Summary
この方法は、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌に外因性脂肪酸を取り込む研究のためのフレームワークを提供する。これを達成するために、鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の濃縮のためのプロトコルと、質量分析を利用した細菌リン脂質のその後の脂肪酸プロファイリングについて説明する。
Abstract
黄色ブドウ球菌および他のグラム陽性病原体は、環境からの脂肪酸を膜リン脂質に組み込む。感染中、外因性脂肪酸の大部分は宿主リポタンパク質粒子内に存在する。宿主脂肪酸の貯蔵所や、細菌がリポタンパク質粒子から脂肪酸を抽出するメカニズムに関しては、不確実性が残っている。本研究では、鶏卵黄からの低密度リポタンパク質(LDL)粒子を濃縮し、LDLがS.アウレウスの脂肪酸貯留槽として機能するかどうかを決定するためのプロトコルについて説明する。この方法は、LLLと細菌間の相互作用を探索するための効果的かつ経済的なモデルである、公平なリピドミック分析と鶏LLLを利用する。LDLからの外因性脂肪酸のS.aureus統合の解析は、高解像度/正確な質量分析とタンデム質量分析を用いて行われ、細菌の脂肪酸組成の特性評価を可能にする。LLLへの曝露時に細菌膜脂質に生じる脂肪酸の新しい組み合わせの膜および公平な同定。これらの高度な質量分析技術は、リン脂質に組み込まれた特定の外因性脂肪酸を明らかにすることによって、脂肪酸の組み込みの比類のない視点を提供します。ここで概説する方法は、他の細菌病原体および複合脂肪酸の代替供給源の研究に適応可能である。
Introduction
メチシリン耐性S.アウレウス(MRSA)は、ヘルスケア関連感染の主な原因であり、関連する抗生物質耐性はかなりの臨床的課題である1、2、3である。したがって、新規治療戦略の開発は最優先事項である。グラム陽性病原体の有望な治療戦略は、脂肪酸合成を阻害しており、S.アウレウスにおいて、ホスファチジルグリセロール(PG)、リシル-PG、およびカージリピン4を含むリン脂質産生の要件である。細菌では、脂肪酸合成II経路(FASII)5を介して脂肪酸産生が起こり、真核生物とはかなり異なり、FASIIは抗生物質開発の魅力的な標的となる5,6.FASII阻害剤は、主にFabIを標的とし、脂肪酸炭素鎖伸びに必要な酵素7.FabI阻害剤トリクロサンは、広く消費財や医療用品8、9で使用されています。追加のFabI阻害剤は、S.アウレウス感染症10、11、12、13、14の治療のためにいくつかの製薬会社によって開発されています ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26.しかしながら、S.aureusを含む多くのグラム陽性病原体は、リン脂質合成のための外因性脂肪酸を清掃し、FASII阻害27、28、29をバイパスすることができる。したがって、FASII阻害剤の臨床的可能性は、宿主脂肪酸の供給源と病原体が宿主27、28から脂肪酸を抽出するメカニズムに関する我々の知識のかなりのギャップのために議論される。これらのギャップに対処するために、リポタンパク質粒子からS.aureusの膜リン脂質への外因性脂肪酸の取り込みを監視する偏りのないリピドミック分析法を開発した。
敗血症の間、宿主リポタンパク質粒子は血管内の宿主由来脂肪酸の潜在的な供給源を表し、宿主脂肪酸の大部分は粒子30に関連している。リポタンパク質は、リン脂質およびタンパク質からなる親水性シェルからなるもので、トリグリセリドおよびコレステロールエステル31の疎水性コアを囲む。シロミクロン、非常に密度の高いリポタンパク質、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質(LDL)の4つの主要なクラスは、ホストによって生成され、脂質輸送手段として機能し、脂肪酸とコレステロールを送達します。血管系を介して細胞をホストします。LLLは、トリグリセリドおよびコレステロールエステル31を含むエステル化脂肪酸に豊富である。我々は、高度に精製されたヒトLLLがPG合成のための外因性脂肪酸の生存可能な供給源であることを以前に実証し、したがってFASII阻害剤バイパス32のメカニズムを提供する。精製ヒトLLLの浄化は技術的に困難で時間がかかる一方で、精製されたヒトLLLの商業的供給源は日常的に使用したり、大規模な細菌スクリーンを実行するために非常に高価です。これらの制限に対処するために、我々は、リポタンパク質粒子33の豊富な供給源である鶏卵黄からのLLLの濃縮のための手順を修正した。我々は、S.aureus32の膜へのヒトLDL由来脂肪酸の取り込みを監視するために、標的とされていない、高解像度/正確な質量分析とタンデム質量分析を使用することに成功しました。以前に報告された方法とは異なり、このアプローチは、3つの主要なブドウ球菌リン脂質タイプのそれぞれについて個々の脂肪酸異性体を定量することができる。オレイン酸(18:1)は、S.アウレウスリン脂質29、30、32に容易に組み込まれるすべての宿主リポタンパク質粒子内に存在する不飽和脂肪酸である。S.アウレウスはオレイン酸合成29ができない。従って、リン脂質組み込みオレイン酸の量は、ブドウ球菌膜29内の宿主リポタンパク質由来脂肪酸の存在を確立する。これらのリン脂質種は、ここで説明する最先端の質量分析法によって同定することができ、脂肪酸源の存在下で培養されたS.aureusの膜組成の前例のない分解能を提供する可能性が高い感染中に遭遇する。
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Protocol
注:鶏卵黄からのLDL粒子の濃縮のための以下のプロトコルは、Moussaら200233に由来する。
1. LDL粒子濃縮用鶏卵黄の調製
- 70%のエタノール溶液で殻を洗って2つの大きな鶏卵を消毒し、空気乾燥を可能にします。
- 70%のエタノール溶液を使用して卵分離器を消毒し、空気乾燥を可能にします。中型ビーカーの唇に卵セパレータを取り付けます。
- 卵セパレータに各卵を個別に割り、アルブデンがビーカーに流れるようにします。無傷の卵黄は、セパレータによって保持されます。
- 卵黄を30mLの無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)で2回洗い、残留アルブミンを除去する。
- 卵黄をフィルターペーパーの上にそっと置きます。
- 滅菌ピペット先端でビテリン膜を穿刺し、無菌50 mLの円錐遠心管に膜の内容物を排出します。膜とフィルターペーパーを捨てます。
2. 鶏卵黄からのLDL含有血漿の分画
- 卵黄にpH 7.0で0.17M NaClの約2つのボリュームを追加し、激しく混ぜます。その後、この溶液を4°Cで60分間混ぜます。
- 卵黄希釈を10°Cで10°Cで10,000 x gで45分間遠心分離し、粒状画分(ペレット)から無菌50mL円錐管に血漿画分(上清)を取り除きます。
- 手順 2.2 を繰り返します。
3. プラズマからのLDL粒子の単離
- プラズマ画分を40%硫酸アンモニウム(w/v)と4°Cで60分間混ぜます。
- 420 mM NaOH溶液でプラズマ画分のpHを8.7に調整します。
- 卵黄希釈を4°Cで10,000 x gで45分間遠心分離し、上半固体黄色分画を7kDa細孔サイズ透析チューブに取り除きます。それが膨らむことを可能にするために、チューブに部屋を提供します。
- 硫酸アンモニウムを除去するために、3Lの超純水で4°Cで一晩透析する。かき混ぜる棒を使って水をそっと混ぜます。
- 無菌50 mL円錐遠心管に透析液を移します。
- 45分間、10,000 x gで4°Cで溶液を遠心分離し、慎重に上半固体黄色分画を無菌チューブに取り除き、4°Cで保存します。
4. 脂肪酸源としての鶏肉LLLの評価
- サブ培養S.アウレウス細胞を脂肪酸フリー1%トリプトンブロスの5mLにし、振盪(225rpm)で37°Cで一晩インキュベートする。脂肪酸の補助栄養, 脂肪酸の供給源と培養物を補う.
- 1%のトリプトンブロスで0.1の600 nm(OD600)で光学密度(OD)に一晩培養を希釈する。丸底96ウェルプレートの各ウェルにセル懸濁液のピペット50μL。
注:脂肪酸の補助栄養を使用する場合は、トリプトンスープの2つのボリュームで一晩培養を洗浄し、培養のODを決定する前に脂肪酸の持ち越しを制限するためにトリプトンスープの5 mLで再懸濁します。 - 未処理のコントロールを含むウェルの場合は、ウェルあたり1%トリプトンブロスの50 μLを追加します。
- 実験細胞懸濁液を含むウェルに、10%卵黄由来LDL、2μMトリクロサン、または10%卵黄由来LDLおよび2μMトリクロサンの混合物を添加した1%トリプトンブロスの50μLを添加する。
注:この時点で、各ウェルは100 μLを含み、卵黄由来LDLとトリクロサンの最終濃度は、それぞれ5%と1μMになります。 - 連続的な線形揺れで37°Cに設定されたマイクロプレートリーダーを使用して、時間の経過とともにOD600を測定し、成長を監視します。
5. 膜脂質分析のためのLLLを用したS.アウレウスのインキュベーション
- 単離されたコロニーを脂肪酸フリー1%トリプトンブロスの5mLに培養し、振盪(225rpm)で37°Cで一晩インキュベートする。
- 1:100を1%トリプトンブロスの50mLを含む無菌250mLのバッフルフラスコに希釈する。振盪で37°Cで中間対数相(約4時間)にインキュベートします。
- 25 mLの培養を無菌50mL遠心管に移し、細胞をペレット化する。上清を取り出し、1%トリプトンブロスの750 μLで細胞ペレットを再中断します。
- 細胞懸濁液の再懸濁細胞とアリコート300 μLを無菌1.5 mL遠心管に組み合わせます。
- 所望の最終濃度にLLLを加え、4時間振る(225rpm)で37°Cでインキュベートします。
- 2分間16,000 x gで4°Cの培養物を遠心分離し、細胞ペレットを2体の無菌PBSで洗浄し、その後繰り返します。
- 各湿った細胞ペレットの重量を記録します。ドライアイスまたは液体窒素でセルペレットをスナップフリーズし、-80°Cで保存するか、セクション6に直接進みます。
6. S.アウレウス膜脂質の抽出
- 冷凍S.アウレウス細胞ペレットをドライアイスに置きます。各セルペレットの上に0.5mmの酸化ジルコニウムビーズを加え、細胞ペレットの体積とほぼ同じ量のビーズを使用します。
注:脂質抽出のこの方法の代替として、研究者は、細菌細胞34から脂質を正確にするために確立されたBlighおよびDyerまたはFolch法を使用することができます。 - 75%メタノール(HPLCグレード)の740 μLを細胞ペレットに直接-80°Cに冷やします。
- 内部標準として細胞の1mg当たり50 μMジミストイルホスファチジルコリン(メタノールで調布)の2 μLを追加します。試験管を閉じ、各サンプルを含む1.5mL遠心分離管を弾丸ブレンダー組織ホモジナイザーの利用可能なポートに置きます。低速でサンプルを均質化し、2-3を設定し、3分間使用します。
- サンプルの均質性を視覚的に検査します。細胞の塊が見える場合は、Bullet Blender で均質化を 2 分単位で続行します。
- 弾丸ブレンダーからサンプルを取り出し、化学ヒュームフードに移します。
- 各サンプルチューブに270μLのクロロホルムを追加します。30分間精力的にサンプルを渦にします。
注意: クロロホルムは発癌物質の可能性があります。 - ベンチトップ遠心分離機でサンプルを最大2,000 x gで最大30分間遠心分離します。互換性のある遠心チューブでより速い速度を使用することができ、遠心分離の持続時間は10分に短縮することができます。
- 化学ヒュームフードで、単相性上清を収集し、抽出管の底部のタンパク質ペレットを慎重に避けながら、新しい試験管に移します。
- 75%メタノール(HPLCグレード)の740 μLと270μLのクロロホルムをタンパク質ペレットに加え、上記のステップ6.6-6.8に記載されているように各サンプルを再抽出します。第2抽出から上清を各サンプルについて以前に収集した上清と組み合わせます。
- 窒素やアルゴンなどの不活性ガスの流れの下、または遠心分離機濃縮器(材料の表)を使用して真空下で抽出溶媒を蒸発させます。
- 乾燥脂質抽出物を水性10mM炭酸アンモニウム溶液の1.0mLで3回洗浄し、ステップ6.10のようにサンプルを再乾燥させます。
- イソプロパノールなどの好適な非極性溶媒に乾燥脂質抽出物を再中断する。ステップ5.7で決定された新鮮な細胞重量の1mg当たり20μLを用いてサンプルを再中断する代わりに、細胞ペレットの重量が不明な場合は、イソプロパノールの200μLでサンプルを再中断し、セクション7に進みます。
7. 高解像度・正確質量分析を用いてS.アウレウス脂質プロファイルの解析
- 完全な脂質分析を行う前に、実験グループから代表的な試験サンプルを選択し、サンプル希釈因子の範囲にわたって分析して、総脂質濃度が線形内にあるサンプル希釈範囲を決定します。質量分析計に対する検出器応答の範囲は、前述の35.
- 脂質分析を施される各試料脂質抽出物のアリコートを蒸発させ、不活性ガス下または遠心分離器調心(材料表)でアリコートを乾燥させる。
- 液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)グレードのイソプロパノール:メタノール(2:1、v:v)20mMアンモニウムを含む各乾燥脂質抽出物を再中断し、ステップ7.1で決定した最適なサンプル希釈因子に相当する量を使用する。
- 標的化されていない脂質分析の場合、サンプルは、フローインジェクションまたは抽出物35、36の直接注入によるクロマトグラフィーを使用せずに、高解像度/正確な質量分析プラットフォームに直接導入され得る。ステップ7.3で調製した希釈脂質抽出物を適切なオートサンプラーバイアルまたは96ウェルプレートに移します。
- フローインジェクションベースの解析では、電子フローを備えたHPLC(材料表)などのキャピラリー/低流量アプリケーションが可能なHPLCシステムの温度制御(15°C)オートサンプラーに自動サンプラーを配置します。プロポーショナルおよびフロー監視システム。
- HPLC溶媒貯留部にLC-MSグレードのイソプロパノール:メタノール(2:1,v:v)を充填し、20mMアンモニウムを含む。
- アジレントケムステーションソフトウェアを使用して、HPLCオートサンプラーをプログラムして5 μLサンプル注入を行います。[インストゥルメント]メニューで、[インジェクタの設定]を選択し、[射出量]フィールドに「5.0」と入力します。 単位はマイクロリットルとして与えられる。HPLCが2:1(v:v)イソプロパノール:20 mMアンモニウムを含むメタノールの分数当たり1 μLでアイソクラティックフローに設定されていることを確認します。
- Chemstationインストゥルメントメニューから、[ポンプを設定]を選択し、マイクロフローモードの切り替えスイッチを選択します。
- [時刻表]フィールドに、次のように入力します:時間 0.00、100% B、フロー 1.0を入力します。[入力]を押して、タイム 10.0、100% B、フロー 1.0と入力して、時刻表の 2 行目を作成します。[ポンプの設定]メニューの下部にある[OK]ボタンを選択します。これらの設定により、毎分1.0 μLの流量で10回の分析実行が可能になります。
- 低流量(34G)金属針を装着したエレクトロスプレーイオン化源を用いて、HPLC転写ラインから質量分析計への溶出を導入します。
- サーモチューンプラス計器制御ソフトウェアを使用して、セットアップメニューを選択し、加熱されたESIソースを選択します。これらの値をダイアログ ボックスの対応するフィールドに入力して、イオン化電圧を 4000 V に設定し、シースガスを 5 (任意の単位) に設定します。同様に、毛細血管温度を150°Cに、Sレンズを50%に設定します。
注: これらの値は、質量分析プラットフォームごとに最適化する必要があります。 - ターゲットを絞らない脂質分析では、検出器として高解像度/正確な質量MSプラットフォーム(材料の表)を使用します。
- サーモチューンプラスソフトウェアを使用して、[スキャンの定義]ボタンをクリックし、アナライザメニューで「FTMS」を選択します。 [[一斉範囲]フィールドを[標準]に設定し、[解像度]フィールドで[100,000]を選択します。スキャンの種類が[いっぱい]に設定されていることを確認します。[範囲をスキャン]メニューの下に、[最初の質量 (m/z)]フィールドに200と入力し、[最後の質量 (m/z)] フィールドに2000と入力します。
- 負の極性が最も豊富なS.アウレウス脂質を検出するために利用されていることを確認してください。
- イオンマッピングのアンデム質量分析(MS/MS)断片化を用いてサンプル分析を繰り返し、目的のスペクトル領域内のすべての脂質イオンの断片化を行い、脂質構造と脂肪酸成分を確認します。あるいは、目的の選択された脂質イオンは、第8項に初期脂質同定が割り当てられた後にMS/MS分析を受けてもよい。
8. 内因性S.アウレウスおよび外因性LDL由来脂質を同定するためのデータベース検索
- サーモXcaliburソフトウェアを使用して、観測された質量精度をさらに向上させます。Xcalibur で、[ツール]メニューの下で、[オフラインの再調整]を選択します。[オフラインの再調整]ウィンドウが開いたら、[ファイル]メニューを選択し、[開く] オプションを選択して、再調整するマススペクトル ファイルを読み込みます。
- 目的のファイルを開き、ビュー ウィンドウの上部にある[行の挿入] ボタンを切り替えて、MS 実行の合計イオン クロマトグラムを表示します。合計イオンクロマトグラムの観測信号ピークの一端でコンピュータマウスを左クリックし、ピークの最も広い部分を横切ってマウスをドラッグすることによって、取得したMS信号を平均化します。
- [スキャンフィルタ] メニューで、フル スキャン MS データに対応するフィルタを選択します。[読み込み Ref...ボタンを選択し、参照ファイルを選択することにより、少なくとも 3 つの既知のS. aureus内因性脂質の理論上の単一同位体の質量を含む参照ファイルを読み込みます。各脂質単一同体質量の横にある [使用] チェック ボックスをオンにします。
- 表示ウィンドウの下部にある[検索]ボタンをクリックします。前に行われた合計イオンクロマトグラムの信号ピークを横切ってMS信号を再平均します。
- 表示ウィンドウの下部にある[変換]ボタンをクリックします。[ダイアログの変換] ボックスが開いたら、[OK] をクリックします。 サーモサイエンティフィック以外のベンダーから質量分析プラットフォームでデータが収集された場合は、この手順を省略します。
- Xcalibur ソフトウェアを使用して、未処理または LDL 処理された各サンプルの再校正された正確な質量ピーク リストを Excel ファイルのワークシートにエクスポートします。クォール ブラウザアイコンを選択します。[ファイル]メニューを選択し、[開く]オプションを選択して、関心のある再調整されたファイルを開きます。
- ステップ8.2で説明したように、イオンクロマトグラム全体の広いピーク全体の信号を平均する。
- マススペクトル表示ウィンドウのサムタックアイコンを右クリックし、[表示]を選択します |スペクトルリスト:同じメニューから、[表示オプション]を選択し、[表示]メニューの [すべてのピーク]トグル ボックスを選択します。[OK]ボタンをクリックして表示ウィンドウを閉じます。
- マススペクトル表示ウィンドウのサムタックアイコンをもう一度右クリックし、エクスポートを選択します |クリップボード (正確な質量).最初のワークシートのエクスポートされたデータ セル A1 を新しい Excel スプレッドシートに貼り付けます。
- エクスポートされたデータ ファイルの最初の 8 行のテキストを削除して、Excel スプレッドシートのセル A1 にマス スペクトルから最初のマス データ ポイントが含まれるようになりました。エクスポートされたピーク リストごとに Excel ファイルの新しいワークシートを使用して、再調整された MS ファイルごとにエクスポートを繰り返します。
- 脂質質量スペクトル分析(LIMSA)ソフトウェア37 Excelのアドインを使用して、Hewelt-Belka et al. 201438で説明した既知のS.アウレウス脂質種の分子式を含むデータベースを構築し、同様にLDLに仮定的に存在する可能性のある脂質種を表す式。
注:さらに、オレイン(18:1)やリノール酸(18:2)脂肪酸32などの主要なLDL脂肪酸を組み込んだ架空の細菌脂質の潜在的な分子製剤をデータベースに含める必要があります。 - データベースを構築するには、空白の Excel スプレッドシートを開きます。第1ワークシートの細胞A1に、データベースに添加する脂質種の理論/計算単一同位体質量を入力し、質量分析計で観察されたイオン状態における脂質種の質量に対応する。細胞B1に、PG(34:0)などの脂質種の名前を入力します。
- 細胞C1において、脂質種の分子式を入力し、質量分析計で観察された脂質のイオン状態に対応する。細胞D1では、質量分析計で観察される脂質種の電荷を入力する。セル A2 に移動して、検索可能なデータベースに入力する次の脂質種の新しいエントリを開始します。
- すべての目的の脂質種がデータベースに入力されるまで、手順 8.12 と 8.13 を繰り返します。データベース ファイルを保存し、Excel で開いたままにします。
- Excel で、[アドイン]メニューを選択します。LIMSAソフトウェアを起動するには、LIMSA を選択します。メインメニューから、[複合ライブラリ]ボタンをクリックします。表示される新しいウィンドウで、[コンパウンドのインポート] をクリックします。これにより、LIMSA ソフトウェアで使用する複合データベースがアップロードされます。
- ベンダーの指示35に従って、LIMSA ソフトウェア アドイン for Excel を使用して、すべての MS スペクトルで正確な質量ベースの脂質識別を実行します。LIMSA メインメニューから、スペクトラムタイプメニューの下でピークリストを選択します。MS データが取得された極性に対応するには、[正モード]または [負のモード]を選択します。
- ピークfwhm (m/z)ウィンドウに、ピーク検索用の目的の質量検索ウィンドウを入力します。高解像度/正確な質量 MS データには、0.003 ~ 0.005 m/z の質量公差検索ウィンドウを使用することをお勧めします。
- 感度ウィンドウに、目的のベースラインカットオフ(例えば、0.01%の相対量)を入力します。[同位板補正]メニューで、[線形フィット]または[減算アルゴリズム] を選択します。
- 利用可能な化合物ウィンドウ内の所望の脂質種をクリックして、データベース検索に含める脂質化合物をハイライト表示します。[追加]ボタンをクリックして、強調表示された脂質の種を検索グループに追加します。
- 追加された化合物をクリックし、選択した内部標準の対応する濃度に濃度ウィンドウを変更して、内部標準を定義します。
- 定量する内部標準および選択された脂質種が、追加された各脂質種と内部標準を選択し、Class フィールドにクラス名(PG や脂質など)を入力して、同じクラス名に属していることを確認します。
- 将来使用するために、検索可能な脂質化合物のグループを保存するには、[グループ]メニューの横にある [保存]ボタンをクリックします。
- エクスポートされたすべての MS ピーク リストを含む Excel ファイルが、最初のS. aureus MS の実行に対応するシートに開いていることを確認し、LIMSA メイン メニューから[検索]ボタンをクリックします。
注: LIMSA データベース検索の出力には、ステップ 8.12-8.13 で構築されたデータベースに存在する脂質に一致する質量スペクトル フィーチャの一覧と、選択した 1 つ以上の正規化後の一致したフィーチャの濃度が含まれます。内部標準。 - Xcaliburソフトウェアを使用して、目的の脂質イオンに対応するm/zの正確な質量MS/MSスペクトルを調べ、各同定された脂質分子種に存在する脂肪酸成分を確認する。クォール ブラウザアイコンを選択します。[ファイル]ドロップダウン メニューを選択し、[開く]オプションを選択して、目的の MS/MS ファイルを開きます。
- マススペクトル表示ウィンドウのサムタックアイコンを右マウスクリックして、対象の脂質m/zのMS/MS解析に対応するスキャンフィルタを選択し、メニューから範囲を選択します。表示される新しいウィンドウで、[フィルタ]メニューを選択してスキャンを選択します。
- ステップ8.2で説明されているように、イオンクロマトグラム全体の信号を平均します。MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) ソフトウェアを使用して、適切な統計テストを実行します。未処理およびLDL処理条件全体で正規化された脂質の存在量を比較することにより、S.アウレウス脂質組成物の統計的有意な差を評価する。
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Representative Results
鶏卵黄からのLDLの濃縮のためのプロトコルを図1に示す。このプロセスは、全卵黄を生理食で希釈し、顆粒と呼ばれる卵黄固体をLLLを含む可溶性または血漿分画から分離することから始まる(図1)33。血漿画分のLDL含有量は、〜30〜40kDaβ-ライブチン(図2)33の沈殿によってさらに濃縮される。140、80、65、60および15 kDaにおけるタンパク質バンドの存在は、LLLのアポプロテインと相関する(図2)33、39。トリクロサンによる治療は、脂肪酸フリー培中のS.アウレウスの増殖を阻害する32.我々は以前に、外因性脂肪酸源として卵黄血漿または精製ヒトLLLで培養を補う培養物がトリクロサン誘発増殖抑制を克服することを実証した(図3)32。同様に、濃縮卵黄LDLを含むトリクロサン処理培養培養物の補充は、成長を回復させる(図3)。また、卵黄LLLの添加は、以前に特徴付けられたS.アウレウス脂肪酸アソキソトロフ(図4)32の増殖を支持する。外因性脂肪酸のS.aureusの最も正確な質量分析ベースのプロファイリングのためには、成長培地中の遊離脂肪酸の存在を制限することが重要である。トリプトンブロスで希釈した1%トリプトンブロス及び鶏卵黄LLLの遊離脂肪酸組成物を、フローインジェクション高解像度/正確質量分析を用いて決定し、遊離脂肪酸の最小量を見出した(図5)。同じ非標的質量分析分析を行い、鶏卵黄LLLに曝露した後のS.アウレウスリン脂質の脂肪酸組成を決定した。豊富なS.アウレウス膜リン脂質の非処理および鶏卵黄LDL処理条件の明確なクラス分離を示した(図6A)。OPLS-DA負荷プロットは、PLS-DAモデルにおける重要な変数として多数のホスファチジルグリセロール種を示した。特に、不飽和脂肪酸を含有するリン脂質は、外因性脂肪酸の分子マーカーであり、LDLの不在でインキュベートされた細胞と比較してLDL補充培養物中に濃縮される(図6B)。以前の研究では、鶏卵黄はオレイン酸を含む不飽和脂肪酸の豊富な供給源であることが判明しました (18:1) 最も豊富な41,42.これらの観察に合わせて、S.アウレウス培養物を鶏卵黄LLLで補充した際に、リン脂質合成に利用される最も一般的な不飽和脂肪酸であるオレイン酸が見つかりました(図6C)。表1は、卵黄LDLの存在下でS.aureusが成長すると、膜リン脂質の脂肪酸プロファイルが変化することをさらに示す。
図1:遠心分離と硫酸アンモニア沈殿を利用した鶏卵黄からのLDL濃縮の図。(A) 鶏卵黄からLDLを濃縮するために必要な試薬。(B) フローチャートは、LDLエンリッチメントプロセスの重要なステップを示しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:LDLの濃縮前後の鶏卵黄のタンパク質プロファイルタンパク質リサエートはRIPAバッファーを用いて調製した。タンパク質リサート(15μg)を8%アクリルアミドSDS-PAGEゲルに装填した。ゲルをバイオラッドタンパク質試薬で一晩染色した。LDL関連タンパク質のkDa中の分子量は、画像の右側に沿って示される。M:プロテインマーカー、Y:鶏卵黄、LDL:鶏卵黄LDL濃縮はこちらをクリックして、この図のより大きなバージョンを表示してください。
図3:卵黄由来LLLは、トリクロサン誘発FASII阻害からS.アウレウスを保護する。S.アウレウスの成長は、次の条件で1%トリプトンブロス(TB)、1μMトリクロサン(TCS)、1%卵黄血漿(TCS +EYP)、5%卵黄LDL(LDL)、または1μMの1%トリプトンブロスでOD600の測定を介して時間をかけてモニタリングしました。5%卵黄LDL(TCS + LDL)を持つトリクロサン。3つの独立した実験からの平均が示されている。誤差バーは、平均の標準偏差を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Sの成長アウレウス脂肪酸アソキソトロフは、卵黄由来LDLによってサポートされています。5%卵黄LDL(LDL)補充の有無にかかわらず1%トリプトンブロス(TB)における脂肪酸の増殖は、OD600の測定を介して経時にモニタリングされた。3つの独立した実験からの平均が示されている。誤差バーは、平均の標準偏差を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:1%トリプトンスープまたは鶏卵黄LDLで測定された遊離脂肪酸含有量。遊離脂肪酸は、フローインジェクションの高解像度/正確な質量分析とアンデム質量分析によって検出された。タンパク質1mg当たりのイオンの正規化数は、1%トリプトンブロスと1%トリプトンスープに5%の鶏卵黄LLLを補充して決定しました。
図6:鶏卵黄低密度リポタンパク質は、S.アウレウスホスファチジルグリセロールの合成のための外因性脂肪酸の貯蔵所である。(A) 高分解能/正確な質量分析法を用いて同定されたニワトリ卵黄黄LDL処理および未処理S.アウレウス膜リン脂質の直交部分最小二乗物の判別分析のスコアプロット。(B) 不飽和ホスファチジルグリセロール(UPG)の割合は、鶏卵黄LDLの不在(WT)または存在(WT+LDL)で増殖したS.アウレウスの総膜PGと比較した(C)不飽和脂肪酸(UFA)膜PGのプロファイルS.アウレウスは(WT)または(WT+LDL)鶏卵黄LDLを含む(全PG脂肪酸の総量の割合としてグラフ化)で成長した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| トリプトンスープで培養したWT | WTはLLLを補充したトリプトンスープで培養 | |||||
| ホスファチジルグリセロール (TC:TDB) | タンパク質の正規化されたイオンの豊富さ/mg | Sd | 脂肪酸c | タンパク質の正規化されたイオンの豊富さ/mg | Sd | 脂肪酸c |
| 24:0 | 0 | 0 | NDb | 0.0.052031116 | 0.02677 | Nd |
| 26:0 | 0 | 0 | Nd | 0.009539117 | 0.00362 | Nd |
| 28:0 | 0.127937113 | 0.04528 | 15:0_13:0 | 0.167643281 | 0.02392 | 15:0_13:0 |
| 28:1 | 0.0066765427 | 0.00157 | Nd | 0.002776821 | 0.00372 | 15:0_13:1 |
| 30:0 | 8.680180809 | 2.68375件 | 15:0_15:0 | 14.04873592 | 2.4531の | 15:0_15:0 |
| 30:1 | 0 | 0 | Nd | 0.010152161 | 0.00449 | 15:1_15:0,13:1_17:0 |
| 31:0 | 4.150511117 | 1.31658年 | 16:0_15:0, 14:0_17:0 | 10.17590926 | 1.88431 1 | 16:0_15:0, 14:0_17:0, 18:0_13:0 |
| 31:1 | 0.016156004 | 0.01216 | 13:1_15:0,12:1_19:0 | 0.473478683 | 0.09063 | 13:1_15:0, 18:1_13:0, 12:1_19:0 |
| 32:0 | 29.29259262 | 8.82993 | 15:0_17:0 | 48.24342037 | 8.95664 | 15:0_17:0, 16:0_16:0 |
| 32:1 | 0.02074815 | 0.00941 | Nd | 0.307044942 | 0.07305 | 18:1_14:0,16:1_16:0 |
| 33:0 | 9.000460122 | 2.78194 | 18:0_15:0, 16:0_17:0 | 15.4531776 | 2.98171 | 18:0_15:0, 16:0_17:0 |
| 33:1 | 0.162934812 | 0.04796 | Nd | 2.921832928 | 0.30851 | 18:1_15:0 |
| 33:2 | 0 | 0 | Nd | 0.167492702 | 0.03211 | 18:1_15:1、18:2_15:0 |
| 34:0 | 12.3064043 | 3.70242 | 19:0_15:0, 17:0_17:0 | 18.40129157 | 3.21385 | 19:0_15:0, 17:0_17:0 |
| 34:1 | 0 | 0 | Nd | 1.423605186 | 0.20066 | 18:1_16:0 |
| 34:2 | 0.000470922 | 0.00082 | Nd | 0.156133734 | 0.03929 | 18:2_16:0 |
| 35:0 | 5.727462455 | 1.74583年 | 20:0_15:0, 18:0_17:0 | 7.771538992 | 1.28515年 | 20:0_15:0, 16:0_19:0, 18:0_17:0 |
| 35:1 | 0.17337586 | 0.05727 | 20:1_15:0 | 0.772202525 | 0.08526 | 20:1_15:0,18:1_17:0 |
| 35:2 | 0 | 0 | Nd | 0.038758757 | 0.01481 | 18:2_17:0,18:1_17:1 |
| 36:0 | 0.671004303 | 0.2116 0 | 21:0_15:0, 19:0_17:0 | 0.967295024 | 0.2572 | 21:0_15:0, 20:0_16:0, 19:0_17:0, 22:0_14:0 |
| 36:2 | 0 | 0 | Nd | 0.495485065 | 0.04473 | 18:1_18:1、18:2_18:0 |
| 36:3 | 0 | 0 | Nd | 0.059268233 | 0.02291 | 18:2_18:1, 20:3_16:0, 20:2_16:1 |
| 37:0 | 0.060466411 | 0.01961 | 22:0_15:0, 20:0_17:0 | 0.114526894 | 0.01852 | 22:0_15:0, 20:0_17:0, 18:0_19:0 |
| 38:2 | 0 | 0 | Nd | 0.079469521 | 0.02872 | 18:2_20:0,16:1_20:1 |
| a.[M-H]-イオンとして検出した。TC、全鎖長;TDB、ダブルボンドの総数。 | ||||||
| bND、未決定 | ||||||
| c脂肪酸は、逆質の豊富な順に記載されています。脂肪酸指定の間のアンダースコアは、タンデム質量分析単独では、脂肪種が位置異性体の混合物として存在する可能性を排除できないため、各脂肪酸がSN1またはSN2位置に存在する可能性があることを示している。 | ||||||
表1:鶏卵黄LLLの存在下で培養されたS.アウレウスの脂肪酸プロファイル。高解像度/正確MSおよびMS/MSを用いた公平なリピドミック分析を用いて、S.アウレウスPG.S.アウレウスの脂肪酸プロファイルを、鶏卵黄LLLの有無にインキュベートし、これらのPGプロファイルを決定した。細胞を1%トリプトンブロスで培養した細胞と比較した。
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Discussion
S.アウレウスは、その膜リン脂質27、32、43に外因性脂肪酸を組み込む。外因性脂肪酸を用いるリン脂質合成は、FASII阻害をバイパスするが、膜27、32、44の生体物理学的特性も変化する。グラム陽性病原体のリン脂質への外因性脂肪酸の取り込みは十分に文書化されているが、宿主脂肪酸貯留の同一性と3つの主要なブドウ球菌リン脂質タイプの構造変化にギャップが残っている。外因性脂肪酸の取り込みから生じる。ここでは、i)鶏卵黄からLDL粒子を濃縮し、脂肪酸の供給源であるii)外因性脂肪酸がS.アウレウスの成長に及ぼす影響を決定し、iii)に対して公平な脂肪分析を利用するプロトコルについて説明する。S.aureusの膜リン脂質への外因性脂肪酸の組み込みを監視する。本研究で提供される高度な質量分析法は、外因性脂肪酸の存在下で成長したS.アウレウスの膜組成物の異常な視点を提供する。
いくつかのグラム陽性病原体は、膜合成のために外因性脂肪酸を利用し、S.aureusと同様に、感染時の外因性脂肪酸の可能な供給源は、よく理解されていない27,43。ここで説明する成長分析は、各病原体の成長動態が考慮される場合にリポタンパク質の存在下での他のグラム陽性病原体の増殖を評価するために修飾することができる。さらに、バックグラウンド光学密度に対する脂肪酸源の潜在的な影響が制御される場合、外因性脂肪酸の他の複雑な宿主源は、このプロトコルを使用して試験することができる。さらに、細菌脂質の分析のための記載された質量分析法は、事実上あらゆる細菌種からのリピドーム評価を可能にするのに十分に柔軟である。脂質の正確な質量データが「フルスキャン」MSモードで収集されるので、特定の脂質の既知の断片化パターンに基づく標的分析方法とは異なり、目的とする細菌種の脂質含有量に関する事前知識はほとんど必要とされていない。32歳,45歳,46.我々が説明する「ターゲットなし」分析ワークフローでは、下流のデータ分析、特に脂質データベースに対する正確な質量ピークリストの検索は、適応性が高く、幅広い細菌をサポートする可能性のある重要なステップです。種と実験的な治療法。脂質種の同定を可能にするために検索可能なデータベースを構築または選択する場合、研究者は、誘導される新規または予期しない外因性脂質の検出を可能にしながら、幅広い仮説的内因性脂質種を考慮する必要があります。実験的治療から。
本研究では、超高分解能/正確質量能力により、高解像度・高精度質量分析計(材料表)を採用した。あるいは、他の多数の高解像度/正確な質量分析プラットフォームを正常に実装して、ターゲットを絞らない脂質分析を行うことができる。同様に、直接注入、脱着エレクトロスプレーイオン化、脂質抽出物の直接分析を可能にするマトリックスアシストレーザー脱離イオン化などの幅広いサンプル導入方法を利用して、迅速に収集することができます。ターゲットを絞らないリピドミックデータ。サンプル導入前に液体クロマトグラフィーを含めることは、高解像度/正確な質量分析と組み合わせて使用する場合、フルスキャンMSデータ収集中にいくつかの等方性脂質種の分解能を可能にし得る。しかし、クロマトグラフィーを含めることは、選択したクロマトグラフィー法が、実験的処置の後に存在する可能性のある予期しないまたは新規な脂質種の分離および検出を可能にするのに十分な汎用性を確保する必要がある。データセット内に存在する脂質を識別するためのデータベース検索は、公的に利用可能な検索可能なデータベースを使用して実行されてもよい。LIMSAソフトウェアは、数万種類の仮説脂質種のユーザー定義データベースの表面的な開発を可能にしますが、高解像度/正確な質量MSピークリストから脂質を識別するための他の多くのオプションが存在します。LIPID MAPSコンソーシアム(www.lipidmaps.org)は、ユーザー定義の質量公差内で高解像度/正確なMS生成ピークリストを使用して、架空の脂質の計算および実験データベースを検索するためのツールを提供します。ベンダーは、リピドミックスデータを分析するための独自のソリューションを提供しています。
成功した成長曲線と外因性脂肪酸分析は、LDL純度およびバックグラウンド脂肪酸レベルの制限を含むいくつかの要因に依存しています。LDL含有分数の適切な同定は極めて重要です。上記のプロトコルと図1は、エンリッチメントプロセスの各ステップに対して保持する正しい分数を示しています。硫酸アンモニウム40%(純度≥99.5%)の使用に成功しました。β-ライブチンの沈殿およびその後の除去のために。しかし、他の人は、卵黄血漿に添加された硫酸アンモニアの純度および濃度が、このステップ47に大きな影響を与えることができると報告している。LDL濃縮における硫酸アンモニウム汚染を制限することは、高濃度の硫酸アンモニウムが増殖を制限することができるので、細菌アッセイに使用されるLDL製剤にとって重要である48。透析中は、硫酸アンモニウムの拡散と除去を可能にするために、透析チューブの十分な空き領域を提供する必要があります。透析プロセスのさらなる最適化は、一晩インキュベーション中に追加の水変化を含みてもよい。ムーサら報告透析は6時間で十分であるが、最良の結果を提供するために一晩透析を発見した。成長曲線中の細胞の開始濃度は、試験間で一貫性を保つことが重要です。S.aureusの場合、細胞を0.05の初期OD600に希釈すると、最も一貫性のある結果がもたれます。さらに、高濃度のFASII阻害剤は、細菌細胞に対する非特異的な効果をもたらし得る。例えば、7μMを超えるトリクロサン濃度は、S.アウレウスにおいて細胞質膜損傷を誘発し、したがって、この化合物の濃度がこのレベル49以下のままである必要がある。最終的なトリクロサン濃度が1μMであることが分かり、再生可能な成長アッセイが生じます。細菌リン脂質合成のための外因性脂肪酸の潜在的な供給源を評価する場合、培養培地の脂肪酸寄与を最小限に抑えることが重要である。上記のアッセイでは、1%トリプトンの培養培地はS.アウレウスの適切な増殖を支持し、脂肪酸汚染を最小限に抑える29,32を有する。
バックグラウンド脂肪酸レベルを制限することは、下流の質量分析ベースの脂肪酸プロファイリングにとって特に重要です。他の人は、鶏卵黄中の遊離脂肪酸の量が自然に低い41であると報告しており、我々の分析はこの結論を支持する(図5)。トリプトンスープを使用し、インキュベーション後にPBSで細胞を徹底的に洗浄することが不可欠です。さらに、細胞の増殖段階を考慮することが重要です。十分な細菌リン脂質合成を確保するために、中間ログ相細胞を選択しました。外因性脂肪酸の他の潜在的な汚染源は、質量分析分析50の前に脂質抽出工程または後続の試料調製中など、細菌増殖後に導入され得る。サンプル調製の任意の段階で導入された外因性脂肪酸は、質量分析分析中に遊離脂肪酸として検出することができる。高温オーブン(少なくとも180°C)で実験室のガラス製品を一晩焼くと、脂質抽出と脂質貯蔵に使用される試験管から外因性脂肪酸を除去することができます。さらに、プラスチックを含む実験室用品は、脂肪酸の背景50を減らすためにメタノールですすいでいてもよい。以前の分析からの残留脂肪酸はまた、質量分析計自体の内部表面を汚染する可能性があります。したがって、遊離脂肪酸のバックグラウンドレベルを決定するための質量分析分析中に分析ブランクを含めることを強くお勧めします。
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Disclosures
著者は開示を持っていません。
Acknowledgments
私たちは、この作品の原稿とサポートの彼らの批判的な評価のためにハンマー研究室のメンバーに感謝します。コロラド大学医学部のアレックス・ホースウィル博士はAH1263を親切に提供しました。ミシガン州立大学のクリス・ウォーターズ博士の研究室は試薬を提供しました。この研究は、アメリカ心臓協会の助成金16SDG30170026とミシガン州立大学が提供するスタートアップ資金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium sulfate | Fisher | BP212R-1 | ≥99.5% pure |
| Cell culture incubator | Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE |
| Costar assay plate | Corning | 3788 | 96 well |
| Filter paper | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Large chicken egg | N/A | N/A | Common store bought egg |
| Microplate spectrophotometer | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus strain AH1263 | N/A | N/A | Provided by Alex Horswill of the University of Colorado |
| Dialysis tubing | Pierce | 68700 | 7,000 MWCO |
| Tryptone | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A4561 | |
| Chloroform (reagent grade) | Fisher | MCX10559 | |
| Isopropanol (LC-MS grade) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850345C-25mg | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | ≥99.5% pure |
| Ammonium formate | Sigma | 70221-25G-F | |
| Xcalibur software | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Scientific | high resolution/accurate mass MS | |
| Agilent 1260 capillary HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac Vacuum Concentrators | Thermo Scientific |
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