Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Isolering av lipoprotein partikler fra Chicken egg eggeplomme for studier av bakteriell patogen fatty acid innlemmelse i membran fosfolipider

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59538
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Summary

Denne metoden gir et rammeverk for å studere inkorporering av eksogene fettsyrer fra komplekse verts kilder i bakterielle membraner, spesielt Staphylococcus aureus. For å oppnå dette, protokoller for berikelse av lipoprotein partikler fra kylling eggeplomme og påfølgende fatty acid profilering av bakteriell fosfolipider utnytte masse massespektrometri er beskrevet.

Abstract

Staphylococcus aureus og andre gram-positive patogener innlemme fettsyrer fra miljøet i membran fosfolipider. Under infeksjon, flertallet av eksogene fettsyrer er til stede i verten lipoprotein partikler. Usikkerhet gjenstår som til reservoarer av verten fettsyrer og mekanismene som bakterier ekstrakt fettsyrer fra lipoprotein partiklene. I dette arbeidet, beskriver vi protokoller for berikelse av lav tetthet lipoprotein (LDL) partikler fra kylling eggeplomme og bestemme om LDLs tjene som fatty acid reservoarer for S. aureus. Denne metoden utnytter objektiv lipidomic analyse og kylling LDLs, en effektiv og økonomisk modell for utforskning av interaksjoner mellom LDLs og bakterier. Analysen av S. aureus integrering av eksogene fettsyrer fra LDLs utføres ved hjelp av høyoppløselig/nøyaktig masse massespektrometri og tandem masse massespektrometri, slik karakterisering av fatty acid sammensetningen av bakteriell membran og objektiv identifisering av romanen kombinasjoner av fettsyrer som oppstår i bakteriell membran lipider ved eksponering for LDLs. Disse avanserte masse massespektrometri teknikker gir et enestående perspektiv av fatty acid innlemmelse ved å avsløre den spesifikke eksogene fettsyrer innlemmet i fosfolipider. Metodene skissert her er tilpasningsdyktige til studiet av andre bakterielle patogener og alternative kilder til komplekse fettsyrer.

Introduction

Meticillinresistente-resistente S. aureus (MRSA) er den ledende årsak til helse-assosiert infeksjon og den tilknyttede antibiotikaresistens er en betydelig klinisk utfordring1,2,3. Derfor er utviklingen av romanen terapeutiske strategier en høy prioritet. En lovende behandling strategi for gram-positive patogener er hemme fatty acid syntese, et krav for membran fosfolipid produksjon som, i S. aureus, inkluderer EGGFOSFATIDYLGLYSEROL (PG), LYSYL-PG, og cardiolipin4. I bakterier, oppstår fatty acid produksjon via fatty acid syntese II Pathway (FASII)5, som er betydelig forskjellig fra eukaryote motstykke, noe som gjør FASII et attraktivt mål for antibiotika utvikling5,6 . FASII-hemmere primært målet FabI, et enzym som kreves for fettsyrer karbon kjede forlengelse7. Den FabI inhibitor Triklosan er bredt brukt i forbruker-og medisinske varer8,9. Ytterligere FabI hemmere utvikles av flere farmasøytiske selskaper for behandling av S. aureus infeksjon10, 11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Men mange gram-positive patogener, inkludert S. aureus, er i stand til å renovering eksogene fettsyrer for fosfolipid syntese, omgåelsen FASIIhemming 27,28,29. Således er det kliniske potensialet av FASII hemmere diskutert på grunn av betydelige hull i vår kunnskap om kildene til verten fettsyrer og mekanismene som patogener ekstrakt fettsyrer fra verten27,28. For å møte disse hullene, utviklet vi en upartisk lipidomic analysemetode for å overvåke inkorporering av eksogene fatty acid fra lipoprotein partikler i membran fosfolipider av S. aureus.

Under sepsis, vert lipoprotein partikler representerer en potensiell kilde til verts-avledet fettsyrer i blodkar, som et flertall av verten fettsyrer er forbundet med partikler30. Lipoproteiner består av et hydrofile skall bestående av fosfolipider og proteiner som omslutter en hydrofobe kjerne av triglyserider og kolesterol estere31. Fire store klasser av lipoproteiner--chylomikron, svært lav tetthet lipoprotein, high-density lipoprotein, og lav tetthet lipoprotein (LDL)-er produsert av verten og fungere som lipid transport kjøretøy, levere fettsyrer og kolesterol til og fra verts celler via blodkar. LDLs er rikelig i forestret fatty acid inkludert triglyserider og kolesterol estere31. Vi har tidligere vist at svært renset menneskelige LDLs er en levedyktig kilde til eksogene fettsyrer for PG syntese, og dermed gi en mekanisme for FASII inhibitor bypass32. Rensende menneskelige LDLs kan være teknisk utfordrende og tidkrevende mens kommersielle kilder til renset menneskelige LDLs er uoverkommelig dyrt å bruke på en rutinemessig basis eller for å utføre store bakterielle skjermer. For å møte disse begrensningene, har vi endret en prosedyre for berikelse av LDLs fra kylling eggeplomme, en rik kilde til lipoprotein partikler33. Vi har med hell brukt målrettede, høyoppløselig/nøyaktig masse massespektrometri og tandem masse massespektrometri å overvåke innlemmelse av humant LDL-avledet fettsyrer i membranen av S. aureus32. I motsetning til tidligere rapporterte metoder, denne tilnærmingen kan kvantifisere individuelle fatty acid isomerene for hver av de tre store stafylokokk fosfolipid typer. Oljesyre acid (18:1) er en umettede fatty acid stede innenfor alle vert lipoprotein partikler som er lett innlemmet i S. aureus fosfolipider29,30,32. S. aureus er ikke i stand til oljesyre syre syntese29; Derfor etablerer mengden av fosfolipid-innarbeidet oljesyre syre tilstedeværelsen av verten lipoprotein-avledede fettsyrer i stafylokokk membranen29. Disse fosfolipid arter kan identifiseres av State-of-the-art masse massespektrometri metoden beskrevet her, og tilbyr enestående oppløsning av membranen sammensetningen av S. aureus kultivert i nærvær av en fatty acid kilde det sannsynlig oppstår under infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: følgende protokoll for berikelse av LDL-partikler fra kylling eggeplomme er avledet fra Moussa et al. 200233.

1. utarbeidelse av kylling eggeplomme for berikelse av LDL-partikler

  1. Rense to store kylling egg ved å vaske skjellene med 70% etanol løsning og la den lufttørke.
  2. Rense egget separator med 70% etanol løsning og la det lufttørke. Fest egg skilletegnet på kanten av et mellomstort beger.
  3. Sprekk hvert egg enkeltvis inn i egget separator og la albumen strømme inn i begeret. Den intakt eggeplomme vil bli beholdt av separatoren.
  4. Vask eggeplomme to ganger med 30 mL sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) for å fjerne rester av albumen.
  5. Legg eggeplomme forsiktig på filter papiret.
  6. Punktering av eggeplomme membran med en steril pipette spissen og drenere innholdet av membranen i en steril 50 mL konisk sentrifugerør. Kast membranen og filter papiret.

2. fraksjonering av LDL-inneholdende plasma fra kylling eggeplomme

  1. Tilsett omtrent to bind med 0,17 M NaCl ved pH 7,0 til eggeplomme og bland kraftig. Bland deretter denne løsningen ved 4 ° c i 60 min.
  2. Sentrifuger eggeplomme fortynning ved 10 ° c ved 10 000 x g for 45 min. Fjern plasma fraksjonen (supernatanten) fra den detaljerte fraksjonen (pellet) til et sterilt 50 ml konisk rør.
  3. Gjenta trinn 2,2.

3. isolering av LDL-partikler fra plasma

  1. Bland plasma fraksjonen med 40% ammonium sulfat (w/v) ved 4 ° c for 60 min.
  2. Juster pH i plasma brøkdel med en 420 mM NaOH løsning til 8,7.
  3. Sentrifuger eggeplomme fortynning ved 4 ° c ved 10 000 x g for en varighet på 45 min. Fjern den øvre semisolid gul brøk i 7 KDA pore størrelse dialyse slange. Gi plass i slangen for å tillate den å hovne opp.
  4. Dialyze over natten ved 4 ° c i 3 liter ultrarent vann for å fjerne ammonium sulfat. Forsiktig agitere vannet ved hjelp av en røre bar.
  5. Overfør dialyzed løsning til et sterilt 50 mL konisk sentrifugerør.
  6. Sentrifuger oppløsningen ved 4 ° c ved 10 000 x g for en varighet på 45 min. Fjern den øvre semisolid gule fraksjonen forsiktig til et sterilt rør og oppbevares ved 4 ° c.

4. vurdering av kylling LDLs som en kilde til fettsyrer

  1. Under kultur S. aureus celler i 5 ml fettsyrer-gratis 1% tryptone buljong og ruge over natten ved 37 ° c med risting (225 RPM). For fatty acid auxotrophs, supplere kulturer med en kilde til fettsyrer.
  2. Fortynne over natten kulturer å en optisk tettheten (OD) for 600 NM (OD600) av 0,1 inne 1% tryptone kjøttkraft. Pipetter 50 μL av celle oppheng i hver brønn av en rund bunn 96-brønn plate.
    Merk: Når du arbeider med fatty acid auxotrophs, vaske over natten kulturer i to bind av tryptone buljong og resuspend i 5 mL tryptone buljong å begrense carryover av fettsyrer før bestemme OD av kulturen.
  3. For brønnene som inneholder ubehandlede kontroller, tilsett 50 μL av 1% tryptone buljong per brønn.
  4. Til brønnene som inneholder de eksperimentelle celle suspensjoner, tilsett 50 μL av 1% tryptone buljong supplert med 10% eggeplomme-avledet LDL, 2 μM Triklosan, eller en blanding av 10% eggeplomme-avledet LDL og 2 μM Triklosan.
    Merk: på dette punktet, vil hver brønn inneholde 100 μL og den endelige konsentrasjonen av eggeplomme-avledet LDL og triklosan per brønn vil være henholdsvis 5% og 1 μM.
  5. Mål OD600 over tid, ved hjelp av en mikroplate leser satt til 37 ° c med kontinuerlig, lineær risting for å overvåke vekst.

5. inkubasjons av S. aureus med LDLs for membran lipid analyse.

  1. Kultur en isolert koloni i 5 mL fettsyrer-fri 1% tryptone buljong og ruge over natten ved 37 ° c med risting (225 RPM).
  2. Fortynne over natten kulturer 1:100 i en steril 250 mL forbløffet kolbe inneholder 50 mL 1% tryptone buljong. Ruge til midt Logg fase (ca. 4 h) ved 37 ° c med risting.
  3. Overfør 25 mL kultur til et sterilt 50 mL sentrifugerør og pellets cellene. Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 750, μL av 1% tryptone buljong.
  4. Kombiner de resuspendert cellene og alikvot 300 μL av celle fjæringen til et sterilt 1,5 mL sentrifugerør.
  5. Legg LDLs til ønsket sluttkonsentrasjon og ruge ved 37 ° c med risting (225 RPM) for 4 timer.
  6. Sentrifuger kulturene ved 4 ° c ved 16 000 x g for en varighet på 2 min og vask celle pellets i to mengder sterile PBS deretter gjenta.
  7. Noter vekten til hver våt celle pellet. Fest fryse celle pellets på tørr is eller i flytende nitrogen og oppbevar ved-80 ° c eller gå direkte til avsnitt 6.

6. ekstraksjon av S. aureus membran lipider

  1. Plasser frosne S. aureus celle pellets på tørr is. Tilsett 0,5 mm zirkonium oksid perler på toppen av hver celle pellet, ved hjelp av et volum av perler omtrent lik volumet av cellen pellet.
    Merk: som et alternativ til denne metoden for lipid utvinning, kan forskerne bruke de veletablerte Bligh og Dyer eller Folch metoder for krevende lipider fra bakterielle celler34.
  2. Tilsett 740 μL av 75% metanol (HPLC grade) kjølt til-80 ° c direkte til celle pellets.
  3. Tilsett 2 μL av 50 μM dimyristoylfosfatidylkolin phosphatidylcholine (fremstilt i metanol) per 1 mg celler som en intern standard. Lukk prøve røret og plasser 1,5 mL sentrifuge rørene som inneholder hver prøve inn i en tilgjengelig port i en bullet blender vev homogenisator. Homogenisere prøvene på lav hastighet, innstilling 2-3, i 3 min.
  4. Inspiser prøvene for homogenitet visuelt. Hvis klumper av celler er synlige, fortsetter homogenisering i Bullet blender i 2 min trinn.
  5. Fjern prøvene fra bullet blender og Overfør til en kjemisk avtrekks hette.
  6. Tilsett 270 μL av kloroform i hvert prøverør. Vortex prøvene kraftig i 30 min.
    FORSIKTIG: kloroform er et mulig kreftfremkallende stoff.
  7. Sentrifuger prøvene i en stasjonære sentrifuge for opptil 30 min på minimum 2 000 x g. Raskere hastigheter kan brukes med kompatible sentrifugerør og varigheten av sentrifugering kan forkortes til 10 min.
  8. I en kjemisk avtrekks hette, samle monofasisk supernatanten og Overfør til et nytt reagensrør, mens du forsiktig unngår protein pellet i bunnen av utvinnings røret.
  9. Tilsett 740 μL av 75% metanol (HPLC-klasse) og 270 μL av kloroform til protein pellet, og re-ekstrakt hver prøve som beskrevet i trinn 6.6-6.8 ovenfor. Kombiner supernatanten fra den andre ekstraksjon med den tidligere innsamlede supernatanten for hver prøve.
  10. Fordampe avsugs løsemidler under en strøm av inert gass som nitrogen eller Argon, eller under vakuum ved hjelp av en sentrifuge konsentrat (tabell av materialer).
  11. Vask tørket lipid ekstrakter tre ganger med 1,0 mL av vandig 10 mM ammonium bikarbonat løsning og re-tørke prøvene som i trinn 6,10.
  12. Resuspend de tørkede lipid ekstrakter i en egnet polare løsemiddel som isopropanol. Resuspend prøver med 20 μL per 1 mg fersk celle vekt fastsatt i trinn 5,7 Alternativt, hvis vekten av celle pellets er ukjent, Resuspend prøvene i 200 μL av isopropanol og går videre til Seksjon 7.

7. analyse av S. aureus lipid profiler ved hjelp av høy oppløsning/nøyaktig masse massespektrometri

  1. Før gjennomfører en full lipid analyse, velger representative testprøver fra eksperimentelle gruppen (e) og analysere dem over en rekke sample fortynning faktorer for å bestemme prøve fortynning områder der den totale lipid konsentrasjoner faller innenfor den lineære spekter av detektor respons for masse spektrometer, som tidligere beskrevet35.
  2. Fordampe alikvoter av hver prøve lipid ekstrakt å bli utsatt for lipid analyse, ved tørking av alikvoter under inert gass eller under vakuum i en sentrifuge konsentrat (tabell med materialer).
  3. Resuspend hver tørket lipid ekstrakt i flytende kromatografi – masse massespektrometri (LC-MS) grade isopropanol: metanol (2:1, v:v) som inneholder 20 mM ammonium formiat, ved hjelp av volumer som tilsvarer en optimal prøve fortynning faktor som bestemmes i trinn 7,1.
  4. For en målrettede lipid analyse, kan prøvene innføres direkte til høyoppløselig/nøyaktig masse massespektrometri plattform uten bruk av kromatografi ved Flow injeksjon eller direkte infusjon av ekstrakter35,36. Overfør de fortynnede lipid ekstrakter fremstilt i trinn 7,3 til en passende autosampler hetteglass eller 96-brønn plate.
  5. For strømnings injeksjons analyse bør du plassere autosampler hetteglass i en temperaturstyrt (15 ° c) autosampler av et HPLC-system som er i stand til kapillær/lav strømnings applikasjoner, for eksempel en HPLC (tabell av materialer) utstyrt med en elektronisk flyt proportioning-og strømnings overvåkingssystem.
  6. Fyll HPLC løsemiddel reservoarer med LC-MS grade isopropanol: metanol (2:1, v:v) inneholdende 20 mM ammonium formiat.
  7. Ved hjelp av Agilent Chemstation programvare, programmere HPLC-autosampler til å utføre 5 μL prøve injeksjoner. Fra instrument menyen, velg Still opp injeksjonsvæske, og Skriv 5,0 i feltet for injeksjonsvolum. Enhetene er gitt som mikroliter. Kontroller at HPLC er satt til isocratic flyt ved 1 μL per min av 2:1 (v:v) isopropanol: metanol som inneholder 20 mM ammonium formiat.
  8. Velg Konfigurer pumpe fra Chemstation instrument -menyen... og velg deretter bryteren Micro Flow -modus.
  9. I tidsplan feltene angir du: tid 0,00, 100% B, flyt 1,0. Trykk på Enter og Opprett en ny rad i timeplanen ved å angi tid 10,0, 100% B, Flow 1,0. Velg OK -knappen nederst i Oppsett pumpe menyen. Disse innstillingene vil muliggjøre 10 analytiske kjøringer med en strømningshastighet på 1,0 μL per minutt.
  10. Introduser eluatet fra HPLC overføringslinje til massen spektrometer ved hjelp av en electrospray ionisering kilde utstyrt med en lav-flow (34 G) metall nål.
  11. Ved hjelp av Thermo tune Plus instrument kontrollprogramvare, velger du setup menyen og velg oppvarmet ESI kilde. Sett ionisering spenning til 4000 V og skjede gass til 5 (vilkårlig enheter) ved å skrive inn disse verdiene i de tilsvarende feltene i dialogboksen. På samme måte setter du kapillær temp til 150 ° c og S-linsen til 50%.
    Merk: disse verdiene må optimaliseres for hver masse massespektrometri plattform.
  12. For målrettede lipid analyse, bruke en høy oppløsning/nøyaktig masse MS plattform (tabell av materialer) som detektoren.
  13. Ved hjelp av Thermo tune Plus-programvare klikker du på Definer Skann -knappen, og i analysator -menyen velger du FTMS. Sett feltet masse område til Normal , og velg 100 000i oppløsning -feltet. Kontroller at skannings type er satt til full. Under menyen Skann områder skriver du inn 200 i det første masse feltet (m/z) og angir 2000 i feltet siste masse (m/z).
  14. Sørg for at negativ polaritet benyttes for å oppdage de mest tallrike S. aureus lipider.
  15. Gjenta prøven analysen ved hjelp av ion kartlegging tandem masse massespektrometri (MS/MS) fragmentering av alle lipid ioner i en Spectral region av interesse for å bekrefte lipid strukturer og fatty acid bestanddeler. Alternativt kan utvalgte lipid ioner av interesse bli utsatt for MS/MS analyse etter første lipid IDer har blitt tildelt i § 8.

8. database søker å identifisere endogene S. aureus og eksogene LDL-avledet lipider

  1. Bruk thermo Xcalibur programvare for ytterligere å avgrense observert masse nøyaktighet. Velg Kalibrer frakobletpå verktøy -menyen i Xcalibur. Etter at du har kalibrere det frakoblede vinduet på nytt, kan du laste inn masse spektrum filen som skal rekalibrert, ved å velge fil- menyen og velge det Åpne alternativet.
  2. Åpen filen av begrave, pinnen det innsette rad knapp på høyden av visningen vindu, å utsikt det sum ion kromatogram for det MULTIPLE SCLEROSIS løpe. Gjennomsnittlig ervervet MS signaler ved å venstre-klikke på datamaskinen musen på den ene kanten av det observerte signalet toppen i den totale ion kromatogram og dra musen over den bredeste delen av peak.
  3. Under Skann filter menyen velger du filteret som tilsvarer full Scan MS data. Last inn en referansefil som inneholder de teoretiske monoisotopic massene av minst tre kjente S. aureus endogene lipider ved å velge Last REF... knappen og velge referansefilen. Sjekk Bruk boksen ved siden av hver lipid monoisotopic masse.
  4. Klikk Søk -knappen nederst i visningsvinduet. Re-gjennomsnitt MS signalet over signalet toppen i den totale ion kromatogram som gjort tidligere.
  5. Klikk på knappen Konverter nær bunnen av visningsvinduet. Når dialogboksen Konverter åpnes, klikker du OK. Utelat dette trinnet hvis data ble samlet inn på masse massespektrometri plattformer fra andre leverandører enn Thermo Scientific.
  6. Ved hjelp av Xcalibur programvare, eksportere rekalibrert nøyaktige masse topp lister for hver ubehandlet eller LDL-behandlet prøve å skille regneark i en Excel-fil. Velg Qual Browser -ikonet. Åpne den rekalibrert filen av interesse ved å velge fil- menyen og velge den Åpne... alternativet.
  7. Gjennomsnittlig signalet over den brede toppen i den totale ion kromatogram som beskrevet i trinn 8,2.
  8. Høyreklikk på thumbtack ikonet i massen spektrum visningsvinduet og velg Vis | Spektrum-listen. Fra den samme menyen velger du Vis alternativer og deretter alle topper veksle boksen i skjerm menyen. Klikk på OK -knappen for å lukke visningsvinduet.
  9. Høyreklikk på thumbtack ikonet i massen spektrum visning vinduet igjen og velg Export | Utklippstavle (eksakt masse). Lim inn den eksporterte datacellen a1 i det første regnearket i et nytt Excel-regneark.
  10. Slett de første 8 radene med tekst i den eksporterte datafilen, slik at celle a1 i Excel-regnearket inneholder det første masse datapunktet fra masse spekteret. Gjenta eksport av hver rekalibrert MS-fil, ved hjelp av et nytt regneark i Excel-filen for hver eksportert topp liste.
  11. Ved hjelp av lipid Mass Spectral Analysis (LIMSA) programvare37 Add-in for Excel, konstruere en database som inneholder molekylære formler av kjente S. aureus lipid arter som beskrevet av Hewelt-Belka et al. 201438, så vel som formler som representerer lipid arter som kan hypotetisk være til stede i LDL.
    Merk: i tillegg bør forsiktighet tas for å inkludere potensielle molekylære formler i databasen for hypotetiske bakteriell lipider som har innarbeidet store LDL fettsyrer, som oljesyre (18:1) og linolsyre (18:2) fettsyrer32.
  12. Åpne et tomt Excel-regneark for å konstruere databasen. I celle a1 i det første regnearket, skriv den teoretiske/beregnede monoisotopic massen av lipid arter som skal legges til databasen, som tilsvarer massen av lipid arter i ioniske staten observert i massen spektrometer. I celle B1 skriver du inn et navn for lipid-artene, for eksempel PG (34:0).
  13. I celle C1, Skriv inn molekyl formelen for lipid arter, som tilsvarer den joniske tilstand lipid observert i massen spektrometer. I celle D1 angir du belastningen for lipid-artene som observert i masse spektrometer. Flytt til celle a2 for å begynne en ny oppføring for de neste lipid artene som skal legges inn i den søkbare databasen.
  14. Gjenta trinnene 8,12 og 8,13 til alle ønskede lipid arter er lagt inn i databasen. Lagre databasefilen og la den være åpen i Excel.
  15. Velg Add-ins- menyen i Excel. Velg LIMSA for å starte LIMSA-programvaren. Fra hovedmenyen klikker du sammensatte bibliotek... -knappen. I det nye vinduet som vises, klikker du på Importer forbindelser. Dette vil laste opp den sammensatte databasen for bruk av LIMSA programvare.
  16. Utføre nøyaktig-masse basert lipid IDer på alle MS Spectra bruke LIMSA programvare Add-in for Excel i henhold til leverandørens instruksjoner35. Fra hovedmenyen for LIMSA velger du topp liste under Spectrum type -menyen. Velg positiv modus eller negativ modus for å SAMSVARE med polariteten som MS-dataene ble anskaffet.
  17. Inne det fjellpigg fwhm (m/z) vindu, gå inn det ønsket masse søkevindu for fjellpigg oppdagelse. En masse toleranse søkevindu av 0.003-0.005 m/z anbefales for høyoppløselig/nøyaktig masse MS data.
  18. I vinduet følsomhet angir du ønsket grunnlinje grense (for eksempel 0,01% relativ overflod). I isotop korreksjon -menyen velger du lineær tilpassing eller trekk fra algoritmer, som kan brukes med topp listedata.
  19. Fremhev lipid forbindelser å inkludere i databasen søket ved å klikke på ønsket lipid arter innenfor tilgjengelige forbindelser vinduet. Klikk på Legg til-knappen for å legge til markerte lipid arter til søke gruppen.
  20. Definer interne standarder ved å klikke på ekstra forbindelser, og deretter endre konsentrasjon vinduet til den tilsvarende konsentrasjonen av den valgte interne standarden.
  21. Sørg for at den interne standarden og utvalgte lipid arter som skal quantitated tilhører samme Klassenavn ved å velge hver tilsatt lipid arter og intern standard og skrive inn et klassenavn (for eksempel PG eller lipid) i klasse-feltet.
  22. For å lagre den søkbare gruppen av lipid forbindelser for fremtidig bruk, klikk på Lagre -knappen ved siden av grupper -menyen.
  23. Kontroller at Excel-filen som inneholder alle eksporterte MS peak lister er åpen for arket som tilsvarer den første S. aureus MS kjøre, og klikk deretter på Søk -knappen fra LIMSA hovedmenyen.
    Merk: utdataene for LIMSA databasen søket vil inneholde en liste over masse Spectral funksjoner matchet til lipider stede i databasen konstruert i trinn 8.12-8.13, samt konsentrasjoner for hver matchet funksjonen etter normalisering til en eller flere Utvalgte interne standarder.
  24. Bruk Xcalibur programvare for å undersøke nøyaktig masse MS/MS Spectra for m/z tilsvarende lipid ioner av interesse for å bekrefte fatty acid bestanddeler til stede i hver identifiserte lipid molekylære arter. Velg Qual Browser -ikonet. Åpne MS/MS-filen av interesse ved å velge rullegardinmenyen fil og velge alternativet Åpne... .
  25. Velg skanne filter som tilsvarer MS/MS analyse av en lipid m/z av interesse ved å høyreklikke på thumbtack ikonet i massen spektrum visningsvinduet og velg spenner fra menyen. I det nye vinduet som vises, velger du filter -menyen for å velge skanningen.
  26. Gjennomsnittlig signal på tvers av den totale ion kromatogram som beskrevet i trinn 8,2. Bruk MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) programvare for å utføre egnede statistiske tester. Evaluere statistisk signifikant forskjell i S. aureus lipid sammensetning ved å sammenligne normalisert lipid forekomster over UBEHANDLET og LDL-behandlet forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen for berikelse av LDL fra kylling eggeplomme er illustrert i figur 1. Denne prosessen begynner med å fortynne hele eggeplomme med saltvann og skille eggeplomme partikler referert til som granulat fra løselig eller plasma brøkdel inneholder LDLs (figur 1)33. LDL-innholdet i plasma fraksjonen er ytterligere beriket med utfelling av ~ 30-40 kDa β-livetins (figur 2)33. Tilstedeværelsen av protein bånd på 140, 80, 65, 60 og 15 KDA samsvarer med apoproteins av LDLs (figur 2)33,39. Behandling med Triklosan hemmer veksten av S. aureus i fatty acid-frie medier32. Vi har tidligere vist at supplere kulturer med eggeplomme plasma eller renset menneskelige LDLs som eksogene fatty acid kilder overvinner Triklosan-indusert veksthemming (Figur 3)32. Tilsvarende gjenoppretter tilskudd av Triklosan-behandlede kulturer med beriket eggeplomme LDL vekst (Figur 3). Videre tillegg av eggeplomme LDLs støtte veksten av en tidligere karakterisert S. aureus fatty acid Auxotroph (figur 4)32. For den mest nøyaktige massen massespektrometri profilering av S. aureus innlemmelse av eksogene fettsyrer, er det viktig å begrense tilstedeværelsen av frie fettsyrer i vekstmedium. Den frie fatty acid sammensetningen av 1% tryptone buljong og kylling eggeplomme LDLs fortynnet i tryptone kjøttkraft ble bestemt ved å ansette Flow injeksjon med høy oppløsning/nøyaktig masse massespektrometri og fant minimale mengder av frie fettsyrer (figur 5). Den samme målrettede masse massespektrometri analyse ble utført for å bestemme fatty acid sammensetningen av S. aureus fosfolipider etter eksponering for kylling eggeplomme LDLs. ortogonale delvis minst-kvadrater discriminant analyse (OPLS-DA)40 av rikelig S. aureus membran fosfolipider demonstrert klar klasse separasjon av ubehandlet og kylling egg eggeplomme LDL-behandlet forhold, som vist i OPLS-da score plot (figur 6a). Den OPLS-DA belastninger tomten indikerte mange eggfosfatidylglyserol arter som viktige variabler i PLS-DA-modellen. Spesielt, fosfolipider inneholder umettede fettsyrer, en molekylær markør av eksogene fatty acid innlemmelse, er beriket i LDL supplert kulturer sammenlignet med celler inkubert i fravær av LDLs (figur 6b). Tidligere studier har funnet at kylling eggeplommer er en rik kilde til umettede fettsyrer med oljesyre acid (18:1) er den mest tallrike41,42. I samråd med disse observasjonene, fant vi oljesyre syre å være den vanligste umettede fatty acid benyttet for fosfolipid syntese når S. aureus kulturer ble supplert med kylling eggeplomme LDLs (figur 6C). Tabell 1 videre illustrerer at fettsyrer profiler av membran fosfolipider endres når S. aureus dyrkes i nærvær av eggeplomme LDL.

Figure 1
Figur 1: en illustrasjon av LDL berikelse fra kylling eggeplomme utnytte sentrifugering og ammoniakk sulfat nedbør. (A) reagensene er nødvendig for BERIKELSE av LDL fra kylling eggeplomme. (B) Flow Chart viser de betydelige TRINNENE i LDL berikelse prosessen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: protein profil av kylling eggeplomme før og etter berikelse for LDL. Protein lysater ble utarbeidet ved hjelp av RIPA buffer. Protein lysat (15 μg) ble lastet inn i en 8% akrylamid SDS-side gel. Gels ble beiset over natten med bio rad protein reagens. Molekyl vektene i kDa av LDL-tilknyttede proteiner er merket langs høyre side av bildet. M: protein markør, Y: kylling eggeplomme, og LDL: kylling eggeplomme LDL berikelse Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eggeplomme-avledet LDLs beskytte S. aureus fra Triklosan-indusert FASII hemming. Veksten av S. aureus ble overvåket over tid via måling av OD600 i 1% tryptone buljong i følgende forhold: 1% tryptone buljong (TB), 1 μm Triklosan (TCS), 1 μm Triklosan med 1% eggeplomme plasma (TCS + EYP), 5% eggeplomme LDL (LDL), eller 1 μM Triklosan med 5% eggeplomme LDL (TCS + LDL). Gjennomsnittet fra tre uavhengige eksperimenter vises. Feilfelt representerer standardavviket for gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: vekst av en S. aureus fatty acid auxotroph er støttet av eggeplomme-avledet LDL. Veksten av en fatty acid auxotroph i 1% tryptone kjøttkraft (TB) med eller uten 5% EGGEPLOMME LDL (LDL) kosttilskudd ble overvåket over tid via måling av OD600. Gjennomsnittet fra tre uavhengige eksperimenter vises. Feilfelt representerer standardavviket for gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: gratis fettsyrer innhold målt i 1% tryptone buljong eller kylling EGGEPLOMME LDL. Frie fettsyrer ble oppdaget av Flow injeksjon med høy oppløsning/nøyaktig masse massespektrometri og tandem masse massespektrometri. Normalisert antall ioner per mg protein ble bestemt for 1% tryptone buljong og 1% tryptone buljong supplert med 5% kylling egg eggeplomme LDLs. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: kylling eggeplomme med lav tetthet lipoproteiner er et reservoar av eksogene fettsyrer for syntese av S. aureus eggfosfatidylglyserol. (A) score tomten av ortogonale delvis minst-kvadrater discriminant analyse av kylling eggeplomme LDL-behandlet og ubehandlet S. aureus membran fosfolipider identifisert ved hjelp av høy oppløsning/nøyaktig masse massespektrometri. (B) prosentandel av umettede EGGFOSFATIDYLGLYSEROL (upg) sammenlignet med total membran PG av S. aureus DYRKET i fravær (WT) eller tilstedeværelse (WT + LDL) av kylling eggeplomme LDLs. (C) umettede fatty acid (UFA) profil av membran PG av S. aureus vokst uten (WT) eller med (WT + LDL) kylling eggeplomme LDLs grafisk som en prosentandel av mengden av total PG fettsyrer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

WT kultivert i tryptone buljong WT kultivert i tryptone buljong supplert med LDLs
Fosfatidyl glyserol (TC: TDB)en Normalisert ion overflod/mg protein Sd Fettsyrerc Normalisert ion overflod/mg protein Sd Fettsyrerc
24:0 0 0 NDb 0,052031116 0,02677 Nd
26:0 0 0 Nd 0,009539117 0,00362 Nd
28:0 0,127937113 0,04528 15:0_13:0 0,167643281 0,02392 15:0_13:0
28:1 0,006765427 0,00157 Nd 0,002776821 0,00372 15:0_13:1
30:0 8,680180809 2,68375 15:0_15:0 14,04873592 2,4531 15:0_15:0
30:1 0 0 Nd 0,010152161 0,00449 15:1_15:0, 13:1_17:0
31:0 4,150511117 1,31658 16:0_15:0, 14:0_17:0 10,17590926 1,88431 16:0_15:0, 14:0_17:0, 18:0_13:0
31:1 0,016156004 0,01216 13:1_15:0, 12:1_19:0 0,473478683 0,09063 13:1_15:0, 18:1_13:0, 12:1_19:0
32:0 29,29259262 8,82993 15:0_17:0 48,24342037 8,95664 15:0_17:0, 16:0_16:0
32:1 0,02074815 0,00941 Nd 0,307044942 0,07305 18:1_14:0, 16:1_16:0
33:0 9,000460122 2,78194 18:0_15:0, 16:0_17:0 15,4531776 2,98171 18:0_15:0, 16:0_17:0
33:1 0,162934812 0,04796 Nd 2,921832928 0,30851 18:1_15:0
33:2 0 0 Nd 0,167492702 0,03211 18:1_15:1, 18:2_15:0
34:0 12,3064043 3,70242 19:0_15:0, 17:0_17:0 18,40129157 3,21385 19:0_15:0, 17:0_17:0
34:1 0 0 Nd 1,423605186 0,20066 18:1_16:0
34:2 0,000470922 0,00082 Nd 0,156133734 0,03929 18:2_16:0
35:0 5,727462455 1,74583 20:0_15:0, 18:0_17:0 7,771538992 1,28515 20:0_15:0, 16:0_19:0, 18:0_17:0
35:1 0,17337586 0,05727 20:1_15:0 0,772202525 0,08526 20:1_15:0, 18:1_17:0
35:2 0 0 Nd 0,038758757 0,01481 18:2_17:0, 18:1_17:1
36:0 0,671004303 0,2116 21:0_15:0, 19:0_17:0 0,967295024 0,2572 21:0_15:0, 20:0_16:0, 19:0_17:0, 22:0_14:0
36:2 0 0 Nd 0,495485065 0,04473 18:1_18:1, 18:2_18:0
36:3 0 0 Nd 0,059268233 0,02291 18:2_18:1, 20:3_16:0, 20:2_16:1
37:0 0,060466411 0,01961 22:0_15:0, 20:0_17:0 0,114526894 0,01852 22:0_15:0, 20:0_17:0, 18:0_19:0
38:2 0 0 Nd 0,079469521 0,02872 18:2_20:0, 16:1_20:1
en egen Oppdaget som [M-H]- ioner. TC, total kjedelengde; TDB, totalt antall doble obligasjoner.
b ND, ikke fastslått
c Fettsyrer er oppført i rekkefølge av isomer overflod. Et understrekingstegn mellom fatty acid betegnelser indikerer at hver fatty acid kan være til stede i enten SN1 eller SN2 posisjon, som tandem masse massespektrometri alene kan ikke utelukke muligheten for at lipid arter eksisterer som en blanding av posisjons isomerene.

Tabell 1: fatty acid profil av S. aureus kultivert i nærvær av kylling eggeplomme LDLs. Vi brukte en objektiv lipidomic analyse utnytte høy oppløsning/nøyaktig MS og MS/MS å fastslå fatty acid profilen til S. aureus PG. S. aureus var inkubert i nærvær eller fravær av kylling EGGEPLOMME LDLs, og PG profilen av disse celler ble sammenlignet med celler kultivert i 1% tryptone buljong.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

S. aureus inkorporerer eksogene fettsyrer i membranen fosfolipider27,32,43. Fosfolipid syntese ved hjelp av eksogene fettsyrer går utenom FASII hemming, men også endrer Biofysiske egenskaper av membranen27,32,44. Mens inkorporering av eksogene fettsyrer i fosfolipider av gram-positive patogener er godt dokumentert, hullene forblir i identiteten til verten fatty acid reservoarer og strukturelle endringer i hver av de tre store stafylokokk fosfolipid typer som følge av eksogene fatty acid innlemmelse. Her beskriver vi protokoller som kan brukes til å: i) berike LDL partikler fra kylling eggeplomme, en kilde til fettsyrer, II) bestemme effekten av eksogene fettsyrer på veksten av S. aureus, og III) benytte en upartisk lipidomic analyse for overvåking eksogene fatty acid innlemmelse i membran fosfolipider av S. aureus. Den avanserte massen massespektrometri metoden gitt i denne studien gir en ekstraordinær perspektiv av membranen sammensetningen av S. aureus vokst i nærvær av eksogene fettsyrer.

Flere gram-positive patogener utnytte eksogene fettsyrer for membran syntese, og som med S. aureus, de mulige kildene til eksogene fettsyrer under infeksjon er dårlig forstått27,43. Veksten analysen beskrevet her kan endres for å evaluere spredning av andre gram-positive patogener i nærvær av lipoproteiner dersom veksten Kinetics av hver patogen vurderes. I tillegg kan andre komplekse verts kilder av eksogene fettsyrer bli testet ved hjelp av denne protokollen hvis de potensielle virkningene av fatty acid kilde på bakgrunn optisk tetthet er kontrollert. Videre er den beskrevne masse massespektrometri metode for analyse av bakterielle lipider tilstrekkelig fleksibel for å muliggjøre lipidome evaluering fra nesten alle bakteriearter. Som lipid nøyaktig masse data er samlet i ' full Scan ' MS-modus, litt a priori kjennskap til lipid innholdet av bakterielle arter av interesse er nødvendig, i motsetning til målrettede analytiske metoder basert på kjente fragmentering mønstre av spesifikke lipider 32 for alle , 45 for alle , 46. i ' målrettede ' analytiske arbeidsflyt vi beskriver, nedstrøms dataanalyse, og spesielt søk av nøyaktig masse topp lister mot en lipid database, er viktige trinn som er svært tilpasningsdyktig og kan støtte et bredt spekter av bakteriell arter og eksperimentelle behandlinger. Ved bygging eller velge en søkbar database for å muliggjøre identifisering av lipid arter, må forskerne vurdere et bredt spekter av hypotetiske endogene lipid arter, samtidig som det gir mulighet for påvisning av romanen eller uforutsette eksogene lipider avledet fra eksperimentell behandling.

I denne studien, en høy oppløsning/nøyaktig masse spektrometer (tabell av materialer) var ansatt på grunn av sin ultra-høy oppløsning/nøyaktig masse evner. Alternativt kan mange andre høyoppløselig/nøyaktig masse massespektrometri plattformer være vellykket implementert for å utføre målrettede lipid analyse. Tilsvarende et bredt spekter av eksempler på Introduksjons metoder, inkludert direkte infusjon, desorpsjon electrospray ionisering, eller Matrix-assistert laser desorpsjon ionisering, som muliggjør direkte analyse av lipid ekstrakter, kan utnyttes til å raskt samle målrettede lipidomic data. Inkluderingen av flytende kromatografi før prøven introduksjon, når den brukes i kombinasjon med høy oppløsning/nøyaktig masse massespektrometri, kan tillate oppløsning av noen isobar lipid arter under full Scan MS datainnsamling. Men inkludering av kromatografi nødvendiggjør sikre at kromatografiske metoden er allsidig nok til å muliggjøre separasjon og påvisning av uventede eller romanen lipid arter som kan være til stede etter eksperimentelle behandlinger. Database søk for å identifisere lipider som finnes i datasettet, kan utføres ved hjelp av alle allment tilgjengelige søkbare databaser. Mens LIMSA programvare muliggjør facile utvikling av brukerdefinerte databaser av titusenvis av hypotetiske lipid arter, finnes det mange andre alternativer for å identifisere lipider fra høy oppløsning/nøyaktig masse MS peak lister. LIPID MAPS Consortium (www.lipidmaps.org) gir verktøy for å søke beregningsorientert og eksperimentelle databaser av hypotetiske lipider bruker høy oppløsning/nøyaktig MS-genererte peak lister innenfor en brukerdefinert masse toleranse, og mange programvare leverandører tilbyr sine egne løsninger for å analysere lipidomics data.

Vellykket vekst kurve og eksogene fatty acid analyse er avhengig av flere faktorer, inkludert LDL renhet og begrense bakgrunn fettsyrer nivåer. Riktig identifisering av brøkdelen av LDL-inneholder er avgjørende. Ovennevnte protokollen og figur 1 illustrerer riktig brøkdel å beholde for hvert trinn i berikelse prosessen. Vi har hatt suksess med bruk av 40% ammonium sulfat (renhet ≥ 99,5%) for nedbør og påfølgende fjerning av β-livetins. Men, andre har rapportert at renhet og konsentrasjon av ammoniakk sulfat lagt til eggeplomme plasma kan signifikant innvirkning på dette trinnet47. Begrense ammonium sulfat forurensning i LDL berikelse er viktig for LDL preparatet skal brukes i bakterielle analyser, som høye konsentrasjoner av ammonium sulfat kan begrense vekst48. Under dialyse, god plass i dialyse slangen må gis for å muliggjøre diffusjon og fjerning av ammonium sulfat. Ytterligere optimering av dialyse prosessen kan inkludere ytterligere vann forandringer i løpet av overnight-inkubasjons. Vi har funnet dialyse over natten for å gi de beste resultatene, selv om Moussa et al. rapport dialyse på 6 h er tilstrekkelig. Det er viktig at start konsentrasjonen av celler i vekst kurvene holdes konsistent mellom forsøkene. For S. aureus, fortynning celler til en første OD600 av 0,05 har gitt de mest konsistente resultatene. I tillegg kan høye konsentrasjoner av FASII-hemmere resultere i ikke-spesifikke effekter på bakterieceller. For eksempel induserer Triklosan konsentrasjoner over 7 μM cytoplasmatiske membran skade i S. aureus, derfor er det nødvendig at konsentrasjonen av denne forbindelsen forblir under dette nivået49. Vi har funnet en endelig Triklosan konsentrasjon på 1 μM resulterer i reproduserbar vekst analyser. Når du evaluerer en potensiell kilde til eksogene fettsyrer for bakteriell fosfolipid syntese, er det viktig å minimere fatty acid bidrag av kulturen medium. I ovennevnte analyser, kultur medium 1% tryptone støtter tilstrekkelig vekst av S. aureus og har minimal fatty acid forurensning29,32.

Begrense bakgrunn fettsyrer nivåer er spesielt viktig for nedstrøms masse massespektrometri fettsyrer profilering. Andre har rapportert mengden av frie fettsyrer i kylling eggeplomme er naturlig lav41 og vår analyse støtter denne konklusjonen (figur 5). Bruke tryptone buljong og grundig vaske celler med PBS etter inkubasjons er avgjørende. I tillegg er det viktig å vurdere vekstfasen av cellene. Vi valgte midt-log fase celler for å sikre rikelig bakteriell fosfolipid syntese. Andre potensielle forurensende kilder av eksogene fettsyrer kan innføres etter bakteriell vekst, for eksempel under lipid utvinning trinn eller påfølgende prøve forberedelser før massen massespektrometri analyse50. Eksogene fettsyrer innført på ethvert trinn i prøven forberedelser kan oppdages som frie fettsyrer under masse massespektrometri analyse. Baking laboratoriet glass i en høy temperatur ovn (minst 180 ° c) over natten kan fjerne eksogene fettsyrer fra reagensrør som brukes for lipid utvinning og lipid lagring. I tillegg kan laboratorieutstyr, inkludert plast, skylles med metanol for å redusere fettsyrer bakgrunnen50. Rester av fettsyrer fra tidligere analyser kan også forurense de innvendige overflatene i selve masse spektrometer. Inkludering av analytiske blanks under masse massespektrometri analyse for fastsettelse av bakgrunnen nivåer av frie fettsyrer er derfor sterkt anbefalt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av hammer laboratoriet for deres kritiske vurdering av manuskriptet og støtte til dette arbeidet. Dr. Alex Horswill ved University of Colorado School of Medicine Vennligst gitt AH1263. Dr. Chris Waters laboratorium ved Michigan State University gitt reagenser. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association Grant 16SDG30170026 og oppstart midler gir ved Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Biokjemi Staphylococcus aureus fatty acid lipoprotein masse massespektrometri fosfolipid eggeplomme lipidomics
Isolering av lipoprotein partikler fra Chicken egg eggeplomme for studier av bakteriell patogen fatty acid innlemmelse i membran fosfolipider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delekta, P. C., Lydic, T. A.,… More

Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter