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Biochemistry

जीवाणु रोगजनक फैटी एसिड समावेश के अध्ययन के लिए चिकन अंडे Yolk से लाइपोप्रोटीन कणों का अलगाव झिल्ली Phospholipids में शामिल

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59538
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Summary

इस विधि में जटिल मेजबान स्रोतों से बाह्य जात फैटी एसिड को जीवाणु झिल्ली, विशेष रूप से स्टेफिलोकोकस ऑरियसमें शामिल करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, चिकन अंडे की जर्दी से लिपोप्रोटीन कणों के संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल और बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करने वाले बैक्टीरियल फॉस्फोलिपिड के बाद फैटी एसिड प्रोफाइलिंग का वर्णन किया गया है।

Abstract

स्टैफिलोकोकस ऑरियस और अन्य ग्राम-पॉजिटिव रोगजनकों में पर्यावरण से फैटी एसिड को झिल्ली फॉस्फोलिपिड में शामिल किया जाता है। संक्रमण के दौरान, अधिकांश exogenous फैटी एसिड मेजबान लिपोप्रोटीन कणों के भीतर मौजूद हैं। अनिश्चितता मेजबान फैटी एसिड के जलाशयों और तंत्र जिसके द्वारा बैक्टीरिया लिपोप्रोटीन कणों से फैटी एसिड निकालने के रूप में रहता है। इस काम में, हम चिकन अंडे की जर्दी से कम घनत्व लिपोप्रोटीन (एलडीएल) कणों के संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन और निर्धारित है कि क्या एलडीएल एस ऑरियसके लिए फैटी एसिड जलाशयों के रूप में सेवा करते हैं। इस विधि निष्पक्ष lipidomic विश्लेषण और चिकन LDLs, LDLs और बैक्टीरिया के बीच बातचीत की खोज के लिए एक प्रभावी और किफायती मॉडल का शोषण. एलडीएल से Exogenous फैटी एसिड के एस aureus एकीकरण का विश्लेषण उच्च संकल्प / सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर के लिए किया जाता है, जीवाणु की फैटी एसिड संरचना की विशेषता को सक्षम करने एलडीएल के संपर्क में आने पर जीवाणु झिल्ली लिपिड में उत्पन्न होने वाले फैटी एसिड के उपन्यास संयोजनों की झिल्ली और निष्पक्ष पहचान। इन उन्नत मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक फॉस्फोलिपिड में शामिल विशिष्ट exogenous फैटी एसिड खुलासा करके फैटी एसिड निगमन की एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य प्रदान करते हैं. यहाँ उल्लिखित तरीके अन्य जीवाणु रोगजनकों और जटिल फैटी एसिड के वैकल्पिक स्रोतों के अध्ययन के लिए अनुकूलनीय हैं।

Introduction

मेथिसिलिन-प्रतिरोधी एस ऑरियस (एमआरएसए) स्वास्थ्य देखभाल से जुड़े संक्रमण का प्रमुख कारण है और संबद्ध एंटीबायोटिक प्रतिरोध एक काफी नैदानिक चुनौती1,2,3है। इसलिए, उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों का विकास एक उच्च प्राथमिकता है. ग्राम सकारात्मक रोगजनकों के लिए एक आशाजनक उपचार रणनीति फैटी एसिड संश्लेषण को बाधित कर रही है, झिल्ली फॉस्फोलिपिड उत्पादन के लिए एक आवश्यकता है कि, एस ऑरियसमें, फॉस्फेटtidylglycerol (पीजी), lysyl-पीजी, और cardilipin4शामिल हैं। बैक्टीरिया में, फैटी एसिड उत्पादन फैटी एसिड संश्लेषण द्वितीय मार्ग (FASII)5के माध्यम से होता है, जो यूकैरियोटिक समकक्ष से काफी अलग है, जिससे FASII एंटीबायोटिक विकास के लिए एक आकर्षक लक्ष्य5,6 . FASII अवरोधक मुख्य रूप से लक्ष्य फैबी, फैटी एसिड कार्बन श्रृंखला दीर्घीकरण7के लिए आवश्यक एक एंजाइम. फेबी अवरोधक ट्राइक्लोसन का प्रयोग मोटे तौर पर उपभोक्ता और चिकित्सा वस्तुओं8,9 में किया जाताहै. एस ऑरियस संक्रमण10,11,12,13,14 के उपचार के लिए कई दवा कंपनियों द्वारा अतिरिक्त फैबी अवरोधक विकसित किए जा रहे हैं ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. हालांकि, कई ग्राम सकारात्मक रोगजनकों, एस ऑरियससहित, फास्फोलिपिड संश्लेषण के लिए exogenous फैटी एसिड की सफाई करने में सक्षम हैं, FASII निषेध को दरकिनार27,28,29. इस प्रकार, एफएएसआईआई अवरोधकों की नैदानिक क्षमता पर मेजबान फैटी एसिड के स्रोतों और तंत्र के बारे में हमारे ज्ञान में काफी कमियों के कारण बहस होती है जिसके द्वारा रोगजनक मेजबान27,28से फैटी एसिड निकालते हैं। इन कमियों को दूर करने के लिए, हमने एस ऑरियसकी झिल्ली फॉस्फोलिपिड में लिपोप्रोटीन कणों से बहिर्जात फैटी एसिड को शामिल करने की निगरानी करने के लिए एक निष्पक्ष लिपिडोमिक विश्लेषण विधि विकसित की है।

सेप्सिस के दौरान, मेजबान लिपोप्रोटीन कण वास्कुलेचर के भीतर मेजबान व्युत्पन्न फैटी एसिड के एक संभावित स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि मेजबान फैटी एसिड के बहुमत कणों के साथ जुड़े हुए हैं30। लाइपोप्रोटीन में फॉस्फोलिपिड और प्रोटीन से बना हाइड्रोफिलिक खोल होता है जो ट्राइग्लिसराइड्स और कोलेस्ट्रॉल एस्टर31के हाइड्रोफोबिक कोर को संलग्न करता है . लिपोप्रोटीन के चार प्रमुख वर्गों---chylomicron, बहुत कम घनत्व लिपोप्रोटीन, उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन, और कम घनत्व लिपोप्रोटीन (एलडीएल) लिपिड परिवहन वाहनों के रूप में मेजबान और समारोह द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, फैटी एसिड और कोलेस्ट्रॉल देने के लिए और से वाहिकाविन्यास के माध्यम से मेजबान कोशिकाओं. एलडीएल ट्राइग्लिसराइड्स और कोलेस्ट्रॉल एस्टर31सहित एस्टर्वेड फैटी एसिड में प्रचुर मात्रा में हैं। हम पहले से पता चला है कि अत्यधिक शुद्ध मानव LDLs पीजी संश्लेषण के लिए exogenous फैटी एसिड का एक व्यवहार्य स्रोत हैं, इस प्रकार FASII अवरोध करनेवाला बाईपास32के लिए एक तंत्र प्रदान . मानव एलडीएल को शुद्ध करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और समय लगता है, जबकि शुद्ध मानव एलडीएल के वाणिज्यिक स्रोत नियमित आधार पर उपयोग करने के लिए या बड़े पैमाने पर जीवाणु स्क्रीन करने के लिए निषिद्ध रूप से महंगे हैं। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम चिकन अंडे की जर्दी, लिपोप्रोटीन कणों का एक समृद्ध स्रोत33से एलडीएल के संवर्धन के लिए एक प्रक्रिया को संशोधित किया है। हम सफलतापूर्वक untargeted, उच्च संकल्प / सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का इस्तेमाल किया है एस aureus32की झिल्ली में मानव एलडीएल व्युत्पन्न फैटी एसिड के निगमन पर नजर रखने के लिए. पहले की सूचना दी तरीकों के विपरीत, इस दृष्टिकोण तीन प्रमुख staphylococcal फॉस्फोलिपिड प्रकार में से प्रत्येक के लिए व्यक्तिगत फैटी एसिड आइसोमर्स मात्रा में कर सकते हैं. Oleic एसिड (18:1) सभी मेजबान लिपोप्रोटीन कणों के भीतर मौजूद एक असंतृप्त फैटी एसिड है कि आसानी से एस ऑरियस फॉस्फोलिपिड29,30,32में शामिल किया जाता है . एस ऑरियस ओलिक एसिड संश्लेषण29में सक्षम नहीं है; इसलिए, फॉस्फोलिपिड-इन्कॉर्पोरेट्ड ओलिक एसिड की मात्रा स्टैफिलोकोकल झिल्ली29के भीतर मेजबान लिपोप्रोटीन व्युत्पन्न फैटी एसिड की उपस्थिति स्थापित करती है। इन फॉस्फोलिपिड प्रजातियों की पहचान यहां वर्णित अत्याधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि द्वारा की जा सकती है, जिसमें एक फैटी एसिड स्रोत की उपस्थिति में एस ऑरियस की झिल्ली संरचना के अभूतपूर्व संकल्प की पेशकश की गई है। संक्रमण के दौरान मुठभेड़ों.

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Protocol

नोट: चिकन अंडे की जर्दी से एलडीएल कणों के संवर्धन के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल Moussa एट अल से ली गई है 200233.

1. एलडीएल कणों के संवर्धन के लिए चिकन अंडे की जर्दी की तैयारी

  1. 70% इथेनॉल समाधान के साथ गोले धोने और सूखी हवा के लिए अनुमति देकर दो बड़े चिकन अंडे Sanitize.
  2. 70% इथेनॉल समाधान का उपयोग कर अंडे विभाजक Sanitize और सूखी हवा के लिए अनुमति देते हैं। एक मध्यम आकार बीकर के होंठ पर अंडे विभाजक संलग्न करें।
  3. अंडे विभाजक में व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक अंडे दरार और एल्बुरेन बीकर में प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं। बरकरार अंडे की जर्दी विभाजक द्वारा बनाए रखा जाएगा.
  4. अवशिष्ट एल्बुमिन को हटाने के लिए अंडे की जर्दी को 30 एमएल बाँझ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) से दो बार धोएं।
  5. धीरे से फिल्टर कागज पर अंडे की जर्दी जगह है.
  6. एक बाँझ पिपेट टिप के साथ vitelline झिल्ली पंचर और एक बाँझ 50 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब में झिल्ली की सामग्री नाली. झिल्ली और फिल्टर कागज छोड़ें.

2. चिकन अंडे की जर्दी से एलडीएल युक्त प्लाज्मा का अंशीकरण

  1. अंडे की जर्दी के लिए पीएच 7.0 पर 0ण्17 एम NaCl के लगभग दो संस्करणों जोड़ें और जोरदार मिश्रण. फिर इस समाधान को 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं।
  2. अंडे की जर्दी को 10 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। दानेदार अंश (सुपरनेट) से प्लाज्मा अंश (सुपरनेंट) को एक बाँझ 50 एमएल शंकु नली में निकालें।
  3. चरण 2.2 दोहराएँ.

3. प्लाज्मा से एलडीएल कणों का अलगाव

  1. प्लाज्मा अंश को 40% अमोनियम सल्फेट (w/v) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 60 मिनट के लिए मिलाएं।
  2. 8-7 के लिए 420 mM NaOH समाधान के साथ प्लाज्मा अंश के पीएच समायोजित करें।
  3. 45 मिनट की अवधि के लिए 10,000 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अंडे की जर्दी कमजोर पड़ने का केंद्रीकरण करें। ऊपरी अर्धठोस पीले अंश को 7 केडीए छिद्र आकार डायलिसिस ट्यूबिंग में निकालें। ट्यूबिंग में कमरे प्रदान करने के लिए यह प्रफुल्लित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. अमोनियम सल्फेट को हटाने के लिए अल्ट्रापुरे पानी के 3 एल में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर डायलीज़। एक हलचल पट्टी का उपयोग कर पानी को धीरे से उत्तेजित करें।
  5. एक बाँझ 50 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब में dilyzed समाधान स्थानांतरण.
  6. 45 मिनट की अवधि के लिए 10,000 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को सावधानी से एक बाँझ ट्यूब के लिए ऊपरी अर्द्धठोस पीले अंश को हटा दें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. फैटी एसिड के एक स्रोत के रूप में चिकन एलडीएल का आकलन

  1. सबकल्चर एस ऑरियस कोशिकाओं में 5 एमएल फैटी एसिड मुक्त 1% tryptone शोरबा और मिलाते हुए (225 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट। फैटी एसिड auxotrophs के लिए, फैटी एसिड का एक स्रोत के साथ पूरक संस्कृतियों.
  2. 1% ट्रिप्टोन शोरबा में 0.1 की 600 एनएम (ओडी600) पर एक ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) के लिए रात भर संस्कृतियों को समाप्त करें। एक गोल-नीचे 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 50 डिग्री सेल्सियस पिपेट।
    नोट: फैटी एसिड auxotrophs के साथ काम करते समय, tryptone शोरबा के दो संस्करणों में रात भर संस्कृतियों धोने और संस्कृति के ओडी का निर्धारण करने से पहले फैटी एसिड के ले जाने को सीमित करने के लिए tryptone शोरबा के 5 एमएल में resuspend.
  3. अनुपचारित नियंत्रण वाले कुओं के लिए, प्रति अच्छी तरह से 1% ट्रिप्टोन शोरबा का 50 $L जोड़ें।
  4. प्रयोगात्मक सेल निलंबन युक्त कुओं के लिए, 1% tryptone शोरबा के 50 $L जोड़ें 10% अंडे की जर्दी व्युत्पन्न एलडीएल, 2 $M trilosan, या 10% अंडे की जर्दी व्युत्पन्न एलडीएल और 2 $M trilosan के साथ पूरक.
    नोट: इस बिंदु पर, प्रत्येक अच्छी तरह से शामिल होंगे 100 डिग्री एल और अंडे की जर्दी व्युत्पन्न एलडीएल और trilosan प्रति अच्छी तरह से अंतिम एकाग्रता 5% और 1 डिग्री सेल्सियस, क्रमशः हो जाएगा.
  5. विकास की निगरानी के लिए निरंतर, रैखिक मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करते हुए, समय के साथ OD600 को मापें।

5. झिल्ली लिपिड विश्लेषण के लिए एलडीएल के साथ एस ऑरियस की इन्क्यूबेशन।

  1. फैटी एसिड मुक्त 1% tryptone शोरबा के 5 एमएल में एक अलग कॉलोनी संस्कृति और मिलाते हुए (225 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  2. रात भर की संस्कृतियों 1:100 एक बाँझ 250 एमएल में चकित फ्लास्क जिसमें 1% tryptone शोरबा के 50 एमएल युक्त। मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्य लॉग चरण (लगभग 4 ज) के लिए इनक्यूबेट।
  3. एक बाँझ 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और गोली कोशिकाओं को संस्कृति के 25 एमएल स्थानांतरण। सुपरनेंट निकालें और 1% ट्रिप्टोन शोरबा के 750 डिग्री एल में सेल गोली को फिर से करें।
  4. पुन: निलंबित कोशिकाओं और एक बाँझ 1.5 एमएल अपकेंद्रण ट्यूब में सेल निलंबन के 300 डिग्री सेल्सियस का मिश्रण।
  5. वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए एलडीएल जोड़ें और 4 ज के लिए मिलाते हुए (225 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 2 मिनट की अवधि के लिए 16,000 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को सेंट्रीफ्यूज करें और बाँझ पीबीएस के दो खंडों में सेल छर्रों को धोएं फिर दोहराएं।
  7. प्रत्येक गीला सेल गोली के वजन रिकॉर्ड. सूखी बर्फ पर या तरल नाइट्रोजन में सेल छर्रों को स्नैप-फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या सीधे अनुभाग 6 पर आगे बढ़ें।

6. एस ऑरियस झिल्ली लिपिड का निष्कर्षण

  1. सूखी बर्फ पर जमे हुए एस ऑरियस सेल छर्रों रखें। सेल गोली की मात्रा के बराबर मोती की मात्रा का उपयोग करते हुए, प्रत्येक सेल गोली के शीर्ष पर 0.5 मिमी zirconium ऑक्साइड मोती जोड़ें.
    नोट: लिपिड निष्कर्षण की इस विधि के लिए एक विकल्प के रूप में, शोधकर्ताओं ने अच्छी तरह से स्थापित Bligh और डायर या Folch तरीकों जीवाणु कोशिकाओं से लिपिड सटीक के लिए उपयोग कर सकतेहैं 34.
  2. 75% मेथनॉल (HPLC ग्रेड) के 740 डिग्री एल जोड़ें -80 डिग्री सेल्सियस सीधे सेल छर्रों के लिए ठंडा।
  3. एक आंतरिक मानक के रूप में कोशिकाओं की 1 मिलीग्राम प्रति 1 मिलीग्राम 50 डिग्री सेल्सियस डाइमाइरिस्टोल फॉस्फाटिडिलकोलाइन (मेथनॉल में तैयार) के 2 डिग्री एल जोड़ें। परखनली को बंद करें और बुलेट ब्लेंडर ऊतक homogenizer में एक उपलब्ध बंदरगाह में प्रत्येक नमूने युक्त 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब जगह है. कम गति पर नमूने Homogenize, 2-3 की स्थापना, 3 मिनट के लिए.
  4. एकरूपता के लिए नमूनों का दृष्टि से निरीक्षण करें। यदि कक्षों के क्लंप दिखाई देते हैं, तो बुलेट ब्लेंडर में 2 मिनट की वृद्धि में एकरूपता जारी रखें.
  5. बुलेट ब्लेंडर से नमूने निकालें और एक रासायनिक धूआं हुड करने के लिए स्थानांतरण।
  6. प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए क्लोरोफॉर्म के 270 डिग्री एल जोड़ें। 30 मिनट के लिए नमूने जोरदार भंवर.
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म एक संभव कासिफ्य है।
  7. बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में नमूनों को कम से कम 2,000 x ग्रामपर 30 मिनट तक के लिए सेंट्रीफ्यूज करें . तेजी से गति संगत अपकेंद्रित्र ट्यूबों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है और centrifugation की अवधि 10 मिनट के लिए छोटा किया जा सकता है.
  8. एक रासायनिक धूआं हुड में, monophasic supernatant इकट्ठा करने और एक नया परीक्षण ट्यूब के लिए स्थानांतरण, जबकि ध्यान से निष्कर्षण ट्यूब के तल पर प्रोटीन गोली से परहेज.
  9. प्रोटीन गोली के लिए 75% मेथनॉल (HPLC ग्रेड) और क्लोरोफॉर्म के 270 डिग्री एल के 740 $L जोड़ें, और ऊपर चरण 6.6-6.8 में वर्णित के रूप में प्रत्येक नमूने को फिर से निकालें। प्रत्येक नमूने के लिए पहले एकत्र supernatant के साथ दूसरी निष्कर्षण से supernatant का मिश्रण.
  10. अक्रिय गैस जैसे नाइट्रोजन या आर्गन की धारा के अंतर्गत या अपकेंद्रण संकेन्द्रक (सामग्री की सारणी) का उपयोग करके निर्वात के अंतर्गत निष्कर्षण सॉल्वैंट्सकोवाष्पित करना।
  11. सूखे लिपिड अर्क को 1.0 एमएल जलीय 10 एमएल अमोनियम बाइकार्बोनेट घोल के साथ तीन बार धोएं और चरण 6.10 के रूप में नमूनों को फिर से सुखाएं।
  12. इस तरह के आइसोप्रोपेनोल के रूप में एक उपयुक्त गैरध्रुवीय विलायक में सूखे लिपिड अर्क को फिर से निलंबित। 20 $L प्रति 1 मिलीग्राम के नए सेल वजन का उपयोग कर के नमूने को पुन: निलंबित कदम में निर्धारित 5.7 वैकल्पिक रूप से, यदि सेल छर्रों का वजन अज्ञात है, तो आइसोप्रोपेनोल के 200 डिग्री एल में नमूनों को फिर से निलंबित करें और धारा 7 पर आगे बढ़ें।

7. उच्च संकल्प का उपयोग कर एस ऑरियस लिपिड प्रोफाइल का विश्लेषण /

  1. एक पूर्ण लिपिड विश्लेषण आयोजित करने से पहले, प्रयोगात्मक समूह (ओं) से प्रतिनिधि परीक्षण के नमूने का चयन करें और नमूना कमजोर पड़ने श्रेणियों जिसमें कुल लिपिड सांद्रता रैखिक के भीतर गिर निर्धारित करने के लिए नमूना कमजोर पड़ने कारकों की एक श्रृंखला पर उन्हें विश्लेषण द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के लिए डिटेक्टर प्रतिक्रिया की सीमा, जैसा कि पहले वर्णित35.
  2. प्रत्येक नमूना लिपिड निकालने के वाष्पित लिपिड निष्कर्ष के अधीन किया जा करने के लिए लिपिड विश्लेषण के अधीन किया जा करने के लिए, अक्रिय गैस के तहत या एक सेंट्रीफ्यूज कंस्टर में वैक्यूम के तहत alicots सुखाने के द्वारा (सामग्री की तालिका)।
  3. तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) ग्रेड आइसोप्रोपेनोल में प्रत्येक सूखे लिपिड निकालने को पुन: असाइन करें:मेथेनोल (2:1, v:v) जिसमें 20 एम एम अमोनियम फोरमेट युक्त है, चरण 7.1 में निर्धारित वॉल्यूम के बराबर वॉल्यूम का उपयोग करके।
  4. एक अलक्षित लिपिड विश्लेषण के लिए, नमूने प्रवाह इंजेक्शन या अर्क के प्रत्यक्ष जलसेक द्वारा क्रोमैटोग्राफी के उपयोग के बिना उच्च संकल्प / सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री मंच के लिए सीधे पेश किया जा सकता है35,36. एक उपयुक्त autosampler शीशी या 96 अच्छी तरह से थाली के लिए चरण 7.3 में तैयार पतला लिपिड अर्क स्थानांतरण.
  5. प्रवाह इंजेक्शन आधारित विश्लेषण के लिए, एक तापमान नियंत्रित में autosampler शीशियों जगह (15 डिग्री सेल्सियस) एक HPLC प्रणाली केautosampler के रूप में केशिका / अनुपात और प्रवाह निगरानी प्रणाली.
  6. एलसी-एमएस ग्रेड आइसोप्रोपेनोल:मेथेनॉल (2:1, v:v) जिसमें 20 एम अमोनियम फोरमेट युक्त HPLC विलायक जलाशयों भरें।
  7. Agilent Chemstation सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, कार्यक्रम HPLC autosampler प्रदर्शन करने के लिए 5 $L नमूना इंजेक्शन. साधन मेनू से, इंजेक्शन सेट अपका चयन करें, और इंजेक्शन वॉल्यूम फ़ील्ड में 5.0 टाइप करें। इकाइयों microliters के रूप में दिया जाता है. सुनिश्चित करें कि HPLC 2:1 (v:v) आइसोप्रोपेनोल:मेथेनॉल जिसमें 20 एम अमोनियम फोरमेट युक्त 1 $L प्रति मिनट पर आइसोक्रेटिक प्रवाह के लिए सेट किया गया है।
  8. Chemstation साधन मेनू से, पम्प सेट करें का चयन करें और फिर माइक्रो फ्लो मोड टॉगल स्विच का चयन करें।
  9. समय सारिणी क्षेत्रों में, दर्ज करें: समय 0.00, 100% बी, प्रवाह 1.0| हिट दर्ज करें और समय 10.0, 100% बी, फ्लो 1.0दर्ज करके समय सारिणी में एक दूसरी पंक्ति बनाएँ। सेट अप पम्प मेनू के निचले भाग पर ठीक बटन का चयन करें. ये सेटिंग्स 1.0 $L प्रति मिनट की प्रवाह दर पर 10 विश्लेषणात्मक रन सक्षम करेंगे।
  10. एक कम प्रवाह (34 जी) धातु की सुई के साथ लगे एक electrospray आयनन स्रोत का उपयोग कर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए HPLC हस्तांतरण लाइन से eluate परिचय.
  11. थर्मो ट्यून प्लस साधन नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, सेटअप मेनू का चयन करें और गरम ईएसआई स्रोतका चयन करें। आयनन वोल्टता को 4000 ट तथा म्यान गैस को 5 (अव्वधन इकाइयाँ) पर इन मानों को संवाद बॉक्स के संगत क्षेत्रों में लिखकर सेट कीजिए। इसी प्रकार कैपिलरी टेम्प को 150 डिग्री सेल्सियस तथा एस-लेंस को 50% तक सेट करें।
    नोट: इन मानों के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए प्रत्येक मास स्पेक्ट्रोमेट्री मंच की आवश्यकता है।
  12. untargeted लिपिड विश्लेषण के लिए, डिटेक्टर के रूप में एक उच्च संकल्प / सटीक जन एमएस मंच (सामग्री कीतालिका) का उपयोग करें।
  13. थर्मो ट्यून प्लस सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, स्कैन परिभाषित करें बटन पर क्लिक करें, और विश्लेषक मेनू में FTMSका चयन करें। मास रेंज फ़ील्ड को सामान्य पर सेट करें और रिज़ॉल्यूशन फ़ील्ड में 100,000का चयन करें. सुनिश्चित करें कि स्कैन प्रकार पूर्णपर सेट है. स्कैन रेंज मेनू के अंतर्गत, प्रथम मास (m/z) फ़ील्ड में 200 दर्ज करें, और अंतिम मास (m/z) फ़ील्डमें 2000 दर्ज करें।
  14. सुनिश्चित करें कि नकारात्मक polarity सबसे प्रचुर मात्रा में एस aureus लिपिड का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है.
  15. आयन मानचित्रण अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर नमूना विश्लेषण दोहराएँ (एमएस /एमएस) ब्याज की एक वर्णक्रमीय क्षेत्र के भीतर सभी लिपिड आयनों के विखंडन लिपिड संरचनाओं और फैटी एसिड घटकों की पुष्टि करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, ब्याज के चयनित लिपिड आयनों को धारा 8 में प्रारंभिक लिपिड पहचान असाइन किए जाने के बाद एमएस/एमएस विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है।

8. अंतर्जात एस ऑरियस और exogenous एलडीएल व्युत्पन्न लिपिड की पहचान करने के लिए खोज डेटाबेस

  1. मनाया बड़े पैमाने पर सटीकता को और परिष्कृत करने के लिए थर्मो Xcalibur सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। Xcalibur में, उपकरण मेनू के अंतर्गत, ऑफ़लाइन पुनर्कैलिब्रेटकरें का चयन करें. ऑफ़लाइन विंडो को पुनः कैलिब्रेट करने के बाद, फ़ाइल मेनू का चयन करके और ओपन विकल्प का चयन करके पुनः कैलिब्रेट की जाने वाली बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम फ़ाइल लोड करें.
  2. ब्याज की फ़ाइल खोलें, दृश्य विंडो के शीर्ष पर पंक्ति सम्मिलित करें बटन टॉगल, एमएस रन के लिए कुल आयन क्रोमैटोग्राम देखने के लिए. कुल आयन क्रोमैटोग्राम में देखे गए सिग्नल पीक के एक किनारे पर कंप्यूटर माउस को बाएं से क्लिक करके और माउस को शिखर के सबसे व्यापक भाग में खींचकर प्राप्त एमएस सिग्नलका औसत.
  3. स्कैन फ़िल्टर मेनू के अंतर्गत, पूर्ण स्कैन MS डेटा के संगत फ़िल्टर का चयन करें. लोड रेफरी बटन का चयन करके और संदर्भ फ़ाइल का चयन करके कम से कम तीन ज्ञात एस ऑरियस अंतर्जात लिपिड के सैद्धांतिक मोनोआइसोटोपिक जनता वाले संदर्भ फ़ाइल को लोड करें। प्रत्येक लिपिड monoisotopic द्रव्यमान के आगे उपयोग करें बॉक्स का उपयोग करें।
  4. देखने वाली विंडो के निचले भाग पर खोज बटन क्लिक करें. पहले किया के रूप में कुल आयन क्रोमैटोग्राम में संकेत चोटी भर में एमएस संकेत फिर से औसत.
  5. देखने वाली विंडो के निचले भाग के पास कनवर्ट करें बटन क्लिक करें. जब संवाद कनवर्ट करें बॉक्स खुलता है, तो ठीकक्लिक करें. इस चरण को Omit यदि डेटा थर्मो वैज्ञानिक के अलावा अन्य विक्रेताओं से मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्लेटफार्मों पर एकत्र किया गया था.
  6. Xcalibur सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, प्रत्येक अनुपचारित या एलडीएल-उपचारित नमूने के लिए Excel फ़ाइल के कार्यपत्रकों को अलग करने के लिए पुनः कैलिब्रेट की गई सटीक ीकृत सटीक सामूहिक पीक सूचियों को निर्यात करें. Qual ब्राउज़र चिह्न का चयन करें। फ़ाइल मेनू का चयन करें और खोलें विकल्प का चयन करके ब्याज की recalibated फ़ाइल खोलें।
  7. चरण 8.2 में वर्णित के रूप में कुल आयन क्रोमैटोग्राम में व्यापक चोटी भर में संकेत औसत.
  8. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम देखने विंडो में thumbtack आइकन राइट क्लिक करें और देखें का चयन करें | स्पेक्ट्रम सूची| एक ही मेनू से, प्रदर्शन विकल्प का चयन करें और फिर प्रदर्शन मेनू में सभी चोटियों टॉगल बॉक्स. देखने वाली विंडो को बंद करने के लिए ठीक बटन क्लिक करें.
  9. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम देखने खिड़की में thumbtack आइकन पर फिर से क्लिक करें और निर्यात का चयन करें | क्लिपबोर्ड (निष्क्रिय मास)| पहले कार्यपत्रक के निर्यात किए गए डेटा कक्ष A1 को नई Excel स्प्रेडशीट में चिपकाएँ.
  10. निर्यात की गई डेटा फ़ाइल में पाठ की पहली 8 पंक्तियाँ हटाएँ, जैसे कि Excel स्प्रेडशीट के कक्ष A1 में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम से पहला मास डेटा बिंदु हो. प्रत्येक निर्यात की गई पीक सूची के लिए Excel फ़ाइल में किसी नए कार्यपत्रक का उपयोग करके प्रत्येक पुनः कैलिब्रेट की गई MS फ़ाइल का निर्यात दोहराएँ.
  11. लिपिड मास स्पेक्ट्रल विश्लेषण (LIMSA) सॉफ्टवेयर37 ऐड-इन एक्सेल के लिए का उपयोग करना, एक डेटाबेस का निर्माण ज्ञात एस aureus लिपिड प्रजातियों के आणविक सूत्रों के रूप में Hewelt-Belka एट अल द्वारा वर्णित के रूप में 201438, के रूप में अच्छी तरह से लिपिड प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करने वाले सूत्र जो एलडीएल में काल्पनिक रूप से मौजूद हो सकते हैं।
    नोट: इसके अतिरिक्त, ध्यान काल्पनिक जीवाणु लिपिड कि प्रमुख एलडीएल फैटी एसिड शामिल है के लिए डेटाबेस में संभावित आणविक सूत्रों को शामिल करने के लिए लिया जाना चाहिए, जैसे oleic (18:1) और linoleic (18:2) फैटी एसिड32.
  12. डेटाबेस बनाने के लिए, कोई रिक्त Excel स्प्रेडशीट खोलें. प्रथम कार्यपत्रक के कक्ष A1 में, लिपिड प्रजातियों के सैद्धांतिक/कम्प्यूटेड मोनोआइसोपिक द्रव्यमान को डेटाबेस में जोड़ा जाना, द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर में पाई जाने वाली आयनिक अवस्था में लिपिड प्रजातियों के द्रव्यमान के संगत प्रकार की होती है। कक्ष B1 में, लिपिड प्रजातियों, जैसे PG(34:0) के लिए कोई नाम दर्ज करें.
  13. सेल C1 में, लिपिड प्रजातियों के लिए आण्विक सूत्र दर्ज करें, जो द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर में पाए गए लिपिड की आयनिक अवस्था से संबंधित है। कोशिका घ1 में, जन स्पेक्ट्रममापी में पाई गई लिपिड प्रजातियों के आवेश को दर्ज की गई है। खोज डेटाबेस में दर्ज किया जा करने के लिए अगले लिपिड प्रजातियों के लिए एक नई प्रविष्टि शुरू करने के लिए सेल A2 के लिए ले जाएँ।
  14. कदम दोहराएँ 8.12 और 8.13 जब तक सभी वांछित लिपिड प्रजातियों डेटाबेस में दर्ज किया गया है. डेटाबेस फ़ाइल सहेजें और इसे Excel में खुला छोड़ दें.
  15. Excel में, ऐड-इन्स मेनू का चयन करें. LIMSA सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करने के लिए LIMSA का चयन करें। मुख्य मेनू से, कंपाउंड लाइब्रेरी क्लिक करें... बटन. प्रकट होने वाली नई विंडो में, कंपाउंड आयातकरें क्लिक करें. यह LIMSA सॉफ्टवेयर द्वारा उपयोग के लिए यौगिक डेटाबेस अपलोड करेगा.
  16. विक्रेता के निर्देशों के अनुसार Excel के लिए LIMSA सॉफ़्टवेयर ऐड-इन का उपयोग कर सभी MS स्पेक्ट्रम पर सटीक-द्रव्यमान आधारित लिपिड पहचान निष्पादित करें35. LIMSA मुख्य मेनू से, स्पेक्ट्रम प्रकार मेनू के अंतर्गत पीक सूची का चयन करें. polarity जिसमें एमएस डेटा प्राप्त किया गया था के साथ संगत करने के लिए सकारात्मक मोड या नकारात्मक मोड का चयन करें।
  17. पीक fwhm (m/z) विंडो में, पीक खोजने के लिए वांछित जन खोज विंडो दर्ज करें। 0.003-0.005 m/z की एक जन सहस्रता खोज विंडो उच्च संकल्प के लिए सिफारिश की है /
  18. संवेदनशीलता विंडो में, वांछित आधार रेखा कटऑफ दर्ज करें (उदाहरण के लिए, 0.01% सापेक्ष बहुतायत). समस्थानिक सुधार मेनू में, रैखिक फिट या घटा एल्गोरिदम का चयन करें, जिनमें से या तो पीक सूची डेटा के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
  19. उपलब्ध यौगिकों खिड़की के भीतर वांछित लिपिड प्रजातियों पर क्लिक करके डेटाबेस खोज में शामिल करने के लिए लिपिड यौगिकों पर प्रकाश डाला। खोज समूह में हाइलाइट की गई लिपिड प्रजातियों को जोड़ने के लिए जोड़ें बटन क्लिक करें.
  20. जोड़ा यौगिकों पर क्लिक करके आंतरिक मानकों को परिभाषित करें, तो चयनित आंतरिक मानक की इसी एकाग्रता के लिए एकाग्रता खिड़की बदल रहा है.
  21. सुनिश्चित करें कि आंतरिक मानक और चयनित लिपिड प्रजातियों को परिमाणित किया जाना प्रत्येक जोड़ा लिपिड प्रजातियों और आंतरिक मानक का चयन करके और कक्षा क्षेत्र में एक वर्ग नाम (जैसे पीजी या लिपिड) टाइप करके एक ही वर्ग के नाम से संबंधित हैं।
  22. भविष्य में उपयोग के लिए लिपिड यौगिकों के खोज योग्य समूह को सहेजने के लिए, समूह मेनू के आगे सहेजें बटन क्लिक करें.
  23. सुनिश्चित करें कि सभी निर्यात किए गए MS पीक सूचियों वाली Excel फ़ाइल पहले S. aureus MS रन के संगत पत्रक के लिए खुली है, और तब LIMSA मुख्य मेनू से खोज बटन क्लिक करें.
    नोट: LIMSA डेटाबेस खोज के उत्पादन बड़े पैमाने पर वर्णक्रमीय सुविधाओं की एक सूची में शामिल होंगे चरण 8.12-8.13 में निर्मित डेटाबेस में मौजूद लिपिड से मेल खाते हैं, साथ ही एक या अधिक चयनित करने के लिए सामान्यीकरण के बाद प्रत्येक मिलान सुविधा के लिए सांद्रता आंतरिक मानकों.
  24. प्रत्येक अभिज्ञात लिपिड आण्विक प्रजातियों में उपस्थित फैटी एसिड घटकों की पुष्टि करने के लिए ब्याज के लिपिड आयनों के संगत के लिए एम/ज के लिए सटीक द्रव्यमान एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम की जांच करने के लिए Xcalibur सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। Qual ब्राउज़र चिह्न का चयन करें। फ़ाइल ड्रॉप-डाउन मेनू का चयन करके और खोलें विकल्प का चयन करके ब्याज की MS/MS फ़ाइल खोलें।
  25. एमएस/एमएस विश्लेषण के अनुरूप स्कैन फ़िल्टर का चयन करें, जो कि बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम देखने वाली विंडो में थंबटैक आइकन पर राइट माउस-क्लिक करके रुचि के लिपिड m/z के विश्लेषण के अनुसार करें और मेनू से श्रेणियों का चयन करें। प्रकट होता है जो नई विंडो में, स्कैन का चयन करने के लिए फ़िल्टर मेनू का चयन करें।
  26. चरण 8.2 में वर्णित के रूप में कुल आयन क्रोमैटोग्राम भर में संकेत औसत. उचित सांख्यिकीय परीक्षण करने के लिए MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। अनुपचारित और एलडीएल इलाज की स्थिति भर में सामान्यीकृत लिपिड बहुतायत की तुलना करके एस ऑरियस लिपिड संरचना में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का मूल्यांकन करें।

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Representative Results

चिकन अंडे की जर्दी से एलडीएल के संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल चित्र 1में दिखाया गया है। यह प्रक्रिया पूरे अंडे की जर्दी को लवणके साथ कम करके और अंडे की जर्दी ठोसों को अलग करके शुरू होती है जिसे एलडीएल युक्त घुलनशील या प्लाज्मा अंश से कणिक कहते हैं (चित्र 1)33. प्लाज्मा अंश की एलडीएल सामग्री को 30-40 केडीए जेड-लाइवटिन्स (चित्र 2)33की वर्षण से और समृद्ध किया जाता है । 140 , 80 , 65 , 60 और 15 केडीए में प्रोटीन बैंडों की उपस्थिति एल डी एल के एपोप्रोटीन ों से संबंधित है (चित्र 2)33,39. ट्राइक्लोसन के साथ उपचार फैटी एसिड मुक्त मीडिया32में एस ऑरियस के विकास को रोकता है। हमने पहले ही यह प्रदर्शित किया है कि अंडे की जर्दी प्लाज्मा या शुद्ध मानव एलडीएल के साथ संस्कृतियों को बहिर्जात फैटी एसिड स्रोतों के रूप में पूरक करने से ट्राइक्लोसन प्रेरित विकास निषेध (चित्र 3)32पर काबू पा लिया जाता है . इसी प्रकार, समृद्ध अंडे की जर्दी एलडीएल के साथ ट्राइलोसन-उपचारित संस्कृतियों की पूरकता विकास को पुनर्स्थापित करती है (चित्र 3)। इसके अतिरिक्त अंडे की जर्दी एलडी के अलावा पूर्व में विशेषता वाले एस ऑरियस फैटी एसिड ऑक्सोट्रोफ (चित्र 4)32के विकास का समर्थन करते हैं। Exogenous फैटी एसिड के एस aureus शामिल की सबसे सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित रूपरेखा के लिए, यह विकास के माध्यम में मुक्त फैटी एसिड की उपस्थिति को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है. 1% tryptone शोरबा और चिकन अंडे की जर्दी की मुक्त फैटी एसिड संरचना tryptone शोरबा में पतला एलडी प्रवाह इंजेक्शन उच्च संकल्प / सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री को रोजगार द्वारा निर्धारित किया गया था और मुक्त फैटी एसिड की कम से कम मात्रा में पाया (चित्र 5). एक ही untargeted मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण चिकन अंडे की जर्दी LDLs के लिए जोखिम के बाद एस ऑरियस फॉस्फोलिपिड की फैटी एसिड संरचना निर्धारित करने के लिए किया गया था। ऑर्थोगोनल आंशिक कम से कम वर्गों भेदभाव विश्लेषण (OPLS-डीए)40 प्रचुर मात्रा में एस ऑरियस झिल्ली फॉस्फोलिपिड ने अनुपचारित और चिकन अंडे की जर्दी एलडीएल-उपचारित स्थितियों के स्पष्ट वर्ग पृथक्करण का प्रदर्शन किया, जैसा कि ओएलएस-डीए स्कोर प्लॉट में दिखाया गया है (चित्र 6क)। ओपीएलएस-डीए लोडिंग प्लॉट ने पीएलएस-डीए मॉडल में महत्वपूर्ण चर के रूप में कई फॉस्फाटिल्डलगलाइसिरोल प्रजातियों का संकेत दिया। विशेष रूप से, असंतृप्त फैटी एसिड युक्त फॉस्फोलिपिड, बहिर्जात फैटी एसिड निगमन का आणविक मार्कर, एलडीएल पूरक संस्कृतियों में एलडीएल की अनुपस्थिति में इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं की तुलना में समृद्ध हैं (चित्र 6 बी)। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि चिकन अंडे की जर्दी ओलिक एसिड (18:1) के साथ असंतृप्त फैटी एसिड का एक समृद्ध स्रोत हैं जो सबसे प्रचुर मात्रा में41,42है . इन टिप्पणियों के साथ समझौते में, हमने पाया oleic एसिड सबसे आम असंतृप्त फैटी एसिड फॉस्फोलिपिड संश्लेषण के लिए उपयोग किया जब एस ऑरियस संस्कृतियों चिकन अंडे की जर्दी LDLs के साथ पूरक थे (चित्र 6C) . तालिका 1 आगे दिखाता है कि झिल्ली फॉस्फोलिपिड की फैटी एसिड प्रोफाइल बदल रहे हैं जब एस ऑरियस अंडे की जर्दी एलडीएल की उपस्थिति में उगाया जाता है।

Figure 1
चित्र 1: चिकन अंडे की जर्दी से एलडीएल संवर्धन का एक उदाहरण सेंट्रीफ्यूगेशन और अमोनिया सल्फेट वर्षा का उपयोग. (क) चिकन अंडे की जर्दी से एलडीएल के संवर्धन के लिए आवश्यक अभिकर्मक। (ख) प्रवाह चार्ट एलडीएल संवर्धन प्रक्रिया के महत्वपूर्ण चरणों को दर्शाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एलडीएल के लिए संवर्धन से पहले और बाद में चिकन अंडे की जर्दी का प्रोटीन प्रोफ़ाइल। प्रोटीन lysates RIPA बफर का उपयोग कर तैयार किए गए थे. प्रोटीन lysate (15 डिग्री) एक 8% acrylamide एसडीएस-पेज जेल में लोड किया गया था. जेल जैव रेड प्रोटीन अभिकर्मक के साथ रात भर दाग रहे थे. एलडीएल संबद्ध प्रोटीन के केडीए में आणविक भार छवि के दाईं ओर के साथ चिह्नित कर रहे हैं. एम: प्रोटीन मार्कर, वाई: चिकन अंडे की जर्दी, और एलडीएल: चिकन अंडे की जर्दी एलडीएल संवर्धन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अंडे की जर्दी व्युत्पन्न एलडीएल ट्राइक्लोसन प्रेरित FASII निषेध से एस ऑरियस की रक्षा करते हैं। एस ऑरियस की वृद्धि निम्नलिखित स्थितियों में OD600 की माप के माध्यम से समय के साथ नजर रखी गई थी 1% tryptone शोरबा (टीबी), 1 $M trilosan (टीसीएस), 1 $M trilosan के साथ 1% अंडे yolk प्लाज्मा (TCS + EYP), 5% अंडे yolk (एलडीएल), या 1 $ एम 5% अंडे की जर्दी एलडीएल (टीसीएस + एलडीएल) के साथ trilosan. तीन स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य दिखाया गया है. त्रुटि पट्टियाँ माध्य के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एक एस की वृद्धि. ऑरियस फैटी एसिड auxotroph अंडे की जर्दी व्युत्पन्न एलडीएल द्वारा समर्थित है। 1% tryptone शोरबा (टीबी) के साथ या बिना एक फैटी एसिड auxotroph के विकास 5% अंडे की जर्दी एलडीएल (एलडीएल) पूरकता OD600की माप के माध्यम से समय के साथ नजर रखी गई थी. तीन स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य दिखाया गया है. त्रुटि पट्टियाँ माध्य के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: नि: शुल्क फैटी एसिड सामग्री 1% tryptone शोरबा या चिकन अंडे की जर्दी एलडीएल में मापा. नि: शुल्क फैटी एसिड प्रवाह इंजेक्शन उच्च संकल्प द्वारा पता चला / प्रोटीन की प्रति मिलीग्राम आयनों की सामान्य संख्या 1% ट्रिप्टोन शोरबा और 1% ट्रिप्टोन शोरबा 5% चिकन अंडे की जर्दी एलडीएल के साथ पूरक के लिए निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: चिकन अंडे की जर्दी कम घनत्व लिपोप्रोटीन एस ऑरियस फॉस्फेटेलिग्लिसरोल के संश्लेषण के लिए exogenous फैटी एसिड का एक जलाशय हैं। (क) चिकन अंडे की जर्दी एलडीएल-उपचारित और अनुपचारित एस ऑरियस झिल्ली फॉस्फोलिपिड के आर्थोगोनल आंशिक कम से कम-वर्ग के स्कोर प्लॉट उच्च संकल्प/सही मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके पहचान की गई। (B ) गैर-संतृप्त फॉस्फाटिल्ग्लिसरोल (यूपीजी) की अनुपस्थिति में उगाए गए एस ऑरियस की कुल झिल्ली पीजी की तुलना में प्रतिशत (डब्ल्यूटी) या चिकन अंडे की जर्दी एलडी की उपस्थिति (डब्ल्यूटी + एलडीएल) (सी) असंतृप्त फैटी एसिड (यूएफए) की झिल्ली पीजी की झिल्ली एस ऑरियस के बिना हो (WT) या के साथ (WT + एलडीएल) चिकन अंडे की जर्दी LDLs कुल पीजी फैटी एसिड की राशि का एक प्रतिशत के रूप में रेखांकित. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

WT सुसंस्कृत में tryptone शोरबा WT सुसंस्कृत में tryptone शोरबा LDLs के साथ पूरक
Phosphatidyl ग्लिसरोल (टीसी:TDB)एक सामान्य आयन बहुतायत/ एसडी फैटी एसिडसी सामान्य आयन बहुतायत/ एसडी फैटी एसिडसी
24:0 0 0 एनडीबी 0.052031116 0.02677 एन डी
26:0 0 0 एन डी 0.009539117 0.00362 एन डी
28:0 0.127937113 0.04528 15:0$13:0 0.167643281 0.02392 15:0$13:0
28:1 0.006765427 0.00157 एन डी 0.002776821 0.00372 15:0$13:1
30:0 8.680180809 2.68375 15:0$15:0 14.04873592 2.4531 15:0$15:0
30:1 0 0 एन डी 0.010152161 0.00449 15:1$15:0, 13:1$17:0
31:0 4.150511117 1.31658 16:0[15:0, 14:0]17:0 10.17590926 1.88431 16:0[15:0, 14:0]17:0, 18:0[13:0]
31:1 0.016156004 0.01216 13:1$15:0, 12:19:0 0.473478683 0.09063 13:1$15:0, 18:1[13:0, 12:1]19:0
32:0 29.29259262 8.82993 15:0]17:0 48.24342037 8.95664 15:0[17:0, 16:0]16:0
32:1 0.02074815 0.00941 एन डी 0.307044942 0.07305 18:1$14:0, 16:1$16:0
33:0 9.000460122 2.78194 18:0[15:0, 16:0]17:0 15.4531776 2.98171 18:0[15:0, 16:0]17:0
33:1 0.162934812 0.04796 एन डी 2.921832928 0.30851 18:1$15:0
33:2 0 0 एन डी 0.167492702 0.03211 18:1$15:1, 18:2$15:0
34:0 12.3064043 3.70242 19:0[15:0, 17:0]17:0 18.40129157 3.21385 19:0[15:0, 17:0]17:0
34:1 0 0 एन डी 1.423605186 0.20066 18:1$16:0
34:2 0.000470922 0.00082 एन डी 0.156133734 0.03929 18:2$16:0
35:0 5.727462455 1.74583 20:0[15:0, 18:0]17:0 7.771538992 1.28515 20:0[15:0, 16:0]19:0, 18:0[17:0]
35:1 0.17337586 0.05727 20:1$15:0 0.772202525 0.08526 20:1$15:0, 18:1$17:0
35:2 0 0 एन डी 0.038758757 0.01481 18:2$17:0, 18:1$17:1
36:0 0.671004303 0.2116 21:0[15:0, 19:0]17:0 0.967295024 0.2572 21:0[15:0, 20:0]16:0, 19:0[17:0, 22:0]14:0
36:2 0 0 एन डी 0.495485065 0.04473 18:1$18:1, 18:2[18:0]
36:3 0 0 एन डी 0.059268233 0.02291 18:2$18:1, 20:3[16:0, 20:2]16:1
37:0 0.060466411 0.01961 22:0$15:0, 20:0]17:0 0.114526894 0.01852 22:0[15:0, 20:0]17:0, 18:0[19:0]
38:2 0 0 एन डी 0.079469521 0.02872 18:2$20:0, 16:1[20:1
एक [M-H] के रूप में पता लगाया- आयनों. टीसी, कुल श्रृंखला लंबाई; TDB, डबल बांड की कुल संख्या.
ख एनडी, निर्धारित नहीं
सी फैटी एसिड समकश बहुतायत के क्रम में सूचीबद्ध होते हैं। फैटी एसिड पदनाम के बीच एक अंडरस्कोर इंगित करता है कि प्रत्येक फैटी एसिड या तो SN1 या SN2 स्थिति में मौजूद हो सकता है, के रूप में अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री अकेले संभावना है कि लिपिड प्रजातियों स्थितिक isomers के एक मिश्रण के रूप में मौजूद बाहर शासन नहीं कर सकते.

तालिका 1: एस aureus के फैटी एसिड प्रोफ़ाइल चिकन अंडे की जर्दी एलडीएल की उपस्थिति में सुसंस्कृत. हम उच्च संकल्प का उपयोग एक निष्पक्ष lipidomic विश्लेषण का इस्तेमाल किया / सटीक एमएस और एमएस / एमएस एस aureus PG. एस ऑरियस की फैटी एसिड प्रोफ़ाइल निर्धारित करने के लिए की उपस्थिति या चिकन अंडे की जर्दी एलडीएल की अनुपस्थिति में incubated था, और इन के पीजी प्रोफ़ाइल कोशिकाओं की तुलना में 1% tryptone शोरबा में सुसंस्कृत कोशिकाओं की थी.

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Discussion

एस ऑरियस ने एक्सोजेनस फैटी एसिड को अपनी झिल्ली फॉस्फोलिपिड27,32,43में समाविष्ट किया है . बाह्य जात वसा अम्लों का प्रयोग करके फॉस्फोलिपिड संश्लेषण एफएएसआई अवरोध को नजरअंदाज करता है लेकिन यह झिल्ली के जैवभौतिक गुणों को भी बदल देता है27,32,44. जबकि ग्राम सकारात्मक रोगजनकों के फॉस्फोलिपिड में exogenous फैटी एसिड का समावेश अच्छी तरह से प्रलेखित है, अंतराल मेजबान फैटी एसिड जलाशयों की पहचान में रहते हैं और तीन प्रमुख स्टेफिलोकोकल फॉस्फोलिपिड प्रकार में से प्रत्येक के लिए संरचनात्मक परिवर्तन कि exogenous फैटी एसिड निगमन से परिणाम. यहाँ, हम प्रोटोकॉल जो करने के लिए नियोजित किया जा सकता है का वर्णन: i) चिकन अंडे की जर्दी से एलडीएल कणों को समृद्ध, फैटी एसिड का एक स्रोत, ii) एस aureusके विकास पर exogenous फैटी एसिड के प्रभाव का निर्धारण, और iii) के लिए एक निष्पक्ष lipidomic विश्लेषण का उपयोग एस ऑरियसकी झिल्ली फॉस्फोलिपिड में बाह्य जात वसा अम्ल का समावेश । इस अध्ययन में प्रदान की उन्नत मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि exogenous फैटी एसिड की उपस्थिति में हो एस aureus की झिल्ली संरचना का एक असाधारण परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है.

कई ग्राम सकारात्मक रोगजनक झिल्ली संश्लेषण के लिए exogenous फैटी एसिड का उपयोग और, एस aureus के साथ के रूप में, संक्रमण के दौरान exogenous फैटी एसिड के संभावित स्रोतों खराब समझ रहे हैं27,43. यदि प्रत्येक रोगजनक की वृद्धि गतिकी पर विचार किया जाता है तो लिपोप्रोटीन की उपस्थिति में अन्य ग्राम-सकारात्मक रोगजनकों के प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए यहां वर्णित विकास विश्लेषण को संशोधित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, exogenous फैटी एसिड के अन्य जटिल मेजबान स्रोतों इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है अगर पृष्ठभूमि ऑप्टिकल घनत्व पर फैटी एसिड स्रोत के संभावित प्रभाव नियंत्रित कर रहे हैं. इसके अलावा, जीवाणु लिपिड के विश्लेषण के लिए वर्णित मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि लगभग किसी भी जीवाणु प्रजातियों से लिपिडोम मूल्यांकन सक्षम करने के लिए पर्याप्त रूप से लचीला है। के रूप में लिपिड सटीक जन डेटा 'पूर्ण स्कैन' एमएस मोड में एकत्र किया जाता है, ब्याज की जीवाणु प्रजातियों के लिपिड सामग्री के थोड़ा एक प्राथमिकता ज्ञान की आवश्यकता है, विशिष्ट लिपिड के ज्ञात विखंडन पैटर्न के आधार पर लक्षित विश्लेषणात्मक तरीकों के विपरीत 32 , 45 , 46.'अनिर्धारित' विश्लेषणात्मक कार्यप्रवाह में हम वर्णन करते हैं, डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण, और विशेष रूप से लिपिड डेटाबेस के खिलाफ सटीक जन शिखर सूचियों की खोज, महत्वपूर्ण कदम हैं जो अत्यधिक अनुकूलनीय हैं और जीवाणु की एक विस्तृत श्रृंखला का समर्थन कर सकते हैं प्रजातियों और प्रयोगात्मक उपचार. लिपिड प्रजातियों की पहचान सक्षम करने के लिए एक खोज योग्य डेटाबेस का निर्माण या चयन करते समय, शोधकर्ताओं को काल्पनिक अंतर्जात लिपिड प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर विचार करना चाहिए, जबकि उपन्यास या अप्रत्याशित exogenous लिपिड व्युत्पन्न का पता लगाने के लिए भी अनुमति देता है प्रयोगात्मक उपचार से.

वर्तमान अध्ययन में, अपने अति उच्च संकल्प/सटीक द्रव्यमान क्षमताओं के कारण एक उच्च रिज़ॉल्यूशन/सटीक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर (सामग्री की तालिका) कार्यरत किया गया था। वैकल्पिक रूप से, कई अन्य उच्च संकल्प / सही मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्लेटफार्मों सफलतापूर्वक untargeted लिपिड विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए लागू किया जा सकता है. इसी तरह, प्रत्यक्ष जलसेक सहित नमूना परिचय विधियों की एक विस्तृत श्रृंखला, desorption electrospray आयनन, या मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption आयनन, कि लिपिड अर्क का प्रत्यक्ष विश्लेषण सक्षम, तेजी से इकट्ठा करने के लिए उपयोग किया जा सकता है अलक्षित लिपिडोमिक डेटा. नमूना परिचय से पहले तरल क्रोमैटोग्राफी का समावेश, जब उच्च संकल्प के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया / सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री, पूर्ण स्कैन एमएस डेटा संग्रह के दौरान कुछ समदाबी लिपिड प्रजातियों के संकल्प की अनुमति हो सकती है. हालांकि, क्रोमैटोग्राफी को शामिल करने के लिए यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि पसंद की क्रोमैटोग्राफी विधि पर्याप्त बहुमुखी है ताकि अप्रत्याशित या उपन्यास लिपिड प्रजातियों का पता लगाया जा सके जो प्रयोगात्मक उपचार के बाद मौजूद हो सकती हैं। डेटासेट में मौजूद लिपिड की पहचान करने के लिए डेटाबेस खोज किसी भी सार्वजनिक रूप से उपलब्ध खोज योग्य डेटाबेस का उपयोग करके किया जा सकता है। जबकि LIMSA सॉफ्टवेयर काल्पनिक लिपिड प्रजातियों के हजारों के दसियों के उपयोगकर्ता परिभाषित डेटाबेस के सुगम विकास में सक्षम बनाता है, कई अन्य विकल्प उच्च संकल्प से लिपिड की पहचान करने के लिए मौजूद / LIPID नक्शे संघ (www.lipidmaps.org) एक यूज़र-डिफ़ाइंड जन सहिष्णुता के भीतर उच्च संकल्प / सटीक एमएस जनित चोटी सूचियों का उपयोग कर काल्पनिक लिपिड की गणना और प्रयोगात्मक डेटाबेस खोज के लिए उपकरण प्रदान करता है, और कई सॉफ्टवेयर विक्रेताओं lipidomics डेटा का विश्लेषण करने के लिए अपने स्वयं के समाधान प्रदान करते हैं.

सफल विकास वक्र और exogenous फैटी एसिड विश्लेषण एलडीएल शुद्धता और सीमित पृष्ठभूमि फैटी एसिड के स्तर सहित कई कारकों पर निर्भर है. एलडीएल युक्त अंश की उचित पहचान महत्वपूर्ण है। उपरोक्त प्रोटोकॉल और चित्र 1 संवर्धन प्रक्रिया के प्रत्येक चरण को बनाए रखने के लिए सही अंश को स्पष्ट करता है. हम 40% अमोनियम सल्फेट के उपयोग के साथ सफलता मिली है (शुद्धता $99.5%) वर्षा के लिए और बाद में हटाने के लिए $ livetins. हालांकि, दूसरों ने सूचित किया है कि अमोनिया सल्फेट की शुद्धता और एकाग्रता अंडे की जर्दी प्लाज्मा में जोड़ा गया है इस कदम47को काफी प्रभावित कर सकता है। एलडीएल संवर्धन में अमोनियम सल्फेट संदूषण को सीमित करना एलडीएल तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है जिसका उपयोग जीवाणु परख में किया जा सकता है, क्योंकि अमोनियम सल्फेट की उच्च सांद्रता विकास को प्रतिबंधित कर सकती है। डायलिसिस के दौरान, डायलिसिस ट्यूबिंग में पर्याप्त मुक्त स्थान प्रदान किया जाना चाहिए ताकि अमोनियम सल्फेट के प्रसार और हटाने की अनुमति दी जा सके। डायलिसिस प्रक्रिया के आगे अनुकूलन रात भर ऊष्मायन के दौरान अतिरिक्त पानी में परिवर्तन शामिल हो सकते हैं. हम रात भर डायलिसिस पाया है सबसे अच्छा परिणाम प्रदान करने के लिए, हालांकि Moussa एट अल. रिपोर्ट 6 एच के डायलिसिस पर्याप्त है. यह महत्वपूर्ण है कि वृद्धि वक्रों में कोशिकाओं की प्रारंभिक सांद्रता परीक्षणों के बीच सुसंगत रखी जाती है। एस aureus के लिए, 0.05 के एक प्रारंभिक OD600 करने के लिए कोशिकाओं को कम सबसे सुसंगत परिणाम प्रदान की गई है. इसके अतिरिक्त, FASII inhibitors के उच्च सांद्रता जीवाणु कोशिकाओं पर गैर विशिष्ट प्रभाव में परिणाम कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, 7 डिग्री सेल्सियस से ऊपर ट्राइक्लोसन सांद्रता एस ऑरियस में साइटोप्लाज्मिक झिल्ली क्षति पैदा करती है, इसलिए यह आवश्यक है कि इस यौगिक की सांद्रता इस स्तर49से नीचे बनी रहे। हम एक अंतिम trilosan एकाग्रता पाया है 1 डिग्री सेल्सियस reproduible वृद्धि परख में परिणाम. बैक्टीरियल फॉस्फोलिपिड संश्लेषण के लिए exogenous फैटी एसिड के एक संभावित स्रोत का मूल्यांकन करते समय, संस्कृति माध्यम के फैटी एसिड योगदान को कम करना महत्वपूर्ण है। उपरोक्त परखों में 1% ट्रिप्टोन का संस्कृति माध्यम एस ऑरियस के पर्याप्त विकास का समर्थन करता है और इसमें कम से कम फैटी एसिड संदूषण29,32है .

पृष्ठभूमि फैटी एसिड के स्तर को सीमित डाउनस्ट्रीम मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित फैटी एसिड प्रोफाइलिंग के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। दूसरों चिकन अंडे की जर्दी में मुक्त फैटी एसिड की मात्रा की सूचना दी है स्वाभाविक रूप से कमहै 41 और हमारे विश्लेषण इस निष्कर्ष का समर्थन करता है (चित्र 5) . ऊष्मायन के बाद ट्रिप्टोन शोरबा और पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोने की कोशिकाओं का उपयोग करना आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, यह कोशिकाओं के विकास चरण पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमने पर्याप्त जीवाणु फॉस्फोलिपिड संश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए मध्य-लॉग चरण कोशिकाओं को चुना। बाह्य जात वसायुक्त अम्लों के अन्य संभावित संदूषक स्रोत जीवाणु वृद्धि के बाद पेश किए जा सकते हैं, जैसे लिपिड निष्कर्षण चरणों के दौरान या बाद में नमूना तैयारी मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले50. Exogenous फैटी एसिड नमूना तैयारी के किसी भी कदम पर शुरू की मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के दौरान मुक्त फैटी एसिड के रूप में पता लगाया जा सकता है. एक उच्च तापमान ओवन में बेकिंग प्रयोगशाला कांच के बर्तन (कम से कम 180 डिग्री सेल्सियस) रात भर लिपिड निष्कर्षण और लिपिड भंडारण के लिए इस्तेमाल किया परीक्षण ट्यूबों से exogenous फैटी एसिड को दूर कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, प्लास्टिक सहित प्रयोगशाला की आपूर्ति मेथनॉल के साथ कुल्ला किया जा सकता है फैटी एसिड पृष्ठभूमि को कम करने केलिए 50. पिछले विश्लेषण से अवशिष्ट फैटी एसिड भी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर ही की आंतरिक सतहों दूषित हो सकता है. मुक्त फैटी एसिड की पृष्ठभूमि के स्तर के निर्धारण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के दौरान विश्लेषणात्मक रिक्त स्थान का समावेश इसलिए दृढ़ता से सलाह दी है.

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Disclosures

लेखकों कोई खुलासे नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि और इस काम के समर्थन के अपने महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए हैमर प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. कोलोराडो स्कूल ऑफ मेडिसिन के डॉ एलेक्स Horswill कृपया AH1263 प्रदान की है। मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी में डॉ क्रिस वाटर्स प्रयोगशाला अभिकर्मकों प्रदान की. यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 16SDG30170026 और शुरू हुआ धन मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific

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जैव रसायन अंक 147 स्टेफिलोकोकस ऑरियस,फैटी एसिड लिपोप्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री फॉस्फोलिपिड अंडे की जर्दी लिपिडोमिक्स
जीवाणु रोगजनक फैटी एसिड समावेश के अध्ययन के लिए चिकन अंडे Yolk से लाइपोप्रोटीन कणों का अलगाव झिल्ली Phospholipids में शामिल
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Delekta, P. C., Lydic, T. A.,… More

Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).

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