Summary
我们演示了巨型囊泡 (GV) 内的细菌的单细胞培养。含有细菌细胞的GV通过滴转移方法制备,固定在玻璃基板上的支撑膜上,直接观察细菌生长。这种方法也可以适应其他细胞。
Abstract
我们开发了一种在巨囊(GVs)内单细胞水平上培养细菌细胞的方法。细菌细胞培养对于了解细菌细胞在自然环境中的功能非常重要。由于技术的进步,各种细菌细胞功能可以在密闭空间内的单细胞水平上显现出来。GV是由两栖脂质分子组成的球形微尺寸隔间,可以容纳各种材料,包括细胞。在这项研究中,通过滴移送法将单个细菌细胞封装到10~30μm的GV中,含有细菌细胞的GV被固定在玻璃基板上的支撑膜上。我们的方法对于观察GV内部单细菌的实时生长非常有用。我们培养大肠杆菌(大肠杆菌) 细胞作为 GV 内的模型,但这种方法可以适应其他细胞类型。我们的方法可用于微生物学、生物学、生物技术和合成生物学的科学和工业领域。
Introduction
单细胞培养受到越来越多的关注。在密闭空间内的单细胞水平上培养细菌细胞可以阐明细菌功能,如型皮变异性1,2,3,4,细胞行为5,6,7,8,9,和抗生素耐药性10,11。由于培养技术的最新进展,单细菌的培养可以在密闭的空间内实现,如在井芯片4,7,8,凝胶滴12,13,和油中水(W/O)滴5,11 。为了促进对单一细菌细胞的了解或利用,需要进一步的技术发展栽培技术。
模仿生物细胞膜的囊泡是由两栖分子组成的球形隔间,可以容纳各种材料。囊泡根据大小进行分类,包括小囊泡(SV,直径<100nm)、大囊泡(LV,<1 μm)和巨型囊泡(GV,>1 μm)。SV或LV通常用作药物载体,因为它们与生物细胞膜14的亲和力。GV还被用作用于建造原细胞15或人工细胞16的反应堆系统。据报道,生物细胞封装到GV中已有17、18种,因此,当与反应器系统结合时,GV显示出细胞培养系统的潜力。
在这里,连同实验程序的视频,我们描述了如何GV可以用作新型细胞培养容器19。含有细菌的GV由滴转移方法20制成,然后固定在盖玻璃上的支撑膜上。我们使用该系统实时观察GV内单细胞水平的细菌生长。
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Protocol
1. 通过滴转移方法制备含有细菌细胞的GV
- 制备1-棕榈基-2-醇-sn-甘油-3磷胆碱(POPC, 10 mM, 1 mL) 和 1,2-distearoyl-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-生物素(聚乙烯乙二醇)-2000] (生物素-PEG-DSPE,0.1 mM,1 mL)氯仿/甲醇溶液(2/1,v/v),并将库存储存在-20°C。
- 制备含脂油溶液
- 将 20 μL 的 POPC 溶液和 4 μL 的生物素-PEG-DSPE 溶液倒入玻璃管中(图 1b (i))。
- 通过气流蒸发有机溶剂,形成脂质膜,并将薄膜放入干燥器中 1 小时,以完全蒸发有机溶剂(图 1b (ii))。
注:有必要将有机溶剂蒸发在烟气罩中。 - 在玻璃瓶中加入 200 μL 矿物油(0.84 g/mL,材料表)(图 1b (iii))。
- 用薄膜包裹玻璃瓶的开口部分,并在超声波浴(120 W)中声波至少1小时(图1b(iii))。POPC和生物素-PEG-DSPE的最终浓度分别为1 mMM和0.002 mM。
- 细菌细胞的预培养
- 将大肠杆菌接种到1x LB培养基(1 g酵母提取物,2克βptone,2 g氯化钠在200 mL的去离子水中),并在37°C孵育12-14小时(过夜)。
- 孵育后,收集20μL的培养溶液,并转移到1.98 mL的新鲜1倍LB培养基,并再次培养细胞2小时。
- 检查预培养溶液(步骤 1.3.2 中准备)的 600 nm (OD600)值的光学密度。应使用 OD600 = 1.0±1.5 的预培养溶液。
- GV 的外层和内部水溶液的准备
- 将葡萄糖溶解在1xLB培养基中,制备GV的外水溶液。制备20 mL的库存葡萄糖溶液(500 mM)。
- 用1倍LB培养基至200 mM稀释库存葡萄糖溶液(表1)。
- 将蔗糖溶解在1xLB介质中,制备GV的内部水溶液。制备20 mL的库存蔗糖溶液(500 mM)。
- 混合预培养溶液(OD600 = 1.0±1.5)、蔗糖溶液(500 mM)和1xLB介质(表1)。培养液的最终 OD600值应为 0.01~0.015,最终蔗糖浓度应为 200 mM。
注:注意避免渗透压力。有必要平衡内水溶液和外水溶液之间的浓度。
- 制备含细菌细胞的油水(W/O)液滴
- 在 0.6 mL 的贴盖塑料管中加入 2 μL 的 GV 内水溶液(在步骤 1.4.4 中制备)至 50 μL 的含脂脂油溶液(含有 POPC 和生物素-PEG-DSPE 的矿物油)中(图 1b (iv))。
- 用手敲击管,使塑料管中的两个部件乳化(图1b(v))。
- 含有细菌细胞的GV的形成
- 在1.5 mL的带盖塑料管中加入50 μL的GV外水溶液(步骤1.4.2中制备),在外水表面轻轻层150μL含有脂质的油溶液(含有POPC和生物素-PEG-DSPE的矿物油)解决方案(图1b(vii))。在室温(RT,25°C)下孵育该样品10-15分钟。
- 使用移液器在油和水溶液的界面上添加 50 μL 的 W/O 液滴溶液(步骤 1.5.2 中准备)。
- 在台式离心机的RT下,将1.5 mL的带盖塑料管(从步骤1.6.2)离心10分钟,在RT处工作10分钟(图1b(ix))。 离心后,使用移液器从1.5mL的压接塑料管中吸出油(顶层),并收集含有细菌细胞的GV(图1b(x)。)。
2. GV观察系统(细菌细胞培养系统)的制备
-
为构造基准备小囊泡 (SV)ng a支持的双层膜
- 将 20 μL 的 POPC 溶液和 4 μL 的生物素-PEG-DSPE 溶液倒入玻璃管中(使用与步骤 1.1 中用于 GV 制剂的脂质组合物相同)。
- 通过气流蒸发有机溶剂,形成脂质膜,并将样品放入干燥器中1小时,以完全蒸发有机溶剂。
- 在 1x LB 培养基(GV 的外部水溶液)中加入 200 μL 的 200 mM 葡萄糖到玻璃瓶中。
- 用薄膜包裹玻璃瓶的开口部分,并在超声波浴(120 W)中声波至少1小时。
- 使用具有 100 nm 孔径的微型挤出机和聚碳酸酯膜使用挤出方法21制备 SV。
-
手工造型室的准备
- 在双面密封件上用空心冲孔钻出 7 mm 孔(10 mm x 10 mm x 1 mm)。
- 将双面密封件与孔粘贴在盖玻璃上(30 mm x 40 mm,厚度 0.25×0.35 毫米)。
-
在造型室孔的盖玻璃上制备支撑的双层膜
- 将 30 μL 的 SV 溶液添加到腔室的孔中(在第 2.2 节中准备),并在 RT 下孵育 30 分钟。
- 通过移液,用含有 200 mM 葡萄糖(GV 的外部水溶液)的 20 μL 1x LB 培养基轻轻清洗孔。
-
在在腔室孔的盖玻璃上支撑双层膜
- 将10μL的中性球素与GV的外水溶液(1mg/mL)引入孔中,并在RT下孵育15分钟。
- 通过移液,用含有 200 mM 葡萄糖(GV 的外部水溶液)的 20 μL 1x LB 培养基轻轻清洗孔。
- 将包含 GV 的所有溶液(在步骤 1.6.3 中制备)添加到造型室的孔中,并盖玻璃(18 mm x 18 mm,厚度 0.13×0.17 mm)密封(图 2b)。
-
GV内部细菌细胞生长的微观观察
- 设置一个微型加热级系统,倒置显微镜配备40x/0.6数值孔径(NA)具有长工作距离的物镜(图2b)。
- 将造型室放在显微加热级系统上(图2b)。在37°C下,在静静条件下孵育含有细菌细胞的GV。
- 使用科学互补金属氧化物半导体 (sCMOS) 摄像机,每 30 分钟捕获并记录一次 GV 内的细菌细胞生长显微镜图像。
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Representative Results
我们提出了一种使用滴转移法生成包含单个细菌细胞的GV的简单方法(图1)。图1a显示了含有细菌的GV降水的示意图。含有细菌的W/O液滴通过离心在油水(脂单层)界面上传递,形成GV。蔗糖(内部水溶液)和葡萄糖(外水溶液)之间的密度差异也有助于跨越W/O液滴的油水界面。有必要监测内水溶液和外水溶液中的渗透压力,因为这些溶液之间的浓度稍有差异会导致GV变形和坍塌。图1b显示了通过滴转移方法制备含有细菌细胞的GV的流程图。通过遵循此程序,可以轻松获得包含单个细菌细胞的 GV。
为了观察GV内的细菌细胞生长,构建了一个用于微观观察的原始培养系统(图2)。含有细菌的GV被固定在覆盖玻璃上涂有中性球蛋白的支撑膜表面(图2a)。这种固定技术能够长期观察GV。
包含单个细菌细胞的不同尺寸的GV的典型相对比显微镜图像如图3所示。在本实验中,我们还获得了含有10μm至30μm的细菌细胞的GV。图3显示了不同尺寸为10.7 μm(图3a)和28 μm(图3b)的GV内单细胞水平的细菌生长。对于两种尺寸的GV,大肠杆菌细胞都经历了伸长和分裂过程,一个或两个大肠杆菌细胞在6小时以上增长到非常大量的细胞。因此,大肠杆菌细胞在GV内部生长。
包含给定数量细菌细胞的GV的相对频率如图4所示。在我们的实验条件下(OD600 = 0.01–0.015),细菌细胞在大约10%的获得的GV(空的GV约为80%)中封装在单细胞水平上。根据图4的录下估计,封装在单细胞水平上的GV大约是含有细菌细胞的GV的50%。
图1:含有细菌的GV的实验程序。(a) 含有细菌的GV方案,采用滴滴转移方法制备。含有细菌的W/O微滴通过离心力穿过脂质单层界面,然后形成脂质双层膜。(b) 含有细菌的GV合成的流量。(i) 含有脂质的有机溶剂(持久性有机污染物和生物素-PEG-DSPE,100:0.2摩尔比)。(ii) 玻璃瓶底部的脂膜。(三) 含有脂质的油溶液。(iv) 含有细菌细胞的50μL油溶液和2μL内水溶液(200mM蔗糖和1xLB培养基)的混合物。(五) 用手敲击乳化(超过50次)。(vi) 50 μL 的外水溶液(1x LB 培养基中 200 mM 葡萄糖)。(vii) 在外水溶液上分层150μL的油溶液。(八) W/O 液滴溶液的分层。(九) 管的离心。(x) 吸入油后含有细菌细胞的沉淀的GV。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:oGV内部细菌细胞培养的培养系统。(a) 通过生物素和神经素结合在盖玻璃上,将GV固定在支撑膜上.GV由加热系统孵育。(b) 观察系统的图片,包括一个手工制作的室。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:含有单细菌细胞的GV的相对比显微镜图像(由黑色箭头表示)。不同尺寸的GV内的细菌细胞生长的快照. (a) 囊泡大小 = 10.7 μm.(b) 囊泡尺寸 = 28 μm.请点击此处查看此图的较大版本。
图4:每GV封装细菌细胞数量的统计分析。GV的相对频率绘制为直方图。内落:包含细菌细胞的GV相对频率从单个细胞放大到10<细胞。共分析了235台GV。请点击此处查看此图的较大版本。
| 外水溶液 | 内部水溶液 | 最后 | |
| 500 mM 葡萄糖,带 LB 培养基 | 200 μL | – | 200 mM |
| 500 mM 蔗糖,带 LB 介质 | – | 200 μL | 200 mM |
| 1x LB 介质 | 300 μL | 295 μL | – |
| 预培养解决方案(OD600 = 1.0±1.5) | – | 5 μL | OD600 = 0.01±0.015 |
| 总体积 | 500 μL | 500 μL |
表1:GV的外层和内水溶液的组成和体积。
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Discussion
在这里,我们描述了一种在GV内单细胞水平上培养细菌细胞的方法。这个简单的方法涉及使用液滴转移方法在单细胞水平上形成含有细菌细胞的GV。与获得含有细菌细胞的GV的其他方法相比,这种方法有两个优点:(i)易于开发,(ii)制备GV需要小体积(2μL)样品溶液。用于制备含有细菌细胞的GV的液滴转移方法20比传统的水化22和微流体方法17简单。例如,经典的水化方法22是制备GV的一种简单易行的方法,但材料在GV中的封装效率相当低,至少需要几百微升样品。与传统的水化方法22相比,最近研制的纤维素纸化补水23和凝胶辅助补水24种方法使GV具有较高的生物分子封装效率。它们的封装效率与滴转移技术一样高,预计这两种方法可以允许将细胞封装在GV内。此外,微流体方法17准确地封装了GV内的单个细胞,并显示出将材料封装到GV中的非常高的封装效率,但需要复杂的处理和技术来制造微器件和大型样品体积(至少几毫升)流管。
在此协议中,油水界面的稳定性对于获得含有细菌细胞的GV非常重要(图1b(vii)。图1b(vii)。图。为了获得许多GV,必须平整油水接口。因此,需要适当准备油相。我们在大功率超声波浴(120 W)中声波油相至少1小时,以完全溶解脂质分子。在声波后立即将油相分层到外水溶液上非常重要(图1b(vii))。
此处描述的方法有两个限制。首先,GV经常破裂,细菌细胞泄漏到外部水溶液中。这是因为在GV形成期间,一些W/O液滴无法通过油水界面转移并破裂。当使用滴转移方法20时,这是不可避免的。此外,GV 在观察过程中可能会中断。必须提高GV的稳定性,例如使用能够稳定GV25的人工细胞骨架。其次,封装的细菌细胞的数量不能完全控制。图4显示,大量细菌细胞被封装在GV中,因此,很难使用滴转移方法控制GV中的细菌细胞数量。为了控制细胞数量,可以使用微流体技术。
与其他材料(凝胶液滴12、13或W/O液滴5、11)相比,GV可以更有效地控制其内部水溶液。例如,由于自然膜渗透性26或透膜率(由膜孔16或运输机27)促进,GV的内部和外部溶液的孔条件被改变。在目前的方法中,油分子(本例中为矿物油)留在膜20中。膜中残留的油对细菌生长的营养物质或氧气的渗透性的影响是未知的。尽管我们不知道营养物质或氧气的自然膜渗透性,但我们认为,在本研究中,生长培养基中的营养物质或氧气量足以促进细菌生长。营养物质或氧气的自然膜渗透性对细菌细胞生长非常重要,是今后研究的重要课题。控制渗透性的技术不能使用凝胶液滴12、13或W/O液滴5、11的培养方法进行。因此,GV 将成为在密闭空间内细菌培养应用的首选。
我们的细菌培养方法是微生物学中一个潜在的新概念和工具,用于培养未知的环境细菌,用于获取或分析其代谢产物。此外,我们的细菌细胞包含的GV是一个混合系统,一个人工细胞模型(GVs)和一个活细胞(细菌细胞),为生物技术28和自下而上的合成生物学29制造一个新的工具。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部(MEXT)的"优秀青年研究人员领导倡议"(LEADER,第16812285号)的支持,这是青年科学家研究资助(第18K18157,16K21034号)从日本科学促进会(JSPS)到M.M.,从MEXT到K.K.(第17H06417号,17H06413号)提供助学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al.
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al.
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L.
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
