Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Isolering av Lipoproteinpartiklar från kyckling äggula för studiet av bakteriell patogen fettsyra inkorporering i Membranfosfolipider

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59538
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Summary

Denna metod ger en ram för att studera inkorporering av exogena fettsyror från komplexa värd källor till bakterie membran, särskilt Staphylococcus aureus. För att uppnå detta beskrivs protokoll för berikning av lipoproteinpartiklar från kyckling äggula och efterföljande fettsyra profilering av bakteriella fosfolipider som utnyttjar masspektrometri.

Abstract

Staphylococcus aureus och andra grampositiva patogener inkorporerar fettsyror från miljön i membranfosfolipider. Under infektion, majoriteten av exogena fettsyror är närvarande inom värd lipoprotein partiklar. Osäkerheten kvarstår när det gäller reservoarerna av värd fettsyror och de mekanismer genom vilka bakterier extraherar fettsyror från lipoproteinpartiklarna. I detta arbete beskriver vi protokoll för berikning av Low-density lipoprotein (LDL) partiklar från kyckling äggula och avgöra om LDLs tjäna som fettsyror reservoarer för S. aureus. Denna metod utnyttjar förutsättningslös lipidomikprofildata analys och kyckling LDLs, en effektiv och ekonomisk modell för utforskning av interaktioner mellan LDLs och bakterier. Analysen av S. aureus integration av exogena fettsyror från LDLs utförs med hjälp av högupplöst/noggrann masspektrometri och tandem masspektrometri, vilket gör det möjligt att karakterisera fettsyrorna sammansättningen av bakterien membran och opartisk identifiering av nya kombinationer av fettsyror som uppstår i bakteriella membran lipider vid exponering för LDLs. Dessa avancerade masspektrometri tekniker erbjuder ett oöverträffat perspektiv av fettsyra inkorporering genom att avslöja de specifika exogena fettsyror som ingår i fosfolipider. De metoder som beskrivs här är anpassningsbara till studiet av andra bakteriella patogener och alternativa källor till komplexa fettsyror.

Introduction

Meticillinresistenta S. aureus (MRSA) är den vanligaste orsaken till vårdrelaterade infektioner och tillhörande antibiotikaresistens är en avsevärd klinisk utmaning1,2,3. Därför är utvecklingen av nya terapeutiska strategier en hög prioritet. En lovande behandlingsstrategi för grampositiva patogener hämmar fettsyror syntes, ett krav för membran fosfolipid produktion som, i S. aureus, innehåller fosfatidylglycerol (PG), lysyl-PG, och kardiolipin4. I bakterier sker produktionen av fettsyror via fettsyra syntes II-vägen (fasII)5, som skiljer sig avsevärt från den eukaryotiska motsvarigheten, vilket gör fasII till ett attraktivt mål för antibiotika utveckling5,6 . FASII-hämmare riktar sig främst till FabI, ett enzym som krävs för kedje förlängning av fettsyror7. Den Fabi-hämmare triclosan används i stor utsträckning i konsument-och medicintekniska produkter8,9. Ytterligare Fabi-hämmare utvecklas av flera läkemedelsföretag för behandling av infektion med S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Emellertid, många grampositiva patogener, inklusive S. aureus, kan rensa exogena fettsyror för fosfolipid syntes, förbigående fasII hämning27,28,29. Således är den kliniska potentialen för fasII-hämmare diskuteras på grund av stora luckor i vår kunskap om källorna till värd fettsyror och de mekanismer genom vilka patogener extrahera fettsyror från värd27,28. För att ta itu med dessa luckor, vi utvecklat en opartisk lipidomikprofildata analysmetod för att övervaka införlivandet av exogena fettsyror från lipoprotein partiklar i membran fosfolipider av S. aureus.

Under sepsis, värd lipoprotein partiklar utgör en potentiell källa av värd-härledda fettsyror inom kärl sammandrabliden, som en majoritet av värd fettsyror är förknippade med partiklarna30. Lipoproteiner består av ett hydrofila skal bestående av fosfolipider och proteiner som omger en hydrofoba kärna av triglycerider och kolesterolestrar31. Fyra stora klasser av lipoproteiner--chylomicron, mycket low-density lipoprotein, hög densitet lipoprotein, och low-density lipoprotein (LDL)-produceras av värden och fungerar som lipid transport fordon, leverera fettsyror och kolesterol till och från värdceller via vaskulaturen. LDLs är rikligt i förestrade fettsyror inklusive triglycerider och kolesterolestrar31. Vi har tidigare visat att högt renade mänskliga LDLs är en livskraftig källa till exogena fettsyror för PG-syntes, vilket ger en mekanism för FASII hämmare bypass32. Rena mänskliga LDLs kan vara tekniskt utmanande och tidskrävande medan kommersiella källor av renade mänskliga LDLs är oöverkomligt dyra att använda rutinmässigt eller att utföra storskaliga bakteriella skärmar. För att åtgärda dessa begränsningar har vi ändrat ett förfarande för berikning av LDL från kyckling äggula, en rik källa av lipoprotein partiklar33. Vi har framgångsrikt använt oriktad, högupplöst/noggrann masspektrometri och tandem masspektrometri för att övervaka införlivandet av humana LDL-härledda fettsyror i membranet i S. aureus32. Till skillnad från tidigare rapporterade metoder, denna metod kan kvantifiera enskilda fettsyror isomerer för var och en av de tre stora staphylococcal fosfolipid typer. Oljesyra (18:1) är en omättad fettsyra närvarande inom alla värd lipoprotein partiklar som är lätt införlivas i S. aureus fosfolipider29,30,32. S. aureus är inte kapabel av oljesyra syntes29; Därför etablerar mängden fosfolipid-inkorporerade oljesyra förekomsten av värd lipoprotein-härledda fettsyror i stafylokockmembranet29. Dessa fosfolipid arter kan identifieras genom den State-of-the-art masspektrometri metod som beskrivs här, erbjuder oöverträffad upplösning av membranet sammansättningen av S. aureus odlade i närvaro av en fettsyra källa det sannolikt möten under infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anmärkning: följande protokoll för berikning av LDL-partiklar från kyckling äggula härrör från Moussa et al. 200233.

1. beredning av kyckling äggula för berikning av LDL-partiklar

  1. Sanitize två stora hönsägg genom att tvätta skalen med 70% etanollösning och låt lufttorka.
  2. Sanitize ägget separatorn med 70% etanollösning och låt lufttorka. Fäst ägg avskiljaren på läppen på en medelstor bägare.
  3. Spricka varje ägg individuellt i ägget separatorn och låta äggvita att flöda in i bägaren. Den intakt äggula kommer att behållas av separatorn.
  4. Tvätta äggula två gånger med 30 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna kvarvarande albumen.
  5. Placera försiktigt äggula på filtrerpapper.
  6. Punktera vitellinmembranet med en steril pipettspets och Töm membranets innehåll i ett sterilt 50 mL koniskt centrifugerör. Kassera membran och filterpapper.

2. fraktionering av LDL-innehållande plasma från kyckling äggula

  1. Tillsätt ungefär två volymer 0,17 M NaCl vid pH 7,0 till äggula och blanda kraftigt. Blanda sedan denna lösning vid 4 ° c i 60 min.
  2. Centrifugera spädningen av äggula vid 10 ° c vid 10 000 x g för 45 min. ta bort plasma fraktionen (supernatanten) från den granulat fraktionen (pelleten) till ett sterilt 50 ml koniskt rör.
  3. Upprepa steg 2,2.

3. isolering av LDL-partiklar från plasma

  1. Blanda plasma fraktionen med 40% ammoniumsulfat (w/v) vid 4 ° c i 60 min.
  2. Justera pH-värdet i plasma fraktionen med en 420 mM NaOH-lösning till 8,7.
  3. Centrifugera spädningen av äggula vid 4 ° c vid 10 000 x g under en tid av 45 min. ta bort den övre semisolida gula fraktionen i 7 kDa pore storlek dialys slang. Ge utrymme i slangen så att den kan svälla.
  4. Dialyze över natten vid 4 ° c i 3 L ultrarent vatten för att avlägsna ammoniumsulfat. Skaka försiktigt vattnet med en Stir bar.
  5. Överför dialyserad lösning till ett sterilt 50 mL koniskt centrifugeringsrör.
  6. Centrifugera lösningen vid 4 ° c vid 10 000 x g under en löptid på 45 min. Ta försiktigt bort den övre semisolida gula fraktionen till ett sterilt rör och förvara vid 4 ° c.

4. bedömning av kyckling LDL som en källa till fettsyror

  1. Subculture S. aureus celler i 5 ml fettsyra-fri 1% trypton buljong och inkubera över natten vid 37 ° c med skakning (225 rpm). För fettsyra auxotrophs, komplettera kulturer med en källa av fettsyror.
  2. Späd över natten kulturer till en optisk densitet (OD) vid 600 Nm (OD600) av 0,1 i 1% trypton buljong. Pipettera 50 μL av cellsuspensionen till varje brunn i en rund-botten 96-brunn tallrik.
    Obs: när du arbetar med fettsyra auxotrophs, tvätta natten kulturer i två volymer trypton buljong och Omsuspendera i 5 ml trypton buljong för att begränsa överföring av fettsyror innan du bestämmer OD av kulturen.
  3. För brunnar som innehåller obehandlade kontroller, tillsätt 50 μl av 1% trypton buljong per brunn.
  4. Till brunnarna som innehåller de experimentella cell suspensionerna, tillsätt 50 μL av 1% tryptonbuljong kompletterad med 10% äggula-derived LDL, 2 μM triclosan, eller en blandning av 10% äggula-derived LDL och 2 μM triclosan.
    Anmärkning: vid denna punkt, varje brunn kommer att innehålla 100 μL och den slutliga koncentrationen av äggula-härledda LDL och triclosan per brunn kommer att vara 5% och 1 μM, respektive.
  5. Mät OD600 med tiden med en mikroplattläsare inställd på 37 ° c med kontinuerlig, linjär skakning för att övervaka tillväxten.

5. inkubering av S. aureus med LDLs för membran lipidanalys.

  1. Odla en isolerad koloni i 5 mL fettsyramfri 1% tryptonbuljong och inkubera över natten vid 37 ° c med skakning (225 rpm).
  2. Späd över natten kulturer 1:100 till en steril 250 ml förbryllad kolv innehållande 50 ml 1% trypton buljong. Inkubera i mitten av log fasen (ca 4 h) vid 37 ° c med skakning.
  3. Överför 25 mL av kulturen till ett sterilt 50 mL centrifugeringsrör och pelleten cellerna. Ta bort supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 750 μl av 1% trypton buljong.
  4. Kombinera de återsuspenderade cellerna och alikvot 300 μL av cellsuspensionen till ett sterilt 1,5 mL centrifugeringrör.
  5. Tillsätt LDLs till önskad slutkoncentration och inkubera vid 37 ° c med skakning (225 rpm) i 4 timmar.
  6. Centrifugera kulturerna vid 4 ° c vid 16 000 x g under en tid av 2 min och tvätta cell pellets i två volymer steril PBS upprepa sedan.
  7. Registrera vikten av varje våt cells pellets. Snap-frys cell pellets på torris eller i flytande kväve och förvara vid-80 ° c eller gå direkt till avsnitt 6.

6. extraktion av S. aureus membran lipider

  1. Placera frysta S. aureus cell pellets på torris. Tillsätt 0,5 mm zirkoniumoxid pärlor ovanpå varje cell pellet, med hjälp av en volym av pärlor ungefär lika med volymen av cellpelleten.
    Anmärkning: som ett alternativ till denna metod för lipid utvinning, forskare kan använda de väletablerade Bligh och Dyer eller Folch metoder för krävande lipider från bakteriella celler34.
  2. Tillsätt 740 μL 75% metanol (HPLC-kvalitet) kyld till-80 ° c direkt till cell pellets.
  3. Tillsätt 2 μl av 50 μm dimyristoylfosfatidylkolin fosfatidylkolin (beredd i metanol) per 1 mg celler som en intern standard. Stäng provröret och placera 1,5 mL centrifugrör som innehåller varje prov i en ledig port i en kula mixer vävnad Homogenisatorer. Homogenisera proverna på låg hastighet, inställning 2-3, för 3 min.
  4. Inspektera proverna visuellt för homogenitet. Om klumpar av celler är synliga, Fortsätt homogenisering i kula mixer i 2 min steg.
  5. Ta bort proverna från Bullet Blender och överför till en kemisk draghuv.
  6. Tillsätt 270 μL kloroform till varje provrör. Vortexblanda proverna kraftigt i 30 minuter.
    Varning: kloroform är en möjlig carcinogen.
  7. Centrifugera proverna i en bänkskiva centrifug i upp till 30 min vid minst 2 000 x g. Snabbare hastigheter kan användas med kompatibla centrifugrör och centrifugeringslängden kan förkortas till 10 minuter.
  8. I en kemisk rök huva, samla monofasiska supernatanten och överföra till ett nytt provrör, samtidigt som försiktigt undvika proteinet pelleten i botten av extraktionsröret.
  9. Tillsätt 740 μL 75% metanol (HPLC-kvalitet) och 270 μL kloroform till proteinpelleten, och extrahera varje prov på nytt enligt anvisningarna i steg 6.6-6.8 ovan. Kombinera supernatanten från den andra extraktionen med den tidigare insamlade supernatanten för varje prov.
  10. Avdunta extraktionsmedel under en ström av inert gas som kväve eller argon, eller under vakuum med hjälp av en centrifug koncentrator (tabell över material).
  11. Tvätta torkade lipidextrakt tre gånger med 1,0 mL vattenlösning av 10 mM ammoniumbikarbonat och torka proverna på nytt som i steg 6,10.
  12. Omsuspendera de torkade lipidutdragen i ett lämpligt nonpolar lösningsmedel såsom isopropanol. Omsuspendera prover med 20 μL per 1 mg färsk cell vikt fastställd i steg 5,7 alternativt, om vikten av cell pellets är okänd, Omsuspendera proverna i 200 μL isopropanol och fortsätt till avsnitt 7.

7. analys av S. aureus lipidprofiler med högupplöst/noggrann masspektrometri

  1. Innan en fullständig lipidanalys utförs, Välj representativa testprover från de experimentella grupp (er) och analysera dem över en rad prov utspädningsfaktorer för att bestämma prov spädnings intervall där de totala lipidkoncentrationerna faller inom den linjära intervall av detektor svar för masspektrometern, som tidigare beskrivits35.
  2. Indunstning av portioner av varje prov lipidextrakt för att genomgå lipidanalys, genom torkning av alikvoter under inert gas eller under vakuum i en centrifugkoncentrator (tabell över material).
  3. Omsuspendera varje torkat lipidextrakt i vätskekromatografi – masspektrometri (LC-MS) grad isopropanol: metanol (2:1, v:v) innehållande 20 mM ammoniumformat, med användning av volymer som motsvarar en optimal prov utspädningsfaktor enligt steg 7,1.
  4. För en oriktad lipidanalys kan prover införas direkt på högupplöst/exakt masspektrometriplattform utan användning av kromatografi genom flödes injektion eller direkt infusion av extrakter35,36. Överför de utspädda lipid extrakt som bereds i steg 7,3 till en lämplig autosampler injektionsflaska eller 96-bra tallrik.
  5. För flödes injektion-baserad analys, placera autosampler injektionsflaskor i en temperaturkontrollerad (15 ° c) autosampler av ett HPLC-system som kan kapillär/lågt flöde applikationer, såsom en HPLC (tabell över material) utrustad med ett elektroniskt flöde inblandnings-och flödes övervakningssystem.
  6. Fyll behållarna med HPLC-vätska med LC-MS-klass isopropanol: metanol (2:1, v:v) innehållande 20 mM ammoniumformat.
  7. Med hjälp av Agilent Chemstation programvara, programmera HPLC autosampler att utföra 5 μL prov injektioner. Välj Ställ in injektorpå instrument menyn och skriv 5,0 i fältet insprutnings volym. Enheterna ges som mikroliter. Säkerställ att HPLC är inställt på isokratiskt flöde vid 1 μL per minut av 2:1 (v:v) isopropanol: metanol innehållande 20 mM ammoniumformat.
  8. På menyn för Chemstation- instrumentet väljer du Ställ in pump... och väljer sedan omkopplaren för mikroflödesläge .
  9. I den tidsplan fält, ange: tid 0,00, 100% B, flöde 1,0. Tryck på Enter och skapa en andra rad i tidtabellen genom att ange tid 10,0, 100% B, flöde 1,0. Välj knappen OK längst ner på menyn Ställ in pump . Dessa inställningar kommer att möjliggöra 10 analytiska körningar med en flödeshastighet på 1,0 μL per minut.
  10. Införa eluat från HPLC överföringsledningen till masspektrometern med hjälp av en elektrospray joniseringskälla försedd med en låg-flöde (34 G) metall nål.
  11. Använd Thermo Tune plus instrument Styrningsprogramvara, Välj inställnings menyn och välj uppvärmd ESI-källa. Ställ joniseringsspänningen till 4000 V och slida gas till 5 (godtyckliga enheter) genom att skriva dessa värden i motsvarande fält i dialogrutan. Likaså ställa Kapillärtemp till 150 ° c och S-objektivet till 50%.
    Observera: dessa värden måste optimeras för varje masspektrometriplattform.
  12. För oriktad lipid analys, Använd en högupplöst/exakt massa MS-plattform (tabell över material) som detektor.
  13. Använd Thermo Tune plus-programvaran, klicka på knappen definiera skanning och välj FTMSi menyn Analyzer . Ställ in fältet Mass intervall på Normal och i fältet upplösning väljer du 100 000. Kontrollera att skanningstypen är inställd på full. Under menyn skanningsområden anger du 200 i det första Mass fältet (m/z) och anger 2000 i det sista Mass fältet (m/z).
  14. Se till att negativ polaritet utnyttjas för att detektera de vanligast förekommande S. aureus lipiderna.
  15. Upprepa provanalysen med hjälp av Jon kartläggning tandem mass spektrometri (MS/MS) fragmentering av alla lipidjoner inom ett spektralområde av intresse för att bekräfta lipidstrukturer och fettsyror beståndsdelar. Alternativt kan utvalda lipidjoner av intresse utsättas för MS/MS-analys efter det att initial lipididentifieringar har tilldelats i avsnitt 8.

8. databas sökning för att identifiera endogena S. aureus och exogena LDL-derived lipider

  1. Använd Thermo Xcalibur programvara för att ytterligare förfina observerad massa noggrannhet. I Xcalibur, under verktyg -menyn, Välj omkalibrera offline. När fönstret omkalibrerat offline öppnas läser du in den Mass spektrum fil som ska kalibreras om genom att välja Arkiv -menyn och välja alternativet Öppna .
  2. Öppna filen av intresse, växla knappen Infoga rad överst i fönstret Visa, för att visa det totala jonkromatogrammet för MS Run. Genomsnittlig de förvärvade MS-signalerna genom att vänsterklicka på datormusen på ena kanten av den observerade signal toppen i det totala jonkromatogrammet och dra musen över den bredaste delen av toppen.
  3. Välj filtret som motsvarar fullständig genomsökning av MS-data under menyn skannings filter . Ladda en referensfil som innehåller de teoretiska monoisotopiska massorna av minst tre kända S. aureus endogena lipider genom att välja knappen load Ref... och välja referensfilen. Markera rutan Använd bredvid varje lipidmonoisotopisk massa.
  4. Klicka på knappen Sök längst ned i visningsfönstret. Re-genomsnittet av MS-signalen över signal toppen i det totala jonkromatogrammet som gjort tidigare.
  5. Klicka på knappen konvertera nära nederkanten av visningsfönstret. När dialogrutan konvertera öppnas klickar du på OK. Utelämna det här steget om data samlades in på masspektrometriplattformar från andra leverantörer än Thermo Scientific.
  6. Med hjälp av Xcalibur programvara, exportera de omkalibrerade exakta massan topplistorna för varje obehandlad eller LDL-behandlade provet att separera kalkylblad i en Excel-fil. Välj den qual Browser -ikonen. Öppna den omkalibrerade filen av intresse genom att välja Arkiv -menyn och välja alternativet Öppna... .
  7. Genomsnittlig signal över den breda toppen i det totala jonkromatogrammet enligt beskrivningen i steg 8,2.
  8. Högerklicka på häftstift-ikonen i Mass spektrum visningsfönstret och välj Visa | Spektrum listan. På samma meny väljer du Visningsalternativ och sedan alla toppar växlings rutan i Visa -menyn. Klicka på knappen OK för att stänga visningsfönstret.
  9. Rätt klick den häftstift ikonen i massan spöke betraktande fönster igen och välja den Exportera | Urklipp (exakt massa). Klistra in den exporterade datacellen a1 i det första kalkylbladet i ett nytt Excel-kalkylblad.
  10. Ta bort de första 8 textraderna i den exporterade datafilen, så att cell a1 i Excel-kalkylbladet innehåller den första Mass datapunkten från Mass spektrumet. Upprepa exporten av varje omkalibrerad MS-fil med hjälp av ett nytt kalkylblad i Excel-filen för varje exporterad topp lista.
  11. Med hjälp av Lipidmassan spektrala analys (LIMSA) programvara37 tillägg för Excel, konstruera en databas som innehåller molekylära formler av kända S. aureus lipid arter som beskrivs av Hewelt-Belka et al. 201438, samt formler som representerar lipidarter som hypotetiskt kan förekomma i LDL.
    Anmärkning: Dessutom bör försiktighet iakttas för att inkludera potentiella molekylära formler i databasen för hypotetiska bakteriella lipider som har införlivat stora LDL-fettsyror, såsom oljesyra (18:1) och linolsyra (18:2) fettsyror32.
  12. Skapa databasen genom att öppna ett tomt Excel-kalkylblad. I cell a1 i det första kalkylbladet anger du den teoretiska/beräknade monoisotopiska massan av de lipidarter som ska läggas till i databasen, vilket motsvarar massan av lipidarterna i det Joniska tillstånd som observerats i masspektrometern. Ange ett namn för lipidarterna i cell B1, till exempel PG (34:0).
  13. I cell C1, ange molekylformeln för lipidarterna, motsvarande den joniska tillstånd av Lipiden som observerats i masspektrometern. I cell D1, ange den laddning av lipidarter som observerats i masspektrometern. Flytta till cell a2 för att påbörja en ny post för nästa lipidart som ska föras in i den sökbara databasen.
  14. Upprepa stegen 8,12 och 8,13 tills alla önskade lipidarter har förts in i databasen. Spara databasfilen och låt den vara öppen i Excel.
  15. I Excel väljer du menyn tillägg i. Välj limsa att starta limsa programvaran. På huvudmenyn klickar du på knappen sammansatt bibliotek... . Klicka på Importera sammansättningari det nya fönstret som visas. Detta kommer att ladda upp den sammansatta databasen för användning av LIMSA programvaran.
  16. Utför exakt Mass-baserade lipididentifieringar på alla MS Spectra med hjälp av LIMSA programvara tillägg för Excel enligt leverantörens instruktioner35. På huvudmenyn i LIMSA väljer du topp lista under menyn spektrum typ . Välj positivt läge eller negativt läge för att motsvara den polaritet i vilken MS-data förvärvades.
  17. I fönstret Peak fwhm (m/z) anger du önskat Mass sökfönster för topp sökning. En massa tolerans sökning fönster på 0,003-0,005 m/z rekommenderas för högupplöst/korrekt massa MS data.
  18. I känslighets fönstret anger du önskad baslinje cutoff (till exempel 0,01% relativ förekomst). I menyn isotop korrigering väljer du linjär passning eller subtrahera algoritmer, som båda kan användas med topplistedata.
  19. Markera lipid föreningar att inkludera i databasen sökning genom att klicka på önskad lipid arter inom tillgängliga föreningar fönstret. Klicka på knappen Lägg till för att lägga till markerade lipidarter i sökgruppen.
  20. Definiera interna standarder genom att klicka på tillagda föreningar, sedan ändra koncentrations fönstret till motsvarande koncentration av den valda interna standarden.
  21. Se till att den interna standarden och valda lipidarter som ska kvantifieras tillhör samma klassnamn genom att välja varje tillsats av lipidarter och intern standard och skriva in ett klassnamn (t. ex. PG eller lipid) i fältet klass.
  22. För att spara den sökbara gruppen av lipidföreningar för framtida bruk, klicka på knappen Spara bredvid menyn grupper .
  23. Se till att Excel-filen som innehåller alla exporterade MS Peak-listor är öppen för arket som motsvarar den första S. aureus MS Run, och klicka sedan på Sök knappen från limsa huvudmenyn.
    Anmärkning: utdata från LIMSA databas sökning kommer att innehålla en lista över massa spektrala funktioner matchas med lipider som finns i databasen konstrueras i steg 8.12-8.13, samt koncentrationer för varje matchande funktion efter normalisering till en eller flera utvalda interna standarder.
  24. Använd Xcalibur programvara för att undersöka exakt massa MS/MS Spectra för m/z som motsvarar lipid joner av intresse för att bekräfta fettsyror beståndsdelar som finns i varje identifierad lipid molekylära arter. Välj den qual Browser -ikonen. Öppna MS/MS-filen av intresse genom att välja rullgardinsmenyn Arkiv och välja alternativet Öppna... .
  25. Välj det skannings filter som motsvarar MS/MS-analys av en lipid m/z av intresse genom att högerklicka på ikonen thumbplease i fönstret Mass spektrum visning och välj intervall från menyn. I det nya fönstret som visas väljer du filter menyn för att välja skanningen.
  26. Genomsnittlig signal över det totala jonkromatogrammet enligt beskrivningen i steg 8,2. Använd programvaran MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) för att utföra lämpliga statistiska tester. Utvärdera statistiskt signifikant skillnad i S. aureus lipidsammansättning genom att jämföra normaliserade lipidöverflöd över obehandlade och LDL-behandlade tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet för berikning av LDL från kyckling äggula illustreras i figur 1. Denna process inleds genom att späda hela äggula med saltlösning och separera äggula fasta ämnen som betecknas som granulat från den lösliga eller plasma fraktion som innehåller LDLs (figur 1)33. LDL-halten i plasma fraktionen berikas ytterligare genom utfällning av ~ 30-40 kDa β-livetiner (figur 2)33. Närvaron av protein band vid 140, 80, 65, 60 och 15 kDa korrelerar med apoproteinerna av LDLs (figur 2)33,39. Behandling med triclosan hämmar tillväxten av S. aureus i fettsyra-fria Media32. Vi har tidigare visat att komplettera kulturer med äggula plasma eller renas mänskliga LDLs som exogena fettsyror källor övervinner triclosan-inducerad tillväxthämning (figur 3)32. Likaså, tillskott av triclosan-behandlade kulturer med berikad äggula LDL återställer tillväxten (figur 3). Ytterligare, tillsats av äggula LDLs stödja tillväxten av en tidigare karakteriserad S. aureus fettsyra auxotroph (figur 4)32. För den mest exakta masspektrometri-baserade profilering av S. aureus inkorporering av exogena fettsyror, är det viktigt att begränsa förekomsten av fria fettsyror i odlingsmediet. Den fria fettsyror sammansättningen av 1% trypton buljong och kyckling äggula LDLs späddes i trypton buljong bestämdes genom att använda flödes injektion högupplöst/noggrann masspektrometri och fann minimala mängder av fria fettsyror (figur 5). Samma oriktade masspektrometri analys utfördes för att bestämma fettsyrasammansättningen av S. aureus fosfolipider efter exponering för kyckling äggula LDLs. ortogonala partiell minsta kvadrat diskriminantanalys (opls-DA)40 av riklig S. aureus membran fosfolipider visat klar klass separation av obehandlad och kyckling äggula LDL-behandlade villkor, som visas i OPLS-da noter Plot (figur 6a). Den opls-da belastningar Plot anges många fosfatidylglycerolarter som viktiga variabler i pls-da-modellen. Särskilt fosfolipider som innehåller omättade fettsyror, en molekyl markör för EXOGEN fettsyra inkorporering, berikas i de LDL-kompletterade kulturerna jämfört med celler som inkuberas i avsaknad av LDL (figur 6b). Tidigare studier har funnit att kyckling äggula är en rik källa av omättade fettsyror med oljesyra (18:1) är den vanligast förekommande41,42. I samförstånd med dessa observationer, fann vi oljesyra vara den vanligaste omättade fettsyror utnyttjas för fosfolipid syntes när S. aureus kulturer kompletterades med kyckling äggula LDLs (figur 6c). Tabell 1 visar ytterligare att fettsyra profilerna hos membranfosfolipider ändras när S. aureus odlas i närvaro av äggula LDL.

Figure 1
Figur 1: en illustration av LDL-berikning från kyckling äggula med hjälp av centrifugering och ammoniumsulfatnederbörd. Ade reagenser som är nödvändiga för ANRIKNINGEN av LDL från kyckling äggula. (B) flödesdiagrammet visar de signifikanta stegen i LDL-anrikningsprocessen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: protein profil av kyckling äggula före och efter berikning för LDL. Protein celllysat utarbetades med hjälp av Ripa buffert. Proteinlysat (15 μg) lästes in i en 8% akrylamid SDS-PAGE gel. Geler färgas över natten med bio rad Proteinreagens. Molekylvikten i kDa av LDL-associerade proteiner betecknas längs bildens högra sida. M: protein markör, Y: kyckling äggula, och LDL: kyckling äggula LDL anrikning vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: LDL-derivat av äggula, skyddar S. aureus från triklosaninducerad FASII-hämning. Tillväxten av S. aureus övervakades med tiden genom mätning av OD600 i 1% trypton buljong i följande villkor: 1% trypton buljong (TB), 1 μm triclosan (TCS), 1 μm triclosan med 1% äggula plasma (TCS + EYP), 5% äggula LDL (LDL), eller 1 μm triclosan med 5% äggula LDL (TCS + LDL). Medelvärdet från tre oberoende experiment visas. Felstaplar representerar medeltalet standardavvikelse. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: tillväxt av en S. aureus fettsyra auxotroph stöds av äggula-derived LDL. Tillväxten av en fettsyra auxotroph i 1% trypton buljong (TB) med eller utan 5% äggula LDL (LDL) tillskott övervakades över tiden via mätning av OD600. Medelvärdet från tre oberoende experiment visas. Felstaplar representerar medeltalet standardavvikelse. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: fritt fettsyrainnehåll mätt i 1% trypton buljong eller kyckling äggula LDL. Fria fettsyror upptäcktes genom flödes insprutning med högupplöst/noggrann masspektrometri och tandem masspektrometri. Normaliserade antalet joner per mg protein bestämdes för 1% trypton buljong och 1% trypton buljong kompletterad med 5% kyckling äggula LDLs. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: kyckling äggula låg densitet lipoproteiner är en reservoar av exogena fettsyror för syntes av S. aureus fosfatidylglycerol. (A) noter Plot av ortogonala partiell minsta kvadrat diskriminerande analys av kyckling äggula LDL-behandlade och obehandlade S. aureus membran fosfolipider identifierats med hög upplösning/noggrann masspektrometri. B) procentuell halt av omättade fosfatidylglycerol (UPG) jämfört med total membran PG av S. aureus som odlas i frånvaro (WT) eller förekomst (WT + LDL) av kyckling äggula LDLs.C) omättade fettsyror (UFA) profil av membran PG av S. aureus odlas utan (WT) eller med (WT + LDL) kyckling äggula LDLs diagram som en procentandel av mängden av totala PG fettsyror. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

WT odlade i trypton buljong WT odlade i trypton buljong kompletterad med LDLs
Fosfatidyl glycerol (TC: TDB)a Normaliserat Jon överflöd/mg protein Sd Fettsyrorc Normaliserat Jon överflöd/mg protein Sd Fettsyrorc
24:0 0 0 NDb 0,052031116 0,02677 Nd
26:0 0 0 Nd 0,009539117 0,00362 Nd
28:0 0,127937113 0,04528 15:0_13:0 0,167643281 0,02392 15:0_13:0
28:1 0,006765427 0,00157 Nd 0,002776821 0,00372 15:0_13:1
30:0 8,680180809 2,68375 15:0_15:0 14,04873592 2,4531 15:0_15:0
30:1 0 0 Nd 0,010152161 0,00449 15:1_15:0, 13:1_17:0
31:0 4,150511117 1,31658 16:0_15:0, 14:0_17:0 10,17590926 1,88431 16:0_15:0, 14:0_17:0, 18:0_13:0
31:1 0,016156004 0,01216 13:1_15:0, 12:1_19:0 0,473478683 0,09063 13:1_15:0, 18:1_13:0, 12:1_19:0
32:0 29,29259262 8,82993 15:0_17:0 48,24342037 8,95664 15:0_17:0, 16:0_16:0
32:1 0,02074815 0,00941 Nd 0,307044942 0,07305 18:1_14:0, 16:1_16:0
33:0 9,000460122 2,78194 18:0_15:0, 16:0_17:0 15,4531776 2,98171 18:0_15:0, 16:0_17:0
33:1 0,162934812 0,04796 Nd 2,921832928 0,30851 18:1_15:0
33:2 0 0 Nd 0,167492702 0,03211 18:1_15:1, 18:2_15:0
34:0 12,3064043 3,70242 19:0_15:0, 17:0_17:0 18,40129157 3,21385 19:0_15:0, 17:0_17:0
34:1 0 0 Nd 1,423605186 0,20066 18:1_16:0
34:2 0,000470922 0,00082 Nd 0,156133734 0,03929 18:2_16:0
35:0 5,727462455 1,74583 20:0_15:0, 18:0_17:0 7,771538992 1,28515 20:0_15:0, 16:0_19:0, 18:0_17:0
35:1 0,17337586 0,05727 20:1_15:0 0,772202525 0,08526 20:1_15:0, 18:1_17:0
35:2 0 0 Nd 0,038758757 0,01481 18:2_17:0, 18:1_17:1
36:0 0,671004303 0,2116 21:0_15:0, 19:0_17:0 0,967295024 0,2572 21:0_15:0, 20:0_16:0, 19:0_17:0, 22:0_14:0
36:2 0 0 Nd 0,495485065 0,04473 18:1_18:1, 18:2_18:0
36:3 0 0 Nd 0,059268233 0,02291 18:2_18:1, 20:3_16:0, 20:2_16:1
37:0 0,060466411 0,01961 22:0_15:0, 20:0_17:0 0,114526894 0,01852 22:0_15:0, 20:0_17:0, 18:0_19:0
38:2 0 0 Nd 0,079469521 0,02872 18:2_20:0, 16:1_20:1
en en Detekteras som [M-H]- joner. TC, total kedjelängd; TDB, totalt antal dubbelbindningar.
b ND, ej bestämd
c Fettsyror listas i ordning efter isomeröverflöd. Ett understreck mellan fettsyra beteckningar indikerar att varje fettsyra kan förekomma i antingen SN1 eller SN2-läge, eftersom tandem masspektrometri ensamt inte kan utesluta möjligheten att lipidarter finns som en blandning av positionella isomerer.

Tabell 1: fettsyraprofil av S. aureus odlade i närvaro av kyckling äggula LDLs. Vi använde en opartisk lipidomikprofildata analys använder högupplöst/korrekt MS och MS/MS för att bestämma fettsyror profil S. aureus PG. S. aureus var inkuberas i närvaro eller frånvaro av kyckling äggula LDLs, och PG profilen av dessa celler som odlas i 1% trypton buljong.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

S. aureus innehåller exogena fettsyror i dess membran fosfolipider27,32,43. Fosfolipidsyntes med exogena fettsyror kringgår fasII-hämning men förändrar även de biofysiska egenskaperna hos membranet27,32,44. Även om införlivandet av exogena fettsyror i fosfolipider av grampositiva patogener är väl dokumenterat, kvarstår luckor i identiteten hos värd fettsyra reservoarer och strukturella förändringar av var och en av de tre stora stafylokockfosfolipid-typerna som härrör från exogent fettsyra inkorporering. Här beskriver vi protokoll som kan användas för att: i) berika LDL-partiklar från kyckling äggula, en källa av fettsyror, II) bestämma effekterna av exogena fettsyror på tillväxten av S. aureus, och III) använda en opartisk lipidomikprofildata analys för övervakning av EXOGEN fettsyra inkorporering i membranfosfolipider av S. aureus. Den avancerade masspektrometri metod som anges i denna studie erbjuder ett extraordinärt perspektiv av membran sammansättningen av S. aureus odlas i närvaro av exogena fettsyror.

Flera grampositiva patogener utnyttja exogena fettsyror för membran syntes och, som med S. aureus, de möjliga källorna till exogena fettsyror under infektion är dåligt förstådda27,43. Den Tillväxtanalys som beskrivs här kan modifieras för att utvärdera spridningen av andra grampositiva patogener i närvaro av lipoproteiner om tillväxtkinetiken hos varje patogen beaktas. Dessutom kan andra komplexa värd källor av exogena fettsyror testas med hjälp av detta protokoll om de potentiella effekterna av fettsyra källan på bakgrunden optisk densitet kontrolleras. Dessutom är den beskrivna masspektrometrimetoden för analys av bakteriella lipider tillräckligt flexibel för att möjliggöra lipidome utvärdering från praktiskt taget alla bakteriearter. Som lipid exakt massa data samlas in i "full Scan" MS-läge, lite a priori kunskap om lipidhalten i bakteriearter av intresse krävs, till skillnad från riktade analytiska metoder baserade på kända fragmentering mönster av specifika lipider 32 , 45 , 46. i det "icke-riktade" analytiska arbetsflödet beskriver vi dataanalysen nedströms, och särskilt sökandet efter exakta massa topplistor mot en lipiddatabas, är viktiga steg som är mycket anpassningsbara och kan stödja ett brett spektrum av bakteriella arter och experimentella behandlingar. Vid konstruktion eller val av en sökbar databas för att möjliggöra identifiering av lipidarter, måste forskarna överväga ett brett spektrum av hypotetiska endogena lipidarter, samtidigt som det möjliggör detektion av nya eller oförutsedda exogena lipider som härrör från den experimentella behandlingen.

I den nuvarande studien, en högupplöst/noggrann masspektrometer (tabell över material) var anställd på grund av dess ultra-hög upplösning/exakt massa kapacitet. Alternativt kan många andra högupplösta/exakta masspektrometri plattformar framgångsrikt genomföras för att utföra oriktad lipid analys. Likaså ett brett spektrum av prov introduktions metoder inklusive direkt infusion, desorption elektrospray jonisering, eller Matrix-Assisted laser desorption jonisering, som möjliggör direkt analys av lipidextrakt, kan utnyttjas för att snabbt samla in icke-riktade lipidomiska data. Införandet av vätskekromatografi före prov introduktionen, när den används i kombination med högupplöst/noggrann masspektrometri, kan tillåta att vissa isobariska lipidarter tas upp vid fullständig genomsökning av MS-datainsamlingen. Införandet av kromatografi nödvänder dock att det är tillräckligt mångsidigt att välja den kromatografiska metoden för att möjliggöra separation och detektion av oförutsedda eller nya lipidarter som kan förekomma efter experimentella behandlingar. Databas sökning för att identifiera lipider som finns i datauppsättningen kan utföras med hjälp av någon allmänt tillgänglig sökbar databas. Medan LIMSA programvara möjliggör facile utveckling av användardefinierade databaser av tiotusentals hypotetiska lipidarter, många andra alternativ finns för att identifiera lipider från högupplöst/exakt massa MS Peak listor. LIPIDKARTORNA Consortium (www.lipidmaps.org) innehåller verktyg för att söka Computational och experimentella databaser av hypotetiska lipider med hög upplösning/exakt MS-genererade topplistor inom en användardefinierad massa tolerans, och många program leverantörerna erbjuder sina egna lösningar för att analysera Lipidomikplattformen-data.

Framgångsrik tillväxtkurva och exogena fettsyror analys är beroende av flera faktorer, inklusive LDL renhet och begränsa bakgrund fettsyra nivåer. Korrekt identifiering av den LDL-innehållande fraktionen är avgörande. Ovanstående protokoll och figur 1 illustrerar den korrekta fraktionen som ska behållas för varje steg i anrikningsprocessen. Vi har haft framgång med användning av 40% ammoniumsulfat (renhet ≥ 99,5%) för nederbörd och efterföljande avlägsnande av β-livetiner. Emellertid, andra har rapporterat att renhet och koncentration av ammoniumsulfat tillsätts äggula plasma kan avsevärt påverka detta steg47. Att begränsa ammoniumsulfatkontamination i LDL-berikningen är viktigt för att LDL-preparatet ska kunna användas i bakteriella analyser, eftersom höga koncentrationer av ammoniumsulfat kan begränsa tillväxten48. Under dialys skall det finnas gott om fritt utrymme i dialys slangen som möjliggör diffusion och avlägsnande av ammoniumsulfat. Ytterligare optimering av dialys processen kan innefatta ytterligare vatten förändringar under natten inkubering. Vi har funnit övernattning dialys för att ge bästa resultat, även om Moussa et al. rapport dialys av 6 h är tillräcklig. Det är viktigt att startkoncentrationen av celler i tillväxtkurvor hålls konsekvent mellan försöken. För S. aureus, späda celler till en initial OD600 av 0,05 har gett de mest konsekventa resultaten. Dessutom kan höga koncentrationer av FASII-hämmare resultera i icke-specifika effekter på bakterieceller. Till exempel, triclosan koncentrationer över 7 μM inducera cytoplasmiska membran skador i S. aureus, därför är det nödvändigt att koncentrationen av denna förening förblir under denna nivå49. Vi har funnit en slutlig triclosan koncentration av 1 μM resulterar i reproducerbara tillväxt analyser. Vid utvärdering av en potentiell källa till exogena fettsyror för bakteriell fosfolipid syntes, är det viktigt att minimera fettsyran bidraget från odlingsmediet. I ovanstående analyser, kultur medium 1% trypton stöder adekvat tillväxt av S. aureus och har minimal fettsyra förorening29,32.

Att begränsa nivåerna av bakgrunds fettsyror är särskilt viktigt för nedströmsmasspektrometri-baserad fettsyra profilering. Andra har rapporterat mängden fria fettsyror i kyckling äggula är naturligtvis låg41 och vår analys stöder denna slutsats (figur 5). Använda trypton buljong och grundligt tvätta celler med PBS efter inkubering är viktiga. Dessutom, det är viktigt att överväga tillväxtfasen av cellerna. Vi valde Mid-log fas celler för att säkerställa riklig bakteriell fosfolipid syntes. Andra potentiella kontaminerande källor av exogena fettsyror kan införas efter bakterietillväxt, såsom under lipidextraktionsstegen eller efterföljande provberedning före masspektrometrianalys50. Exogena fettsyror som introduceras vid varje steg av prov preparationen kan upptäckas som fria fettsyror under masspektrometrianalys. Bakning laboratorieglas i en högtemperaturugn (minst 180 ° c) över natten kan ta bort exogena fettsyror från provrör som används för lipid utvinning och lipid lagring. Dessutom kan laboratoriematerial, inklusive plaster, sköljas med metanol för att minska fett syrans bakgrund50. Kvarvarande fettsyror från tidigare analyser kan också förorda de inre ytorna på själva masspektrometern. Det rekommenderas därför starkt att analytiska ämnen inkluderas under masspektrometrianalys för bestämning av bakgrundsnivåer av fria fettsyror.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga avslöjanden.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmar i Hammer Laboratory för deras kritiska utvärdering av manuskriptet och stöd för detta arbete. Dr Alex Horswill vid University of Colorado School of Medicine vänligt förutsatt AH1263. Dr Chris Waters laboratorium vid Michigan State University förutsatt reagenser. Detta arbete stöddes av American Heart Association Grant 16SDG30170026 och start-up medel ger av Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Biokemi Staphylococcus aureus fettsyror lipoprotein masspektrometri fosfolipid äggula lipidomik
Isolering av Lipoproteinpartiklar från kyckling äggula för studiet av bakteriell patogen fettsyra inkorporering i Membranfosfolipider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delekta, P. C., Lydic, T. A.,… More

Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter