我々は、巨大な小胞(GV)内の細菌の単細胞培養を実証する。細菌細胞を含むGVは液滴転写法により調製し、ガラス基板上の支持膜上に固定化し、細菌増殖を直接観察した。このアプローチは、他の細胞にも適応可能である。
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この記事について
サマリー
要約
我々は、巨大小胞(GV)内の単細胞レベルで細菌細胞を培養する方法を開発した。細菌細胞培養は、自然環境における細菌細胞の機能を理解するために重要である。技術の進歩により、限られた空間内の単細胞レベルで様々な細菌細胞機能が明らかになります。GVは、親和性脂質分子からなる球状の微小サイズのコンパートメントで、細胞を含む様々な材料を保持することができます。本研究では、液滴転写法により10~30μm GVに単一の細菌細胞を封入し、細菌細胞を含むGVをガラス基板上の支持膜上に固定化した。本手法は、GV内の単一細菌のリアルタイム増殖を観察するのに有用である。大腸菌(大腸菌)細胞をGV内のモデルとして培養したが、この方法は他の細胞型に適応できる。微生物学、生物学、バイオテクノロジー、合成生物学の科学・産業分野で活用できます。
概要
単細胞レベルでの細菌細胞の培養が注目を集めています。限られた空間内の単細胞レベルで細菌細胞を培養すると、表現型変動性1、2、3、4、細胞挙動5などの細菌機能を解明できる。6,7,8,9、および抗生物質耐性10、11。近年の培養技術の進歩により、単一細菌の培養は、ウェルチップ4、7、8、ゲル液滴12、13などの限られた空間内で達成することができる。
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プロトコル
1. 液滴転写法による細菌細胞を含むGVの調製
- 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC、 10 mM、1 mL)および1,2-ジステアロイル-snグリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチニル(ポリエチルネグリコール)-2000](ビオチン-PEG-DSPE、0.1mM、1mL)メタノール溶液(2/1、v/v)を保存し、-20°Cで在庫を保存します。
- 脂質含有油溶液の調製
- POPC溶液の20μLとビオチン-PEG-DSPE溶液の4μLをガラス管に注ぎます(図1b(i)))。
- 空気の流れによって有機溶媒を蒸発させ、脂質フィルムを形成し、フィルムを1時間のデシケータに入れ、有機溶媒を完全に蒸発させる(図1b(ii)))。
注:ヒュームフード内の有機溶媒を蒸発させる必要があります。 - ガラスバイアルに200μLの鉱物油(0.84g/mL、材料の表)をガラスバイアルに加えます(図1b(iii)))。
- ガラスバイアルの開口部をフィルムで包み、超音波浴(120W)で少なくとも1時間(図1b(i....
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結果
液滴転写法を用いて単一細菌細胞を含むGVを生成する簡単な方法を提示する(図1)。図1aは、細菌を含むGVの沈殿物の概略図を示す。細菌を含むW/O液滴は、遠心分離によって油水(脂質単層)界面を越えてGVを形成する。スクロース(内部水溶液)とブドウ糖(外水溶液)の密度の違いは、W/O液滴の油水界面の交差を助けます。これらの溶液間の濃度のわずかな違いは、GVの変形および崩壊を引き起こす可能性があるため、内側および外側の水溶液中の浸透圧を監視する必要があります。液滴転写法により細菌細胞を含むGVを調製するためのフローチャートを図1bに示す。この手順に従うことにより、単一の細菌細胞を含むGVを容易に得ることができる。
GV内の細菌細胞増殖を観察するために、顕微鏡観察用の独自の培養システ.......
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ディスカッション
ここでは、GV内部の単細胞レベルで細菌細胞を培養する方法について述べている。この簡易方法は、液滴転写法を用いて単細胞レベルで細菌細胞を含むGVを形成することを含む。細菌細胞を含むGVを得るための他のアプローチと比較して、この方法には2つの利点があります:(i)開発が容易であり、(ii)GVを調作するためにサンプル溶液の少量(2μL)が必要である。細菌細胞を含むGVを用いた液滴転写方法20は、古典的な水和22およびマイクロ流体法17よりも単純である。例えば、古典的な水和方法22は、GVを調製するための簡単で簡単な方法であるが、GVへの材料の封入効率は非常に低く、サンプルの少なくとも数百マイクロリットルが必要である。最近開発されたセルロース紙アベド水和23およびゲル支援水和24法は、古典的な水和法22と比較して.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
この研究は、文部科学省の優秀若手研究者のためのリーディング・イニシアティブ(第16812285号)、若手科学者研究助成金(No.18K18157,16K21034)の支援を受けました。日本学術振興会(JSPS)からM.M.、文部科学省から株式会社への助成金(第17H06417号、17H06413)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| バクトトリプトン | BD バイオサイエンス | 211705 | |
| クロロホルム | 和光 純薬品 | 032-21921 | |
| カバーガラス (18 回; 18 mm) | 松波ガラス Ind. | C018181 | 厚さ0.13–0.17 mm |
| カバーガラス (30 × 40 mm) | 松波硝子工業 | カスタムオーダー | の厚さ0.25–0.35 mm |
| 卓上遠心分離機 | Hi-Tech Co. | ATT101 | スイングローター式 |
| 両面シール (10回 10 | ニトムス | T4613 | |
| ガラスガラスバイアル | AS ONE | 6-306-01 | ダーラム発酵管 |
| グルコース | 和光純薬 | 049-31165 | |
| 倒立顕微鏡 | オリンパス | IX-73 | |
| メタノール | 和光純薬 | 133-16771 | |
| 微細加熱ステージシステム | 東海ヒット | TP-110R-100 | |
| 鉱物油 | ナカライテスク | 23334-85 | |
| ミニ押出機 | アバンティ 極性脂質 | 610000 | |
| ニュートラビジン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 31000 | |
| 対物レンズ | オリンパス | LUCPLFLN 40回;/0.6 NA | |
| ポリカーボネート膜 | Avanti Polar Lipids | 610005 | 孔径 100nm |
| sCMOSカメラ | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| 塩化ナトリウム | 和光純薬 | 191-01665 | |
| ショ糖 | 和光純薬 | 196-00015 | |
| 超音波浴 | AS ONE | ASU-3D | |
| 酵母抽出物 | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL フタ付きプラスチックチューブ | ワトソン | 130-806C | |
| 1.5 mL フタ付きプラスチックチューブ | 住友ベークライト | MS4265-M | |
| 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン | アバンティ極性脂質 | 850457P | POPC |
| 1,2-ジステアロイル-スニセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチニル(ポリエチレングリコール)-2000] | アバンティ極性脂質 | 880129P | ビオチン-PEG-DSPE |
参考文献
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1....
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