Summary
Den senaste epidemi av zikavirus belyser vikten av att etablera omvända genetiska metoder för att utveckla vacciner och/eller terapeutiska strategier. Här beskriver vi protokollet för att rädda ett infektiöst rekombinant zikavirus från en fullängds cDNA-klon som samlats i en bakterie konstgjord kromosom under kontroll av det humana cytomegalovirusets omedelbara-tidiga promotor.
Abstract
Association of zika virus (ZIKV) infektion med neurologiska komplikationer under det senaste världsomspännande utbrottet och avsaknaden av godkända vacciner och/eller antivirala läkemedel har underskattat det akuta behovet av att utveckla ZIKV omvända genetiska system för att underlätta studie av ZIKV biologi och utvecklingen av terapeutiska och/eller profylaktiska metoder. Men liksom med andra flavivirus, generationen av ZIKV fullängds infektiösa cDNA kloner har hämmats på grund av toxiciteten av virala sekvenser under dess amplifiering i bakterier. För att övervinna detta problem har vi utvecklat en icke-traditionell strategi som bygger på användning av bakteriella konstgjorda kromosomer (BACs). Med detta tillvägagångssätt genereras den fullängds cDNA-kopian av ZIKV-stammen Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) från fyra syntetiska DNA-fragment och monteras i en enda kopia pBeloBAC11 plasmid under kontroll av humant cytomegalovirus (CMV) omedelbar-tidigt promotor. Den sammansatta BAC cDNA klon är stabil under förökning i bakterier, och infektiösa rekombinant (r) ZIKV återvinns i Vero celler efter transfektion av BAC cDNA klon. Det protokoll som beskrivs här ger en kraftfull teknik för generering av infektiösa kloner av flavivirus, inklusive ZIKV, och andra positiva-strand RNA-virus, särskilt de med stora genom som har stabilitetsproblem under bakteriell förökning.
Introduction
ZIKV är en mygg buren medlem av flavivirus släkte inom familjen Flaviviridae som för närvarande utgör en global folkhälsokris1. Liksom andra flavivirus, ZIKV är en höljeförsedda RNA-virus med en icosahedral-liknande struktur som innehåller en positiv känsla, enkelsträngad RNA-molekyl på ca 10,8 KB (figur 1)2. Den virala arvsmassan kodar en stor polyprotein av cirka 3 423 aminosyror som bearbetas av virala och cellulära proteaser i tre strukturella proteiner (Capsid [C], premembran/membran [prM/M], och kuvert [E]) som är involverade i bildandet av virala partiklar och sju icke-strukturella (NS) proteiner (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B och NS5) som deltar i genomreplikering, virus sammansättning och undvikande av värdens immunsvar (figur 1)3.
Historiskt har zikv-infektion förknippats med en mild febril sjukdom4,5. Men den explosiva senaste pandemin av zikv infektioner i hela Syd-och Central Amerika, södra Stilla havet, och Västindien6,7,8, och dess samband med förekomsten av Guillain-Barrés syndrom och mikrocefali9,10,11,12,13, har förändrat den historiska uppfattningen och potentierade relevansen av zikv som en viktig mänsklig patogen. I denna mening kommer utvecklingen av molekylära verktyg, såsom infektiösa cDNA-kloner, att underlätta studiet av viral patogenes och utvecklingen av genetiskt definierade vacciner och identifieringen av antivirala läkemedel för behandling av ZIKV-infektion. Som beskrivits för andra flavivirus, är generering av ZIKV infektiösa kloner svårt på grund av förekomsten av kryptiska bakteriella initiativtagare i viral Genome14 som gör att läckande uttryck av giftiga virala proteiner under spridningen av cDNA kloner i bakterier med hjälp av standard hög-kopia-nummer plasmider15,16,17. För att övervinna denna toxicitet problem, flera icke-traditionella metoder har genomförts framgångsrikt under de senaste två åren18. Dessa inkluderar användning av låg-Copy-nummer plasmider19,20, införandet av introner att störa de giftiga regionerna21,22,23, in vitro-ligering av cDNA fragment 24 , 25, Mutations ljuddämpnings av kryptiska bakteriella initiativtagare närvarande i viral Genome26,27, infektiösa subgenomic amplikonerna (ISA)28,29, den Gibson monteringsmetod30 , och användningen av cirkulär polymerasförlängning reaktion (CPER)31.
Häri beskriver vi detaljerade protokoll för konstruktion av en fullängds cDNA klon av ZIKV stam ZIKV-RGN13, med hjälp av en BAC att övervinna toxicitet problemet, och räddning av infektiösa rZIKV genom direkt överföring av BAC cDNA klon till Vero celler32, en cellinjer som godkänts av Food and Drug Administration (FDA) för utveckling av humanvaccin33. I detta system är den fullständiga cDNA-kopian av virusgenomet monterad i BAC plasmid pBeloBAC1134 (figur 2A), en Plasmid med låg kopia (en till två kopior per cell) som härrör från Escherichia coli F-Factor35. som minimerar toxiciteten av flavivirussekvenser under dess utbredning hos bakterier. Den cDNA av zikv genom är monterad i pBeloBAC11 under kontroll av den mänskliga CMV omedelbar-tidig promotor, att tillåta uttrycket av viral (v) RNA i kärnan av transfekterade celler av cellulära RNA-polymeras II, och flankerad vid 3 '-End av hepatit deltavirus (HDV) ribozym (RZ), följt av sekvenser av nötkreatur tillväxthormon (BGH) uppsägning och polyadenylering signaler att producera syntetiska rnas med autentiska 5 '-och 3 '-ändar av viral genomet, respektive (figur 2b). Detta cDNA-lanserade system resulterar i det intracellulära uttrycket av utjämnat virus-RNA, vilket möjliggör återhämtning av infektiösa ZIKV utan behov av en in vitro-transkription steg. Den BAC metoden ger en kraftfull metod som gäller för att konstruera stabila och fullt fungerande infektiösa cDNA kloner för andra flavivirus, liksom andra positiva-strandsatta RNA-virus36,37, 38,39,40,41.
Protocol
1. konstruktion av en ZIKV infektiös cDNA-klon i en BAC
Anmärkning: Strategin för montering av ZIKV i BACs beskrivs för RGN-stammen13 (anslutningsnummer KU527068) (figur 2).
- Välj unika restriktionssajter som är lämpligt placerade i det virala genomet som saknas i plasmid pBeloBAC11 (figur 2A).
Anmärkning: För ZIKV-RGN valdes begränsnings platserna PML I, AFE I och BstB I (genomiska positioner 3 347, 5 969 respektive 9 127). Om inga lämpliga begränsnings platser finns tillgängliga i viral genom, generera nya restriktionssajter genom att införa tysta nukleotidmutationer i viral genomet under design av cDNA-fragment. - Generera genom kemisk syntes fyra cDNA fragment spänner över full längd arvsmassan (Z1 till Z4), flankerad av CMV promotorn vid 5 '-End och HDV RZ, BGH uppsägning, och polyadenylation sekvenser vid 3 '-End ( figur 2b). Varje fragment måste flankeras av de valda begränsnings platserna (steg 1,1).
Anmärkning: Fragment Z1 används som en ryggrad för att klona resten av fragment i pBeloBac11. För detta ändamål måste det innehålla den mänskliga CMV promotorn och måste flankeras vid 5 '-End av ApaL jag (för att klona detta fragment i pBeloBAC11) och ASC i (frånvarande i viral genomet), och vid 3 '-End av restriktionssorter som valts för montering av infektiös klon (PML I , AFE i, och BstB i) följt av MLU I (frånvarande i viral genomet) och BamH I (för att klona detta fragment i pBeloBAC11). Fragment Z4 måste innehålla den genomiska regionen från den sista restriktionplats som valts (BstB I) till slutet av viral genomet, följt av HDV-RZ, BGH-terminering och polyadenylationssekvenser, och MLU I-Restriktionshalten (figur 2b). Alternativt kan cDNA-fragmenten (Z1-Z4) genereras genom en kombination av vanliga omvända transkriptas-polymeraskedjereaktioner (RT-PCRs) och överlappande PCRs med specifika oligonukleotider. - Montera den smittsamma cDNA-klon genom sekventiell kloning av fragment Z1 till Z4 i pBeloBAC11 (figur 2b).
- Smälta pBeloBAC11 plasmid och Z1-fragmentet med ApaL I och BamH I. För detta, blanda 2 μg pBeloBAC11 plasmid eller 1 μg Z1 fragment med 10 μL 10X reaktionsbuffert, 20 enheter av varje enzym, och vatten för att nå en slutlig volym av 100 μL. Inkubera vid 37 ° c i 2 timmar.
- Defosforylera BAC vektorn med hjälp av räkor alkaliskt fosfatas (SAP). För detta ändamål, tillsätt 2,5 μL (2,5 enheter) av sav till den smälta BAC och inkubera vid 37 ° c för 1 h. Värm-inaktivera sav genom inkubation vid 75 ° c i 15 min.
- Rena defosforylerade BAC vektor och fragment Z1 av aguppstod gel elektrofores med hjälp av en kommersiell gel Clean-up kit optimerad för rening av DNA-fragment större än 10 kB (se tabellen av material).
- Utför ligeringreaktionen för att generera plasmid (p) BAC-Z1. För detta ändamål, Blanda 150 ng av renad smälta BAC vektor med den renade insatsen med hjälp av en molar förhållandet mellan vektor-till-INSERT av 1:3, 1,5 μL av 10X T4 DNA Ligase buffert som innehåller 10 mM ATP, en enhet av T4 DNA Ligase, och vatten till en slutlig volym av 15 μL.
- Inkubera ligationsblandningen i 20 h vid 16 ° c. Som kontrollerar av ligationreaktionen, utför parallellt en ligationreaktion utan sätter in. Värm upp ligasen genom inkubation vid 65 ° c i 15 min.
Anmärkning: När det gäller trubbiga DNAs, inkubera ligationsreaktionen i 20 h vid 14 ° c. På grund av den stora storleken på BAC vektor (figur 2A), är det viktigt att använda större mängder av vektor och infoga än ligationer med konventionella plasmider för att öka ligering effektivitet. - Omvandla 50 μl av E. coli DH10B elektrokompetenta celler med 2 μl av ligeringsreaktionen (steg 1.3.5) genom elektroporation (25 μF kapacitans, 2,5 kV och 100 Ω motstånd), med hjälp av elektroporering kyvetter försedda med elektroder placerade i intervaller om 0,2 cm, efter standardprotokoll.
- Överför cellerna till ett Polypropenrör med 1 mL SOC-medium (2% Tryptone, 0,5% jästextrakt, 0,05% NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mm MgSO4, 20 mm glukos [pH 7,0]) och inkubera dem vid 37 ° c i 1 h med skonsam skakning (200-250 rpm). Platta cellerna på Luria buljong (LB) agar plattor som innehåller 12,5 μg/mL kloramfenikol och inkubera dem vid 37 ° c för 16 h.
- Plocka 8 till 12 bakteriekolonier, göra en replik på en färsk LB agar tallrik som innehåller 12,5 μg/mL kloramfenikol, och testa om de innehåller rätt infoga genom direkt PCR-analys med hjälp av specifika oligonukleotides.
- Välj en positiv koloni från replik plattan, odla den i 100 mL LB innehållande 12,5 μg/mL kloramfenikol och isolera BAC cDNA genom den alkaliska Lys metoden med hjälp av ett kommersiellt plasmid MIDI-kit, efter rekommendationen för rening av stora plasmider med låg kopia (se tabell över material).
Anmärkning: BAC cDNA som utarbetats av denna metod kan vara förorenat med upp till 30% av bakteriell genomisk DNA, men det är lämpligt i kvalitet för att utföra begränsning analys, sekvensering, och kloning. Beroende på BAC-storlek, kan avkastningen på 4-6 μg av BAC plasmid erhållas. - Kontrollera den genetiska integriteten hos det klonade cDNA genom begränsnings analys. Digest 500 ng av pBAC-Z1 Plasmid med ASC I och PML I vid 37 ° c för 1 h och bekräfta närvaron av Z1 fragment av gel elektrofores. För att ytterligare bekräfta att oönskade mutationer inte har införts, sekvens insatsen med specifika oligonukleotides.
- Med början från plasmid pBAC-Z1 som innehåller de valda restriktionssajterna (PML I, AFE I, BstB I och MLU I), sekventiellt klona fragment Z2 till Z4 för att generera full längd infektiös cDNA klon pBAC-ZIKV (figur 2b), efter liknande experimentella metoder som beskrivs ovan för fragment Z1 (steg 1.3.1-1.3.10).
2. beredning av hög renhet pBAC-ZIKV för räddning av infektiösa rZIKV
Anmärkning: Den storskaliga beredningen av en ultrarent PBAC-zikv infektiös klon, lämplig för transfektion och räddning av smittsamma virus, utförs av alkaliska Lys med en kommersiell kit speciellt utvecklad för BAC rening (se tabell över Material). Kitet måste innehålla ett ATP-beroende Exonuklease digestionssteg som avlägsnar bakteriell genomisk DNA-kontamination, vilket möjliggör isolering av BAC cDNA med en renhetsgrad som liknar den som erhålls med cesiumkloridmetoden.
- Odla en enda koloni av E. coli DH10B som transporterar PBAC-zikv infektiös klon i 5 ml lb-medium innehållande 12,5 μg/ml kloramfenikol vid 37 ° c i 8 timmar med skonsam skakning (200-250 rpm).
- Tillsätt 1 mL bakterieodling (steg 2,1) till 500 mL LB med 12,5 μg/mL kloramfenikol i en 2 L kolv och odla cellerna vid 37 ° c i 14-16 h (till en OD600 på 0,6-0,8).
Anmärkning: Rika buljonger, såsom Terrific buljong (TB), kan producera extremt höga cell tätheter, vilket resulterar i en lägre avkastning och mindre renhet av BAC cDNA. - Rena BAC infektiösa cDNA-klon av alkaliska Lys med hjälp av en kommersiell kit speciellt utvecklad för BAC rening, enligt tillverkarens specifikationer (se tabellen av material). Förvara det renade BAC cDNA vid 4 ° c. Beroende på Bac storlek, kan avkastningen på 30 μg ultrarent BAC cDNA klon erhållas.
Anmärkning: Torka inte DNA-pelleten i mer än 5 minuter, eftersom övertorkning kommer att göra det svårt att lösa upp BAC cDNA. På grund av den stora storleken på Bac cDNA klon, undvika vortexa eller pipettering för att förhindra plasmid klippning.
3. räddning av infektiösa rZIKV från BAC cDNA klon av transfektion av Vero celler
Anmärkning: Infektiösa rZIKV återvinns genom transfektion av Vero-celler med pBAC-ZIKV cDNA-klon, med hjälp av en kommersiell katjoniska lipidtransfektion reagens (se tabellen av material; Figur 3).
- En dag före transfektion, plattan på 6-well tallrikar 5 x 105 Vero celler/väl i tillväxtmedium (Dulbecco modifierade Eagle ' s medium [DMEM] kompletteras med 5% foster bovint serum [FBS], 2 mm L-glutamin, och 1% onödiga aminosyror) utan antibiotika för att höja 90% konfluenta-cellmonolayers vid tidpunkten för transfektion.
Anmärkning: Vi rekommenderar att du utför virus räddningar i tre exemplar. -
Equilibrate serum-reducerad medium (se tabellen av material) vid rumstemperatur och förbereda transfektion blandningar i sterila mikrofugrör rör för varje transfektion prov enligt följande.
- Tillsätt 4 μg BAC cDNA klon i 250 μl av serum-reducerad medium och blanda försiktigt, undvika vortexa att förhindra plasmid klippning.
- Späd 12 μL av transfektionsreagens (1 mg/mL) i ett separat rör (se tabellen med material) i 250 μl serum reducerat medium, blanda med vortexing och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Kombinera den utspädda BAC cDNA och transfection reagens (med en 1:3 förhållandet mellan DNA: transfektion reagens), blanda försiktigt och samtidigt undvika vortexing, och inkubera i rumstemperatur för 20-30 min.
- Under inkubationstiden för BAC cDNA/transfektion reagentblandning, tvätta Vero celler med odlingssubstrat utan antibiotika och lämna cellerna i 1 mL färskt medium utan antibiotika.
Anmärkning: Tillsats av antibiotika under transfektionprocessen kan minska transfektionseffektiviteten. - Fördela droppvis den 500 μl av den BAC cDNA/transfection reagens blandningen (av steg 3.2.3) på Vero celler, blanda dem genom att gunga plattan fram och tillbaka, och inkubera cellerna i en 5% Co2 fuktad inkubator vid 37 ° c för 6 h.
- Ta bort transfektion mediet, tillsätt 2 mL färskt odlingssubstrat med antibiotika (100 U/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin), inkubera cellerna i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° c, och kontrollera varje dag för induktion av cytopatisk effekt (CPE ).
Anmärkning: ZIKV CPE är ganska uttalad i Vero celler och det kännetecknas av närvaron av rundade och birefrragande celler som lossnar och flyter i vävnad kulturen supernatanten. - Samla in alikvoter (100 μL) av supernatanterna av Vero cell Tissue (steg 3,5) var 24: e timme för att fastställa effektiviteten hos virus återvinningen genom att bedöma närvaron av ZIKV med hjälp av en standard-plack-analys på färska Vero-celler (figur 4a).
- Efter fyra till sex dagar av transfektion, när CPE är runt 50%-75% (figur 4b), samla in vävnad kulturen samman supernatanterna i 15 ml koniska rör och centrifugera vid 2 000 x g i 10 min vid 4 ° c för att ta bort cellulära skräp.
- Skörda supernatanterna som innehåller rZIKV och kassera cell pellets. Aliquot supernatanten i kryotubes och förvara dem vid-80 ° c för att ytterligare bekräfta närvaron av räddade rZIKV.
4. titrering av återvunna rZIKV-
- En dag före titrering, utsäde på 12-well plattor 2,5 x 105 Vero celler/väl i tillväxtmedium för att höja 90% konfluenta cell enskiktslager vid tidpunkten för titrering.
Anmärkning: Vi rekommenderar att man genomför titreringen av de återvunna rZIKV i tre exemplar. - Ta bort en alikvot av supernatanten från frysen (steg 3,8) och gör seriella 10-faldigt spädningar i odlingsmedium utan FBS.
- Tvätta Vero-celler 2x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 200 μL/brunn av varje virus utspädning i tre exemplar. Placera plattorna i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° c och häll var 15 min under en 90 min adsorptionsperiod.
- Ta bort viral inoculum, överlagra cellerna med 2 mL tillväxtmedium som innehåller 2% FBS, 1% DEAE-dextran, och 0,6% agar Noble, och inkubera vid 37 ° c under 5 % Co2 för 3-4 dagar.
Anmärkning: Det är möjligt att använda Agreste, metylcellulosa, eller andra overlay media. Tiden för korrekt plack bildas varierar beroende på overlay används och ZIKV stam. -
Fix ZIKV-infekterade celler med 1 mL/brunn av 4% formaldehyd utspädd i PBS vid rumstemperatur i 1 h, ta bort överlägget, och visualisera de virala plack genom färgning dem med 0,1% Crystal Violet i 20% metanol vid rumstemperatur i 15 min.
- Kassera kristallviolett, tvätta 3x med vatten, låt plattorna torka, och räkna manuellt plack (figur 4c, vänster panel). Viral titer beräknas som plack bildar enheter per milliliter (PFU/ml).
-
Alternativt kan virala plack visualiseras genom immunofärgning med Pan-flavivirus E protein Mouse monoklonal antikropp (mAb) 4G2 (figur 4c, höger panel).
- För att utvärdera ZIKV plack genom immunofärgning, efter fixering och avlägsnande av overlay agar som beskrivs ovan (i steg 4,5), tvätta cellerna 2x med PBS och permeabilize dem genom inkubation med 200 μL/brunn av 0,5% Triton-X100 i PBS för 15 min vid rumstemperatur.
- Ta bort permeabiliseringslösningen, tvätta cellerna 3x med PBS och blockera dem med 200 μL/brunn av blockerande lösning (10% FBS i PBS) för 1 h vid rumstemperatur.
Anmärkning: Andra standardblockeringslösningar (t. ex. 2,5% BSA i PBS) kan användas i detta steg. - Ta bort den blockerande lösningen och inkubera cellerna med 200 μL/brunn av Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 utspädd i blockerande lösning (1 μg/mL) i 1 h vid 37 ° c.
Anmärkning: Andra mAb eller polyklonala antikroppar (pAb) kan användas i stället för 4G2 för immunofärgning och detektion av virala plack. - Tvätta cellerna 3x med PBS och inkubera dem med 200 μL biotinylerad antimus sekundär antikropp utspädd (efter tillverkarens rekommendation) i blockerande lösning för 1 h vid 37 ° c.
- Ta bort den sekundära antikroppen, tvätta cellerna 4x med PBS och visualisera de virala plack med hjälp av en Avidin/biotin-baserade peroxidassats enligt tillverkarens specifikationer (se tabellen av material).
5. bekräftelse av lyckad rZIKV räddning
Anmärkning: För att ytterligare bekräfta identiteten hos det räddade viruset analyseras ZIKV E proteinuttryck genom immunofluorescens med hjälp av musen mAb 1176-56 specifikt för ZIKV E protein (figur 4D). Detta mAb är specifikt för ZIKV E protein, i motsats till situationen för Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 (steg 4.6.3). Alternativt kan virus identiteten bekräftas genom sekvensering.
- En dag före immunofluorescensanalys, utsäde täckglas i 24-brunn plattor som innehåller 1 x 105 Vero celler/väl i tillväxtmedium för att höja 90% konfluenta cell enskiktslager vid tidpunkten för infektionen.
- Tvätta cellerna 2x med PBS och infektera dem med en mångfald av infektion (MOI) av 0,5 PFU/cell av det räddade viruset i tillväxtmedium utan FBS (100 μL/brunn) i tre exemplar. Inkubera plattorna vid 37 ° c i 90 min.
- Efter viral adsorption, ta bort viral inoculum, tillsätt 0,5 mL av färskt odlingssubstrat med 2% FBS, och inkubera cellerna i en 5% CO2 befuktade inkubator vid 37 ° c för 48 h.
- Ta bort vävnad kulturen supernatanten, fixa cellerna med 150 μL/brunn av 4% PARAFORMALDEHYD i PBS för 20 min vid rumstemperatur, och permeabilize cellerna med 150 μL/brunn av 0,5% Triton-X100 i PBS för 15 min vid rumstemperatur.
- Efter avlägsnande av depolarisering lösning och tvätta cellerna 3x med PBS, blockera cellerna med 150 μl/brunn av blockerande lösning under 1 h vid rumstemperatur.
Anmärkning: Cell skanning blockeras med alternativa blockeringslösningar (t. ex. 2,5% BSA i PBS). - Ta bort blockeringslösningen och inkubera cellerna med 100 μL/brunn av mAb 1176-56, specifikt för ZIKV E-protein, utspädd i blockerande lösning (1 μg/mL) för 1 h vid 37 ° c.
- Tvätta cellerna 3x med PBS, inkubera dem vid rumstemperatur i 1 h med 100 μL/brunn av Alexa fluor 488-konjugerad antimus sekundär antikropp utspädd (efter tillverkarens rekommendation) i blockerande lösning, tvätta cellerna i stor utsträckning med PBS och Inkubera dem med 150 μL/brunn av 4 ', 6 '-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 mg/mL) utspädd 1:200 i PBS vid rumstemperatur i 10 min.
- Tvätta cellerna 3x med PBS, montera täckglas på ett AntiFade monteringsmedium (se tabellen av material), och analysera proverna under ett fluorescensmikroskop.
Anmärkning: För långtidsförvaring, förvara proverna vid 4 ° c, skyddade från ljus.
6. amplifiering och generering av virus bestånd
Anmärkning: När identiteten hos det räddade viruset bekräftas (avsnitt 5), förstärka viruset på Vero-celler och generera virala lager för fortsatta studier.
- Odla Vero-celler i 100 mm x 21 mm plattor på 90% sammanflödet och infektera dem med en Moi av 0,1 PFU/cell som beskrivits tidigare.
- När CPE är runt 75% (ca 48-72 h postinfektion), samla in vävnads kulturen supernatanten i ett 50 mL koniskt rör och centrifugera vid 2 000 x g i 10 min vid 4 ° c för att ta bort den cellulära skräp.
- Skörda supernatanten som innehåller rZIKV och kassera cellpelleten. Aliquot supernatanten i kryotubes och förvara dem vid-80 ° c.
- Ta bort ett virus alikvot från frysen och bestäm viral titer genom plack test som beskrivs tidigare (avsnitt 4).
Representative Results
Det protokoll som beskrivs här gör det möjligt för generering av stabila ZIKV full längd cDNA infektiösa kloner med hjälp av en BAC för att minimera toxicitet problem i samband med flera flavivirala sekvenser. Effektiv återhämtning av infektiösa rZIKV från BAC cDNA-klon kan lätt uppnås efter transfektion av mottagliga Vero-celler (figur 2). Med detta protokoll har vi genererat en stabil fullängds cDNA-klon av ZIKV-stammen RGN32 genom att i ordningsföljd klona fyra överlappande cDNA-fragment till BAC plasmid pBeloBAC1134 med konventionella klonings metoder och unika restriktionssajter som förekommer i virusgenomet (figur 2). Den fullständiga cDNA-klonen flankerades vid 5-änden av den humana CMV-promotorn för att tillåta uttrycket av vRNA i kärnan av transfekterade celler, och vid 3-änden av HDV-RZ följt av BGH polyadenylering och terminerings-sekvenser, för att framställa rnas som innehåller den exakta 3-änden av virusgenomet (figur 2). Stabiliteten hos bakterier i den genererade BAC cDNA-klonen, tillsammans med dess enkla manipulation med hjälp av standardiserade rekombinanta DNA-tekniker, belyser potentialen hos BAC cDNA-metoden för snabb och tillförlitlig generering av stabila fullängds cDNA-kloner av ZIKV och andra flavivirus eller positiva-strandsatta RNA-virus med instabila virala genomer.
När BAC cDNA klon var monterad (figur 2), smittsamma virus kan lätt återvinnas efter direkt överföring av mottagliga Vero-celler med BAC cDNA klon med hjälp av katjoniska liposomer(figur 3). Detta cDNA-lanserade systemet tillät intracellulära uttrycket av den utjämnade vRNA, vilket möjliggör återvinning av smittsamma virus utan behov av en in vitro-transkription steg. Med hjälp av denna metod kunde vi rädda rZIKV-RGN med titrar högre än 106 PFU/ml vid 5 dagar posttransfektion (figur 4a). Dessutom inducerade det räddade viruset en tydlig CPE (figur 4b), genererade homogena plack på ca 2 mm i storlek (figur 4c), och dess identitet bekräftades genom sekvensering (data som inte visats) och immunofluorescensanalys med hjälp av den MAB specifika för ZIKV E protein, 1176-56 (figur 4D). In vitro data indikerar att den återvunna rZIKV-RGN replikeras effektivt i Vero-celler och nivåer jämfört med en naturlig ZIKV isolera32 (data visas inte). Sammantaget visar dessa resultat att infektiösa rZIKV kan räddas från full längd cDNA kloner monteras i en BAC.
Figur 1 : Zikv arvs organisation och spjälkat virus struktur. (A) arvsmassa organisation: zikv innehåller ett positivt enkelsträngat RNA som översätts som en enda polyprotein. Den översatta polyprotein var klyvs av viral (pilar) och värd (diamanter) proteaser för att producera strukturella proteiner kapsid (C, blå), matris (M, brun), och omge (E, grön), och sju icke-strukturella proteiner (ns1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, och NS5). De 5 "och 3" icke översatta regionerna (utr) i slutet av viral genomet indikeras med svarta linjer. (B) Virion struktur: zikv virioner var dekorerad med E och M proteiner, förankrade i ett lipidbilayer med en ikosahedral-liknande struktur. Enligt viral kuverten var viral nucleocapsid består av C-proteinet i samband med viral genomisk RNA. Denna siffra har anpassats från Ávila-Pérez et al.18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Montering av ZIKV fullängds infektiösa cDNA klon i en BAC. A) schematisk representation av pBeloBAC11 Bac: regulatoriska gener ParA, parb, ParCoch repe,F-faktorreplikeringens ursprung (OriS), kloramfenikolresistenta genen (cmr) och Lac Z-genen indikeras. De relevanta begränsnings områden som används för att montera den smittsamma ZIKV cDNA-klon är understrukna. (B) montering av zikv fullängd infektiös cDNA-klon i pBeloBAC11 Bac: fyra överlappande DNA-fragment (Z1-Z4), som täcker hela zikv-genomet (figur 1) och flankeras av de angivna begränsnings platserna, genererades av kemisk syntes och sekventiellt klonade in pBeloBAC11 att generera den smittsamma ZIKV cDNA klon pBAC-ZIKV. Den fullängds zikv infektiösa cDNA samlades under kontroll av humant cytomegalovirus omedelbar-tidig promotor (CMV) och flankerad vid 3 '-slutet av HDV ribozym (RZ) och nötkreatur tillväxthormon (BGH) uppsägning och polyadenylation sekvenser. Akronymerna för virugener och regulatoriska element beskrivs i figur 1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Arbetsflöde för att generera rZIKV från Bac cDNA klon. Vero-celler vid 90% av sammanflödet transfekterade i enskiktslager med zikv full-length infektiösa cDNA klon PBAC-zikv (figur 2) med hjälp av katjoniska liposomer. Vid 4-6 dagar posttransfektion, när CPE var uppenbart, vävnad kultur samman supernatanterna innehåller rzikv samlades och utvärderas för förekomst av virus (figur 4) och används för viral förstärkning i Vero celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Återhämtning och in vitro karaktärisering av rZIKV. (A) räddning av infektiösa rzikv från Bac cDNA-klon: Vero-celler vid 90% av sammanflödet (6-well tallrik format, tre exemplar) var håna-transfekterade eller transfekterade med 4 μg/brunn av PBAC-zikv (figur 3), och vid de angivna dagarna posttransfektion, virus titrar i vävnad kultur samman supernatanterna bestämdes genom plack assay (PFU/ml). Felstaplar indikerar standardavvikelser från tre olika transfektionsexperiment. Den streckade svarta linjen indikerar detektionsgränsen (50 PFU/mL). (B) viral CPE: Vero celler vid 90% sammanflödet (6-well tallrik format, triplicates) var mock-infekterade (topp) eller infekterade (Moi av 0,5 PFU/cell) med rzikv, och vid 48 h postinfection, förekomsten av CPE utvärderades genom ljus mikroskopi. Skalstreck = 100 μm. (C) viral plack assay och immunofärgning: Vero celler vid 90% sammanflödet (12-well tallrik format) var infekterade med rzikv, och vid 72 h postinfection, virala plack visualiserades av kristall violett färgning (vänster) eller genom immunofärgning ( till höger) med Pan-flavivirus E protein mAb 4G2. Skalstreck = 5 mm. (D) immunofluorescens: Vero-celler vid 90% sammanflödet (24-brunn plätera formaterar, triplicates) var infekterade (Moi av 0,5 PFU/cell) med rzikv och, på 48 h postinfection, analyserad av immunofluorescens med hjälp av MAB 1176-56, specifikt för zikv E-protein. Cell kärnor färgas med DAPI. En representativ sammanfogad bild av de ZIKV-infekterade Vero-cellerna visas. Den vita kvadraten uppe till höger representerar en förstorad bild av de ZIKV-infekterade Vero-cellerna. Skalstreck = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Infektiösa cDNA-kloner utgör essentiella molekylära verktyg för grundforskning av RNA-virus och utveckling av vacciner och/eller identifiering av antivirala strategier. Men för många positiva-strandsatta RNA-virus, inklusive flavivirus, är generering av infektiösa cDNA-kloner svåra på grund av instabiliteten hos den klonade cDNAs när den sprids i bakterier med hjälp av standardiserade hög-kopieringsplasmider. När det gäller zikv och andra flavivirus beror denna instabilitet främst på det läckande uttrycket av giftiga virala proteiner från kryptiska bakteriella initiativtagare som finns i viral genomet14,15,16,17 . Här beskriver vi ett alternativt och kraftfullt protokoll för att generera en stabil ZIKV fullängds infektiös cDNA-klon som en enda plasmid, baserad på användningen av BAC plasmid pBeloBAC1134 (figur 2A) för att övervinna toxicitetsproblemet, användningen av CMV promotor att tillåta uttrycket av vRNA i kärnan av transfekterade celler, och HDV RZ att generera vrnas med exakt 3 '-ändar (figur 2b). Med den här metoden har vi framgångsrikt genererat en fullt stabil smittsam klon av ZIKV-stammen RGN som möjliggör effektiv och tillförlitlig återhämtning av infektiösa rZIKV efter direkt överföring av mottagliga Vero-celler (figur 3 och Figur 4).
En enorm ansträngning har gjorts under de senaste åren för att övervinna instabilitet problem i samband med ZIKV infektiösa cDNA kloner, och flera metoder har framgångsrikt genomförts18, inklusive in vitro-ligering av cDNA fragment24 ,25, låg-kopia plasmider19,20, inaktivering av kryptiska bakteriella initiativtagare genom införandet av tysta mutationer26,27, intron insättning21, 22 , 23, den Gibson monteringsmetod30, ISA metod28,29, och användningen av cper31. Även om dessa metoder övervinna toxicitet problemet och är användbara för att generera ZIKV infektiösa cDNA kloner, några av dem är mödosamma och uppvisar flera nackdelar, inklusive behovet av in vitro-ligering och transkription steg som minskar virus återhämtning effektivitet eller införandet av ett stort antal tysta mutationer för att inaktivera kryptiska bakteriell promotor som kan påverka viral Fitness, bland annat. Det tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll innebär följande fördelar. i) den BAC plasmid pBeloBAC1134 har en strikt kontrollerad replikering, att hålla en eller två kopior av plasmid per cell, vilket minimerar toxicitet och möjliggör stabilt underhåll i bakterier av instabila cdnas. II) spridningen och modifieringen av BAC plasmider är nästan desamma som för konventionella plasmider, med tanke på de smärre modifieringar som beskrivs i detta protokoll för att manipulera stora BAC-DNA-fragment och lågkopieringsplasmider. I synnerhet kan BAC cDNA-klon också modifieras till E. coli genom homolog rekombination med hjälp av det röda rekombinations systemet42,43,44. III) användning av CMV-promotorn gör det intracellulära uttrycket av utjämnade ZIKV vRNA och återvinning av smittsamma virus utan att kräva en in vitro-transkription steg. IV) infektiös rZIKV genereras efter direkt transfektion av mottagliga celler (t. ex. Vero) med BAC cDNA-klon. Eftersom DNA-transfektion i däggdjursceller är effektivare än RNA-transfektion, är virusets återhämtnings effektivitet med BAC-metoden högre än den som observerats med hjälp av RNA-utskrifter, vilket minskar antalet passager i kultur celler för att generera en virusstam och, Följaktligen begränsar införandet av oönskade mutationer genom cellkultur anpassning.
Slutligen, potentialen i BAC strategi stöds av en framgångsrik användning av denna metod (med smärre ändringar) att iscensätta infektiösa cDNA kloner av andra flavivirus, inklusive denguefeber virus36, och flera coronaviruses av hög effekt i människors och djurs hälsa, såsom transmissibel gastroenterit coronavirus37 (tgev), felint infektiös peritonit-virus38 (fipv), humant coronavirus OC4339 (HCoV-OC43), svår akut respiratorisk sjukdom coronavirus40 (Sars-CoV), och Mellanöstern respiratoriskt syndrom coronavirus41 (Mers-COV), bland annat.
I det protokoll som beskrivs här finns det två kritiska steg som bör övervägas. En viktig faktor är att identifiera lämpliga unika restriktioner platser i viral genomet som saknas i BAC plasmid. Om det inte finns några lämpliga begränsnings platser kan nya restriktionssajter genereras under klonings designen genom att tysta nukleotidmutationer införs. En annan viktig fråga är att BAC plasmider finns i endast en eller två kopior per cell, och därför, låg avkastning av BAC plasmider med en hög förorening av bakteriell genomisk DNA erhålls med hjälp av standardprotokoll avsedda för hög-och medel-kopiera-numrerar Plasmids. Detta potentiella problem är lätt att övervinna med hjälp av stora kultur volymer och rening av BAC Plasmid med en kommersiell kit speciellt utvecklad för BAC rening.
Sammanfattnings, har vi utvecklat en kraftfull ZIKV omvänd genetisk strategi som bygger på användning av en BAC som kan anpassas för att generera stabila och fullt fungerande infektiösa cDNA kloner av andra positiva-strandsatta RNA-virus för att underlätta studiet av biologi av dessa virus och utveckling av vacciner och/eller för att underlätta identifieringen av antivirala läkemedel.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Carla Gómez för hennes tekniska hjälp i BAC cDNA klon generationen och Snezhana Dimitrova för att hjälpa till med video förberedelse. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från det spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft (MINECO, Grant Number BFU2016-79127-R) till F.A.T. och National Institutes of Health (NIH, Grant nummer 1R21AI120500) till L.M.S. och F.A.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Molecular Biology Reagents | |||
| Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 Units/mL |
| AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
| ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
| Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 Units/mL |
| BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 Units/mL |
| BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 Units/mL |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
| Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
| LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
| LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
| Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
| Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 Units/mL |
| Oligonucleotides | IDT | N/A | |
| Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
| Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
| Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 Units/mL |
| Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
| Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 Units/mL |
| SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
| Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
| T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 Units/mL |
| 2. Cell Culture Reagents | |||
| 6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
| 12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
| 24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
| Agar Noble | VWR | 214230 | |
| Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
| Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
| Cell Culture Dishes (100 mm x 21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
| Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
| Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
| DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
| L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
| Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
| PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
| ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
| 3. Equipment | |||
| Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
| Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
| Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
| High-speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
| SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
| Vortexer | Varies | N/A |
References
- Friedrich, M. J. WHO Calls Off Global Zika Emergency. JAMA. 317 (3), 246 (2017).
- Sirohi, D., et al. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
- Lindenbach, B. D., Murray, C. J., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer | Lippincott Williams & Wilkins. 712-748 (2013).
- Boeuf, P., Drummer, H. E., Richards, J. S., Scoullar, M. J., Beeson, J. G. The global threat of Zika virus to pregnancy: epidemiology, clinical perspectives, mechanisms, and impact. BMC Medicine. 14 (1), 112 (2016).
- Simpson, D. I.
- Campos, G. S., Bandeira, A. C., Sardi, S. I. Zika Virus Outbreak, Bahia, Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1885-1886 (2015).
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Costello, A., et al. Defining the syndrome associated with congenital Zika virus infection. Bulletin of the World Health Organization. 94 (6), 406-406A (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- do Rosario, M. S., et al. Guillain-Barre Syndrome After Zika Virus Infection in Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 95 (5), 1157-1160 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. The New England Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLOS ONE. 6 (3), e18197 (2011).
- Aubry, F., Nougairede, A., Gould, E. A., de Lamballerie, X. Flavivirus reverse genetic systems, construction techniques and applications: a historical perspective. Antiviral Research. 114, 67-85 (2015).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. Journal of Virology. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Advances in Virus Research. 53, 183-207 (1999).
- Avila-Perez, G., Nogales, A., Martin, V., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetic Approaches for the Generation of Recombinant Zika Virus. Viruses. 10 (11), (2018).
- Annamalai, A. S., et al. Zika Virus Encoding Nonglycosylated Envelope Protein Is Attenuated and Defective in Neuroinvasion. Journal of Virology. 91 (23), (2017).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host & Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Liu, Z. Y., et al. Characterization of cis-Acting RNA Elements of Zika Virus by Using a Self-Splicing Ribozyme-Dependent Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Deng, C. L., et al. Recovery of the Zika virus through an in vitro ligation approach. Journal of General Virology. 98 (7), 1739-1743 (2017).
- Widman, D. G., et al. A Reverse Genetics Platform That Spans the Zika Virus Family Tree. mBio. 8 (2), (2017).
- Munster, M., et al. A Reverse Genetics System for Zika Virus Based on a Simple Molecular Cloning Strategy. Viruses. 10 (7), (2018).
- Zhao, F., et al. Negligible contribution of M2634V substitution to ZIKV pathogenesis in AG6 mice revealed by a bacterial promoter activity reduced infectious clone. Scientific Reports. 8 (1), 10491 (2018).
- Atieh, T., Baronti, C., de Lamballerie, X., Nougairede, A. Simple reverse genetics systems for Asian and African Zika viruses. Scientific Reports. 6, 39384 (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497 (Supplement C), 157-162 (2016).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. Journal of Virology. 91 (1), (2017).
- Setoh, Y. X., et al. De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere. 2 (3), (2017).
- Marquez-Jurado, S., et al. An Alanine-to-Valine Substitution in the Residue 175 of Zika Virus NS2A Protein Affects Viral RNA Synthesis and Attenuates the Virus In Vivo. Viruses. 10 (10), (2018).
- Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Wang, K., Boysen, C., Shizuya, H., Simon, M. I., Hood, L. Complete nucleotide sequence of two generations of a bacterial artificial chromosome cloning vector. BioTechniques. 23 (6), 992-994 (1997).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Research. 180, 12-22 (2014).
- Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5516-5521 (2000).
- Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. Journal of Virology. 86 (11), 6258-6267 (2012).
- St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. Journal of Virology. 80 (7), 3670-3674 (2006).
- Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. Journal of Virology. 80 (21), 10900-10906 (2006).
- Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. mBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
- Jamsai, D., et al. Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette. Genomics. 82 (1), 68-77 (2003).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73 (1), 56-65 (2001).
- Tischer, B. K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. BioTechniques. 40 (2), 191-197 (2006).
