikkeld voor het zuiveren van BAC (Zie de tabel van Materialen). De kit moet een ATP-afhankelijke exonuclease verterings stap bevatten die bacteriële genomische DNA-besmetting verwijdert, waardoor de isolatie van BAC cDNA met een zuiverheidsgraad vergelijkbaar is met die verkregen met de cesium chloride methode.
- Kweek een enkele kolonie van E. coli DH10B het dragen van de pbac-zikv infectieuze kloon in 5 ml lb medium met 12,5 μg/ml chlooramfenicol bij 37 °c voor 8 uur met zacht schudden (200-250 rpm).
- Voeg 1 mL bacteriële kweek (stap 2,1) toe aan 500 mL LB met 12,5 μg/mL chlooramfenicol in een kolf van 2 L en kweek de cellen bij 37 °C voor 14-16 h (tot een OD600 van 0,6-0,8).
Opmerking: Rijke Bouillon, zoals geweldige Bouillon (TB), kan extreem hoge celdichtheden produceren, wat resulteert in een lagere opbrengst en minder zuiverheid van het BAC cDNA. - Reinig de BAC infectieuze cDNA-kloon door alkalische lysis met behulp van een commerciële Kit die speciaal is ontwikkeld voor het zuiveren van BAC, volgens de specificaties van de fabrikant (Zie de tabel met materialen). Houd het gezuiverde BAC cDNA bij 4 °C. Afhankelijk van de grootte van het BAC, kunnen opbrengsten van 30 μg ultrapuur BAC cDNA-kloon worden verkregen.
Opmerking: Droog de DNA-pellet niet langer dan 5 min, omdat overdroging het moeilijk zal maken om het BAC cDNA op te lossen. Vanwege de grote omvang van de Bac cDNA kloon, Vermijd grondig of pipetteren om plasmide scheren te voorkomen.
3. redding van infectieuze rZIKV van de kloon van het BAC cDNA door transfectie van Vero-cellen
Opmerking: Infectieuze rZIKV wordt teruggewonnen door de transfectie van Vero-cellen met de pBAC-ZIKV cDNA-kloon, met behulp van een commercieel kationisch lipide-transfectiereagens (Zie de tabel met materialen; Figuur 3).
- Een dag voor de transfectie, plaat op 6-well platen 5 x 105 Vero cellen/goed in groeimedium (Dulbecco's gemodificeerde eagle's medium [DMEM] aangevuld met 5% foetaal runderserum [FBS], 2 mm L-glutamine, en 1% niet-essentiële aminozuren) zonder antibiotica om 90% confluente celmonolagen te verhogen tegen de tijd van transfectie.
Opmerking: We raden aan om de virus recues in triplicates uit te voeren. -
Evenwichts serum-verlaagd medium (Zie de tabel met materialen) bij kamertemperatuur en bereid transfectie mengsels in steriele microfugebuis buizen voor elk transfectie monster als volgt.
- Voeg 4 μg van de kloon van de Bac cDNA toe in 250 μL serum-gereduceerd medium en meng zorgvuldig, waarbij grondig wordt vermeden om plasmide Shearing te voorkomen.
- Verdun in een aparte buis 12 μL transfectie reagens (1 mg/mL) (Zie de tabel met materialen) in 250 μL serum verlaagd medium, Meng door vortexing en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Combineer het verdunde BAC cDNA en het transfectie-reagens (met een 1:3 ratio van DNA: transfectie-reagens), meng zorgvuldig terwijl u vortexing vermijdt en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20-30 min.
- Was tijdens de incubatieperiode van de reagentmix van het BAC cDNA/transfection Vero-cellen met groeimedium zonder antibiotica en laat de cellen in 1 mL vers medium zonder antibiotica.
Opmerking: De toevoeging van antibiotica tijdens het transfectie proces kan de efficiëntie van transfectie verminderen. - Verdeel met druppelsgewijs de 500 μL van het BAC cDNA/transfection-reagens mengsel (van stap 3.2.3) op de Vero-cellen, meng ze door de plaat heen en weer te schommelen en incureer de cellen in een 5% Co2 bevoficeerde incubator bij 37 °c gedurende 6 uur.
- Verwijder het transfectie medium, voeg 2 mL vers groeimedium toe met antibiotica (100 U/mL penicillaire en 100 μg/mL streptomycine), incuberen de cellen in een met 5% CO2 bevoficeerde incubator bij 37 °c en controleer elke dag op de inductie van cytopathisch effect (CPE ).
Opmerking: ZIKV CPE is vrij uitgesproken in de Vero-cellen en wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van afgeronde en birefringent cellen die zich losmaken en drijven in de weefselcultuur supernatant. - Verzamel aliquots (100 μL) van de Vero Cell tissue-culture supernatanten (stap 3,5) om de 24 uur om de efficiëntie van het herstel van het virus te bepalen door de aanwezigheid van zikv te beoordelen aan de hand van een standaard plaque test op verse Vero-cellen (figuur 4a).
- Na vier tot zes dagen van transfectie, wanneer de CPE ongeveer 50%-75% (figuur 4b) is, verzamel dan de weefselkweek supernatanten in 15 ml conische buizen en centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c om cellulair puin te verwijderen.
- Oogst de supernatanten die rzikv bevatten en gooi de celpellets weg. Aliquot de supernatant in cryotubes en bewaar ze bij-80 °C om de aanwezigheid van geredde rZIKV verder te bevestigen.
4. titratie van teruggewonnen rZIKV
- Een dag voor titratie, zaad op 12-well platen 2,5 x 105 Vero cellen/goed in groeimedium te verhogen 90% confluente celmonolayers op het moment van titratie.
Opmerking: Wij adviseren het uitvoeren van de titratie van de herstelde rZIKV in triplicaten. - Verwijder een aliquot van de supernatant uit de vriezer (stap 3,8) en maak seriële 10-voudige verdunningen in groeimedium zonder FBS.
- Was de Vero-cellen 2x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 200 μL/goed toe van elke virus verdunning in drievlaat. Plaats de platen in een 5% CO2 bevoficeerde incubator bij 37 °c en steen elke 15 minuten gedurende een adsorptie periode van 90 minuten.
- Verwijder het virale inoculum, overlay de cellen met 2 mL groeimedium met 2% FBS, 1% DEAE-dextran, en 0,6% agar Noble, en incuberen bij 37 °C onder 5% co2 voor 3-4 dagen.
Opmerking: Het is mogelijk om agarose, methylcellulose of andere overlay media te gebruiken. De tijd voor de juiste plaque vorming zal variëren afhankelijk van de overlay gebruikt en de ZIKV stam. -
Fix ZIKV-geïnfecteerde cellen met 1 mL/goed van 4% formaldehyde verdund in PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, verwijder de overlay, en visualiseer de virale plaques door ze te kleuren met 0,1% kristalviolet in 20% methanol bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Gooi het kristalviolet weg, was 3x met water, laat de platen drogen en Tel handmatig de plaques (figuur 4c, linker paneel). Virale titer wordt berekend als plaquevormende eenheden per milliliter (PFU/ml).
-
Als alternatief kunnen virale plaques worden gevisualiseerd door immunokleuring met het pan-Flavivirus E Protein Mouse monoklonaal antilichaam (mAb) 4G2 (figuur 4c, rechter paneel).
- Om ZIKV plaques te evalueren door middel van immunokleuring, na de bevestiging en verwijdering van de overlay agar zoals hierboven beschreven (in stap 4,5), was de cellen 2x met PBS en permeabiliseer ze door te incuberen met 200 μL/goed van 0,5% Triton-X100 in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de permeabilization-oplossing, was de cellen 3x met PBS en Blokkeer ze met 200 μL/goed van de blokkerende oplossing (10% FBS in PBS) voor 1 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: In deze stap kunnen andere standaard blokkerende oplossingen (bijv. 2,5% BSA in PBS) worden gebruikt. - Verwijder de blokkerende oplossing en inbroed de cellen met 200 μL/goed van het pan-Flavivirus E proteïne mAb 4G2 verdund in blokkerende oplossing (1 μg/mL) gedurende 1 uur bij 37 °C.
Opmerking: Andere mAb of Polyklonale antilichamen (pAb) kunnen worden gebruikt in plaats van 4G2 voor de immunokleuring en detectie van virale plaques. - Was de cellen 3x met PBS en infiltreer ze met 200 μL biotinyleerd anti-muis secundair antilichaam verdund (volgens de aanbeveling van de fabrikant) in blokkerende oplossing voor 1 uur bij 37 °c.
- Verwijder het secundaire antilichaam, was de cellen 4x met PBS en visualiseer de virale plaques met behulp van een op avidin/biotin gebaseerde peroxidase Kit volgens de specificaties van de fabrikant (Zie de tabel met materialen).
5. bevestiging van succesvolle rZIKV redding
Opmerking: Om de identiteit van het gered virus verder te bevestigen, wordt ZIKV E eiwit expressie geanalyseerd door immunofluorescentie met behulp van de muis mAb 1176-56 specifiek voor ZIKV E eiwit (figuur 4D). Deze mAb is specifiek voor ZIKV E-eiwitten, in tegenstelling tot de situatie van het pan-Flavivirus E proteïne mAb 4G2 (stap 4.6.3). Als alternatief kan de virus identiteit worden bevestigd door sequencing.
- Een dag vóór de immunofluorescentie analyse wordt het zaad afgedekt in 24-goed platen met 1 x 105 Vero-cellen/goed in het groeimedium om 90% confluente celmonolagen te verhogen tegen de tijd van infectie.
- Was de cellen 2x met PBS en besmetten ze met een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,5 PFU/cel van het geredde virus in het groeimedium zonder FBS (100 μL/goed) in drievat. Inincuberen van de platen bij 37 °C gedurende 90 min.
- Na virale adsorptie, verwijder het virale entmateriaal, Voeg 0,5 mL vers groeimedium toe met 2% FBS en inculeer de cellen in een 5% CO2 bevoficeerde incubator bij 37 °c voor 48 h.
- Verwijder de weefselkweek supernatant, Fixeer de cellen met 150 μL/goed van 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en permeabiliseer de cellen met 150 μL/goed van 0,5% Triton-X100 in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Na het verwijderen van de permeabilization oplossing en het wassen van de cellen 3x met PBS, Blokkeer de cellen met 150 μL/goed van blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: Celscan wordt geblokkeerd met alternatieve blokkerende oplossingen (bijv. 2,5% BSA in PBS). - Verwijder de blokkerende oplossing en inbroed de cellen met 100 μL/goed van mAb 1176-56, specifiek voor ZIKV E-eiwit, verdund in blokkerende oplossing (1 μg/mL) voor 1 uur bij 37 °C.
- Was de cellen 3x met PBS, inbroed ze bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met 100 μL/goed van Alexa Fluor 488-geconjugeerde anti-muis secundair antilichaam verdund (volgens de aanbeveling van de fabrikant) in blokkerende oplossing, was de cellen uitgebreid met PBS, en inbroed ze met 150 μL/goed van 4 ', 6 '-diamidino-2-fenylindole (DAPI; 1 mg/mL) verdund 1:200 in PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Was de cellen 3x met PBS, Monteer de dekstroken op een anti fade-bevestigings medium (Zie de tabel met materialen) en analyseer de monsters onder een fluorescentiemicroscoop.
Opmerking: Voor langdurige opslag, bewaren van monsters bij 4 °C, beschermd tegen licht.
6. versterking en aanmaak van virale voorraden
Opmerking: Zodra de identiteit van het geredde virus is bevestigd (rubriek 5), versterkt u het virus op de Vero-cellen en genereert u virale voorraden voor verdere studies.
- Grow Vero cellen in 100 mm x 21 mm platen bij 90% samenvloeiing en infecteren ze met een MOI van 0,1 PFU/cel zoals eerder beschreven.
- Wanneer de CPE ongeveer 75% (ongeveer 48-72 h na infectie) is, verzamel dan de weefselkweek supernatant in een conische buis van 50 mL en centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c om het cellulaire puin te verwijderen.
- Oogst de supernatant met rZIKV en gooi de celpellet weg. Aliquot de supernatant in cryotubes en bewaar ze bij-80 °C.
- Verwijder een virus aliquot uit de vriezer en bepaal de virale titer met plaque assay zoals eerder beschreven (rubriek 4).
Representative Results
Het protocol dat hier wordt beschreven, zorgt voor het genereren van stabiele ZIKV volledige lengte cDNA infectieuze klonen met behulp van een BAC om de toxiciteits problemen in verband met verschillende flavivirale sequenties te minimaliseren. Efficiënt herstel van infectieuze rZIKV van de kloon van de BAC cDNA kan gemakkelijk worden bereikt na de transfectie van vatbare Vero-cellen (Figuur 2). Met dit protocol hebben we een stabiele volledige cDNA-kloon van de ZIKV-stam RGN32 gegenereerd door achtereenvolgens vier overlappende cDNA-fragmenten in de Bac plasmide pBeloBAC1134 te klonen met behulp van conventionele kloon methoden en unieke de in het virale genoom aanwezige beperkingsgebieden (Figuur 2). De volledige cDNA-kloon werd aan het einde van de 5 '-end door de Human CMV Promoter geflankeerd om de expressie van vRNA in de kern van getransfuneerde cellen mogelijk te maken, en aan de 3 '-end door de HDV RZ, gevolgd door de BGH polyadenylering en terminatie sequenties, om Rna's te produceren die de precieze 3 '-end van het virale genoom (Figuur 2). De stabiliteit in bacteriën van de gegenereerde BAC cDNA-kloon, samen met zijn eenvoudige manipulatie met behulp van standaard recombinant DNA-technologieën, benadrukt het potentieel van de BAC cDNA-benadering voor de snelle en betrouwbare generatie van stabiele volledige cDNA-klonen van ZIKV en andere flavivirussen of positief-gestrande RNA-virussen met instabiele virale Genomes.
Zodra de kloon van de Bac cDNA werd geassembleerd (Figuur 2), kon infectieuze virus gemakkelijk worden hersteld na de directe transfectie van vatbare Vero-cellen met de Bac cDNA-kloon met cationische liposomen(Figuur 3). Dit cDNA-gelanceerd systeem toegestaan de intracellulaire expressie van de afgetopte Vrna, waardoor het herstel van infectieuze virussen zonder de noodzaak voor een in vitro transcriptie stap. Met behulp van deze aanpak, we waren in staat om rZIKV-RGN te redden met Antilichaamtiters hoger dan 106 Pfu/ml op 5 dagen posttransfection (figuur 4a). Bovendien veroorzaakte het gered virus een duidelijke CPE (figuur 4b), gegenereerde homogene plaques van ongeveer 2 mm in grootte (figuur 4c), en de identiteit ervan werd bevestigd door sequencing (gegevens niet weergegeven) en immunofluorescentie analyse met behulp van de MAB-specifieke voor ZIKV E-eiwit, 1176-56 (figuur 4D). In vitro gegevens geven aan dat de herstelde rZIKV-RGN efficiënt wordt gerepliceerd in Vero-cellen en op niveaus in vergelijking met een natuurlijk ZIKV-isolaat32 (gegevens niet weergegeven). Over het algemeen tonen deze resultaten aan dat infectieuze rZIKV kan worden gered van volledige cDNA-klonen die in een BAC zijn geassembleerd.
Figuur 1 : Zikv genoom organisatie en virion structuur. (A) genoom organisatie: zikv bevat een positief enkel-streng RNA dat wordt vertaald als een enkel poly eiwit. De vertaalde poly proteïne werd gecleaved door virale (pijlen) en gastheer (diamanten) proteasen voor de productie van de structurele eiwitten capside (C, blauw), matrix (M, Brown), en omhullen (E, groen), en zeven niet-structurele eiwitten (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, en NS5). De 5 ' en 3 ' onvertaalde gebieden (UTRs) aan het einde van het virale genoom worden aangeduid met zwarte lijnen. B) virion structuur: zikv virionen werden versierd met de E-en M-eiwitten, verankerd in een lipide-dubbellaag met een icosahedrale achtige structuur. Onder de virale omhullen was de virale nucleocapside-samengesteld uit het C-eiwit dat is geassocieerd met het virale genomische RNA. Dit cijfer is aangepast van Ávila-Pérez et al.18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Assemblage van de ZIKV van de volledige lengte infectieuze cDNA kloon in een BAC. A) Schematische weergave van de pBeloBAC11 BAC: de regulerende genen ParA, parb, parCen Repe,de oorsprong van de F-factor replicatie (OriS), het chlooramfenicol resistente gen (cmr) en het Lac Z-gen zijn geïndiceerd. De relevante beperkings sites die worden gebruikt om de infectieuze ZIKV cDNA-kloon te monteren, worden onderstreept. B) samenstelling van zikv infectieuze cDNA-kloon in de pBeloBAC11 BAC: vier overlappende DNA-fragmenten (Z1-Z4), die het gehele zikv-genoom (Figuur 1) bedekken en geflankeerd door de aangegeven beperkings plaatsen, werden gegenereerd door chemische synthese en opeenvolgend gekloond in pBeloBAC11 voor het genereren van de infectieuze ZIKV cDNA kloon pBAC-ZIKV. De volledige lengte ZIKV infectieuze cDNA werd geassembleerd onder de controle van het humaan cytomegalovirus onmiddellijk-vroege promotor (CMV) en geflankeerd aan de 3 '-end door de HDV ribozyme (RZ) en de groei van het bovine-hormoon (BGH) beëindiging en polyadenylatie sequenties. De acroniemen voor de virale genen en regelgevende elementen zijn zoals beschreven in Figuur 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Workflow voor het genereren van rZIKV van de kloon van de Bac cDNA. Vero-cellen bij 90% van de samenvloeiing werden in monolaag met de zikv-infectieuze cDNA-kloon pbac-zikv (Figuur 2) met cationische liposomen getransffecteerd. Na 4-6 dagen posttransfectie, toen cpe duidelijk was, werden weefselkweek supernatanten met rzikv verzameld en geëvalueerd op de aanwezigheid van virus (Figuur 4) en gebruikt voor virale versterking in Vero-cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Herstel en in vitro karakterisering van rZIKV. A) redding van infectieuze rzikv uit de kloon van het BAC cDNA: Vero-cellen bij 90% van de samenvloeiing (6-goed plaat formaat, triplicaten) werden met een mock-transmissie of met 4 μg/put van pbac-Zikv (Figuur 3), en op de aangegeven dagen posttransfectie, virus Antilichaamtiters in weefselkweek supernatanten werden bepaald door plaque assay (Pfu/ml). De foutbalken geven standaardafwijkingen van drie verschillende transfectie experimenten aan. De gestippelde zwarte lijn geeft de aantoonbaarheidsgrens aan (50 PFU/mL). B) virale CPE: Vero-cellen met 90% samenvloeiing (6-goed plaat formaat, triplicaten) waren mock-geïnfecteerde (top) of GEÏNFECTEERD (MOI van 0,5 Pfu/cel) met rZIKV, en bij 48 h na infectie, werd de aanwezigheid van CPE geëvalueerd door Lichtmicroscopie. Schaal staven = 100 μm. (C) virale plaque assay en immunokleuring: Vero-cellen bij 90% samenloop (12-well plate Format) waren geïnfecteerd met rZIKV en bij 72 h na infectie werden virale plaques gevisualiseerd door kristalviolet kleuring (links) of door immunokleuring ( rechts) met behulp van het pan-Flavivirus E proteïne mAb 4G2. Schaal staven = 5 mm. (D) immunofluorescentie: Vero-cellen bij 90% samenvloeiing (24-goed plaat formaat, triplicaten) werden GEÏNFECTEERD (MOI van 0,5 Pfu/cel) met rzikv en, bij 48 h postinfectie, geanalyseerd door immunofluorescentie met behulp van de MAB 1176-56, specifiek voor zikv E eiwit. Celkernen waren bevlekt met DAPI. Er wordt een representatieve samengevoegde afbeelding van met ZIKV geïnfecteerde Vero-cellen weergegeven. Het witte vierkant in de rechterbovenhoek vertegenwoordigt een vergrote afbeelding van met ZIKV geïnfecteerde Vero-cellen. Schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Infectieuze cDNA-klonen vormen essentiële moleculaire hulpmiddelen voor fundamenteel onderzoek van RNA-virussen en de ontwikkeling van vaccins en/of de identificatie van antivirale strategieën. Echter, voor veel positief-gestrande RNA-virussen, waaronder flavivirussen, is de generatie van infectieuze cDNA-klonen moeilijk te wijten aan de instabiliteit van de gekloonde Cdna's wanneer ze worden gekweekt in bacteriën met behulp van standaard High-Copy-nummer plasmiden. In het geval van zikv en andere flavivirussen is deze instabiliteit hoofdzakelijk te wijten aan de lektige expressie van toxische virale eiwitten van cryptische bacteriële promoters die aanwezig zijn in het virale genoom14,15,16,17 . Hier beschrijven we een alternatief en krachtig protocol voor het genereren van een stabiele ZIKV volledige infectieuze cDNA kloon als een enkele plasmide, gebaseerd op het gebruik van de BAC plasmide pBeloBAC1134 (Figuur 2a) om het toxiciteits probleem te overwinnen, het gebruik van de CMV Promoter om de uitdrukking van de vRNA in de kern van getransfunde cellen mogelijk te maken, en de HDV RZ om Vrna's te genereren met nauwkeurige 3 '-ends (Figuur 2b). Met deze methode hebben we met succes een volledig stabiele infectieuze kloon van de ZIKV-stam RGN gegenereerd die het efficiënte en betrouwbare herstel van infectieuze rZIKV mogelijk maakt na de directe transfectie van gevoelige Vero-cellen (Figuur 3 en Figuur 4).
Er is een enorme inspanning geleverd in de afgelopen jaren om de instabiliteit problemen in verband met ZIKV infectieuze cDNA-klonen te overwinnen, en verschillende benaderingen zijn met succes geïmplementeerd18, met inbegrip van de in vitro ligatie van cDNA fragmenten24 ,25, laag-Copy plasmiden19,20, de inactivatie van cryptische bacteriële promotors door de invoering van stille mutaties26,27, intron insertion21, 22 , 23, de Gibson assembly methode30, de ISA methode28,29, en het gebruik van CPER31. Hoewel deze benaderingen het toxiciteits probleem overwinnen en nuttig zijn voor het genereren van ZIKV infectieuze cDNA-klonen, sommige van hen zijn bewerkelijk en presenteren verschillende nadelen, met inbegrip van de noodzaak voor in vitro ligatie en transcriptie stappen die virus verminderen herstel-efficiëntie of de invoering van een groot aantal stille mutaties te inactiveren cryptische bacteriële promotor die kan invloed hebben op virale fitness, onder andere. De in dit protocol beschreven aanpak biedt de volgende voordelen. i) het BAC plasmide pBeloBAC1134 heeft een streng gecontroleerde replicatie, waarbij één of twee kopieën van plasmide per cel worden gehouden, wat de toxiciteit minimaliseert en stabiel onderhoud mogelijk maakt in bacteriën van instabiele cdna's. II) de voortplanting en modificatie van BAC plasmiden zijn bijna gelijk aan die van conventionele plasmiden, gezien de lichte wijzigingen beschreven in dit protocol voor het manipuleren van grote-grootte BAC-DNA fragmenten en laag-Copy plasmiden. Met name de Bac cDNA kloon kan ook worden gewijzigd in E. coli door homologeuze recombinatie met behulp van de rode recombinatie systeem42,43,44. III) het gebruik van CMV Promoter maakt het mogelijk intracellulaire expressie van afgetopte ZIKV vRNA en het herstel van infectieuze virussen zonder een in vitro transcriptie stap te vereisen. IV) infectieuze rZIKV wordt gegenereerd na de directe transfectie van gevoelige cellen (bijv. Vero) met de kloon van het BAC cDNA. Aangezien DNA-transfectie in zoogdiercellen efficiënter is dan RNA-transfectie, is de herstel efficiëntie van het virus met de BAC-benadering hoger dan die waargenomen met RNA-transcripten, waardoor het aantal passages in kweekcellen wordt verminderd om een virale voorraad te genereren en Bijgevolg, beperking van de invoering van ongewenste mutaties door aanpassing van de celcultuur.
Ten slotte wordt het potentieel van de BAC-benadering ondersteund door het succesvolle gebruik van deze methode (met kleine aanpassingen) om infectieuze cDNA-klonen van andere flavivirussen te engineeren, waaronder Denguevirus36, en verschillende coronavirussen van hoge impact in gezondheid van mens en dier, zoals overdraagbare gastro-enteritis Corona37 (tgev), Feline infectieuze peritonitis virus38 (FIPV), humaan Corona OC4339 (hcov-OC43), ernstig acuut respiratoir syndroom Corona40 (SARS-CoV), en het Midden-Oosten respiratoire syndroom Corona41 (MERS-cov), onder andere.
In het protocol dat hier wordt beschreven, zijn er twee kritieke stappen die moeten worden overwogen. Een belangrijke overweging is het identificeren van geschikte unieke beperkings sites in het virale genoom die afwezig zijn in het BAC plasmide. Als er geen adequate beperkings sites beschikbaar zijn, kunnen er tijdens het klonen ontwerp nieuwe beperkings sites worden gegenereerd door de introductie van stille nucleotide-mutaties. Een andere belangrijke kwestie is dat de BAC plasmiden in slechts één of twee kopieën per cel aanwezig zijn, en daarom worden lage opbrengsten van BAC plasmiden met een hoge contaminatie van bacterieel genomisch DNA verkregen met behulp van standaardprotocollen die zijn ontworpen voor High-en medium-Copy-nummer plasmiden. Dit potentiële probleem is gemakkelijk te overwinnen met behulp van grote cultuur volumes en Zuiverende het BAC plasmide met een commerciële Kit speciaal ontwikkeld voor het zuiveren van BAC.
Samenvattend hebben we een krachtige ZIKV reverse genetische aanpak ontwikkeld op basis van het gebruik van een BAC die kan worden aangepast om stabiele en volledig functionele infectieuze cDNA-klonen van andere positief-gestrande RNA-virussen te genereren om de studie van de biologie van deze virussen en de ontwikkeling van vaccins en/of ter vergemakkelijking van de identificatie van antivirale geneesmiddelen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Carla Gómez bedanken voor haar technische assistentie in de BAC cDNA Clone Generation en Snezhana Dimitrova om te helpen met de video voorbereiding. Dit werk werd deels gesteund door subsidies van het Spaanse ministerie van economie en concurrentievermogen (MINECO, subsidie nummer BFU2016-79127-R) aan FAT en de National Institutes of Health (NIH, subsidie nummer 1R21AI120500) aan L.M.S. en FAT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Molecular Biology Reagents | |||
| Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 Units/mL |
| AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
| ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
| Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 Units/mL |
| BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 Units/mL |
| BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 Units/mL |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
| Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
| LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
| LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
| Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
| Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 Units/mL |
| Oligonucleotides | IDT | N/A | |
| Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
| Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
| Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 Units/mL |
| Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
| Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 Units/mL |
| SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
| Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
| T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 Units/mL |
| 2. Cell Culture Reagents | |||
| 6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
| 12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
| 24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
| Agar Noble | VWR | 214230 | |
| Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
| Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
| Cell Culture Dishes (100 mm x 21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
| Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
| Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
| DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
| L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
| Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
| PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
| ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
| 3. Equipment | |||
| Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
| Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
| Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
| High-speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
| SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
| Vortexer | Varies | N/A |
References
- Friedrich, M. J. WHO Calls Off Global Zika Emergency. JAMA. 317 (3), 246 (2017).
- Sirohi, D., et al. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
- Lindenbach, B. D., Murray, C. J., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer | Lippincott Williams & Wilkins. 712-748 (2013).
- Boeuf, P., Drummer, H. E., Richards, J. S., Scoullar, M. J., Beeson, J. G. The global threat of Zika virus to pregnancy: epidemiology, clinical perspectives, mechanisms, and impact. BMC Medicine. 14 (1), 112 (2016).
- Simpson, D. I. Zika virus infection in man. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Campos, G. S., Bandeira, A. C., Sardi, S. I. Zika Virus Outbreak, Bahia, Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1885-1886 (2015).
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Costello, A., et al. Defining the syndrome associated with congenital Zika virus infection. Bulletin of the World Health Organization. 94 (6), 406-406A (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- do Rosario, M. S., et al. Guillain-Barre Syndrome After Zika Virus Infection in Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 95 (5), 1157-1160 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. The New England Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLOS ONE. 6 (3), e18197 (2011).
- Aubry, F., Nougairede, A., Gould, E. A., de Lamballerie, X. Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and applications: a historical perspective. Antiviral Research. 114, 67-85 (2015).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. Journal of Virology. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Advances in Virus Research. 53, 183-207 (1999).
- Avila-Perez, G., Nogales, A., Martin, V., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetic Approaches for the Generation of Recombinant Zika Virus. Viruses. 10 (11), (2018).
- Annamalai, A. S., et al. Zika Virus Encoding Nonglycosylated Envelope Protein Is Attenuated and Defective in Neuroinvasion. Journal of Virology. 91 (23), (2017).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host & Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Liu, Z. Y., et al. Characterization of cis-Acting RNA Elements of Zika Virus by Using a Self-Splicing Ribozyme-Dependent Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Deng, C. L., et al. Recovery of the Zika virus through an in vitro ligation approach. Journal of General Virology. 98 (7), 1739-1743 (2017).
- Widman, D. G., et al. A Reverse Genetics Platform That Spans the Zika Virus Family Tree. mBio. 8 (2), (2017).
- Munster, M., et al. A Reverse Genetics System for Zika Virus Based on a Simple Molecular Cloning Strategy. Viruses. 10 (7), (2018).
- Zhao, F., et al. Negligible contribution of M2634V substitution to ZIKV pathogenesis in AG6 mice revealed by a bacterial promoter activity reduced infectious clone. Scientific Reports. 8 (1), 10491 (2018).
- Atieh, T., Baronti, C., de Lamballerie, X., Nougairede, A. Simple reverse genetics systems for Asian and African Zika viruses. Scientific Reports. 6, 39384 (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497 (Supplement C), 157-162 (2016).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (1), (2017).
- Setoh, Y. X., et al. De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere. 2 (3), (2017).
- Marquez-Jurado, S., et al. An Alanine-to-Valine Substitution in the Residue 175 of Zika Virus NS2A Protein Affects Viral RNA Synthesis and Attenuates the Virus In Vivo. Viruses. 10 (10), (2018).
- Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Wang, K., Boysen, C., Shizuya, H., Simon, M. I., Hood, L. Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. BioTechniques. 23 (6), 992-994 (1997).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Research. 180, 12-22 (2014).
- Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5516-5521 (2000).
- Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. Journal of Virology. 86 (11), 6258-6267 (2012).
- St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. Journal of Virology. 80 (7), 3670-3674 (2006).
- Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. Journal of Virology. 80 (21), 10900-10906 (2006).
- Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. mBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
- Jamsai, D., et al. Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette. Genomics. 82 (1), 68-77 (2003).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73 (1), 56-65 (2001).
- Tischer, B. K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. BioTechniques. 40 (2), 191-197 (2006).
