Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Бактериальная культура клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59555
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

Summary

Мы демонстрируем одноклеточную культуру бактерий внутри гигантских пузырьков (ГВ). ГВ, содержащие бактериальные клетки, были подготовлены методом передачи капель и были обездвижены на поддерживаемой мембране на стеклянном субстрате для прямого наблюдения за бактериальным ростом. Этот подход также может быть адаптирован к другим клеткам.

Abstract

Мы разработали метод культивирования бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков (ГВ). Культура бактериальных клеток важна для понимания функции бактериальных клеток в естественной среде. Из-за технологических достижений, различные бактериальные функции клеток могут быть выявлены на одноклеточном уровне внутри ограниченного пространства. GVs представляют сферические микроразмерные отсеки, состоящие из амфифильных липидных молекул и могут содержать различные материалы, в том числе клетки. В этом исследовании, одна бактериальная клетка была инкапсулирована в 10-30 мкм GVs методом передачи капель и GVs, содержащие бактериальные клетки были обездвижены на поддерживаемой мембране на стеклянном субстрате. Наш метод полезен для наблюдения за ростом в реальном времени отдельных бактерий внутри ГВ. Мы культивировали клетки Escherichia coli (E.coli)в качестве модели внутри GV, но этот метод можно адаптировать к другим типам клеток. Наш метод может быть использован в научно-промышленных областях микробиологии, биологии, биотехнологии и синтетической биологии.

Introduction

Культура бактериальных клеток на одноклеточном уровне получила все большее внимание. Культирование бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри ограниченного пространства может выяснить бактериальные функции, такие как фенотипическая изменчивость1,2,3,поведениеклеток5, 6 , 7 (г. , 8 , 9, и устойчивость к антибиотикам10,11. Из-за последних достижений в области техники культуры, культура отдельных бактерий может быть достигнута внутри ограниченного пространства, например, в хорошо чип4,7,8, гель капли12,13 , и вода в масле (W / O) капля5,11. Для содействия пониманию или использованию отдельных бактериальных клеток необходимы дальнейшие технические разработки методов выращивания.

Везикулы, имитирующие мембрану биологических клеток, представляют сферические отсеки, состоящие из амфифильных молекул, и могут содержать различные материалы. Везикулы классифицируются в зависимости от размера и включают в себя небольшие пузырьки (SVs, диаметр йlt; 100 нм), большие пузырьки (LVs, lt;1 мкм), и гигантские пузырьки (GVs, SVs или LVs обыкновенно использованы как несущие снадобья из-за их сродства к биологической мембране клетки14. GVs также были использованы в качестве реакторной системы для строительства протоэлементов15 или искусственных клеток16. Инкапсуляция биологических клеток в GVs было сообщено17,18, и, таким образом, GVs показать потенциал в качестве системы клеточной культуры в сочетании с реакторной системой.

Здесь, наряду с видео экспериментальных процедур, мы описываем, как GVs могут быть использованы в качестве новых сосудов клеточной культуры19. GVs, содержащие бактерии были сделаны методом передачи капель20, а затем обездвижены на поддерживаемой мембране на крышке стекла. Мы использовали эту систему для наблюдения за ростом бактерий на одноклеточном уровне внутри ГВ в режиме реального времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка ГВ, содержащих бактериальные клетки методом передачи капель

  1. Подготовка липидных стоковых растворов 1-пальмитоила-2-олеоил-сн-глицеро-3-фосфохолин (POPC, 10 мМ, 1 мл) и 1,2-дистеэроил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Н-биотиниол (полиэтиленегликоль) -2000" (биотин-ПЕГ-ДСПЕ, 0,1 мм, 1 мл) в хлороформе/ метанол раствор (2/1, v/v) и хранить акции при -20 градусах Цельсия.
  2. Приготовление липидосодержащего масляного раствора
    1. Налейте 20 зл раствора POPC и 4 зл раствора биотин-PEG-DSPE в стеклянную трубку(рисунок 1b (i)).
    2. Испарите органический растворитель потоком воздуха, чтобы сформировать липидную пленку и поместите пленку в обезвреживание на 1 ч, чтобы полностью испариться с органическим растворителем(рисунок 1b (ii)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо испарять органический растворитель в дымовом капюшоне.
    3. Добавьте в стеклянный флакон 200 л минерального масла (0,84 г/мл, таблицаматериалов) (рисунок1b (iii)).
    4. Оберните открываюшую часть стеклянного флакона пленкой и снизите ее в ультразвуковую ванну (120 Вт) не менее 1 ч(рисунок 1b (iii)). Окончательные концентрации POPC и biotin-PEG-DSPE составляют 1 мМ и 0,002 мМ соответственно.
  3. Предкультура бактериальных клеток
    1. Прививать кишечную палочку в 1x LB среды (1 г дрожжевого экстракта, 2 г бакто триптона, и 2 г хлорида натрия в 200 мл деионизированной воды) из пластины LB и инкубировать при 37 кс для 12-14 ч (ночь).
    2. После инкубации соберите 20 юл культурного раствора и перенесите в 1,98 мл свежей 1x LB-среды и снова засучив клетки на 2 ч.
    3. Проверьте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600)значения докультурного решения (подготовлено в шаге 1.3.2). Следует использовать предкультурное решение OD600 и 1,0-1.5.
  4. Подготовка внешних и внутренних водной решений GVs
    1. Растворите глюкозу в среде 1x LB для подготовки внешнего водиного раствора GVs. Подготовьте 20 мл раствора глюкозы (500 мм).
    2. Разбавить бульонный раствор глюкозы 1x LB среднего до 200 мМ(таблица 1).
    3. Растворите сахарозу в 1x LB среде для подготовки внутреннего вкового раствора GVs. Подготовьте 20 мл раствора сахарозы (500 мм).
    4. Смешайте предкультурное решение (OD600 и 1,0-1,5), сахарозный раствор (500 мМ) и 1x LB средний(таблица 1). Окончательное значение OD600 культурного решения должно состочиться 0,01-0,015, а конечная концентрация сахарозы должна сосуна 200 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь, чтобы избежать осмотического давления. Необходимо сбалансировать концентрацию между внутренним и внешним ваквным раствором.
  5. Приготовление капель water-in-oil (W/O), содержащих бактериальные клетки
    1. Добавьте 2 ql внутреннего водного раствора ГВ (подготовленного в шаге 1.4.4) к 50 л масляного раствора, содержащего липиды (минеральное масло с POPC и biotin-PEG-DSPE) в пластиковой трубке с крышкой 0,6 мл(рисунок 1b (iv)).
    2. Эмульгировать два компонента в пластиковой трубке, нажав трубку вручную(рисунок 1b (v)).
  6. Формирование ГВ, содержащих бактериальные клетки
    1. Добавьте 50 qqueous solution of GVs (подготовленного в шаге 1.4.2) в пластиковой трубке 1,5 мл(рисунок 1b (vi)) и мягко слой 150 л масляного раствора, содержащего липиды (минеральное масло с POPC и биотин-PEG-DSPE) на поверхности внешнего aqueous решение(рисунок 1b (vii)). Инкубировать этот образец при комнатной температуре (RT, 25 градусов по Цельсию) в течение 10-15 мин. Проверьте, чтобы убедиться, что интерфейс масла и водной раствор ы плоский.
    2. Добавьте 50 кл. раствора капли W/O (подготовленного в шаге 1.5.2) на интерфейсе масла и водного раствора с помощью пипетки(рисунок 1b (viii)).
    3. Centrifuge 1,5 мл крышкой пластиковой трубки (от шага 1.6.2) в течение 10 минут на 1600 х г на RT в центрифуге рабочего стола (рисунок1b (ix)). После центрифугирования, аспирировать масло (верхний слой) из 1,5-мл крышкой пластиковой трубки с помощью пипетки, и собирать GVs, содержащие бактериальные клетки(Рисунок 1b (x)).

2. Подготовка системы наблюдения GV (Система культуры бактериальных клеток)

  1. Подготовка небольших пузырьков (SVs) для конструктивов нг а поддерживаемая двухслойная мембрана
    1. Налейте 20 зл раствора POPC и 4 зЛ раствора биотин-PEG-DSPE в стеклянную трубку (используя тот же липидный состав, который используется для подготовки ГВ в шаге 1.1).
    2. Испарите органический растворитель потоком воздуха, чтобы сформировать липидную пленку и поместите этот образец в обезврежье в течение 1 ч, чтобы полностью испариться органического растворителя.
    3. Добавьте 200 мл глюкозы 200 мМ в 1x LB среде (внешний вакаусальный раствор ГВ) в стеклянный флакон.
    4. Оберните открываюшую часть стеклянного флакона пленкой и снизите ее в ультразвуковую ванну (120 Вт) не менее 1 ч.
    5. Подготовьте SVs методом экструзии21 с использованием мини-экструдера и поликарбонатной мембраны с размером 100 нм пор.
  2. Приготовление камеры ручной работы
    1. Просверлите отверстие 7 мм с полым ударом на двуликую уплотнитель (10 мм x 10 мм х 1 мм).
    2. Вставьте двуликую печать с отверстием на крышке стекла (30 мм х 40 мм, толщина 0,25-0,35 мм).
  3. Приготовление поддерживаемой двухслойной мембраны на крышке стекла в отверстие камеры
    1. Добавьте 30 зЛ раствора SV в отверстие камеры (подготовлено в разделе 2.2) и инкубируйте на RT в течение 30 мин.
    2. Аккуратно промыть отверстие дважды с 20 Зл 1x LB среды, содержащей 200 мМ глюкозы (внешний ваквоковой раствор GVs) путем pipetting.
  4. Иммобилизация GVs на поддерживается двухслойная мембрана на крышке стекла в отверстие камеры
    1. Ввести 10 зЛ нейтравидина с внешним вквокевым раствором ГВ (1 мг/мл) в отверстие и инкубировать на RT в течение 15 минут.
    2. Аккуратно промыть отверстие дважды с 20 Зл 1x LB среды, содержащей 200 мМ глюкозы (внешний ваквоковой раствор GVs) путем pipetting.
    3. Добавьте в отверстие камеры все растворы, содержащие ГВ (подготовленный в шаге 1.6.3) и запечатайте крышкой (18 мм х 18 мм, толщина 0,13–0,17 мм)(рисунок 2b).
  5. Микроскопическое наблюдение роста бактериальных клеток внутри ГВ
    1. Установите микроскопическую систему стадии нагрева с перевернутым микроскопом, оснащенным объективной линзой 40x/0.6 numerical aperture (NA) с большим рабочим расстоянием (рис.2б).
    2. Поместите камеру на микроскопическую систему стадии нагрева(рисунок 2b). Инкубировать GVs, содержащие бактериальные клетки в камере в статичном состоянии в течение 6 ч при 37 градусах Цельсия.
    3. Захват и запись микроскопа изображения роста бактериальных клеток внутри GVs каждые 30 минут с помощью научного дополнительного полупроводника оксида металла (sCMOS) камеры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы представляем простой метод для генерации ГВ, содержащих отдельные бактериальные клетки с помощью метода передачи капель(рисунок 1). На рисунке 1а показано схематическое изображение осадков ГВ, содержащих бактерии. W / O капель, содержащих бактерии передаются через масло-вода (липидный монослой) интерфейс центрифугации для формирования GVs. Разница в плотности между сахарозой (внутренним водным раствором) и глюкозой (внешнее водное решение) также способствует скрещиванию масляно-водного интерфейса капель W/O. Необходимо контролировать осмотическое давление во внутреннем и внешнем ваквомом растворе, так как небольшая разница в концентрации между этими растворами может вызвать деформацию и коллапс ГВ. Диаграмма потока для подготовки GVs, содержащего бактериальные клетки методом передачи капель, показана на рисунке 1b. Следуя этой процедуре, GVs, содержащие отдельные бактериальные клетки могут быть легко получены.

Для наблюдения за ростом бактериальных клеток в ГВ, оригинальная система культуры была построена для микроскопических наблюдений(рисунок 2). GVs, содержащие бактерии были обездвижены на поддерживаемой поверхности мембраны, покрытой нейтравидином на крышке стекла(рисунок 2a). Этот метод иммобилизации позволил длительное наблюдение Загина.

Типичные фазово-контрастные микроскопические изображения разного размера ГВ, содержащие одиночные бактериальные клетки, показаны на рисунке 3. В этом эксперименте мы также получили ГВ, содержащие бактериальные клетки с размерами от 10 мкм до 30 мкм. Рисунок 3 показывает рост бактерий на одноклеточном уровне внутри ГВ с различными размерами 10,7 мкм(рисунок 3а) и 28 мкм (рисунок3b). Для обоих размеров ГВ, E. coli клетки прошли удлинение и деление процессов, с одной или двумя e. coli клеток растет до очень большого числа клеток более 6 ч. Таким образом, клетки кишечной палочки стали стабилно внутри GVs.

Относительная частота ГВ, содержащих определенное количество бактериальных клеток, показана на рисунке 4. В нашем экспериментальном состоянии (OD600 - 0,01-0.015) бактериальные клетки были инкапсулированы на уровне одной клетки примерно в 10% полученных ГВ (пустые ГВ были примерно 80%). GVs инкапсулированные на уровне одной клетки были приблизительно 50% из GVs содержа бактериальные клетки, как оценено от вриса рисунка4.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальные процедуры ГВ, содержащие бактерии. () Схема ГВ, содержащих бактерии, подготовленные методом передачи капель. W/O микрокапли, содержащие бактерии, проходят через липидный монослойный интерфейс центробежной силой, а затем образуют липидную двухслойную мембрану. (b) Поток синтеза ГВ, содержащих бактерии. i) Органический растворитель, содержащий липиды (POPC и biotin-PEG-DSPE, коэффициент 100:0,2 моляра). ii) Липидная пленка в нижней части стеклянного флакона. iii) Масляный раствор, содержащий липиды. iv) Смесь 50 л масляного раствора и 2 л внутреннего ваквого раствора (сахароза 200 мм и 1x LB-среды), содержащая бактериальные клетки. v) Эмульгация с помощью ручного прослушивания (более 50 раз). vi) 50 л внешнего ваквого раствора (200 мМ глюкозы в 1x LB среде). (vii) Укладка 150 л масляного раствора на внешнем ваквоме. (viii) Укладка раствора капли W/O. (ix) Центрифугация трубки. (x) Осадки ГВ, содержащие бактериальные клетки после аспирации масла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: О система бсервации бактериальной клеточной культуры внутри ГВ. () GVs обездвижены на поддерживаемой мембране через биотин-невтравидина связывания на крышке стекла. GVs инкубируются системой отопления. (b) Изображение системы наблюдения, включая камеру ручной работы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Фазово-контрастные микроскопии изображения GVs, содержащие клетки отдельных бактерий (показано черными стрелками). Привязки выстрелов роста бактериальных клеток внутри различных размеров GVs. ( a ) Размер Весикля 10,7 мкм. (б) Размер Весикля - 28 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Статистический анализ количества инкапсулированных бактериальных клеток на ГВ. Относительные частоты ГВ были построены как гистограммы. Врез: Увеличение относительных частот ГВ, содержащих бактериальные клетки от одного до 10-л; клеток. Всего было проанализировано 235 ГВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Внешнее вакостное решение Внутреннее вакосовые решение Окончательный
500 мМ Глюкоза с LB средний 200 зл. – 200 мМ
500 мМ сахароза с LB средний – 200 зл. 200 мМ
1x LB средний 300 л 295 л –
Докультурное решение (OD600 и 1,0-1,5) – 5 зл OD600 - 0,01-0,015
Общий объем 500 л 500 л

Таблица 1: Состав и объемы внешних и внутренних вакавых решений GVs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем метод культивирования бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри ГВ. Этот простой метод включает в себя формирование ГВ, содержащих бактериальные клетки на одноклеточном уровне с помощью метода передачи капель. По сравнению с другими подходами к получению ГВ, содержащих бактериальные клетки, этот метод имеет два преимущества: (i) легко развивается, и (ii) для подготовки GVs требуется небольшой объем (2 кВ) выборки. Метод передачи капель20 для подготовки ГВ, содержащих бактериальные клетки, проще, чем классическая гидратация22 и методы микрофлюики17. Например, классический метод гидратации22 является простым и простым методом для подготовки ГВ, но эффективность инкапсуляции материалов в ГВ довольно низка и требуется не менее нескольких сотен микролитров образца. Недавно разработанный целлюлозы бумаги аферации гидратации23 и гель-помощь гидратации24 методы для изготовления GVs имеют высокую эффективность инкапсуляции биомолекул по сравнению с классическим методом гидратации22. Их эффективность инкапсуляции так же высока, как и техника передачи капель, и ожидается, что эти два метода могут позволить инкапсуляции клеток внутри GVs. Кроме того, метод микрофлюитики17 точно инкапсулирует одиночные клетки внутри ГВ и показывает очень высокую эффективность инкапсуляции материалов в ГВ, но требует сложной обработки и методов изготовления микроустройств и больших объем образца (по крайней мере несколько миллилитров) для потока трубки.

В этом протоколе, стабильность интерфейса масляно-воды имеет важное значение для получения ГВ, содержащих бактериальные клетки(Рисунок 1b (vii)). Для получения большого количества GVs необходимо сгладить интерфейс с масляной водой. Поэтому необходима надлежащая подготовка фазы масла. Мы sonicated фазы масла, по крайней мере 1 ч в мощной ультразвуковой ванне (120 Вт), чтобы полностью растворить липидные молекулы. Важно, чтобы слой фазы масла на внешнем ваквоме раствор сразу после sonication(Рисунок 1b (vii)).

Описанный здесь метод имеет два ограничения. Во-первых, GVs часто ломаются и бактериальные клетки просачиваются во внешнее вакационное решение. Это потому, что во время образования GV, некоторые W / O капель не может передавать через интерфейс нефти воды и стать разорван. Это неизбежно при использовании метода передачи капель20. Кроме того, GVs может сломаться во время наблюдения. Стабильность GVs должны быть улучшены, например, с помощью искусственного цитоскелета, который стабилизирует GVs25. Во-вторых, количество инкапсулированных бактериальных клеток не может быть идеально контролируется. Рисунок 4 показывает, что большое количество бактериальных клеток были инкапсулированы в ГВ, и, следовательно, трудно контролировать количество бактериальных клеток в ГВ с помощью метода передачи капель. Для управления номером ячейки можно использовать технологию микрофлюиды.

GVs может контролировать их внутреннее водное решение более эффективно, чем другие материалы (капли геля12,13 или W / O капель5,11). Например, ваковые условия внутренних и внешних растворов ГВ изменяются естественной мембранной проницаемостью26 или проницаемости, облегчаемыми мембранной порой16 или транспортером27. При нынешнем методе молекулы масла (минеральное масло в данном случае) остались в мембране20. Влияние масла, оставшегося в мембране, на проницаемость питательных веществ или кислорода для роста бактерий неизвестно. Хотя мы не знаем естественной мембраны проницаемость питательных веществ или кислорода, мы считаем, что количество питательных веществ или кислорода в среде роста было достаточно для роста бактерий в настоящем исследовании. Естественная мембранная проницаемость питательных веществ или кислорода очень важна для роста бактериальных клеток и является важной темой для будущего исследования. Техника контроля проницаемости не может быть проведена с использованием метода культуры с гелевой капли12,13 или W /O капель5,11. GVs таким образом будет первым выбором для применения бактериальной культуры в ограниченном космосе.

Наш метод бактериальной культуры является потенциально новой концепцией и инструментом в микробиологии19 культуры неизвестных экологических бактерий для получения или анализа их метаболических продуктов. Кроме того, наши бактериальные клетки, содержащие GVs являются гибридной системой искусственной модели клеток (ГВ) и живой клетки (бактериальные клетки), чтобы сделать новый инструмент для биотехнологии28 и снизу вверх синтетической биологии29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана ведущей инициативой для превосходных молодых исследователей (ЛИДЕР, No 16812285) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT) Японии, Грант-в-помощь для молодых ученых исследований (No 18K18157, 16K21034) от Японского общества содействия науке (JSPS) до M.M., и Грант-в-помощи от MEXT до K.K. (No 17H06417, 17H06413).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bactotryptone BD Biosciences 211705
Chloroform Wako Pure Chemicals 032-21921
Cover glass (18 × 18 mm) Matsunami Glass Ind. C018181 thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm) Matsunami Glass Ind. custom-order thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge Hi-Tech Co. ATT101 swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) Nitoms T4613
Glass vial AS ONE 6-306-01 Durham fermentation tube
Glucose Wako Pure Chemicals 049-31165
Inverted microscope Olympus IX-73
Methanol Wako Pure Chemicals 133-16771
Microscopic heating stage system TOKAI HIT TP-110R-100
Mineral oil Nacalai Tesque 23334-85
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610000
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Objective lens Olympus LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids 610005 pore size 100 nm
sCMOS camera Andor Zyla 4.2 plus
Sodium chloride Wako Pure Chemicals 191-01665
Sucrose Wako Pure Chemicals 196-00015
Ultrasonic bath AS ONE ASU-3D
Yeast extract BD Biosciences 212750
0.6 mL lidded plastic tube Watson 130-806C
1.5 mL lidded plastic tube Sumitomo Bakelite Co. MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline Avanti Polar Lipids 850457P POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids 880129P Biotin-PEG-DSPE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 146 культура бактериальных клеток одноклеточная культура гигантские пузырьки метод передачи капель инкубатор на основе искусственных клеток микробиология
Бактериальная культура клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morita, M., Ota, Y., Katoh, K.,… More

Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter