Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59538
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

Summary

Deze methode biedt een kader voor het bestuderen van de opname van exogene vetzuren uit complexe gastheer bronnen in bacteriële membranen, met name Staphylococcus aureus. Om dit te bereiken, protocollen voor de verrijking van lipoproteïne deeltjes uit kip eierdooier en daaropvolgende vetzuur profilering van bacteriële fosfolipiden met behulp van massaspectrometrie worden beschreven.

Abstract

Staphylococcus aureus en andere gram-positieve pathogenen bevatten vetzuren uit het milieu in membraan fosfolipiden. Tijdens infectie, de meerderheid van exogene vetzuren aanwezig zijn binnen gastheer lipoproteïne deeltjes. Onzekerheid blijft over de reservoirs van gastheer vetzuren en de mechanismen waarmee bacteriën vetzuren uit de lipoproteïne deeltjes halen. In dit werk beschrijven we protocollen voor de verrijking van low-density lipoproteïne (LDL) deeltjes uit kippen eierdooier en bepalen of ldls dienen als vetzuur reservoirs voor S. aureus. Deze methode exploiteert onbevooroordeelde lipidomische analyse en kip LDLs, een effectief en economisch model voor het onderzoek van interacties tussen LDLs en bacteriën. De analyse van S. aureus integratie van exogene vetzuren uit ldls wordt uitgevoerd met behulp van hoge-resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie en tandem massaspectrometrie, waardoor de karakterisering van de vetzuur samenstelling van de bacteriële membraan en onbevooroordeelde identificatie van nieuwe combinaties van vetzuren die ontstaan in bacteriële membraan lipiden bij blootstelling aan LDLs. Deze geavanceerde massaspectrometrie technieken bieden een ongeëvenaard perspectief op de opname van vetzuren door het onthullen van de specifieke exogene vetzuren die in de fosfolipiden zijn opgenomen. De hier beschreven methoden zijn aanpasbaar aan de studie van andere bacteriële pathogenen en alternatieve bronnen van complexe vetzuren.

Introduction

Methicillaire-resistente S. aureus (MRSA) is de belangrijkste oorzaak van de gezondheidszorg-geassocieerde infectie en de bijbehorende antibioticaresistentie is een aanzienlijke klinische uitdaging1,2,3. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën een hoge prioriteit. Een veelbelovende behandelingsstrategie voor gram-positieve pathogenen is remming van de vetzuur synthese, een vereiste voor membraan fosfolipide productie die, in S. aureus, omvat dunlaag GLYCEROL (PG), lysyl-PG, en cardiolipine4. Bij bacteriën, vetzuur productie vindt plaats via de vetzuur synthese II Pathway (fasii)5, die aanzienlijk verschilt van de eukaryotische tegenhanger, waardoor fasii een aantrekkelijk doelwit voor de ontwikkeling van antibiotica5,6 . FASII remmers richten voornamelijk op FabI, een enzym vereist voor vetzuur koolstofketen rek7. De Fabi-remmer triclosan wordt in grote lijnen gebruikt in consumenten-en medische goederen8,9. Er worden extra Fabi-remmers ontwikkeld door verschillende farmaceutische bedrijven voor de behandeling van S. aureus -infectie10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Echter, veel gram-positieve pathogenen, waaronder S. aureus, zijn geschikt voor het opruimen van exogene vetzuren voor fosfolipide synthese, omzeilen van fasii remming27,28,29. Zo wordt het klinische potentieel van fasii remmers besproken als gevolg van aanzienlijke lacunes in onze kennis van de bronnen van gastheer vetzuren en de mechanismen waarmee pathogenen vetzuren uit de gastheer27,28extract. Om deze lacunes aan te pakken, ontwikkelden we een onbevooroordeelde lipidomische analysemethode om de opname van exogene vetzuren uit lipoproteïne deeltjes in membraan fosfolipiden van S. aureuste monitoren.

Tijdens sepsis, gastheer lipoproteïne deeltjes vertegenwoordigen een potentiële bron van gastheer-afgeleide vetzuren binnen de vasculatuur, als een meerderheid van de gastheer vetzuren worden geassocieerd met de deeltjes30. Lipoproteïnen bestaan uit een hydrofiele schil bestaande uit fosfolipiden en eiwitten die een hydrofobe kern van triglyceriden en cholesterol esters31omsluiten. Vier belangrijke klassen van lipoproteins-chylomicron, zeer lage dichtheid lipoproteïne, high-density lipoproteïne, en low-density lipoproteïne (LDL) — worden geproduceerd door de gastheer en de functie als lipide vervoer voertuigen, leveren van vetzuren en cholesterol van en naar cellen hosten via de vasculatuur. LDLs zijn overvloedig in veresterd vetzuur, met inbegrip van triglyceriden en cholesterol esters31. We hebben eerder aangetoond dat zeer gezuiverde menselijke Ldl's een levensvatbare bron van exogene vetzuren voor PG-synthese zijn, waardoor een mechanisme wordt geboden voor de bypass van de FASII-remmer32. Zuiverende menselijke Ldl's kunnen technisch uitdagend en tijdrovend zijn, terwijl commerciële bronnen van gezuiverde menselijke Ldl's buitensporig duur zijn om routinematig te gebruiken of grootschalige bacteriële schermen uit te voeren. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een procedure voor de verrijking van LDLs van kip eierdooier, een rijke bron van lipoproteïne deeltjes33gewijzigd. We hebben met succes ongerichte, hoge-resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie en tandem massaspectrometrie gebruikt om de opname van menselijke LDL-afgeleide vetzuren in het membraan van S. aureus32te monitoren. In tegenstelling tot eerder gemelde methoden, deze aanpak kan kwantificeren individuele vetzuur-isomeren voor elk van de drie belangrijkste Staphylococcus fosfolipide typen. Oliezuur (18:1) is een onverzadigd vetzuur aanwezig in alle gastheer lipoproteïne deeltjes die gemakkelijk is opgenomen in S. aureus fosfolipiden29,30,32. S. aureus is niet geschikt voor oliezuur synthese29; Daarom, de hoeveelheid fosfolipide-opgenomen oliezuur stelt de aanwezigheid van gastheer lipoprotein-afgeleide vetzuren binnen de Staphylococcus membraan29. Deze fosfolipide soorten kunnen worden geïdentificeerd door de State-of-the-art massaspectrometrie methode hier beschreven, het aanbieden van een ongekende resolutie van de membraan samenstelling van S. aureus gekweekt in de aanwezigheid van een vetzuur bron het waarschijnlijk ontmoetingen tijdens infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: het volgende protocol voor de verrijking van LDL-deeltjes uit kippen eierdooier is afgeleid van Moussa et al. 200233.

1. bereiding van kippenei dooier voor verrijking van LDL-deeltjes

  1. Sanitize twee grote kippeneieren door de schelpen te wassen met 70% ethanol oplossing en laat drogen.
  2. Ontsmettings de Eier separator met behulp van 70% ethanol oplossing en laat de lucht drogen. Bevestig de Eier separator op de lip van een middelgroot bekerglas.
  3. Scheur elk ei afzonderlijk in de Eier separator en laat de albumine in het bekerglas stromen. De intacte eierdooier wordt door de separator vastgehouden.
  4. Was de eierdooier tweemaal met 30 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de resterende albumine te verwijderen.
  5. Plaats de eidooier zachtjes op filtreerpapier.
  6. Prik de vitelline membraan met een steriele pipetpunt en giet de inhoud van het membraan in een steriele 50 mL conische centrifugebuis. Gooi het membraan en filtreerpapier weg.

2. fractionering van LDL-bevattende plasma van kippen eierdooier

  1. Voeg ongeveer twee volumes van 0,17 M NaCl bij pH 7,0 toe aan de eidooier en meng krachtig. Meng deze oplossing vervolgens bij 4 °C gedurende 60 min.
  2. Centrifugeer de eidooier verdunning bij 10 °C bij 10.000 x g gedurende 45 min. Verwijder de plasma fractie (supernatant) van de korrelige fractie (pellet) in een steriele 50 ml conische buis.
  3. Herhaal stap 2,2.

3. isolatie van LDL-deeltjes uit plasma

  1. Meng de plasma breuk met 40% ammoniumsulfaat (w/v) bij 4 °C gedurende 60 min.
  2. Pas de pH van de plasma Fractie aan met een 420 mM NaOH-oplossing naar 8,7.
  3. Centrifugeer de eidooier verdunning bij 4 °c bij 10.000 x g gedurende een duur van 45 min. Verwijder de bovenste halfvaste gele Fractie in 7 kDa poriegrootte dialyse slang. Bied ruimte in de slang om het te laten zwellen.
  4. Dialyze 's nachts bij 4 °C in 3 L ultrapuur water om het ammoniumsulfaat te verwijderen. Schud het water zachtjes met een roer stang.
  5. Breng dialyzed Solution over in een steriele 50 mL conische centrifugebuis.
  6. Centrifugeer de oplossing bij 4 °c bij 10.000 x g gedurende een duur van 45 min. Verwijder voorzichtig de bovenste halfvaste gele fractie tot een steriele buis en bewaar bij 4 °c.

4. beoordeling van kippen Ld's als bron van vetzuren

  1. Subcultuurs . aureus cellen in 5 ml vetzuur vrij 1% vorming Bouillon en incuberen 's nachts bij 37 °c met schudden (225 rpm). Voor vetzuur auxotrophs, supplement culturen met een bron van vetzuren.
  2. Verdun nachtelijke culturen tot een optische dichtheid (OD) bij 600 nm (OD600) van 0,1 in 1% vorming Bouillon. Pipetteer 50 μL van de celsuspensie in elke put van een ronde bodem 96-well plate.
    Opmerking: was bij het werken met vetzuur auxotrophs de nachtelijke culturen in twee delen vorming Bouillon en respendeer in 5 ml vorming Bouillon om de overdracht van vetzuren te beperken voordat de OD van de cultuur wordt bepaald.
  3. Voeg voor de putjes met onbehandelde controles 50 μL van 1% vorming Bouillon per putje toe.
  4. Voeg aan de putjes met de experimentele celsuspensies 50 μL van 1% vorming bouillon toe, aangevuld met 10% eidooier-afgeleide LDL, 2 μm triclosan, of een mengsel van 10% eigeel-afgeleide LDL en 2 μm triclosan.
    Opmerking: op dit punt, elk goed zal bevatten 100 μL en de uiteindelijke concentratie van ei dooier-afgeleide LDL en triclosan per goed zal 5% en 1 μM, respectievelijk.
  5. Meet od600 na verloop van tijd met behulp van een microplaat Reader ingesteld op 37 °c met continu, lineair schudden om de groei te monitoren.

5. incubatie van S. aureus met ldls voor membraan lipide-analyse.

  1. Cultuur een geïsoleerde kolonie in 5 ml vetzuur vrij 1% vorming Bouillon en incuberen 's nachts bij 37 °c met schudden (225 rpm).
  2. Verdun 's nachts culturen 1:100 tot een steriele kolf van 250 ml met 50 ml 1% vorming Bouillon. Inincuberen tot de fase halverwege het log (ongeveer 4 uur) bij 37 °C met schudden.
  3. Breng 25 mL cultuur over naar een steriele 50 mL centrifugebuis en pellet de cellen. Verwijder de supernatant en rebreng de celpellet in 750 μL van 1% vorming Bouillon.
  4. Combineer de resuspendeerde cellen en aliquot 300 μL van de celsuspensie in een steriele centrifugebuis van 1,5 mL.
  5. Voeg Ldl's toe aan de gewenste eindconcentratie en incuberen bij 37 °C met schudden (225 rpm) gedurende 4 uur.
  6. Centrifugeer de culturen bij 4 °C bij 16.000 x g gedurende 2 minuten en was de celpellets in twee delen steriele PBS en herhaal deze.
  7. Noteer het gewicht van elke natte cel pellet. Maak de celpellets op droogijs of in vloeibare stikstof in de vriezer en bewaar bij-80 °C of ga rechtstreeks naar sectie 6.

6. extractie van S. aureus membraan lipiden

  1. Plaats bevroren S. aureus celpellets op droogijs. Voeg 0,5 mm zirkoniumoxide kralen op de bovenkant van elke cel pellet, met behulp van een volume van kralen ongeveer gelijk aan het volume van de cel pellet.
    Opmerking: als alternatief voor deze methode van lipide-extractie, onderzoekers kunnen gebruik maken van de gevestigde Bligh en Dyer of Folch methoden voor veeleisende lipiden uit bacteriële cellen34.
  2. Voeg 740 μL 75% methanol (HPLC-kwaliteit) gekoeld tot-80 °C rechtstreeks toe aan de celpellets.
  3. Voeg 2 μL 50 μM zijn dunlaag (bereid in methanol) per 1 mg cellen toe als interne standaard. Sluit de reageerbuis en plaats de 1,5 mL centrifuge buisjes die elk monster bevatten in een beschikbare poort in een weefselhomogenisator van de Bullet-Blender. Homogeniseren de monsters op lage snelheid, instelling 2-3, voor 3 min.
  4. Inspecteer de monsters visueel op homogeniteit. Als er klontjes van cellen zichtbaar zijn, ga dan verder met homogenisatie in de Bullet Blender in stappen van 2 min.
  5. Verwijder de samples van de Bullet Blender en zet ze over naar een chemische rook afzuigkap.
  6. Voeg 270 μL chloroform toe aan elke monsterbuis. Vortex de monsters krachtig gedurende 30 minuten.
    Let op: chloroform is een mogelijk kankerverwekkend.
  7. Centrifugeer de monsters in een tafel centrifuge tot 30 min bij een minimum van 2.000 x g. Hogere snelheden kunnen worden gebruikt met compatibele centrifugebuizen en de duur van centrifugeren kan worden verkort tot 10 min.
  8. In een chemische rook afzuigkap, verzamel de monofasische supernatant en overdracht naar een nieuwe reageerbuis, terwijl zorgvuldig het vermijden van de proteïne pellet aan de onderkant van de extractie buis.
  9. Voeg 740 μL van 75% methanol (HPLC-kwaliteit) en 270 μL chloroform toe aan de proteïne pellet en extraheer elk monster opnieuw zoals beschreven in de stappen 6.6-6.8 hierboven. Combineer de supernatant van de tweede extractie met de eerder verzamelde supernatant voor elk monster.
  10. Damp de extractiemiddelen in onder een stroom inert gas, zoals stikstof of argon, of onder vacuüm met behulp van een centrifuge-concentrator (tabel met materialen).
  11. Was gedroogd lipide extracten driemaal met 1,0 mL waterige 10 mM ammoniumbicarbonaatoplossing en de monsters opnieuw drogen zoals in stap 6,10.
  12. Resuspendeer de gedroogde lipide extracten in een geschikt nonpolaire oplosmiddel zoals isopropanol. Respendeer monsters met 20 μL per 1 mg vers celgewicht, bepaald in stap 5,7 als alternatief, als het gewicht van de celpellets onbekend is, respendeert u de monsters in 200 μL isopropanol en gaat u verder met rubriek 7.

7. analyse van S. aureus lipidenprofielen met behulp van hoge resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie

  1. Voordat u een volledige lipide-analyse uitvoert, selecteert u representatieve test monsters uit de experimentele groep (en) en analyseert u deze op een reeks monster verdunningsfactoren om de monster verdunnings waarden te bepalen waarin de totale lipideconcentraties binnen de lineaire bereik van de reactie van de detector voor de massaspectrometer, zoals eerder beschreven35.
  2. Verdampte aliquots van elk monster lipide-extract worden onderworpen aan lipide-analyse, door het drogen van de aliquots onder inert gas of onder vacuüm in een centrifuge-concentrator (tabel van materialen).
  3. Resubreng elk gedroogd lipide-extract in vloeibare chromatografie – massaspectrometrie (LC-MS) kwaliteit isopropanol: methanol (2:1, v:v) met 20 mM ammonium formaat, met gebruikmaking van volumes die gelijkwaardig zijn aan een optimale monster verdunningsfactor zoals bepaald in stap 7,1.
  4. Voor een niet-gerichte lipideanalyse kunnen monsters direct worden geïntroduceerd op het hoge resolutie/nauwkeurige massaspectrometrieplatform zonder het gebruik van chromatografie doorstroom injectie of directe infusie van extracten35,36. Breng de verdunde lipide-extracten die in stap 7,3 zijn bereid over naar een geschikte autosampler-injectieflacon of 96-well-plaat.
  5. Voor analyse op basis van flow injectie, plaatst u de autosampler-flacons in een autosampler met temperatuurregeling (15 °C) van een HPLC-systeem dat geschikt is voor toepassingen met capillaire/lage stroming, zoals een HPLC (tabel met materialen) die is uitgerust met een elektronische stroom en het debiet controlesysteem.
  6. Vul de HPLC-vloeistofreservoirs met LC-MS-klasse isopropanol: methanol (2:1, v:v) met 20 mM ammonium formaat.
  7. Gebruik de Agilent Chemstation-software om de HPLC-autosampler te programmeren om 5 μL-monster injecties uit te voeren. Selecteer in het menu instrument de optie injector instellenen typ 5,0 in het veld injectie volume. De units worden als micro liters gegeven. Zorg ervoor dat de HPLC is ingesteld op isocratische stroom bij 1 μL per min 2:1 (v:v) isopropanol: methanol met 20 mM ammonium formaat.
  8. Selecteer in het instrument menu van chemstation de optie pomp instellen... en selecteer vervolgens de micro flow -modus schakelaar.
  9. Voer in de velden tijd schema : tijd 0,00, 100% B, stroom 1,0. Druk op Enter en maak een tweede rij in de tijd schema door het invoeren van tijd 10,0, 100% B, flow 1,0. Selecteer de knop OK onder in het menu pomp instellen . Deze instellingen zullen 10 analytische runs mogelijk maken met een debiet van 1,0 μL per minuut.
  10. Introduceer eluaat van de HPLC-Transfer lijn naar de massaspectrometer met behulp van een elektro spray-ionisatie bron die is uitgerust met een laag debiet (34 G) metalen naald.
  11. Gebruik thermo Tune plus instrument Control software, selecteer het Setup -menu en selecteer verwarmde ESI-bron. Stel de ionisatie spanning in op 4000 V en mantel gas tot 5 (willekeurige eenheden) door deze waarden in de corresponderende velden van het dialoogvenster te typen. Stel op dezelfde manier de capillaire Temp in op 150 °C en de S-lens tot 50%.
    Opmerking: deze waarden moeten worden geoptimaliseerd voor elke massaspectrometrie platform.
  12. Voor niet-gerichte lipideanalyse, gebruik een hoge resolutie/nauwkeurige massa MS platform (tabel van de materialen) als de detector.
  13. Gebruik thermo Tune plus-software, klik op de knop Scan definiëren en selecteer in het menu Analyzer de optie FTMS. Stel het veld massa bereik in op normaal en selecteer in het veld resolutie de optie 100.000. Zorg ervoor dat het Scan type is ingesteld op volledig. Voer onder het menu Scan Ranges 200 in het veld eerste massa (m/z) in en voer 2000 in het veld laatste massa (m/z)in.
  14. Zorg ervoor dat de negatieve polariteit wordt gebruikt om de meest voorkomende S. aureus lipiden te detecteren.
  15. Herhaal de analyse van het monster met behulp van Ion mapping tandem massaspectrometrie (MS/MS) fragmentatie van alle lipide-ionen binnen een spectrale regio van belang om te bevestigen lipide structuren en vetzuren bestanddelen. Als alternatief kunnen geselecteerde lipide-ionen van belang worden onderworpen aan MS/MS-analyse nadat de initiële lipide-identificaties zijn toegewezen in rubriek 8.

8. database zoeken om endogene S. aureus en EXOGENE LDL-afgeleide lipiden te identificeren

  1. Gebruik thermo Xcalibur software om de waargenomen massa nauwkeurigheid verder te verfijnen. Selecteer in Xcalibur onder het menu extra de optie offlineopnieuw kalibreren. Nadat het venster offline opnieuw kalibreren is geopend, laadt u het massaspectrum bestand dat u opnieuw wilt kalibreren door het menu bestand te selecteren en de optie openen te selecteren.
  2. Open het bestand van belang, schakel de knop rij invoegen boven aan het venster weergave in om het totale ionchromatogram voor de MS-run weer te geven. Gemiddelde de verworven MS-signalen door met de linkermuisknop op de computermuis te klikken op één rand van de waargenomen signaal piek in het totale ionchromatogram en de muis over het breedste deel van de piek te slepen.
  3. Selecteer in het menu Scan filter het filter dat overeenkomt met MS-gegevens van volledige scan. Laad een referentiebestand met de theoretische isotopische massa's van ten minste drie bekende S. aureus endogene lipiden door de knop laden Ref... te selecteren en het referentiebestand te selecteren. Controleer het gebruik vak naast elke lipide isotopische massa.
  4. Klik op de knop zoeken onder in het weergavevenster. Hergemiddelde het MS-signaal over de signaal piek in het totale ionchromatogram zoals eerder gedaan.
  5. Klik op de knop converteren onder in het weergavevenster. Wanneer het dialoogvenster converteren wordt geopend, klikt u op OK. Deze stap weglaten als gegevens zijn verzameld op massaspectrometrie platforms van andere leveranciers dan Thermo-wetenschappelijke.
  6. Gebruik Xcalibur-software om de opnieuw gekalibreerd nauwkeurige Mass Peak-lijsten voor elk onbehandeld of met LDL behandeld monster te exporteren naar afzonderlijke werkbladen van een Excel-bestand. Selecteer het pictogram van de qual-browser . Open het herkalibreerde bestand van belang door het menu bestand te selecteren en de optie openen...
  7. Het gemiddelde van het signaal over de brede piek in het totale ionchromatogram zoals beschreven in stap 8,2.
  8. Klik met de rechtermuisknop op het punaise-pictogram in het weergavevenster voor massaspectrum en selecteer weergave | Spectrum lijst. Selecteer in hetzelfde menu Weergaveopties en vervolgens alle pieken in het weergave menu. Klik op de knop OK om het weergavevenster te sluiten.
  9. Klik met de rechtermuisknop op het pictogram van de punaise in het venster massaspectrum weergeven en selecteer de exporteren | Klembord (exacte massa). Plak de geëxporteerde gegevencel a1 van het eerste werkblad in een nieuw Excel-werkblad.
  10. Verwijder de eerste 8 rijen tekst in het geëxporteerde gegevensbestand, zodat cel a1 van het Excel-werkblad het eerste gegevenspunt voor de massa van het massaspectrum bevat. Herhaal het exporteren van elk opnieuw gekalibreerd MS-bestand met behulp van een nieuw werkblad in het Excel-bestand voor elke geëxporteerde piek lijst.
  11. Met behulp van de lipide massa spectrale analyse (LIMSA) software37 add-in voor Excel, construeren van een database met moleculaire formules van bekende S. aureus lipide soorten zoals beschreven door Hewelt-Belka et al. 201438, evenals formules die lipide-soorten die kunnen hypothetisch aanwezig zijn in LDL.
    Opmerking: Bovendien moet worden gezorgd voor het opnemen van potentiële moleculaire formules in de database voor hypothetische bacteriële lipiden die grote LDL-vetzuren hebben opgenomen, zoals olie (18:1) en linol (18:2) vetzuren32.
  12. Als u de database wilt maken, opent u een leeg Excel-werkblad. Typ in cel a1 van het eerste werkblad de theoretische/berekende isotopische massa van de lipide-soort die moet worden toegevoegd aan de database, overeenkomend met de massa van de lipide-soort in de Ionische toestand die in de massaspectrometer is waargenomen. Voer in cel B1 een naam in voor de lipide-soort, zoals PG (34:0).
  13. In cel C1, voer de molecuulformule voor de lipide-soort, overeenkomend met de Ionische toestand van het lipide waargenomen in de massaspectrometer. In cel D1, voer de lading van de lipide soort zoals waargenomen in de massaspectrometer. Ga naar cel a2 om een nieuwe vermelding te beginnen voor de volgende lipide-soort die in de doorzoekbare database moet worden ingevoerd.
  14. Herhaal de stappen 8,12 en 8,13 totdat alle gewenste lipiden soorten in de database zijn ingevoerd. Sla het databasebestand op en laat het openen in Excel.
  15. Selecteer in Excel het menu invoegtoepassingen in. Selecteer limsa om de limsa-software te starten. Klik in het hoofdmenu op de knop samengestelde bibliotheek... Klik in het nieuwe venster dat wordt weergegeven op Verbindingen importeren. Hiermee uploadt u de samengestelde database voor gebruik door de LIMSA-software.
  16. Voer op alle MS spectra met behulp van de LIMSA software add-in voor Excel nauwkeurige massa-gebaseerde lipiden identificaties uit volgens de instructies van de leverancier35. Selecteer in het hoofdmenu van LIMSA de optie piek lijst onder het menu spectrum type . Selecteer de positieve modus of de negatieve modus om overeen te komen met de polariteit waarin de MS-gegevens zijn verkregen.
  17. Voer in het venster piek fwhm (m/z) het gewenste venster voor massaal zoeken in voor piek bevinding. Een venster massa tolerantie zoeken van 0,003-0,005 m/z wordt aanbevolen voor hoge resolutie/nauwkeurige massa MS-gegevens.
  18. Voer in het venster gevoeligheid de gewenste Baseline-cutoff in (bijvoorbeeld 0,01% relatieve overvloed). In de isotoop correctie menu, selecteer lineaire pasvorm of aftrekken algoritmen, een van die kan worden gebruikt met Peak List data.
  19. Markeer lipide verbindingen om op te nemen in de database zoeken door te klikken op de gewenste lipide soort binnen de beschikbare verbindingen venster. Klik op de knop toevoegen om gemarkeerde lipidensoorten toe te voegen aan de zoekgroep.
  20. Definieer interne standaarden door op toegevoegde verbindingen te klikken en vervolgens het concentratie venster te wijzigen in de corresponderende concentratie van de geselecteerde interne standaard.
  21. Zorg ervoor dat de interne standaard en de geselecteerde lipiden soorten tot dezelfde klassennaam behoren door elke toegevoegde lipidensoort en interne standaard te selecteren en een klassenaam (zoals PG of lipide) in het klasseveld te typen.
  22. Om de doorzoekbare groep van lipiden verbindingen voor toekomstig gebruik op te slaan, klikt u op de knop Opslaan naast het menu groepen .
  23. Zorg ervoor dat het Excel-bestand met alle geëxporteerde MS Peak-lijsten open is voor het blad dat overeenkomt met de eerste S. aureus MS run en klik vervolgens op de zoeken knop in het limsa hoofdmenu.
    Opmerking: de uitvoer van de LIMSA-database zoekopdracht bevat een lijst met massaspectrale functies die overeenkomen met de lipiden die aanwezig zijn in de database die is gebouwd in stappen 8.12-8.13, evenals concentraties voor elke overeenkomende functie na normalisatie naar een of meer geselecteerde interne normen.
  24. Gebruik Xcalibur software om nauwkeurige massa MS/MS spectra te onderzoeken voor m/z overeenkomend met lipide-ionen die van belang zijn voor de bevestiging van vetzuur bestanddelen die aanwezig zijn in elke geïdentificeerde lipide-moleculaire soort. Selecteer het pictogram van de qual-browser . Open het MS/MS-bestand van belang door het vervolgkeuzemenu bestand te selecteren en de optie openen...
  25. Selecteer het Scan filter dat overeenkomt met MS/MS-analyse van een lipide m/z van belang door met de rechtermuisknop te klikken op het pictogram van de punaise in het venster voor het weergeven van het massaspectrum en selecteer bereiken in het menu. In het nieuwe venster dat verschijnt, selecteert u het filter menu om de scan te selecteren.
  26. Het gemiddelde van het signaal over het totale ionchromatogram zoals beschreven in stap 8,2. Gebruik MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) software om de juiste statistische tests uit te voeren. Evalueer statistisch significant verschil in S. aureus lipide samenstelling door het vergelijken van genormaliseerde lipide Abundances over onbehandelde en LDL-behandelde voorwaarden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol voor de verrijking van LDL van kippenei dooier wordt geïllustreerd in Figuur 1. Dit proces begint met het verdunen van hele eidooier met een zoutoplossing en het scheiden van de eierdooiers die korrels worden genoemd uit de oplosbare of plasma fractie die de Ldl's bevat (Figuur 1)33. Het LDL-gehalte van de plasma fractie wordt verder verrijkt door precipitatie van de ~ 30-40 kDa β-livetinen (Figuur 2)33. De aanwezigheid van eiwithoudende bands bij 140, 80, 65, 60 en 15 kDa correleren met de apoproteïnen van ldls (Figuur 2)33,39. Behandeling met triclosan remt de groei van S. aureus in vetzuur vrije media32. We hebben eerder aangetoond dat het aanvullen van culturen met eidooier plasma of gezuiverde menselijke Ldl's als exogene vetzuur bronnen overkomt triclosan-geïnduceerde groeiremming (Figuur 3)32. Evenzo, suppletie van triclosan behandelde culturen met verrijkt eierdooier LDL herstelt groei (Figuur 3). Bovendien ondersteunt de toevoeging van eidooier LDLs de groei van een eerder gekarakteriseerde S. aureus vetzuur auxotroph (figuur 4)32. Voor de meest accurate op massaspectrometrie gebaseerde profilering van S. aureus opname van exogene vetzuren, is het belangrijk om de aanwezigheid van vrije vetzuren in het groeimedium te beperken. De vrije vetzuur samenstelling van 1% vorming Bouillon en kippen eidooier ldls verdund in vorming Bouillon werd bepaald door het gebruik van flow Injection hoge-resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie en vond minimale hoeveelheden vrij vetzuur (Figuur 5). Dezelfde ongetargete massaspectrometrie analyse werd uitgevoerd om de vetzuur samenstelling van S. aureus fosfolipiden te bepalen na blootstelling aan kip eidooier ldls. orthogonale gedeeltelijke kleinste kwadraten discriminant analyse (opls-DA)40 van overvloedige S. aureus membraan fosfolipiden toonde duidelijke klasse scheiding van onbehandeld en kip eierdooier LDL-behandelde voorwaarden, zoals weergegeven in de OPLS-da scores plot (Figuur 6a). De opls-da belastingen plot aangegeven tal van dunlaag glycerol soorten als belangrijke variabelen in het pls-da-model. Met name fosfolipiden die onverzadigde vetzuren bevatten, een moleculaire marker van exogene vetzuur opname, zijn verrijkt in de met LDL aangevuld culturen vergeleken met cellen die zijn geïnineerd bij afwezigheid van LDLs (Figuur 6b). Eerdere studies hebben geconstateerd dat kippen eierdooiers een rijke bron zijn van onverzadigde vetzuren met oliezuur (18:1) die de meest voorkomende41,42zijn. In overeenstemming met deze observaties, we vonden oleïnezuur de meest voorkomende onverzadigde vetzuren gebruikt voor fosfolipide synthese wanneer S. aureus culturen werden aangevuld met kip eidooier ldls (figuur 6c). Tabel 1 illustreert verder dat de vetzuur profielen van membraan fosfolipiden worden gewijzigd wanneer S. aureus wordt geteeld in aanwezigheid van eidooier LDL.

Figure 1
Figuur 1: een illustratie van LDL verrijking van kip eierdooier met behulp van centrifugeren en ammoniak sulfaat neerslag. A) de reagentia die nodig zijn voor de VERRIJKING van LDL van kippenei dooier. B) het stroomdiagram toont de significante stappen van het LDL-verrijkingsproces. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: eiwit Profiel van kip eierdooier vóór en na verrijking voor LDL. Eiwit lysaten werden bereid met behulp van RIPA Buffer. Eiwit lysaat (15 μg) werd in een 8% acrylamide SDS-PAGE gel geladen. Gels werden 's nachts gekleurd met Bio Rad proteïne reagens. De molecuulgewichten in kDa van LDL geassocieerde eiwitten worden aangeduid langs de rechterkant van de afbeelding. M: eiwit marker, Y: kip eierdooier, en LDL: kip ei dooier LDL verrijking Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: eidooier-afgeleide Ldl's beschermen S. aureus tegen triclosan-geïnduceerde fasii remming. De groei van S. aureus werd na verloop van tijd gemonitord via meting van od600 in 1% vorming Bouillon in de volgende omstandigheden: 1% vorming Bouillon (TB), 1 μm triclosan (TCS), 1 μm triclosan met 1% eidooier plasma (TCS + EYP), 5% eigeel LDL (LDL), of 1 μm Triclosan met 5% eidooier LDL (TCS + LDL). Het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten wordt getoond. Foutbalken geven de standaarddeviatie van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: groei van een S. aureus vetzuur auxotroph wordt ondersteund door het eidooier-afgeleide LDL. De groei van een vetzuur auxotroph in 1% vorming Bouillon (TB) met of zonder 5% eidooier LDL (LDL) suppletie werd gecontroleerd na verloop van tijd via meting van od600. Het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten wordt getoond. Foutbalken geven de standaarddeviatie van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: vrij Vetzuurgehalte gemeten in 1% vorming Bouillon of kippenei dooier LDL. Vrije vetzuren werden gedetecteerd door flow Injection hoge-resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie en tandem massaspectrometrie. Genormaliseerde aantallen ionen per mg eiwit werden bepaald voor 1% vorming Bouillon en 1% vorming Bouillon aangevuld met 5% kip eidooier ldls. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: kip eidooier low-density lipoproteïnen zijn een reservoir van exogene vetzuren voor synthese van S. aureus dunlaag. (A) scores plot van orthogonale gedeeltelijke kleinste kwadraten discriminant analyse van kip eierdooier LDL-behandelde en onbehandeld S. aureus membraan fosfolipiden geïdentificeerd met behulp van hoge resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie. (B) percentage onverzadigde dunlaag (UPG) in vergelijking met het totale membraan PG van S. aureus geteeld in de afwezigheid (WT) of aanwezigheid (WT + LDL) van kip eidooier ldls.C) ONVERZADIGD vetzuur (UFA) Profiel van membraan PG van S. aureus geteeld zonder (WT) of met (WT + LDL) kip eidooier ldls grafiek als een percentage van het bedrag van de totale PG vetzuren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

WT gecultiveerde in vorming Bouillon WT gecultiveerde in vorming Bouillon aangevuld met ldls
Fosfatidyl glycerol (TC: TDB)a Genormaliseerde ionen overvloed/mg eiwit Sd Vetzurenc Genormaliseerde ionen overvloed/mg eiwit Sd Vetzurenc
24:0 0 0 NDb 0,052031116 0,02677 Nd
26:0 0 0 Nd 0,009539117 0,00362 Nd
28:0 0,127937113 0,04528 15:0_13:0 0,167643281 0,02392 15:0_13:0
28:1 0,006765427 0,00157 Nd 0,002776821 0,00372 15:0_13:1
30:0 8,680180809 2,68375 15:0_15:0 14,04873592 2,4531 15:0_15:0
30:1 0 0 Nd 0,010152161 0,00449 15:1_15:0, 13:1_17:0
31:0 4,150511117 1,31658 16:0_15:0, 14:0_17:0 10,17590926 1,88431 16:0_15:0, 14:0_17:0, 18:0_13:0
31:1 0,016156004 0,01216 13:1_15:0, 12:1_19:0 0,473478683 0,09063 13:1_15:0, 18:1_13:0, 12:1_19:0
32:0 29,29259262 8,82993 15:0_17:0 48,24342037 8,95664 15:0_17:0, 16:0_16:0
32:1 0,02074815 0,00941 Nd 0,307044942 0,07305 18:1_14:0, 16:1_16:0
33:0 9,000460122 2,78194 18:0_15:0, 16:0_17:0 15,4531776 2,98171 18:0_15:0, 16:0_17:0
33:1 0,162934812 0,04796 Nd 2,921832928 0,30851 18:1_15:0
33:2 0 0 Nd 0,167492702 0,03211 18:1_15:1, 18:2_15:0
34:0 12,3064043 3,70242 19:0_15:0, 17:0_17:0 18,40129157 3,21385 19:0_15:0, 17:0_17:0
34:1 0 0 Nd 1,423605186 0,20066 18:1_16:0
34:2 0,000470922 0,00082 Nd 0,156133734 0,03929 18:2_16:0
35:0 5,727462455 1,74583 20:0_15:0, 18:0_17:0 7,771538992 1,28515 20:0_15:0, 16:0_19:0, 18:0_17:0
35:1 0,17337586 0,05727 20:1_15:0 0,772202525 0,08526 20:1_15:0, 18:1_17:0
35:2 0 0 Nd 0,038758757 0,01481 18:2_17:0, 18:1_17:1
36:0 0,671004303 0,2116 21:0_15:0, 19:0_17:0 0,967295024 0,2572 21:0_15:0, 20:0_16:0, 19:0_17:0, 22:0_14:0
36:2 0 0 Nd 0,495485065 0,04473 18:1_18:1, 18:2_18:0
36:3 0 0 Nd 0,059268233 0,02291 18:2_18:1, 20:3_16:0, 20:2_16:1
37:0 0,060466411 0,01961 22:0_15:0, 20:0_17:0 0,114526894 0,01852 22:0_15:0, 20:0_17:0, 18:0_19:0
38:2 0 0 Nd 0,079469521 0,02872 18:2_20:0, 16:1_20:1
een heel Gedetecteerd als [M-H]- ionen. TC, totale ketting lengte; TDB, totaal aantal dubbele bindingen.
b ND, niet bepaald
c Vetzuren worden vermeld in de volgorde van de overvloed van de isomeer. Een onderstrepingsteken tussen vetzuur aanduidingen geeft aan dat elk vetzuur aanwezig kan zijn in de SN1-of SN2-positie, aangezien de massaspectrometrie op de tandem alleen niet uitsluit dat lipide-soorten bestaan als een mengsel van positionele isomeren.

Tabel 1: vetzuurprofiel van S. aureus gekweekt in de aanwezigheid van kip eidooier ldls. We gebruikten een onbevooroordeelde lipidomische analyse met behulp van hoge-resolutie/nauwkeurige MS en MS/MS om het vetzuurprofiel van S. aureus pg. S. aureus te bepalen werd geïnineerd in de aanwezigheid of afwezigheid van kippen eidooier LDL'S, en het PG-Profiel van deze cellen werd vergeleken met die van cellen gecultiveerde in 1% vorming Bouillon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

S. aureus bevat exogene vetzuren in zijn membraan fosfolipiden27,32,43. Fosfolipide synthese met behulp van exogene vetzuren omzeilt fasii remming, maar verandert ook de biofysische eigenschappen van het membraan27,32,44. Hoewel de opname van exogene vetzuren in fosfolipiden van gram-positieve pathogenen goed gedocumenteerd is, blijven er lacunes in de identiteit van host-vetzuur reservoirs en de structurele veranderingen aan elk van de drie belangrijkste Staphylococcus-fosfolipide-typen die voortvloeien uit exogene vetzuur opname. Hier beschrijven we de protocollen die kunnen worden gebruikt om: i) het verrijken van LDL-deeltjes uit kippen eierdooier, een bron van vetzuren, II) bepalen de effecten van exogene vetzuren op de groei van S. aureus, en III) gebruik maken van een onbevooroordeelde lipidomische analyse voor monitoring van exogene vetzuur opname in membraan fosfolipiden van S. aureus. De geavanceerde massaspectrometrie methode die in deze studie wordt gegeven, biedt een buitengewoon perspectief op de membraan samenstelling van S. aureus , gekweekt in aanwezigheid van exogene vetzuren.

Verschillende gram-positieve pathogenen maken gebruik van exogene vetzuren voor membraan synthese en, net als bij S. aureus, de mogelijke bronnen van exogene vetzuren tijdens infectie zijn slecht begrepen27,43. De hier beschreven groeianalyse kan worden aangepast om de proliferatie van andere gram-positieve pathogenen in de aanwezigheid van lipoproteïnen te evalueren als de groei kinetiek van elk pathogeen wordt overwogen. Daarnaast kunnen andere complexe gastheer bronnen van exogene vetzuren worden getest met behulp van dit protocol als de potentiële effecten van de vetzuur bron op de achtergrond optische dichtheid worden gecontroleerd. Bovendien is de beschreven massaspectrometrie methode voor analyse van bacteriële lipiden voldoende flexibel om lipidome-evaluatie van vrijwel elke bacteriesoort mogelijk te maken. Als lipide nauwkeurige massa gegevens worden verzameld in ' Full scan ' MS-modus, weinig a priori kennis van het vetgehalte van de bacteriële soorten van belang is vereist, in tegenstelling tot gerichte analytische methoden op basis van bekende fragmentatie patronen van specifieke lipiden 32 , 45 , 46. in de ' ongerichte ' analytische workflow beschrijven we, de downstream data-analyse, en in het bijzonder het zoeken naar nauwkeurige Mass Peak-lijsten tegen een lipide-database, zijn belangrijke stappen die zeer aanpasbaar zijn en kunnen een breed scala aan bacteriële soorten en experimentele behandelingen. Bij het construeren of kiezen van een doorzoekbare database om de identificatie van lipiden soorten mogelijk te maken, moeten onderzoekers een breed scala aan hypothetische endogene lipisoorten overwegen, terwijl het ook mogelijk is om nieuwe of onvoorziene exogene lipiden te detecteren die zijn afgeleid van de experimentele behandeling.

In de huidige studie, een hoge resolutie/nauwkeurige massaspectrometer (tabel van de materialen) werd gebruikt vanwege de ultra-hoge resolutie/nauwkeurige massa-mogelijkheden. Als alternatief, tal van andere hoge resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie platforms kunnen met succes worden geïmplementeerd om ongerichte lipide analyse uit te voeren. Evenzo kan een breed scala van monster introductie methoden, waaronder directe infusie, desorptie elektro spray ionisatie, of matrix-geassisteerde Laser desorptie-ionisatie, die directe analyse van lipide-extracten mogelijk maken, worden gebruikt om snel te verzamelen niet-gerichte lipidomische gegevens. De opname van vloeibare chromatografie voorafgaand aan monster introductie, wanneer gebruikt in combinatie met hoge resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie, kan de oplossing van sommige isobarische lipide soorten toestaan tijdens full-scan MS-gegevensverzameling. Het opnemen van chromatografie vereist echter dat de chromatografische methode van keuze veelzijdig genoeg is om te zorgen voor scheiding en detectie van onverwachte of nieuwe lipide-soorten die aanwezig kunnen zijn na experimentele behandelingen. Database zoeken voor het identificeren van lipiden aanwezig zijn in de gegevensset kan worden uitgevoerd met behulp van een openbaar beschikbare database te doorzoeken. Terwijl LIMSA software maakt facile ontwikkeling van de gebruiker gedefinieerde databases van tienduizenden hypothetische lipide-soorten, tal van andere opties bestaan voor het identificeren van lipiden uit hoge resolutie/nauwkeurige massa MS piek lijsten. Het LIPIDE MAPS Consortium (www.lipidmaps.org) biedt tools voor het doorzoeken van computationele en experimentele databases van hypothetische lipiden met behulp van hoge resolutie/nauwkeurige door MS gegenereerde piek lijsten binnen een door de gebruiker gedefinieerde massa tolerantie, en veel software leveranciers bieden hun eigen oplossingen voor het analyseren van jachtgeweerlipidomics gegevens.

Succesvolle groeicurve en exogene vetzuur analyse is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de LDL-zuiverheid en het beperken van de achtergrond vetzuur niveaus. De juiste identificatie van de LDL-bevattende breuk is cruciaal. Het bovenstaande protocol en Figuur 1 illustreren de juiste Fractie om voor elke stap van het verrijkingsproces te behouden. We hebben succes gehad met het gebruik van 40% ammoniumsulfaat (zuiverheid ≥ 99,5%) voor de neerslag en daaropvolgende verwijdering van β-livetinen. Echter, anderen hebben gemeld dat de zuiverheid en de concentratie van ammoniak sulfaat toegevoegd aan de eierdooier plasma kan aanzienlijke invloed hebben op deze stap47. Het beperken van ammoniumsulfaat besmetting in de LDL-verrijking is belangrijk voor het LDL-preparaat om te worden gebruikt in bacteriële assays, omdat hoge concentraties van ammoniumsulfaat de groei kunnen beperken48. Tijdens de dialyse moet voldoende vrije ruimte in de dialyse slang aanwezig zijn om de diffusie en verwijdering van het ammoniumsulfaat mogelijk te maken. Verdere optimalisatie van het dialyse proces kan extra water veranderingen omvatten tijdens de nachtelijke incubatie. We hebben overnacht dialyse gevonden om de beste resultaten te bieden, hoewel Moussa et al. het verslag dialyse van 6 uur volstaat. Het is van cruciaal belang dat de beginconcentratie van cellen in de groeicurves consistent blijft tussen de proeven. Voor S. aureus heeft het verdunnen van cellen tot een initiële od600 van 0,05 de meest consistente resultaten opgeleverd. Bovendien, hoge concentraties van FASII remmers kunnen resulteren in niet-specifieke effecten op bacteriële cellen. Bijvoorbeeld, triclosan concentraties boven 7 μM induceren cytoplasma membraan schade in S. aureus, daarom is het noodzakelijk dat de concentratie van dit samengestelde blijven onder dit niveau49. We hebben een laatste triclosan-concentratie van 1 μM gevonden die resulteert in reproduceerbare groei testen. Bij het evalueren van een potentiële bron van exogene vetzuren voor bacteriële fosfolipide synthese, is het belangrijk om de vetzuur bijdrage van het kweekmedium te minimaliseren. In de bovengenoemde assays ondersteunt het kweekmedium van 1% vorming een adequate groei van S. aureus en heeft het minimale vetzuur verontreiniging29,32.

Beperking van de achtergrond vetzuur niveaus is vooral belangrijk voor downstream massaspectrometrie gebaseerde vetzuur profilering. Anderen hebben gemeld dat de hoeveelheid vrije vetzuren in kippen eierdooier natuurlijk laag is41 en onze analyse ondersteunt deze conclusie (Figuur 5). Het gebruik van vorming Bouillon en het grondig wassen van cellen met PBS na incubatie zijn essentieel. Bovendien is het belangrijk om de groeifase van de cellen te overwegen. We kozen voor mid-log fase cellen om te zorgen voor voldoende bacteriële fosfolipide synthese. Andere potentiële verontreinigende bronnen van exogene vetzuren kunnen worden geïntroduceerd na bacteriële groei, zoals tijdens de lipide-extractie stappen of daaropvolgende monstervoorbereiding voorafgaand aan massaspectrometrie analyse50. Exogene vetzuren die bij elke stap van het monster preparaat worden geïntroduceerd, kunnen tijdens massaspectrometrie analyse als vrije vetzuren worden opgespoord. Het bakken van laboratoriumglaswerk in een oven met hoge temperatuur (ten minste 180 °C) 's nachts kan exogene vetzuren verwijderen uit testbuisjes die worden gebruikt voor lipide-extractie en lipide-opslag. Bovendien kunnen laboratoriumbenodigdheden, waaronder kunststoffen, worden gespoeld met methanol om de vetzuur achtergrond50te verminderen. Rest vetzuren uit eerdere analyses kunnen ook inwendige oppervlakken van de massaspectrometer zelf besmetten. De opname van analytische blanks tijdens massaspectrometrie analyse voor de bepaling van de achtergrondniveaus van vrije vetzuren wordt daarom sterk aangeraden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen informatie.

Acknowledgments

We danken de leden van het Hammer Laboratory voor hun kritische evaluatie van het manuscript en de ondersteuning van dit werk. Dr. Alex Horswill van de Universiteit van Colorado school of Medicine vriendelijk voorzien AH1263. Dr. Chris Waters Laboratory aan de Michigan State University verstrekt reagentia. Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse hart vereniging Grant 16SDG30170026 en start-up fondsen voorzien door Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts - Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Biochemie uitgave 147 Staphylococcus aureus vetzuur lipoproteïne massaspectrometrie fosfolipide eidooier jachtgeweerlipidomics
Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delekta, P. C., Lydic, T. A.,… More

Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter