Summary
Dimostriamo la coltura unicellulare di batteri all'interno di vescicoli giganti (GV). I GV contenenti cellule batteriche sono stati preparati con il metodo di trasferimento delle goccioline e sono stati immobilizzati su una membrana sostenuta su un substrato di vetro per l'osservazione diretta della crescita batterica. Questo approccio può anche essere adattabile ad altre cellule.
Abstract
Abbiamo sviluppato un metodo per coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicole giganti (GV). La coltura delle cellule batteriche è importante per comprendere la funzione delle cellule batteriche nell'ambiente naturale. A causa dei progressi tecnologici, varie funzioni delle cellule batteriche possono essere rivelate a livello di singola cellula all'interno di uno spazio confinato. I GV sono compartimenti sferici di micro-dimensioni composti da molecole lipidiche anfifili e possono contenere vari materiali, comprese le cellule. In questo studio, una singola cellula batterica è stata incapsulata in 10-30 GV con il metodo di trasferimento delle goccioline e i Env contenenti cellule batteriche sono stati immobilizzati su una membrana supportata su un substrato di vetro. Il nostro metodo è utile per osservare la crescita in tempo reale di singoli batteri all'interno dei GV. Abbiamo coltivato cellule di Escherichia coli (E. coli) come modello all'interno di GV, ma questo metodo può essere adattato ad altri tipi di cellule. Il nostro metodo può essere utilizzato nei campi scientifici e industriali della microbiologia, della biologia, della biotecnologia e della biologia sintetica.
Introduction
La coltura delle cellule batteriche a livello di singola cellula ha ricevuto una crescente attenzione. Coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di uno spazio ristretto può chiarire le funzioni batteriche come la variabilità fenotipica1,2,3,4, il comportamento cellulare5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9, e resistenza agli antibiotici10,11. A causa dei recenti progressi nelle tecniche di coltura, la coltura di singoli batteri può essere raggiunta all'interno di uno spazio confinato, come in un pozzo4,7,8, goccia di gel12,13 e gocciolatore acqua in olio (W/O)5,11. Per promuovere la comprensione o l'utilizzo di singole cellule batteriche, sono necessari ulteriori sviluppi tecnici delle tecniche di coltivazione.
Le vescicole che imitano la membrana cellulare biologica sono compartimenti sferici costituiti da molecole anfifile e possono contenere vari materiali. Le vesciche sono classificate in base alle dimensioni e includono piccole vesciche (SV, diametro < 100 nm), grandi vescicle (LV, <1 m) e vescicle giganti (GV, >1 m). SV o LV sono comunemente utilizzati come portatori di droga a causa della loro affinità con la membrana cellulare biologica14. I GV sono stati utilizzati anche come sistema di reattori per la costruzione di protocelle15 o cellule artificiali16. L'incapsulamento di cellule biologiche in GV è stato segnalato17,18, e quindi i GV mostrano il potenziale come sistema di coltura cellulare quando combinati con il sistema del reattore.
Qui, insieme a un video di procedure sperimentali, descriviamo come i GV possono essere utilizzati come nuovi vasi di coltura cellulare19. I GV contenenti batteri sono stati realizzati con il metodo di trasferimento delle goccioline20 e sono stati poi immobilizzati su una membrana supportata su un vetro di copertura. Abbiamo usato questo sistema per osservare la crescita batterica a livello di singola cellula all'interno dei GV in tempo reale.
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Protocol
1. Preparazione di GV contenenti cellule batteriche con il metodo di trasferimento goccia
- Preparare soluzioni di riserva lipididiche di 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in cloroformio/ soluzione di metanolo (2/1, v/v) e conservare il brodo a -20 gradi centigradi.
- Preparazione di una soluzione di olio contenente lipidi
- Versare in un tubo di vetro 20 - L della soluzione POPC e 4 -L della soluzione biotina-PEG-DSPE (Figura1b (i)).
- Evaporare il solvente organico per flusso d'aria per formare una pellicola lipida e posizionare la pellicola in un desiccatore per 1 h per far evaporare completamente il solvente organico (Figura1b (ii)).
NOT: È necessario far evaporare il solvente organico in un cappuccio fumatore. - Aggiungere alla fiala del vetro 200 - L di olio minerale (0,84 g/mL, tabella deimateriali) alla fiala di vetro (Figura 1b (iii)).
- Avvolgere la parte iniziale della fiala di vetro con pellicola e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni (120 W) per almeno 1 h (Figura1b iii )). Le concentrazioni finali di POPC e biotina-PEG-DSPE sono rispettivamente di 1 mM e 0,002 mM.
- Pre-coltura di cellule batteriche
- Inoculare E. coli in 1x LB medio (1 g di estratto di lievito, 2 g di bacto tryptone, e 2 g di cloruro di sodio in 200 mL di acqua deionizzata) da una piastra LB e incubare a 37 gradi centigradi per 12-14 h (peruna pernotata).
- Dopo l'incubazione, raccogliere 20 l della soluzione di coltura e trasferire a 1,98 mL di mezzo fresco 1x LB, e ricolturare le cellule per 2 h.
- Controllare la densità ottica a 600 nm (OD600) valore della soluzione di pre-coltura (preparata nel passaggio 1.3.2). Deve essere utilizzata una soluzione pre-cultura di OD600 - 1,0 – 1,5.
- Preparazione delle soluzioni acquose esterne e interne dei GV
- Sciogliere il glucosio in 1x lB medio per preparare una soluzione acquosa esterna di GV. Preparare 20 mL di una soluzione di glucosio a scorta (500 mM).
- Diluire la soluzione di glucosio stock con 1x LB medio a 200 mM (Tabella 1).
- Sciogliere il saccarosio in 1 x lb medio per preparare una soluzione acquosa interna di GV. Preparare 20 mL di una soluzione di saccarosio di riserva (500 mM).
- Mescolare la soluzione di pre-coltura (OD600 - 1,0–1,5), la soluzione di saccarosio (500 mM) e il supporto 1x LB (tabella1). Il valore finale oD600 della soluzione di coltura deve essere 0,01–0,015 e la concentrazione finale di saccarosio dovrebbe essere 200 mM.
NOT: Fare attenzione a evitare la pressione osmotica. È necessario bilanciare la concentrazione tra la soluzione acquosa interna ed esterna.
- Preparazione di goccioline acqua-in-olio (W/O) contenenti cellule batteriche
- Aggiungete 2 -L della soluzione acquosa interna dei GV (preparati al punto 1.4.4) a 50 -L della soluzione di olio contenente lipidi (olio minerale con POPC e biotina-PEG-DSPE) in un tubo di plastica laidded da 0,6 mL (Figura1b (iv)).
- Emulsionare i due componenti nel tubo di plastica toccando il tubo a mano (Figura1b (v)).
- Formazione di GV contenenti cellule batteriche
- Aggiungere 50 l di soluzione esterna abossesy dei GV (preparati al punto 1.4.2) in un tubo di plastica con coperchio da 1,5 ml (Figura1b (vi)) e strato delicatamente 150 l della soluzione ad olio contenente lipidi (olio con POPC e biotina-PEG-DSPE) sulla superficie dell'esterno acquoso (Figura1b (vii)). Incubare questo campione a temperatura ambiente (RT, 25 gradi centigradi) per 10-15 min. Verificare che l'interfaccia dell'olio e le soluzioni acquose siano piatte.
- Aggiungere 50 l della soluzione di gocciolina W/O (preparata al punto 1.5.2) sull'interfaccia dell'olio e soluzione acquosa utilizzando una pipetta (Figura1b (viii)).
- Centrifugare il tubo di plastica coperchiato 1,5 mL (dal punto 1.6.2) per 10 min a 1.600 x g a RT in una centrifuga desktop (Figura 1b (ix)). Dopo la centrifuga, aspirare l'olio (strato superiore) dal tubo di plastica scartato da 1,5 ml usando una pipetta e raccogliere i GV contenenti cellule batteriche (Figura 1b (x)).
2. Preparazione di un sistema di osservazione GV (sistema di coltura cellulare batterica)
-
Preparazione di piccole vesciche (SV) per constructi ng a membrana bistrato supportato
- Versare in un tubo di vetro 20 - L della soluzione POPC e 4 -L della soluzione biotina-PEG-DSPE (utilizzando la stessa composizione lipidica utilizzata per la preparazione del GV nel passaggio 1.1).
- Evaporare il solvente organico per flusso d'aria per formare una pellicola lipida e mettere questo campione in un desiccatore per 1 h per far evaporare completamente il solvente organico.
- Aggiungere alla fiala di vetro 200 ml di glucosio 200 mM nel mezzo 1x LB (la soluzione acquosa esterna dei gV).
- Avvolgere la parte iniziale della fiala di vetro con pellicola e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni (120 W) per almeno 1 h.
- Preparare gli SV con il metodo di estrusione21 utilizzando una membrana mini-estrusore e policarbonato con dimensioni dei pori di 100 nm.
-
Preparazione di una camera fatta a mano
- Forare un foro di 7 mm con un punzone cavo su una guarnizione a doppia faccia (10 mm x 10 mm x 1 mm).
- Incollare la guarizione bifronte con il foro su un vetro di copertura (30 mm x 40 mm, spessore 0,25–0,35 mm).
-
Preparazione di una membrana bistrato supportata sul vetro di copertura nel foro della camera
- Aggiungere 30 l della soluzione SV al foro della camera (preparato nella sezione 2.2) e incubare RT per 30 min.
- Lavare delicatamente il foro due volte con 20 x L di 1x lB medio contenente 200 m di glucosio (la soluzione esterna acquosa dei GV) mediante pipettaggio.
-
Immobilizzazione dei membrana bistrato supportato sul vetro di copertura nel foro della camera
- Introduci 10 L di neutravidina con la soluzione aquessa esterna dei GV (1 mg/mL) nel foro e incuba a RT per 15 min.
- Lavare delicatamente il foro due volte con 20 x L di 1x lB medio contenente 200 m di glucosio (la soluzione esterna acquosa dei GV) mediante pipettaggio.
- Aggiungere tutta la soluzione contenente i GV (preparati al punto 1.6.3) nel foro della camera e sigillare con un vetro di copertura (18 mm x 18 mm, spessore 0,13–0,17 mm) (Figura 2b).
-
Osservazione microscopica della crescita delle cellule batteriche all'interno dei GV
- Impostare un microscopico sistema di fase di riscaldamento con un microscopio invertito dotato di un obiettivo ad apertura numerica 40x/0.6 (NA) con una lunga distanza di lavoro (Figura 2b).
- Posizionare la camera sul sistema di fase di riscaldamento microscopico (Figura 2b). Incubare i GV contenenti cellule batteriche nella camera in una condizione statica per 6 h a 37 .
- Cattura e registra immagini al microscopio della crescita delle cellule batteriche all'interno di GV ogni 30 min utilizzando una telecamera scientifica a semiconduttore di ossido di metallo complementare (sCMOS).
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Representative Results
Presentiamo un metodo semplice per generare GV contenenti singole cellule batteriche utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole (Figura 1). La figura 1a mostra un'immagine schematica della precipitazione di GV contenenti batteri. Le goccioline W/O contenenti batteri vengono trasferite attraverso l'interfaccia olio-acqua (strato di lipidi) dalla centrifugazione per formare i GV. La differenza di densità tra il saccarosio (soluzione acquosa interna) e il glucosio (soluzione esterna attiva) aiuta anche l'incrocio dell'interfaccia olio-acqua delle goccioline W/O. È necessario monitorare la pressione osmotica nella soluzione acquosa interna ed esterna perché una leggera differenza di concentrazione tra queste soluzioni può indurre deformazioni e collasso di Uv. Un diagramma di flusso per la preparazione di GV contenenti celle batteriche con il metodo di trasferimento delle gocciole è illustrato nella Figura 1b. Seguendo questa procedura, i GV contenenti singole cellule batteriche possono essere facilmente ottenuti.
Per osservare la crescita delle cellule batteriche all'interno dei GV, è stato costruito un sistema di coltura originale per l'osservazione microscopica (Figura 2). I GV contenenti batteri sono stati immobilizzati su una superficie di membrana sostenuta rivestita di neutravidina su un vetro di copertura (Figura 2a). Questa tecnica di immobilizzazione ha permesso un'osservazione prolungata dei GM.
Le immagini di microscopia a contrasto di fase tipiche dei GV di dimensioni diverse contenenti singole cellule batteriche sono mostrate nella Figura 3. In questo esperimento, abbiamo anche ottenuto GV contenenti cellule batteriche con dimensioni che vanno da 10 m a 30 m. La figura 3 mostra la crescita batterica a livello di singola cellula all'interno di GV con dimensioni diverse di 10,7 m (Figura 3a) e 28 m (Figura 3b). Per entrambe le dimensioni dei GM, le cellule e. coli hanno subito processi di allungamento e divisione, con una o due cellule E. coli che crescono fino a un numero molto elevato di cellule superiori a 6 h. Così, le cellule E. coli sono cresciute stabilmente all'interno dei GV.
La frequenza relativa dei GM contenenti un determinato numero di cellule batteriche è illustrata nella Figura 4. Nella nostra condizione sperimentale (OD600 - 0,01–0,015), le cellule batteriche sono state incapsulate a livello di singola cellula in circa il 10% dei Env ottenuti (i GV vuoti erano circa l'80%). I GV incapsulati a livello di singola cellula erano circa il 50% dei GV contenenti cellule batteriche, come stimato dall'insetto della Figura 4.
Figura 1: Procedure sperimentali di GV contenenti batteri. (a) Schema di GV contenenti batteri preparati con un metodo di trasferimento di goccioline. Le microgocciole W/O contenenti batteri passano attraverso un'interfaccia a monostrato lipidico con la forza centrifuga e quindi formano una membrana bistrato lipidica. (b) Flusso della sintesi di GV contenenti batteri. (i) Solvente organico contenente lipidi (POPC e biotina-PEG-DSPE, 100:0.2 rapporto molare). (ii) Pellicola a ibiale nella parte inferiore della fiala di vetro. (iii) Soluzione ad olio contenente lipidi. (iv) Miscela di 50 l di soluzione olio e 2 l'l di soluzione acquosa interna (200 mm di saccarosio e 1x lB medio) contenente cellule batteriche. (v) Emulsione toccando a mano (oltre 50 volte). (vi) 50 l della soluzione acquosa esterna (200 mm di glucosio in 1x lB medio). (vii) Stratificazione di 150 l di soluzione di olio sulla soluzione acquosa esterna. (viii) Stratificazione della soluzione di gocciolina W/O. (ix) Centrifugazione del tubo. (x) GV precipitati contenenti cellule batteriche dopo l'aspirazione dell'olio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La sistema di bservation di coltura delle cellule batteriche all'interno di GV. (a) I GV sono immobilizzati su una membrana sostenuta attraverso il legame biotina-neutravidina sul vetro di copertura. I GV sono incubati da un sistema di riscaldamento. (b) Immagine del sistema di osservazione che comprende una camera fatta a mano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini al microscopio a contrasto di fase di GV contenenti singole cellule batteriche (indicate dalle frecce nere). Scatti a scatto della crescita delle cellulebatteriche all'interno di GV di dimensioni diverse. (b) Dimensioni del vescicolo: 28 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi statistica del numero di cellule batteriche incapsulate per GV. Le frequenze relative dei GV sono state tracciate come istogrammi. Inset: Ingrandimento delle frequenze relative dei GV contenenti cellule batteriche da cellule singole a 10<. Un totale di 235 GV sono stati analizzati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione esterna | Soluzione interna acquosa | ultimo | |
| 500 mM Glucosio con LB medio | 200 l | – | 200mm |
| 500 mM di saccarosio con lb medio | – | 200 l | 200mm |
| 1x LB medio | 300 lL | 295 -L | – |
| Soluzione di pre-coltura (OD600 - 1,0–1,5) | – | 5 ll | OD600 - 0,01–0,015 |
| Volume totale | 500 lL | 500 lL |
Tabella 1: La composizione e i volumi delle soluzioni acquose esterne e interne dei GV.
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Discussion
Qui, descriviamo un metodo per coltivare le cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno dei GV. Questo semplice metodo prevede la formazione di GV contenenti cellule batteriche a livello di singola cellula utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole. Rispetto ad altri approcci per ottenere GV contenenti cellule batteriche, questo metodo presenta due vantaggi: (i) è facile da sviluppare e (ii) è necessario un piccolo volume (2 -L) della soluzione campione per preparare i GV. Il metodo di trasferimento delle goccioline20 per la preparazione di GV contenenti cellule batteriche è più semplice rispetto ai metodi classici di idratazione22 e microfluidica17. Ad esempio, il metodo di idratazione classico22 è un metodo semplice e semplice per la preparazione dei GV, ma l'efficienza di incapsulamento dei materiali nei gV è piuttosto bassa e sono necessarie almeno poche centinaia di microlitri di campione. La cellulosa di carta-abetted23 recentemente sviluppato e i metodi di idratazione assistita da gel24 per fare GVs hanno un'elevata efficienza di incapsulamento delle biomolecole rispetto al metodo di idratazione classico22. La loro efficienza di incapsulamento è alta quanto quella della tecnica di trasferimento delle goccioline, e si prevede che questi due metodi possano consentire l'incapsulamento delle cellule all'interno dei GV. Inoltre, il metodo di microfluidica17 incapsula accuratamente singole celle all'interno dei GV e mostra un'elevata efficienza di incapsulamento dei materiali nei GV, ma richiede una gestione e tecniche complicate per la fabbricazione di microdispositivi e un volume del campione (almeno alcuni millilitri) per far scorrere il tubo.
In questo protocollo, la stabilità dell'interfaccia olio-acqua è importante per ottenere GV contenenti cellule batteriche (Figura1b (vii)). Per ottenere molti GV, è essenziale appiattire l'interfaccia olio-acqua. Pertanto, è necessaria una corretta preparazione della fase dell'olio. Abbiamo sonicato la fase dell'olio per almeno 1 h in un bagno ultrasonico ad alta potenza (120 W) per sciogliere completamente le molecole lipidiche. È importante sovrapporre la fase dell'olio sulla soluzione acquosa esterna immediatamente successiva alla sonicazione (Figura 1b (vii)).
Il metodo qui descritto presenta due limitazioni. In primo luogo, i GV spesso si rompono e le cellule batteriche fuoriescono nella soluzione acquosa esterna. Questo perché durante la formazione di GV, alcune goccioline W/O non possono trasferire attraverso l'interfaccia olio-acqua e si sono rotte. Ciò è inevitabile quando si utilizza il metodo di trasferimento gocciolante20. Inoltre, i GM potrebbero rompersi durante l'osservazione. La stabilità delle GV deve essere migliorata, ad esempio utilizzando un citoscheletro artificiale che stabilizza i GV25. In secondo luogo, il numero di cellule batteriche incapsulate non può essere perfettamente controllato. La figura 4 mostra che un gran numero di cellule batteriche sono state incapsulate nei GV, e quindi è difficile controllare il numero di cellule batteriche nei GV utilizzando il metodo di trasferimento delle goccioline. Per controllare il numero di cellulare, è possibile utilizzare la tecnologia microfluidica.
I GV possono controllare la loro soluzione acquosa interna in modo più efficace rispetto ad altri materiali (goccioline di gel12,13 o goccioline W/O5,11). Ad esempio, le condizioni acquose delle soluzioni interne ed esterne dei GV sono alterate dalla permeabilità naturale della membrana26 o dalla permeabilità facilitata da un poro di membrana16 o da un trasportatore27. Nel metodo attuale, le molecole di olio (olio minerale in questo caso) sono rimaste nella membrana20. L'influenza dell'olio rimasto nella membrana sulla permeabilità dei nutrienti o dell'ossigeno per la crescita batterica è sconosciuta. Anche se non conosciamo la permeabilità naturale della membrana di nutrienti o ossigeno, riteniamo che la quantità di nutrienti o ossigeno nel mezzo di crescita era sufficiente per la crescita batterica nel presente studio. La permeabilità naturale della membrana di nutrienti o ossigeno è molto importante per la crescita delle cellule batteriche ed è un argomento importante per lo studio futuro. La tecnica di controllo della permeabilità non può essere condotta utilizzando il metodo della coltura con goccioline di gel12,13 o goccioline W/O5,11. I GV diventeranno così la prima scelta per le applicazioni della coltura batterica in uno spazio ristretto.
Il nostro metodo di coltura batterica è un concetto potenzialmente nuovo e strumento in microbiologia19 a coltura batteri ambientali sconosciuti per ottenere o analizzare i loro prodotti metabolici. Inoltre, i nostri GV contenenti cellule batteriche sono un sistema ibrido di un modello di cellule artificiali (GV) e una cellula vivente (cellule batteriche) per creare un nuovo strumento per la biotecnologia28 e biologia sintetica dal basso verso l'alto29.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un'iniziativa leader per eccellenti giovani ricercatori (LEADER, n. 16812285) del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) del Giappone, un Grant-in-Aid per la ricerca sui giovani scienziati (n. 18K18157, 16K21034) dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) a M.M., e Grant-in-Aid da MEXT a K.K. (n. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al.
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al.
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L.
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
