Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59555
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

Summary

אנו מדגימים תרבות תא יחיד של חיידקים בתוך שלפוחיות ענק (GVs). GVs המכיל תאים חיידקיים הוכנו על ידי שיטת העברת droplet היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע זכוכית להתבוננות ישירה של גידול חיידקי. גישה זו עשויה להיות גם הסתגלות לתאים אחרים.

Abstract

פיתחנו שיטה עבור תאים חיידקיים culturing ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק (GVs). התרבות התא חיידקי חשוב להבנת הפונקציה של תאים חיידקיים בסביבה הטבעית. בגלל ההתקדמות הטכנולוגית, ניתן לגלות פונקציות שונות של תאים חיידקיים במפלס התא היחיד בתוך מרחב סגור. GVs הם תאים מיקרו בגודל כדורי מורכב מולקולות השומנים האמפיפילי והוא יכול להכיל חומרים שונים, כולל תאים. במחקר זה, תא חיידקי בודד הועבר 10 – 30 יקרומטר gvs על ידי שיטת העברת droplet ו-gvs המכיל תאים חיידקיים היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע הזכוכית. השיטה שלנו היא שימושית להתבוננות בצמיחה בזמן אמת של חיידקים בודדים בתוך GVs. אנו מתורבתים Es, האנתכיה קולי (E. coli) תאים כמודל בתוך gvs, אבל שיטה זו ניתן להתאים לסוגי תאים אחרים. ניתן להשתמש בשיטה שלנו בתחומי המדע והתעשייה של מיקרוביולוגיה, ביולוגיה, ביוטכנולוגיה וביולוגיה סינתטית.

Introduction

התרבות של תאים חיידקיים ברמה תא אחד קיבל את תשומת הלב הגוברת. התאים חיידקי בקטריאלי ברמת תא בודד בתוך שטח מוגבל יכול להבהיר פונקציות חיידקיים כגון השונות פנוטימית1,2,3,4, התנהגות התא5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9, ו עמידות לאנטיביוטיקה10,11. בגלל ההתקדמות האחרונה בטכניקות התרבות, ניתן להשיג את התרבות של חיידקים בודדים בתוך מקום מוגבל, כגון שבב היטב4,7,8, ג'ל droplet12,13 , והמים בשמן (W/O) droplet5,11. כדי לקדם הבנה או ניצול של תאים חיידקיים בודדים, יש צורך בהתפתחויות טכניות נוספות של טכניקות טיפוח.

שלפוחיות המחקים את קרום התא הביולוגי הן תאים כדוריים המורכב ממולקולות אמפיפיליות ויכולות להכיל חומרים שונים. שלפוחיות מסווגים לפי גודל וכוללות שלפוחיות קטנות (SVs, קוטר < 100 ננומטר), שלפוחיות גדולות (LVs, < 1 μm), ושלפוחיות ענק (GVs, > 1 μm). SVs או LVs משמשים בדרך כלל כנשאים לתרופות בשל הזיקה לקרום התא הביולוגי14. GVs יש גם שימש כמערכת הכור עבור הבנייה של פרוטותאים15 או מלאכותי תאים16. כימוס של תאים ביולוגיים לתוך gvs דווח17,18, ולכן gvs להראות פוטנציאל כמערכת תרבות התא כאשר בשילוב עם מערכת הכור.

כאן, יחד עם וידאו של הליכים ניסיוניים, אנו מתארים כיצד GVs יכול לשמש ככלי תרבות התא הרומן19. GVs המכילים חיידקים נעשו על ידי שיטת ה-droplet העברת20 והיו מקיבוע על קרום נתמך על זכוכית כיסוי. השתמשנו במערכת זו כדי להתבונן בגידול חיידקי ברמה של תא בודד בתוך GVs בזמן אמת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת GVs המכיל תאים חיידקיים על ידי שיטת העברת Droplet

  1. הכנת פתרונות מניות ליפיד של 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-לגליקו-3-פוספולולין (POPC, 10 מ"מ, 1 מ ל) ו-1, 2-distearoyl-sn-גליקו-3-פוספולאטאנאמין-N-[ביוטיקסיל (פוליאתילן)-2000] (biotin-יתד-DSPE, 0.1 מ"מ, 1 מ ל) בכלורופורם/ מתנול פתרון (2/1, v/v) ולאחסן את המניה ב-20 ° c.
  2. הכנת תמיסת שמן המכילה שומנים בדם
    1. יוצקים 20 μL של פתרון POPC ו 4 μL של הפתרון biotin-יתד-DSPE לתוך צינור זכוכית (איור 1b (i)).
    2. להתנדף את הממס האורגני על ידי זרימת האוויר כדי ליצור סרט השומנים ולמקם את הסרט desiccator עבור 1 h כדי לאדות לחלוטין את הממס אורגני (איור 1b (ii)).
      הערה: יש צורך לאדות את הממס האורגני בתוך מכסה המנוע.
    3. הוסף 200 μL של שמן מינרלי (0.84 g/mL, טבלת חומרים) לבקבוקון זכוכית (איור 1b (iii)).
    4. עטוף את החלק הפותח של בקבוקון זכוכית עם הסרט וsonicate אותו באמבטיה אולטרה סאונד (120 W) עבור לפחות 1 h (איור 1b (iii)). הריכוזים הסופיים של POPC ו biotin-יתד-DSPE הם 1 מ"מ ו 0.002 מ"מ, בהתאמה.
  3. טרום תרבות של תאים חיידקיים
    1. החיידק הקולי לתוך מדיום 1x ליברות (1 גרם שמרים לחלץ, 2 g bacto טריטונים, ו 2 גרם נתרן כלוריד ב 200 mL של מים מיוהים) מ לוחית LB ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 12 – 14 h (לילה).
    2. לאחר הדגירה, לאסוף 20 μL של פתרון התרבות ולהעביר ל 1.98 mL של טריים 1x בינוני LB, ותרבות התאים שוב עבור 2 h.
    3. בדוק את הדחיסות האופטית ב600 nm (OD600) ערך של פתרון טרום תרבות (מוכן בשלב 1.3.2). יש להשתמש בפתרון טרום תרבות של OD600 = 1.0 – 1.5.
  4. הכנת פתרונות המים החיצוניים והפנימיים של GVs
    1. התמוססות גלוקוז ב-1x ליברות בינונית כדי להכין פתרון מימית החיצוני של GVs. הכן 20 מ ל של פתרון גלוקוז מניות (500 mM).
    2. לדלל את התמיסה הגלוקוז במניה עם מדיום 1x ליברות 200 מ"מ (שולחן 1).
    3. מתמוסס התמוססות ב 1x ליברות בינונית כדי להכין פתרון מימית פנימי של GVs. הכינו 20 מ ל של מניות הפתרון של סוכרוז (500 מ"מ).
    4. לערבב את הפתרון טרום תרבות (OD600 = 1.0 – 1.5), סוכרוז פתרון (500 mM), ו 1X LB בינונית (טבלה 1). ה-OD הסופי600 ערך של הפתרון התרבותי צריך להיות 0.01 – 0.015 והריכוז האחרון של סוכות צריך להיות 200 מ"מ.
      הערה: . תדאג להימנע מלחץ אוסמוטי יש צורך לאזן את הריכוז בין הפתרון הפנימי והחיצוני.
  5. הכנת המים בשמן (W/O) טיפות המכילות תאים חיידקיים
    1. הוסף 2 μL של הפתרון הפנימי מימית של GVs (מוכן בשלב 1.4.4) כדי 50 μL של פתרון שמן המכיל שומנים (שמן מינרלי עם POPC ו biotin-יתד-DSPE) בצינור פלסטיק 0.6 mL (איור 1b (iv)).
    2. אמולסיה של שני הרכיבים בצינור הפלסטיק על-ידי הקשה על הצינור באמצעות יד (איור 1b (v)).
  6. היווצרות של GVs המכיל תאים חיידקיים
    1. הוסף 50 μL של הפתרון החיצוני מימית של GVs (מוכן בשלב 1.4.2) בצינור פלסטיק של 1.5 mL (איור 1b (vi)) ושכבה בעדינות 150 μl של פתרון השמן המכיל שומנים (שמן מינרלי עם popc ו BIOTIN-יתד-dspe) על המשטח של מימית החיצונית (איור 1b (vii)). מיכל הדגימה בטמפרטורת החדר (RT, 25 ° c) במשך 10 – 15 דקות בדוק כדי לוודא כי הממשק של השמן ופתרונות מימית הוא שטוח.
    2. הוסף 50 μL של הפתרון של W/O droplet (מוכן בשלב 1.5.2) על הממשק של השמן ואת התמיסה מימית באמצעות פיפטה (איור 1b (viii)).
    3. צנטריפוגה את שפופרת הפלסטיק 1.5 mL (משלב 1.6.2) עבור 10 דקות ב 1,600 x g ב RT ב צנטריפוגה שולחן עבודה (איור 1b (ix)). לאחר צנטריפוגה, לאכול את השמן (השכבה העליונה) מצינור פלסטיק 1.5-mL בעקבות הצינורות, ולאסוף את GVs המכיל תאים חיידקיים (איור 1b (x)).

2. הכנת מערכת תצפית GV (מערכת תרבות התא חיידקי)

  1. הכנת שלפוחיות קטנות (SVs) לקונסטרוקטי ng ממברנה בילייר נתמכת
    1. יוצקים 20 μL של פתרון POPC ו 4 μL של הפתרון biotin-יתד-DSPE לתוך צינור זכוכית (באמצעות הרכב השומנים זהה משמש הכנה GV בשלב 1.1).
    2. להתנדף את הממס האורגני על ידי זרימת האוויר כדי ליצור סרט השומנים ולמקם את המדגם הזה desiccator עבור 1 h כדי להתאדות לחלוטין את הממס האורגני.
    3. הוסף 200 μL של הגלוקוז 200 mM ב 1x בינונית LB (הפתרון החיצוני מימית של GVs) לבקבוקון זכוכית.
    4. עטוף את החלק הפותח של בקבוקון זכוכית עם הסרט וsonicate אותו באמבטיה אולטראסוניות (120 W) עבור לפחות 1 h.
    5. הכינו SVs על ידי שיטת ההבלטה21 באמצעות הבלטת ממד מיני קרום פוליקרבונט עם 100 בגודל נקבובית ננומטר.
  2. הכנת תא בעבודת יד
    1. מקדחה חור 7 מ"מ עם אגרוף חלול על אטם כפול פנים (10 מ"מ x 10 מ"מ x 1 מ"מ).
    2. הדבק את החותם כפול פנים עם החור על זכוכית כיסוי (30 מ"מ x 40 מ"מ, עובי 0.25 – 0.35 mm).
  3. הכנת קרום bilayer נתמך על הזכוכית המכסה בחור של התא
    1. הוסף 30 μL של פתרון SV לחור של התא (מוכן בסעיף 2.2) ו דגירה ב RT עבור 30 דקות.
    2. בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 μL של 1x בינוני LB המכיל 200 mM גלוקוז (הפתרון החיצוני מימית של GVs) על ידי ליטוף.
  4. השתק של GVs על ה הממברנה הנתמכת על הזכוכית המכסה בחור החדר
    1. הצג 10 μL של neutravidin עם הפתרון החיצוני מימית של GVs (1 מ"ג/mL) לתוך החור ו-דגירה ב RT עבור 15 דקות.
    2. בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 μL של 1x בינוני LB המכיל 200 mM גלוקוז (הפתרון החיצוני מימית של GVs) על ידי ליטוף.
    3. הוסף את כל הפתרון המכיל GVs (מוכן בשלב 1.6.3) לתוך החור של התא וחותם עם זכוכית כיסוי (18 מ"מ x 18 מ"מ, עובי 0.13 – 0.17 מ"מ) (איור 2b).
  5. התבוננות מיקרוסקופית של צמיחת תאים חיידקיים בתוך GVs
    1. הגדר מערכת הבמה חימום מיקרוסקופיים עם מיקרוסקופ הפוך מצויד בצמצם 40x/0.6 מספרית (NA) העדשה האובייקטיבית עם מרחק עבודה ארוך (איור 2b).
    2. מניחים את התא על מערכת הבמה חימום מיקרוסקופיים (איור 2b). דגירה של GVs המכיל תאים חיידקיים בחדר במצב סטטי עבור 6 h ב 37 ° c.
    3. ללכוד ולהקליט תמונות מיקרוסקופ של צמיחת תאים חיידקיים בתוך GVs כל 30 דקות באמצעות מדעית מתכת משלימה תחמוצת מוליכים למחצה (sCMOS) מצלמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מציגים שיטה פשוטה ליצירת GVs המכיל תאים חיידקיים בודדים באמצעות שיטת ה-droplet העברה (איור 1). איור 1a מראה תמונה סכמטית של המשקעים של gvs המכילים חיידקים. W/O טיפות המכילים חיידקים מועברים על פני מי השמן (מונאולד מונואולייר) ממשק ידי צנטריפוגה כדי ליצור GVs. ההבדל בין הצפיפות בין התמיסה הפנימית והגלוקוז (פתרון המים החיצוני) מסייע גם לחציית ממשק מי השמן של טיפות W/O. יש צורך לפקח על הלחץ אוסמוטי בפתרון מימית פנימי וחיצוני, כי הבדל קל בריכוז בין פתרונות אלה יכול לגרום לעיוות והתמוטטות של GVs. תרשים זרימה להכנת GVs המכיל תאים חיידקיים על-ידי שיטת העברת ה-droplet מוצג באיור 1b. על-ידי ביצוע הליך זה, GVs המכיל תאים חיידקיים בודדים ניתן להשיג בקלות.

כדי להתבונן בצמיחת התאים החיידקיים בתוך GVs, נבנתה מערכת תרבות מקורית להתבוננות מיקרוסקופית (איור 2). GVs המכילים חיידקים היו מקיבוע על פני ממברנה נתמך מצופה עם neutravidin על זכוכית כיסוי (איור 2a). טכניקת השתק אפשרה התבוננות ממושכת בשיטת GVs.

אופייני מיקרוסקופית הפאזה מראה תמונות של GVs בגודל שונה המכיל תאים חיידקיים בודדים מוצגים באיור 3. בניסוי זה, אנו גם השיגו gvs המכיל תאים חיידקיים עם גדלים החל 10 יקרומטר עד 30 יקרומטר. איור 3 מראה צמיחה בקטריאלי ברמה תא יחיד בתוך gvs עם גדלים שונים של 10.7 יקרומטר (איור 3a) ו 28 יקרומטר (איור 3ב). בשני הגדלים של GVs, E. coli תאים עברו התארכות ותהליכים חילוק, עם אחד או שני תאים E. coli גדל למספר גדול מאוד של תאים מעל 6 h. כך התאים החיידק הקולי גדלו באופן בלתי נשכח בתוך ה-gvs.

התדר היחסי של GVs המכיל מספר נתון של תאים חיידקיים מוצג באיור 4. במצב הניסיוני שלנו (OD600 = 0.01 – 0.015), תאים חיידקיים כוליינו ברמת התא בודד כ 10% של gvs שהתקבלו (gvs ריק היו כ 80%). GVs כדורית ברמת תא בודד היו כ 50% של GVs המכילים תאים חיידקיים, כפי שנאמד מתוך הכניסה של איור 4.

Figure 1
איור 1: הליכים ניסיוניים של GVs המכילים חיידקים. (א) הערכה של gvs המכיל חיידקים שהוכנו על ידי שיטת העברת droplet. מיקרוטיפות W/O המכיל חיידקים לעבור דרך ממשק דופלקס השומנים על ידי כוח צנטריפוגלי ולאחר מכן טופס קרום bilayer ליפיד. (ב) זרימה של סינתזה של gvs המכיל חיידקים. (i) ממיסים אורגניים המכילים שומנים (POPC ו biotin-יתד-DSPE, 100:0.2 היחס הטוחנת). (ii) סרט ליפיד בתחתית בקבוקון הזכוכית. (3) השמן תמיסה המכילה שומנים. (iv) תערובת של 50 μL של פתרון הנפט 2 μL של פתרון המים הפנימיים (200 מ"מ בינונית ו-1x ליברות) המכיל תאים חיידקיים. (v) אמולסיה באמצעות הקשה ידנית (מעל 50 פעמים). (vi) 50 μL של הפתרון החיצוני מימית (200 mM גלוקוז במדיום 1x LB). (vii) שכבות של 150 μL של פתרון שמן על הפתרון החיצוני מימית. (8) בשכבות של פתרון ה-W/O. (ix) צנטריפוגה של השפופרת. (x) זירז כנגד המכיל תאים חיידקיים לאחר שאיפה של השמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: o מערכת bservation של תרבות התא חיידקי בתוך GVs. (א) gvs הם מקיבוע על קרום נתמך דרך biotin-neutravidin הכריכה על הזכוכית המכסה. GVs מודבטים על ידי מערכת חימום. (ב) תמונה של מערכת התצפית, לרבות חדר עבודת יד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות מיקרוסקופ בחדות פאזה של GVs המכיל תאים בודדים חיידקים (המצוין על ידי החיצים השחורים). הצמד יריות של צמיחת תאים חיידקיים בתוך בגודל שונה GVs. (a) בגודל = 10.7 μm. (ב) בגודל שלפוחית = 28 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח סטטיסטי של מספר התאים החיידקיים המכומות לכל GV. התדרים היחסיים של ה-GVs הותוו כהויסטגרמות. שיבוץ: הגדלה של תדרים יחסיים של GVs המכיל תאים חיידקיים מיחיד עד 10 תאים <. סך של 235 GVs נותחו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תמיסה חיצונית מימית תמיסה פנימית מימית סופי
500 מ"מ גלוקוז עם מדיום LB 200 מיקרומטר – 200 ממ '
500 מ ג סוכרוז עם LB מדיום – 200 מיקרומטר 200 ממ '
1x ליברות בינונית 300 מיקרומטר 295 מיקרומטר –
פתרון טרום תרבות (OD600 = 1.0 – 1.5) – 5 מיקרומטר OD600 = 0.01 – 0.015
נפח כולל 500 מיקרומטר 500 מיקרומטר

טבלה 1: הקומפוזיציה והכרכים של פתרונות המים החיצוניים והפנימיים של GVs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מתארים שיטה עבור תאים חיידקיים culturing ברמה תא אחד בתוך GVs. שיטה פשוטה זו כרוכה ביצירת GVs המכיל תאים חיידקיים ברמה תא יחיד באמצעות שיטת ה-droplet העברה. לעומת גישות אחרות להשגת GVs המכיל תאים חיידקיים, שיטה זו יש שני יתרונות: (אני) זה קל לפתח, ו (ii) נפח קטן (2 μL) של פתרון לדוגמה נדרש כדי להכין את GVs. שיטת ה-droplet העברת20 להכנת gvs המכילים תאים חיידקיים היא פשוטה יותר מאשר לחות קלאסית22 ו מיקרופלואידיקה שיטות מיקרופלואידיקה17. לדוגמה, שיטת החות הקלאסית22 היא שיטה פשוטה וקלה להכנת gvs, אך היעילות המעטיפת של חומרים לתוך gvs היא נמוכה למדי ולפחות כמה מאות מיקרויטר של מדגם נדרש. שפותחו לאחרונה נייר תאית שפותחה לחות23 ו ג'ל בסיוע לחות24 שיטות לעשיית gvs יש יעילות אנקפסולציה גבוהה של biomolecules לעומת שיטת החות הקלאסית22. יעילות האנקפסולציה שלהם היא גבוהה כמו זה של טכניקת העברת droplet, והוא צפוי כי שתי שיטות אלה עשויה לאפשר אנקפסולציה של תאים בתוך GVs. יתר על כן, שיטת מיקרופלואידיקה17 מדויק במדויק בתאים בודדים בתוך gvs ומראה יעילות אנקפסולציה גבוהה מאוד של חומרים לתוך gvs אבל דורש טיפול מסובך וטכניקות עבור בדיית microating מיקרו מכשירים גדולים נפח לדוגמה (לפחות כמה מיליליטר) כדי להזרים את הצינור.

בפרוטוקול זה, את היציבות של ממשק מים שמן חשוב להשגת GVs המכיל תאים חיידקיים (איור 1b (vii)). כדי להשיג GVs רבים, זה חיוני כדי לשטח את ממשק מים הנפט. לכן, יש צורך בהכנה נאותה של שלב הנפט. אנחנו sonicated את שלב הנפט לפחות 1 h באמבטיה אולטרה סאונד גבוהה (120 W) כדי לפזר לחלוטין את מולקולות השומנים. חשוב לרובד את שלב הנפט על הפתרון החיצוני מימית מיד לאחר sonication (איור 1b (vii)).

לשיטה המתוארת כאן יש שתי מגבלות. ראשון, GVs לעתים קרובות לשבור תאים חיידקיים לדלוף לתוך הפתרון החיצוני מימית. הסיבה לכך היא במהלך היווצרות GV, כמה טיפות W/O לא יכול להעביר דרך ממשק מים שמן ולהיות נקרע. זה בלתי נמנע בעת שימוש בשיטה העברת droplet20. בנוסף, GVs עלול להישבר במהלך התבוננות. היציבות של GVs חייב להיות משופר, כגון על ידי שימוש בשלד התא מלאכותי המייצאת GVs25. שנית, מספר התאים החיידקיים שעברו כימוע לא יכול להיות נשלט באופן מושלם. איור 4 מראה כי מספר גדול של תאים חיידקיים היו כימוס ב-gvs, ולכן, קשה לשלוט על מספר התאים חיידקי gvs באמצעות שיטת ה-droplet העברה. כדי לשלוט במספר התאים, ניתן להשתמש בטכנולוגיית microfluiאידיקה.

Gvs עשוי לשלוט הפתרון הפנימי שלהם מימית בצורה יעילה יותר מאשר חומרים אחרים (ג'ל טיפות12,13 או W/O טיפות5,11). לדוגמה, התנאים מימית של הפתרונות הפנימיים והחיצוניים של GVs משתנים על ידי חדירות קרום טבעי26 או חדירות הקלה על ידי נקבובית הממברנה16 או טרנספורטר27. בשיטה הנוכחית, מולקולות שמן (שמן מינרלי במקרה זה) נשארו בקרום20. השפעת השמן הנותר בקרום על החדירות של חומרים מזינים או חמצן לגידול חיידקי אינו ידוע. למרות שאנחנו לא יודעים את חדירות הקרום הטבעי של חומרים מזינים או חמצן, אנו מחשיבים כי כמות החומרים המזינים או החמצן במדיום הצמיחה היה מספיק לצמיחה חיידקים במחקר הנוכחי. חדירות הקרום הטבעי של חומרים מזינים או חמצן חשוב מאוד לצמיחת תאים חיידקיים הוא נושא חשוב למחקר עתידי. אין אפשרות לנהל את הטכניקה לשליטה בחדירות באמצעות שיטת התרבות עם טיפות ג'ל12,13 או W/O טיפות5,11. GVs יהיה ובכך להפוך את הבחירה הראשונה עבור יישומים תרבות חיידקית בחלל סגור.

שיטת התרבות החיידקית שלנו היא קונספט וכלי חדש בתחום המיקרוביולוגיה19 לתרבות חיידקים לא ידועים להשגת או ניתוח מוצרי חילוף החומרים שלהם. יתר על כן, התאים החיידקיים שלנו המכילים GVs הם מערכת היברידית של מודל תא מלאכותי (GVs) תא חי (תאים חיידקיים) כדי ליצור כלי חדש ביוטכנולוגיה28 ומלמטה למעלה ביולוגיה סינתטית29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי יוזמה מובילה לחוקרים צעירים מצוינים (מנהיג, No. 16812285) ממשרד החינוך, התרבות, ספורט, מדע וטכנולוגיה (MEXT) של יפן, מענק סיוע למחקר מדען צעיר (No. 18K18157, 16K21034) מחברה יפן לקידום המדע (JSPS) ל M.M., ו גרנט-עזרה מ-MEXT ל-K.K. (No. 17H06417, 17H06417).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bactotryptone BD Biosciences 211705
Chloroform Wako Pure Chemicals 032-21921
Cover glass (18 × 18 mm) Matsunami Glass Ind. C018181 thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm) Matsunami Glass Ind. custom-order thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge Hi-Tech Co. ATT101 swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) Nitoms T4613
Glass vial AS ONE 6-306-01 Durham fermentation tube
Glucose Wako Pure Chemicals 049-31165
Inverted microscope Olympus IX-73
Methanol Wako Pure Chemicals 133-16771
Microscopic heating stage system TOKAI HIT TP-110R-100
Mineral oil Nacalai Tesque 23334-85
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610000
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Objective lens Olympus LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids 610005 pore size 100 nm
sCMOS camera Andor Zyla 4.2 plus
Sodium chloride Wako Pure Chemicals 191-01665
Sucrose Wako Pure Chemicals 196-00015
Ultrasonic bath AS ONE ASU-3D
Yeast extract BD Biosciences 212750
0.6 mL lidded plastic tube Watson 130-806C
1.5 mL lidded plastic tube Sumitomo Bakelite Co. MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline Avanti Polar Lipids 850457P POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids 880129P Biotin-PEG-DSPE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 146 תרבות תא בקטריאלי תרבות תא יחיד שלפוחיות ענק שיטת העברת droplet מלאכותי תא מבוסס חממה מיקרוביולוגיה
תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morita, M., Ota, Y., Katoh, K.,… More

Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter