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Biochemistry

Aislamiento de partículas de lipoproteínas de yema de huevo de pollo para el estudio de la incorporación de ácidos grasos patógenos bacterianos en fosfolípidos de membrana

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59538
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Summary

Este método proporciona un marco para el estudio de la incorporación de ácidos grasos exógenos de fuentes huésped complejas en membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para lograrlo, se describen los protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas a partir de la yema de huevo de pollo y el posterior perfilado de ácidos grasos de fosfolípidos bacterianos utilizando espectrometría de masas.

Abstract

Staphylococcus aureus y otros patógenos Gram-positivos incorporan ácidos grasos del medio ambiente en fosfolípidos de membrana. Durante la infección, la mayoría de los ácidos grasos exógenos están presentes dentro de las partículas de lipoproteínas del huésped. Sigue habiendo incertidumbre en cuanto a los reservorios de ácidos grasos huésped y los mecanismos por los cuales las bacterias extraen ácidos grasos de las partículas de lipoproteínas. En este trabajo, describimos protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) a partir de yema de huevo de pollo y determinando si los LDL sirven como reservorios de ácidos grasos para S. aureus. Este método explota el análisis lipidémico imparcial y los LDL de pollo, un modelo eficaz y económico para la exploración de interacciones entre LDL y bacterias. El análisis de la integración de S. aureus de ácidos grasos exógenos de lDL se realiza utilizando espectrometría de masas de alta resolución/precisa y espectrometría de masas en tándem, permitiendo la caracterización de la composición de ácidos grasos de la bacteria identificación imparcial de nuevas combinaciones de ácidos grasos que surgen en los lípidos de la membrana bacteriana al exponerse a los LDL. Estas técnicas avanzadas de espectrometría de masas ofrecen una perspectiva sin igual de la incorporación de ácidos grasos al revelar los ácidos grasos exógenos específicos incorporados en los fosfolípidos. Los métodos descritos aquí son adaptables al estudio de otros patógenos bacterianos y fuentes alternativas de ácidos grasos complejos.

Introduction

S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) es la principal causa de infección asociada a la atención sanitaria y la resistencia a los antibióticos asociada es un desafío clínico considerable1,2,3. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas es una alta prioridad. Una estrategia de tratamiento prometedora para patógenos Gram-positivos está inhibiendo la síntesis de ácidos grasos, un requisito para la producción de fosfolípidos de membrana que, en S. aureus, incluye fosfatidilglicerol (PG), lisil-PG, y cardiolipina4. En bacterias, la producción de ácidos grasos se produce a través de la vía de síntesis de ácidos grasos II (FASII)5, que es considerablemente diferente de la contraparte eucariota, haciendo de FASII un objetivo atractivo para el desarrollo de antibióticos5,6 . Los inhibidores de FASII se dirigen principalmente a FabI, una enzima necesaria para el alargamiento de la cadena de carbono de ácidos grasos7. El inhibidor FabI triclosán se utiliza ampliamente en bienes de consumo y médicos8,9. Inhibidores Adicionales FabI están siendo desarrollados por varias compañías farmacéuticas para el tratamiento de la infección por S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Sin embargo, muchos patógenos Gram-positivos, incluyendo S. aureus, son capaces de barrer ácidos grasos exógenos para la síntesis de fosfolípidos, eludiendo la inhibición FASII27,28,29. Así, el potencial clínico de los inhibidores FASII se debate debido a considerables lagunas en nuestro conocimiento de las fuentes de ácidos grasos del huésped y los mecanismos por los cuales los patógenos extraen ácidos grasos del huésped27,28. Para abordar estas lagunas, desarrollamos un método de análisis lipidomico imparcial para monitorear la incorporación de ácidogra exógeno a partir de partículas de lipoproteínas en fosfolípidos de membrana de S. aureus.

Durante la sepsis, las partículas de lipoproteínas huésped representan una fuente potencial de ácidos grasos derivados del huésped dentro de la vasculatura, ya que la mayoría de los ácidos grasos del huésped están asociados con las partículas30. Las lipoproteínas consisten en una cáscara hidrófila compuesta de fosfolípidos y proteínas que encierran un núcleo hidrófobo de triglicéridos y ésteres de colesterol31. El huésped produce cuatro clases principales de lipoproteínas (quilomicron, lipoproteína de muy baja densidad, lipoproteína de alta densidad y lipoproteína de baja densidad (LDL)) y funcionan como vehículos de transporte de lípidos, suministrando ácidos grasos y colesterol hacia y desde células anfitrionas a través de la vasculatura. Los LDL son abundantes en ácidos grasos esterificados incluyendo triglicéridos y ésteres de colesterol31. Hemos demostrado previamente que los LDL humanos altamente purificados son una fuente viable de ácidos grasos exógenos para la síntesis de PG, proporcionando así un mecanismo para el bypass inhibidor de FASII32. La purificación de los LDL humanos puede ser técnicamente difícil y llevar mucho tiempo, mientras que las fuentes comerciales de LDL humanos purificados son prohibitivamente costosas de usar de forma rutinaria o para realizar pantallas bacterianas a gran escala. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos modificado un procedimiento para el enriquecimiento de LDL a partir de la yema de huevo de pollo, una rica fuente de partículas de lipoproteínas33. Hemos utilizado con éxito espectrometría de masas no objetivo, de alta resolución/precisa y espectrometría de masas en tándem para monitorear la incorporación de ácidos grasos derivados de LDL humanos en la membrana de S. aureus32. A diferencia de los métodos reportados anteriormente, este enfoque puede cuantificar isómeros de ácidos grasos individuales para cada uno de los tres tipos principales de fosfolípidos estafilocócicos. El ácido oleico (18:1) es un ácido graso insaturado presente en todas las partículas de lipoproteínas del huésped que se incorpora fácilmente en S. aureus phospholipids29,30,32. S. aureus no es capaz de síntesis de ácido oleico29; por lo tanto, la cantidad de ácido oleico incorporado en fosfolípidos establece la presencia de ácidos grasos derivados de lipoproteínas huésped dentro de la membrana estafilocócica29. Estas especies de fosfolípidos pueden ser identificadas por el método de espectrometría de masas de última generación descrito aquí, ofreciendo una resolución sin precedentes de la composición de la membrana de S. aureus cultivada en presencia de una fuente de ácidos grasos que probablemente durante la infección.

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Protocol

NOTA: El siguiente protocolo para el enriquecimiento de partículas LDL de yema de huevo de pollo se deriva de Moussa et al. 200233.

1. Preparación de yema de huevo de pollo para el enriquecimiento de partículas LDL

  1. Desinfecte dos huevos de pollo grandes lavando las cáscaras con una solución de etanol al 70% y deje secar al aire.
  2. Desinfecte el separador de huevos con una solución de etanol al 70% y deje secar al aire. Coloque el separador de huevos en el labio de un vaso de precipitados de tamaño mediano.
  3. Rompe cada huevo individualmente en el separador de huevos y deja que el albúmina fluya hacia el vaso de precipitados. La yema de huevo intacta será retenida por el separador.
  4. Lave la yema de huevo dos veces con 30 ml de solución salina estéril con fosfato (PBS) para eliminar el albúmina residual.
  5. Coloque suavemente la yema de huevo en el papel de filtro.
  6. Perforar la membrana vitelina con una punta de pipeta estéril y drenar el contenido de la membrana en un tubo de centrífuga cónico estéril de 50 ml. Deseche la membrana y el papel de filtro.

2. Fraccionamiento del plasma que contiene LDL a partir de yema de huevo de pollo

  1. Añadir aproximadamente dos volúmenes de 0,17 M NaCl a pH 7,0 a la yema de huevo y mezclar vigorosamente. A continuación, mezcle esta solución a 4 oC durante 60 min.
  2. Centrifugar la dilución de la yema de huevo a 10oC a 10.000 x g durante 45 min. Retire la fracción plasmática (sobrenadante) de la fracción granular (pellet) en un tubo cónico estéril de 50 ml.
  3. Repita el paso 2.2.

3. Aislamiento de partículas LDL del plasma

  1. Mezclar la fracción plasmática con 40% de sulfato de amonio (p/v) a 4 oC durante 60 min.
  2. Ajuste el pH de la fracción de plasma con una solución NaOH de 420 mM a 8,7.
  3. Centrifugar la dilución de la yema de huevo a 4 oC a 10.000 x g durante una duración de 45 min. Retire la fracción amarilla semisólida superior en tubos de diálisis de tamaño de poro de 7 kDa. Proporcione espacio en el tubo para permitir que se hinche.
  4. Dializar durante la noche a 4 oC en 3 L de agua ultrapura para eliminar el sulfato de amonio. Agitar suavemente el agua con una barra de agitación.
  5. Transfiera la solución dializada a un tubo centrífugo cónico estéril de 50 ml.
  6. Centrifugar la solución a 4oC a 10.000 x g durante una duración de 45 min. Retire cuidadosamente la fracción amarilla semisólida superior a un tubo estéril y guárdela a 4oC.

4. Evaluación de los LDL de pollo como fuente de ácidos grasos

  1. Subcultivo S. aureus células en 5 mL de caldo de triptona libre de ácidos grasos e incubar durante la noche a 37 oC con agitación (225 rpm). Para los auxotrofitos de ácidos grasos, suplemento cultivos con una fuente de ácidos grasos.
  2. Diluir los cultivos nocturnos a una densidad óptica (OD) a 600 nm (OD600) de 0,1 en 1% de caldo de triptona. Pipetear 50 l de la suspensión celular en cada pocal de una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
    NOTA: Cuando trabaje con auxotrofotos ácidos grasos, lave los cultivos nocturnos en dos volúmenes de caldo de triptona y resuspenda en 5 ml de caldo de triptona para limitar el arrastre de ácidos grasos antes de determinar la DO del cultivo.
  3. Para los pozos que contienen controles no tratados, agregue 50 s de caldo de triptona al 1% por poca.
  4. A los pozos que contienen las suspensiones celulares experimentales, añadir 50 l de caldo de triptona al 1% complementado con 10% de LDL derivado de la yema de huevo, 2 éM de triclosán, o una mezcla de 10% de yema de huevo derivado de LDL y 2 M de triclosán.
    NOTA: En este punto, cada pozo contendrá 100 l y la concentración final de LDL y triclosán derivados de la yema de huevo por pozo será de 5% y 1 M, respectivamente.
  5. Mida OD600 con el tiempo, utilizando un lector de microplacas ajustado a 37 oC con agitación continua y lineal para monitorear el crecimiento.

5. Incubación de S. aureus con LDL para el análisis de lípidos de membrana.

  1. Cultivar una colonia aislada en 5 ml de caldo de triptona libre de ácidos grasos e incubar durante la noche a 37 oC con temblor (225 rpm).
  2. Diluir los cultivos nocturnos 1:100 en un matraz desconcertado estéril de 250 ml que contiene 50 ml de caldo de triptona al 1%. Incubar a la fase de registro medio (aproximadamente 4 h) a 37 oC con agitación.
  3. Transfiera 25 ml de cultivo a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml y peletizar las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulos celulares en 750 s de caldo de triptona al 1%.
  4. Combine las células resuspendidas y la alícuota de 300 ml de la suspensión celular en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml.
  5. Añadir los LDL a la concentración final deseada e incubar a 37oC con agitación (225 rpm) durante 4 h.
  6. Centrifugar los cultivos a 4 oC a 16.000 x g durante una duración de 2 min y lavar los gránulos celulares en dos volúmenes de PBS estéril y luego repetir.
  7. Registre el peso de cada pellet de célula sin húmeda. Congele los gránulos celulares en hielo seco o en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 oC o proceda directamente a la sección 6.

6. Extracción de lípidos de membrana De S. aureus

  1. Coloque los gránulos congelados de la célula de S. aureus sobre hielo seco. Añadir cuentas de óxido de circonio de 0,5 mm en la parte superior de cada pellet celular, utilizando un volumen de cuentas aproximadamente igual al volumen del pellet celular.
    NOTA: Como alternativa a este método de extracción de lípidos, los investigadores pueden utilizar los métodos bien establecidos Bligh y Dyer o Folch para exigir lípidos de células bacterianas34.
  2. Añadir 740 l de metanol 75% (grado HPLC) refrigerado a -80 oC directamente a los pellets celulares.
  3. Añadir 2 ml de 50 m de dimyristoil fosfatidilcolina (preparado en metanol) por 1 mg de células como estándar interno. Cierre el tubo de ensayo y coloque los tubos centrífugos de 1,5 ml que contienen cada muestra en un puerto disponible en un homogeneizador de tejido Bullet Blender. Homogeneizar las muestras a baja velocidad, ajustando 2-3, durante 3 min.
  4. Inspeccione visualmente la homogeneidad de las muestras. Si los grupos de celdas son visibles, continúe la homogeneización en la mezcladora de balas en incrementos de 2 minutos.
  5. Retire las muestras de Bullet Blender y transfiera a una campana de humo químico.
  6. Añadir 270 l de cloroformo a cada tubo de muestra. Vortex las muestras vigorosamente durante 30 min.
    ADVERTENCIA: El cloroformo es un posible carcinógeno.
  7. Centrifugar las muestras en una centrífuga de sobremesa durante un máximo de 30 min a un mínimo de 2.000 x g. Se pueden utilizar velocidades más rápidas con tubos centrífugos compatibles y la duración de la centrifugación puede acortarse a 10 min.
  8. En una campana de humo químico, recoger el sobrenadante monofásico y transferir a un nuevo tubo de ensayo, evitando cuidadosamente el pellet de proteína en la parte inferior del tubo de extracción.
  9. Añadir 740 l de metanol 75% (grado HPLC) y 270 l de cloroformo a la proteína pellet, y volver a extraer cada muestra como se describe en los pasos 6.6-6.8 anteriores. Combine el sobrenadante de la segunda extracción con el sobrenadante previamente recolectado para cada muestra.
  10. Evaporar los disolventes de extracción bajo una corriente de gas inerte como nitrógeno o argón, o bajo vacío utilizando un concentrador de centrífuga (Tablade materiales).
  11. Lavar los extractos de lípidos secos tres veces con 1,0 ml de solución acuosa de bicarbonato de amonio de 10 mM y volver a secar las muestras como en el paso 6.10.
  12. Resuspender los extractos de lípidos secos en un disolvente no polar adecuado como el isopropanol. Resuspenda las muestras utilizando 20 ml por 1 mg de peso celular fresco determinado en el paso 5.7 Alternativamente, si se desconoce el peso de los gránulos celulares, resuspenda las muestras en 200 ml de isopropanol y proceda a la Sección 7.

7. Análisis de perfiles de lípidos de S. aureus utilizando espectrometría de masas de alta resolución/precisa

  1. Antes de realizar un análisis completo de lípidos, seleccione muestras de prueba representativas del grupo o grupos experimentales y analícelas en una serie de factores de dilución de muestras para determinar los rangos de dilución de muestras en los que las concentraciones totales de lípidos se encuentran dentro de lo lineal rango de respuesta del detector para el espectrómetro de masas, como se describió anteriormente35.
  2. Evaporar las alícuotas de cada extracto de lípidos de muestra que se someterá a análisis de lípidos, secando las alícuotas bajo gas inerte o bajo vacío en un concentrador de centrífuga (Tablade materiales).
  3. Resuspenda cada extracto de lípidoseco seco en cromatografía líquida– espectrometría de masas (LC-MS) grado isopropanol:metanol (2:1, v:v) que contenga formato de amonio de 20 mM, utilizando volúmenes equivalentes a un factor de dilución de muestra óptimo según se determina en el paso 7.1.
  4. Para un análisis de lípidos no dirigido, las muestras pueden introducirse directamente en la plataforma de espectrometría de masas de alta resolución/precisa sin el uso de cromatografía por inyección de flujo o infusión directa de extractos35,36. Transfiera los extractos de lípidos diluidos preparados en el paso 7.3 a un vial de automuestrador adecuado o placa de 96 pocillos.
  5. Para el análisis basado en inyección de flujo, coloque los viales del muestreador automático en un automuestreador controlado por temperatura (15 oC) de un sistema HPLC capaz de aplicaciones capilares/de bajo caudal, como un HPLC (Tablade Materiales)equipado con un flujo electrónico sistema de monitoreo de flujo.
  6. Llene los depósitos de disolvente HPLC con isopropanol de grado LC-MS:metanol (2:1, v:v) que contiene formatede de amonio de 20 mM.
  7. Usando el software Agilent Chemstation, programe el muestreador automático HPLC para realizar inyecciones de muestra de 5 l. En el menú Instrumento, seleccione Configurar inyectory escriba 5.0 en el campo Volumen de inyección. Las unidades se dan como microlitros. Asegúrese de que el HPLC esté configurado en flujo isocrático a 1 l por minuto de 2:1 (v:v) isopropanol:metanol que contenga un formate de amonio de 20 mM.
  8. En el menú Instrumento de Chemstation, seleccione Configurar bomba... y, a continuación, seleccione el interruptor de alternancia Modo de microflujo.
  9. En los campos Calendario, especifique: Tiempo 0,00, 100% B, Flujo 1,0. Pulse Intro y cree una segunda fila en el Calendario introduciendo Tiempo 10,0, 100% B, Flujo 1.0. Seleccione el botón Aceptar en la parte inferior del menú Configurar bomba. Estos ajustes permitirán 10 corridas analíticas a un caudal de 1,0 ml por minuto.
  10. Introducir eluado de la línea de transferencia HPLC al espectrómetro de masas utilizando una fuente de ionización de electrospray equipada con una aguja de metal de bajo flujo (34 G).
  11. Con el software de control de instrumentos Thermo Tune Plus, seleccione el menú Configuración y seleccione Fuente ESI calentada. Establezca la tensión de ionización en 4000 V y el gas de vaina en 5 (unidades arbitrarias) escribiendo estos valores en los campos correspondientes del cuadro de diálogo. Del mismo modo, ajuste la Temperatura Capilar a 150 oC y la lente S en 50%.
    NOTA: Estos valores deben optimizarse para cada plataforma de espectrometría de masas.
  12. Para el análisis de lípidos no dirigidos, utilice una plataforma mS de alta resolución/masa precisa (Tablade materiales)como detector.
  13. Con el software Thermo Tune Plus, haga clic en el botón Definir análisis y, en el menú Analizador, seleccione FTMS. Establezca el campo Rango de masaen en Normal y, en el campo Resolución, seleccione 100.000. Asegúrese de que Tipo de análisis esté establecido en Completo. En el menú Rangos de escaneado, escriba 200 en el campo Primera masa (m/z) e introduzca 2000 en el campo Ultima masa (m/z).
  14. Asegúrese de que se utiliza la polaridad negativa para detectar los lípidos de S. aureus más abundantes.
  15. Repita el análisis de la muestra utilizando la fragmentación de la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) de todos los iones lipídicos dentro de una región espectral de interés para confirmar las estructuras lipídicas y los componentes de ácidos grasos. Alternativamente, los iones de lípidos seleccionados de interés pueden ser sometidos a análisis de MS/MS después de que se hayan asignado identificaciones iniciales de lípidos en la Sección 8.

8. Búsqueda de bases de datos para identificar los lípidos endógenos derivados de S. aureus y LDL exógenos

  1. Utilice el software Thermo Xcalibur para refinar aún más la precisión de masa observada. En Xcalibur, en el menú Herramientas, seleccione Recalibrar sin conexión. Después de que se abra la ventana Recalibrar sin conexión, cargue el archivo de espectro de masa que se va a recalibrar seleccionando el menú Archivo y seleccionando la opción Abrir.
  2. Abra el archivo de interés, cambie el botón Insertar fila en la parte superior de la ventana de vista para ver el cromatograma iónico total para la ejecución de MS. Promedio de las señales de LA MS adquiridas haciendo clic izquierdo en el ratón del ordenador en un borde del pico de señal observado en el cromatograma de iones total y arrastrando el ratón a través de la parte más ancha del pico.
  3. En el menú Filtro de escaneado, seleccione el filtro correspondiente a los datos de MS de escaneado completo. Cargue un archivo de referencia que contenga las masas monoisotópicas teóricas de al menos tres lípidos endógenos de S. aureus conocidos seleccionando el botón Load Ref... y seleccionando el archivo de referencia. Marque la casilla Usar junto a cada masa monoisotópica de lípidos.
  4. Haga clic en el botón Buscar en la parte inferior de la ventana de visualización. Vuelva a promediar la señal MS a través del pico de la señal en el cromatograma de iones total como se hizo anteriormente.
  5. Haga clic en el botón Convertir situado cerca de la parte inferior de la ventana de visualización. Cuando se abra el cuadro de diálogo Convertir, haga clic en Aceptar. Omita este paso si se recopilaron datos en plataformas de espectrometría de masas de proveedores distintos de Thermo Scientific.
  6. Con el software Xcalibur, exporte las listas de picos de masa precisas recalibradas para cada muestra no tratada o tratada con LDL a hojas de trabajo separadas de un archivo de Excel. Seleccione el icono Qual Browser. Abra el archivo recalibrado de interés seleccionando el menú Archivo y seleccionando la opción Abrir...
  7. Promedio de la señal a través del pico amplio en el cromatograma de iones total como se describe en el paso 8.2.
  8. Haga clic con el botón derecho del botón derecho en el icono de la huella digital en la ventana de visualización del espectro de masas y seleccione Ver . Lista de espectro. En el mismo menú, seleccione Opciones de visualización y, a continuación, cuadro de alternancia Todos los picos en el menú Visualización. Haga clic en el botón Aceptar para cerrar la ventana de visualización.
  9. Haga clic con el botón derecho del botón derecho en el icono de la huella digital en la ventana de visualización del espectro de masas de nuevo y seleccione la opción Exportar . Portapapeles (masa exacta). Pegue la celda de datos exportada A1 de la primera hoja de cálculo en una nueva hoja de cálculo de Excel.
  10. Elimine las primeras 8 filas de texto del archivo de datos exportado, de modo que la celda A1 de la hoja de cálculo de Excel contenga el primer punto de datos masivos del espectro de masas. Repita la exportación de cada archivo MS recalibrado, utilizando una nueva hoja de cálculo en el archivo de Excel para cada lista de picos exportados.
  11. Usando el software lipid Mass Spectral Analysis (LIMSA)37 Add-In for Excel, construya una base de datos que contenga fórmulas moleculares de especies de lípidos conocidas de S. aureus como se describe por Hewelt-Belka et al. 2014 38 , así como 201438, así como fórmulas que representan especies lipídicas que hipotéticamente podrían estar presentes en LDL.
    NOTA: Además, se debe tener cuidado de incluir posibles fórmulas moleculares en la base de datos de lípidos bacterianos hipotéticos que han incorporado importantes ácidos grasos LDL, como los ácidos grasos oleico (18:1) y linoleico (18:2)32.
  12. Para construir la base de datos, abra una hoja de cálculo de Excel en blanco. En la celda A1 de la primera hoja de trabajo, escriba la masa monoisotópica teórica/calculada de las especies lipídicas que se añadirán a la base de datos, correspondiente a la masa de la especie lipídica en el estado iónico observado en el espectrómetro de masas. En la celda B1, ingrese un nombre para las especies de lípidos, como PG(34:0).
  13. En la celda C1, ingrese la fórmula molecular para las especies de lípidos, correspondiente al estado iónico del lípido observado en el espectrómetro de masas. En la celda D1, ingrese la carga de la especie de lípidos como se observa en el espectrómetro de masas. Pase a la celda A2 para comenzar una nueva entrada para las próximas especies de lípidos que se introducirán en la base de datos de búsqueda.
  14. Repita los pasos 8.12 y 8.13 hasta que todas las especies de lípidos deseadas hayan sido introducidas en la base de datos. Guarde el archivo de base de datos y déjelo abierto en Excel.
  15. En Excel, seleccione el menú Complementos. Seleccione LIMSA para iniciar el software LIMSA. En el menú principal, haga clic en el botón Biblioteca compuesta... En la nueva ventana que aparece, haga clic en Importar compuestos. Esto cargará la base de datos compuesta para su uso por el software LIMSA.
  16. Realice identificaciones de lípidos basadas en masa precisa en todos los espectros de EM utilizando el complemento de software LIMSA para Excel de acuerdo con las instrucciones del proveedor35. En el menú principal de LIMSA, seleccione Lista de picos en el menú Tipo de espectro. Seleccione Modo positivo o Modo negativo para que se corresponda con la polaridad en la que se adquirieron los datos de LAM.
  17. En la ventana Peak fwhm (m/z), introduzca la ventana de búsqueda en masa deseada para el hallazgo máximo. Se recomienda una ventana de búsqueda de tolerancia de masa de 0.003-0.005 m/z para datos de MS de alta resolución/masa precisa.
  18. En la ventana Sensibilidad, introduzca el límite de línea base deseado (por ejemplo, 0,01% de abundancia relativa). En el menú Corrección de isótopos, seleccione Ajuste lineal o Restar algoritmos, cualquiera de los cuales se puede utilizar con datos de lista de picos.
  19. Resalte los compuestos lipídicos que se incluirán en la búsqueda de la base de datos haciendo clic en las especies de lípidos deseadas dentro de la ventana Compuestos disponibles. Haga clic en el botón Agregar para agregar especies de lípidos resaltados al grupo de búsqueda.
  20. Defina las normas internas haciendo clic en los compuestos añadidos y, a continuación, cambiando la ventana Concentración a la concentración correspondiente del estándar interno seleccionado.
  21. Asegúrese de que el estándar interno y las especies de lípidos seleccionadas que se van a cuantificar pertenezcan al mismo nombre de clase seleccionando cada especie de lípidos añadida y estándar interna y escribiendo un nombre de clase (como PG o Lípido) en el campo Clase.
  22. Para guardar el grupo de compuestos lipídicos que se pueden buscar para su uso futuro, haga clic en el botón Guardar situado junto al menú Grupos.
  23. Asegúrese de que el archivo de Excel que contiene todas las listas de picos de MS exportadas está abierto a la hoja correspondiente a la primera ejecución de S. aureus MS y, a continuación, haga clic en el botón Buscar del menú principal de LIMSA.
    NOTA: La salida de la búsqueda de la base de datos LIMSA incluirá una lista de características espectrales de masa coincidentes con los lípidos presentes en la base de datos construida en los pasos 8.12-8.13, así como las concentraciones para cada entidad coincidente después de la normalización a una o más seleccionadas normas internas.
  24. Utilice el software Xcalibur para examinar los espectros precisos de masa MS/MS para m/z correspondientes a iones lipídis de interés con el fin de confirmar los componentes de ácidos grasos presentes en cada especie molecular de lípidos identificada. Seleccione el icono Qual Browser. Abra el archivo MS/MS de interés seleccionando el menú desplegable Archivo y seleccionando la opción Abrir...
  25. Seleccione el filtro de escaneo correspondiente al análisis MS/MS de un lípido m/z de interés haciendo clic con el botón derecho del ratón en el icono de thumbtack en la ventana de visualización del espectro de masas y seleccione Rangos en el menú. En la nueva ventana que aparece, seleccione el menú Filtro para seleccionar el análisis.
  26. Promedio de la señal a través del cromatograma de iones total como se describe en el paso 8.2. Utilice el software MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) para realizar las pruebas estadísticas adecuadas. Evalúe la diferencia estadísticamente significativa en la composición de lípidos de S. aureus comparando las abundancias de lípidos normalizadas en condiciones no tratadas y tratadas con LDL.

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Representative Results

El protocolo para el enriquecimiento de LDL a partir de la yema de huevo de pollo se ilustra en la Figura1. Este proceso comienza diluyendo la yema de huevo entera con salina y separando los sólidos de yemade huevo conocidos como gránulos de la fracción soluble o plasmática que contiene los LDL (Figura 1)33. El contenido de LDL de la fracción plasmática se enriquece aún más con laprecipitación de las "vivatins de 30-40 kDa" (Figura 2)33. La presencia de bandas proteicas a 140, 80, 65, 60 y 15 kDa se correlaciona con las apoproteínas de los LDL (Figura2)33,39. El tratamiento con triclosán inhibe el crecimiento de S. aureus en medios libres de ácidos grasos32. Hemos demostrado previamente que suplementar cultivos con plasma de yema de huevo o LDL humanos purificados comofuentes de ácidos grasos exógenos supera la inhibición del crecimiento inducida por el triclosán (Figura 3)32. Del mismo modo, la suplementación de cultivos tratados con triclosán con yema de huevo enriquecida LDL restaura el crecimiento (Figura 3). Además, la adición de LDL de yema de huevo apoya el crecimiento de un auxotroph de ácido graso de S. aureus previamente caracterizado (Figura 4)32. Para el perfilado más preciso basado en espectrometría de masas de S. aureus incorporación de ácidos grasos exógenos, es importante limitar la presencia de ácidos grasos libres en el medio de crecimiento. La composición de ácidos grasos libres de 1% caldo de triptona y yema de huevo de pollo LDL diluido en caldo de triptona se determinó mediante el empleo de inyección de flujo de alta resolución / espectrometría de masas precisa y se encontró cantidades mínimas de ácido graso libre (Figura5). Se realizó el mismo análisis de espectrometría de masas no dirigido para determinar la composición de ácidos grasos de S. aureus phospholipids después de la exposición a los LDL de yema de huevo de pollo. Análisis discriminante de mínimos parciales ortogonales (OPLS-DA)40 de abundantes fosfolípidos de membrana De S. aureus demostraron separación clara de clase de condiciones no tratadas y de yema de huevo de pollo tratadas con LDL, como se muestra en la gráfica de puntuaciones OPLS-DA (Figura6A). La gráfica de cargas OPLS-DA indicó numerosas especies de fosfatidilglicerol como variables importantes en el modelo PLS-DA. En particular, los fosfolípidos que contienen ácidos grasos insaturados, un marcador molecular de la incorporación de ácidos grasos exógenos, se enriquecen en los cultivos suplementados con LDL en comparación con las células incubadas en ausencia de LDL (Figura6B). Estudios anteriores han encontrado que las yemas de huevo de pollo son una rica fuente de ácidos grasos insaturados con ácido oleico (18:1) siendo las41másabundantes,42. De acuerdo con estas observaciones, encontramos que el ácido oleico era el ácido graso insaturado más común utilizado para la síntesis de fosfolípidos cuando los cultivos de S. aureus se complementaron con LDL de yema de huevo de pollo (Figura6C). La Tabla 1 ilustra además que los perfiles de ácidos grasos de los fosfolípidos de membrana se alteran cuando S. aureus se cultiva en presencia de yema de huevo LDL.

Figure 1
Figura 1: Una ilustración del enriquecimiento de LDL de la yema de huevo de pollo utilizando centrifugación y precipitación de sulfato de amoníaco. (A) Los reactivos necesarios para el enriquecimiento de LDL a partir de la yema de huevo de pollo. (B) El diagrama de flujo representa los pasos significativos del proceso de enriquecimiento de LDL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Perfil proteico de la yema de huevo de pollo antes y después del enriquecimiento de LDL. Se prepararon lejas proteicas utilizando el tampón RIPA. El lisato proteico (15 g) se cargó en un gel SDS-PAGE de acrilamida al 8%. Los geles se teñieron durante la noche con el reactivo Bio Rad Protein. Los pesos moleculares en kDa de proteínas asociadas a LDL se indican a lo largo del lado derecho de la imagen. M: marcador de proteína, Y: yema de huevo de pollo, y LDL: yema de huevo de pollo LDL enriquecimiento Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Los LDL derivados de la yema de huevo protegen a S. aureus de la inhibición de la FASII inducida por el triclosán. El crecimiento de S. aureus fue monitoreado a lo largo del tiempo a través de la medición de OD600 en caldo de triptona al 1% en las siguientes condiciones: 1% caldo de triptona (TB), 1 m de triclosán (TCS), 1 ácrico con 1% de plasma de yema de huevo (TCS + EYP), 5% yema de huevo LDL (LDL), o 1 M de trígono con 1% de plasma de yema de huevo (TCS + EYP), 5% yema de huevo LDL (LDL) o 1 M de triclosán con 5% de yema de huevo LDL (TCS + LDL). Se muestra la media de tres experimentos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Crecimiento de una S. el ácido graso de aureus auxotroph es apoyado por LDL derivado de la yema de huevo. El crecimiento de un auxotroph de ácido graso en 1% caldo de triptona (TB) con o sin 5% de suplementos de yema de huevo LDL (LDL) fue monitoreado con el tiempo a través de la medición de OD600. Se muestra la media de tres experimentos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Contenido de ácidos grasos libres medido en 1% caldo de triptona o yema de huevo de pollo LDL. Los ácidos grasos libres se detectaron mediante inyección de flujo de espectrometría de masas de alta resolución/precisa y espectrometría de masas en tándem. Números normalizados de iones por mg de proteína se determinó para 1% caldo de triptona y 1% caldo de triptona complementado con 5% lDL de yema de huevo de pollo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figure 6
Figura 6: Las lipoproteínas de baja densidad de yema de huevo de pollo son un reservorio de ácidos grasos exógenos para la síntesis de S. aureus phosphatidylglycerol. (A) Puntuaciones gráfica de análisis discriminante parcial ortogonal de yema de huevo de pollo LDL-tratado y sin tratar S. aureus membrana fosfolípidos identificados mediante espectrometría de masas de alta resolución/precisa. (B) Porcentaje de fosfatidilcerol insaturado (UPG) en comparación con la membrana total PG de S. aureus cultivada en ausencia (WT) o presencia (WT + LDL) de yema de huevo de pollo LDLs. (C) Perfil de ácidos grasos insaturados (UFA) de membrana PG de membrana de PG de membrana de PG de membrana de PG de membrana de PG de membrana de PG de membrana S. aureus cultivado sin (WT) o con (WT + LDL) yema de huevo de pollo LDL graficado como un porcentaje de la cantidad de ácidos grasos PG totales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

WT cultivado en caldo de triptona WT cultivado en caldo de triptona complementado con LDL
Glicerol de fosfatidil (TC:TDB)a Abundancia de iones normalizada/mg de proteína Sd Acidos grasosc Abundancia de iones normalizada/mg de proteína Sd Acidos grasosc
24:0 0 0 NDb 0.052031116 0.02677 Nd
26:0 0 0 Nd 0.009539117 0.00362 Nd
28:0 0.127937113 0.04528 15:0_13:0 0.167643281 0.02392 15:0_13:0
28:1 0.006765427 0.00157 Nd 0.002776821 0.00372 15:0_13:1
30:0 8.680180809 2.68375 15:0_15:0 14.04873592 2.4531 15:0_15:0
30:1 0 0 Nd 0.010152161 0.00449 15:1_15:0, 13:1_17:0
31:0 4.150511117 1.31658 16:0_15:0, 14:0_17:0 10.17590926 1.88431 16:0_15:0, 14:0_17:0, 18:0_13:0
31:1 0.016156004 0.01216 13:1_15:0, 12:1_19:0 0.473478683 0.09063 13:1_15:0, 18:1_13:0, 12:1_19:0
32:0 29.29259262 8.82993 15:0_17:0 48.24342037 8.95664 15:0_17:0, 16:0_16:0
32:1 0.02074815 0.00941 Nd 0.307044942 0.07305 18:1_14:0, 16:1_16:0
33:0 9.000460122 2.78194 18:0_15:0, 16:0_17:0 15.4531776 2.98171 18:0_15:0, 16:0_17:0
33:1 0.162934812 0.04796 Nd 2.921832928 0.30851 18:1_15:0
33:2 0 0 Nd 0.167492702 0.03211 18:1_15:1, 18:2_15:0
34:0 12.3064043 3.70242 19:0_15:0, 17:0_17:0 18.40129157 3.21385 19:0_15:0, 17:0_17:0
34:1 0 0 Nd 1.423605186 0.20066 18:1_16:0
34:2 0.000470922 0.00082 Nd 0.156133734 0.03929 18:2_16:0
35:0 5.727462455 1.74583 20:0_15:0, 18:0_17:0 7.771538992 1.28515 20:0_15:0, 16:0_19:0, 18:0_17:0
35:1 0.17337586 0.05727 20:1_15:0 0.772202525 0.08526 20:1_15:0, 18:1_17:0
35:2 0 0 Nd 0.038758757 0.01481 18:2_17:0, 18:1_17:1
36:0 0.671004303 0.2116 21:0_15:0, 19:0_17:0 0.967295024 0.2572 21:0_15:0, 20:0_16:0, 19:0_17:0, 22:0_14:0
36:2 0 0 Nd 0.495485065 0.04473 18:1_18:1, 18:2_18:0
36:3 0 0 Nd 0.059268233 0.02291 18:2_18:1, 20:3_16:0, 20:2_16:1
37:0 0.060466411 0.01961 22:0_15:0, 20:0_17:0 0.114526894 0.01852 22:0_15:0, 20:0_17:0, 18:0_19:0
38:2 0 0 Nd 0.079469521 0.02872 18:2_20:0, 16:1_20:1
a Detectado como [M-H]- iones. TC, longitud total de la cadena; TDB, número total de bonos dobles.
b ND, no determinado
c Los ácidos grasos se enumeran en orden de abundancia de isómeros. Un subrayado entre las designaciones de ácidos grasos indica que cada ácido graso puede estar presente en la posición SN1 o SN2, ya que la espectrometría de masas en tándem por sí sola no puede descartar la posibilidad de que existan especies de lípidos como una mezcla de isómeros posicionales.

Tabla 1: Perfil de ácido graso de S. aureus cultivado en presencia de LDL de yema de huevo de pollo. Utilizamos un análisis lipidémico imparcial utilizando MS de alta resolución/precisa y MS/MS para determinar el perfil de ácidos grasos de S. aureus PG. S. aureus fue incubado en presencia o ausencia de LDL de yema de huevo de pollo, y el perfil PG de estos células se comparó con la de las células cultivadas en caldo de triptona al 1%.

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Discussion

S. aureus incorpora ácidos grasos exógenos en su membrana fosfolípidos27,32,43. La síntesis de fosfolípidos utilizando ácidos grasos exógenos evita la inhibición de faSII, pero también altera las propiedades biofísicas de la membrana27,32,44. Si bien la incorporación de ácidos grasos exógenos en fosfolípidos de patógenos Gram-positivos está bien documentada, siguen existiendo lagunas en la identidad de los reservorios de ácidos grasos del huésped y las alteraciones estructurales de cada uno de los tres tipos principales de fosfolípidos estafilocócicos que resultan de la incorporación de ácidos grasos exógenos. Aquí, describimos protocolos que se pueden emplear para: i) enriquecer las partículas de LDL de la yema de huevo de pollo, una fuente de ácidos grasos, ii) determinar los efectos de los ácidos grasos exógenos en el crecimiento de S. aureus,y iii) utilizar un análisis lipidémico imparcial para un análisis lipidomico imparcial para monitorización de la incorporación de ácidos grasos exógenos en fosfolípidos de membrana de S. aureus. El método avanzado de espectrometría de masas proporcionado en este estudio ofrece una perspectiva extraordinaria de la composición de la membrana de S. aureus cultivada en presencia de ácidos grasos exógenos.

Varios patógenos Gram-positivos utilizan ácidos grasos exógenos para la síntesis de membranas y, al igual que con S. aureus, las posibles fuentes de ácidos grasos exógenos durante la infección se entienden mal27,43. El análisis de crecimiento descrito aquí puede ser modificado para evaluar la proliferación de otros patógenos Gram-positivos en presencia de lipoproteínas si se considera la cinética de crecimiento de cada patógeno. Además, otras fuentes complejas de host de ácidos grasos exógenos podrían probarse utilizando este protocolo si se controlan los efectos potenciales de la fuente de ácidos grasos en la densidad óptica de fondo. Además, el método de espectrometría de masas descrito para el análisis de lípidos bacterianos es lo suficientemente flexible como para permitir la evaluación del lipidome de prácticamente cualquier especie bacteriana. A medida que los datos de masa precisos de lípidos se recopilan en el modo "análisis completo" de EM, se requiere poco conocimiento a priori del contenido de lípidos de las especies bacterianas de interés, a diferencia de los métodos analíticos específicos basados en patrones de fragmentación conocidos de lípidos específicos 32 , 45 , 46. En el flujo de trabajo analítico "no dirigido" que describimos, el análisis de datos posterior, y en particular la búsqueda de listas de picos de masa precisas contra una base de datos de lípidos, son pasos clave que son altamente adaptables y pueden admitir una amplia gama de bacterias especies y tratamientos experimentales. Al construir o elegir una base de datos de búsqueda para permitir la identificación de especies de lípidos, los investigadores deben considerar una amplia gama de especies hipotéticas de lípidos endógenos, al tiempo que permiten la detección de lípidos exógenos novedosos o imprevistos derivados del tratamiento experimental.

En el presente estudio, se empleó un espectrómetro de masas de alta resolución/preciso (Tablade materiales)debido a sus capacidades de carga ultra alta de resolución/precisión. Alternativamente, numerosas otras plataformas de espectrometría de masas de alta resolución/precisa podrían implementarse con éxito para realizar análisis de lípidos no dirigidos. Del mismo modo, una amplia gama de métodos de introducción de muestras, incluyendo la infusión directa, la ionización por electrospray por desorción de desorción o la ionización por láser asistida por matriz, que permiten el análisis directo de extractos de lípidos, podrían utilizarse para recoger rápidamente datos lipidómicos no focalizados. La inclusión de cromatografía líquida antes de la introducción de la muestra, cuando se utiliza en combinación con espectrometría de masas de alta resolución/precisa, puede permitir la resolución de algunas especies de lípidos isobáricos durante la recopilación completa de datos de EM. Sin embargo, la inclusión de la cromatografía requiere garantizar que el método cromatográfico de elección sea lo suficientemente versátil como para permitir la separación y detección de especies de lípidos imprevistas o novedosas que puedan estar presentes después de tratamientos experimentales. La búsqueda de bases de datos para identificar los lípidos presentes en el conjunto de datos se puede realizar utilizando cualquier base de datos de búsqueda disponible públicamente. Mientras que el software LIMSA permite el desarrollo fácil de bases de datos definidas por el usuario de decenas de miles de especies hipotéticas de lípidos, existen numerosas otras opciones para identificar lípidos a partir de listas de picos de EM de alta resolución/masa precisa. El consorcio LIPID MAPS (www.lipidmaps.org) proporciona herramientas para buscar bases de datos computacionales y experimentales de lípidos hipotéticos utilizando listas de picos generadas por MS de alta resolución/precisas dentro de una tolerancia de masa definida por el usuario, y muchos software los proveedores ofrecen sus propias soluciones para analizar los datos de lipidomics.

La curva de crecimiento exitosa y el análisis de ácidos grasos exógenos dependen de varios factores, incluyendo la pureza de LDL y la limitación de los niveles de ácidos grasos de fondo. La identificación adecuada de la fracción que contiene LDL es crucial. El protocolo antedicho y el cuadro 1 ilustran la fracción correcta a retener para cada paso del proceso de enriquecimiento. Hemos tenido éxito con el uso de 40% sulfato de amonio (pureza 99,5%) para la precipitación y posterior extirpación de los vivos. Sin embargo, otros han informado de que la pureza y concentración de sulfato de amoníaco añadido al plasma de la yema de huevo puede afectar significativamente este paso47. Limitar la contaminación por sulfato de amonio en el enriquecimiento de LDL es importante para la preparación de LDL que se utilizará en ensayos bacterianos, ya que las altas concentraciones de sulfato de amonio pueden restringir el crecimiento48. Durante la diálisis, se debe proporcionar un amplio espacio libre en el tubo de diálisis para permitir la difusión y eliminación del sulfato de amonio. Una mayor optimización del proceso de diálisis puede incluir cambios adicionales de agua durante la incubación durante la noche. Hemos encontrado diálisis durante la noche para proporcionar los mejores resultados, aunque Moussa et al. reportan diálisis de 6 h es suficiente. Es fundamental que la concentración inicial de células en las curvas de crecimiento se mantenga constante entre los ensayos. Para S. aureus, diluir las células a una ODinicial 600 de 0,05 ha proporcionado los resultados más consistentes. Además, altas concentraciones de inhibidores de FASII pueden resultar en efectos no específicos en las células bacterianas. Por ejemplo, las concentraciones de triclosán por encima de 7 m inducen daño a la membrana citoplasmática en S. aureus, por lo tanto es necesario que la concentración de este compuesto permanezca por debajo de este nivel49. Hemos encontrado una concentración final de triclosán de 1 M resulta en ensayos de crecimiento reproducibles. Al evaluar una fuente potencial de ácidos grasos exógenos para la síntesis de fosfolípidos bacterianos, es importante minimizar la contribución de ácidos grasos del medio de cultivo. En los ensayos anteriores, el medio de cultivo de 1% de triptona apoya un crecimiento adecuado de S. aureus y tiene una contaminación mínima de ácidos grasos29,32.

Limitar los niveles de ácidos grasos de fondo es particularmente importante para el perfilado de ácidos grasos basados en espectrometría de masas aguas abajo. Otros han informado de que la cantidad de ácidos grasos libres en la yema de huevo de pollo es naturalmente baja41 y nuestro análisis apoya esta conclusión (Figura5). El uso de caldo de triptona y el lavado a fondo de las celdas con PBS después de la incubación son esenciales. Además, es importante considerar la fase de crecimiento de las células. Elegimos células de fase de registro medio para asegurar una amplia síntesis de fosfolípidos bacterianos. Otras posibles fuentes contaminantes de ácidos grasos exógenos pueden introducirse después del crecimiento bacteriano, como durante los pasos de extracción de lípidos o la preparación posterior de la muestra antes del análisis de espectrometría de masas50. Los ácidos grasos exógenos introducidos en cualquier paso de la preparación de la muestra podrían detectarse como ácidos grasos libres durante el análisis de espectrometría de masas. La cristalería de laboratorio de cocción en un horno de alta temperatura (al menos 180 oC) durante la noche puede eliminar los ácidos grasos exógenos de los tubos de ensayo utilizados para la extracción de lípidos y el almacenamiento de lípidos. Además, los suministros de laboratorio, incluidos los plásticos, pueden enjuagarse con metanol para reducir el fondo de ácidos grasos50. Los ácidos grasos residuales de análisis anteriores también pueden contaminar las superficies internas del propio espectrómetro de masas. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente la inclusión de espacios en blanco analíticos durante el análisis de espectrometría de masas para la determinación de los niveles de fondo de los ácidos grasos libres.

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Disclosures

Los autores no tienen revelaciones.

Acknowledgments

Agradecemos a los miembros del laboratorio Hammer por su evaluación crítica del manuscrito y el apoyo de este trabajo. El Dr. Alex Horswill de la Escuela de Medicina de la Universidad de Colorado amablemente proporcionó AH1263. El laboratorio del Dr. Chris Waters de la Universidad Estatal de Michigan proporcionó reactivos. Este trabajo fue apoyado por la concesión 16SDG30170026 de la Asociación Americana del Corazón y los fondos de puesta en marcha de la Universidad Estatal de Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific

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References

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Bioquímica Número 147 Staphylococcus aureus,ácido graso lipoproteína espectrometría de masas fosfolípidos yema de huevo lipidómica
Aislamiento de partículas de lipoproteínas de yema de huevo de pollo para el estudio de la incorporación de ácidos grasos patógenos bacterianos en fosfolípidos de membrana
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Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).

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