Summary
Biz dev veziküller (GVs) içinde bakteri tek hücreli kültürü göstermektedir. Bakteriyel hücreler içeren GVs damlacık transfer yöntemi ile hazırlanmıştır ve bakteriyel büyüme doğrudan gözlem için bir cam substrat üzerinde desteklenen bir membran immobilize edildi. Bu yaklaşım, diğer hücrelere de uyarlanabilir.
Abstract
Biz dev veziküller (GVs) içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler kültür için bir yöntem geliştirdik. Bakteriyel hücre kültürü, doğal ortamda bakteriyel hücrelerin fonksiyonunu anlamak için önemlidir. Teknolojik gelişmeler nedeniyle, çeşitli bakteriyel hücre fonksiyonları sınırlı bir alan içinde tek hücreli düzeyde ortaya olabilir. GVs, amphiphilik lipid moleküllerinden oluşan küresel mikro boyutlu bölmeler ve hücreler de dahil olmak üzere çeşitli malzemeler tutabilir. Bu çalışmada, tek bir bakteriyel hücre, damlacık transfer yöntemi ile 10 – 30 μm GVs içine kapsüllenmiş ve bakteriyel hücreler içeren GVs cam substrat üzerinde desteklenen bir membran üzerinde immobilize edildi. Bizim yöntemi GVs içinde tek bakterilerin gerçek zamanlı büyüme gözlem için yararlıdır. Biz GVs içinde bir model olarak Escherichia coli (E. coli) hücreleri kültürlü, ama bu yöntem diğer hücre türlerine adapte edilebilir. Bizim yöntemi Mikrobiyoloji, biyoloji, biyoteknoloji ve sentetik biyoloji bilim ve sanayi alanlarında kullanılabilir.
Introduction
Tek hücreli düzeyde bakteriyel hücrelerin kültürü artan ilgi aldı. Sınırlı bir alan içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreleri kültür fenotip değişkenlik1,2,3,4, hücre davranışı5gibi bakteriyel fonksiyonları aydınlatmak olabilir, 6 , 7 , 8 , 9ve antibiyotik direnci10,11. Kültür tekniklerindeki son gelişmeler nedeniyle, tek bakterilerin kültürü, bir iyi çip4,7,8, jel damlacık12,13 gibi kapalı bir alanda elde edilebilir ve yağ içinde su (W/O) damlacık5,11. Tek bakteriyel hücrelerin anlayış veya kullanımını teşvik etmek için, yetiştirme tekniklerinin daha fazla teknik gelişimi gereklidir.
Biyolojik hücre membranı taklit eden veziküller, amphiphilik moleküllerden oluşan küresel bölmeler olup çeşitli materyalleri tutabilir. Veziküller boyutuna göre sınıflandırılır ve küçük veziküller (SVs, çapı < 100 Nm), büyük veziküller (LVs, < 1 μm) ve dev veziküller (GVs, > 1 μm) içerir. SVs veya LVs yaygın olarak biyolojik hücre membranı14için kendi yakınlık nedeniyle uyuşturucu taşıyıcıları olarak kullanılır. GVS Ayrıca belirleyebiliyorlar15 veya suni hücreler16inşası için bir reaktör sistemi olarak kullanılmıştır. Biyolojik hücrelerin GVS içine kapsülleme,17,18bildirilmiştir ve böylece reaktör sistemi ile kombine edildiğinde bir hücre kültürü sistemi olarak potansiyel GVS göstermek.
Burada, deneysel prosedürler bir video ile birlikte, biz nasıl GVs yeni hücre kültürü gemiler olarak kullanılabilir tarif19. Bakteriler içeren GVs damlacık transfer yöntemi20 tarafından yapılmıştır ve daha sonra bir kapak camında desteklenen bir membran üzerinde immobilize edildi. Bu sistemi, gerçek zamanlı olarak GVs içindeki tek hücreli seviyede bakteriyel büyümesini gözlemlemek için kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. droplet transfer yöntemi ile bakteriyel hücreler Içeren GVs hazırlanması
- 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-gliserin-3-fosfokolin lipid stok çözümleri hazırlayın (POPC, 10 mM, 1 mL) ve 1, 2-distearoyl-sn-gliserol-3-fosfoetolin-N-[biotinyl (polileneglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) kloroform/ Metanol çözeltisi (2/1, v/v) ve stokları-20 °C ' de saklayın.
- Lipid içeren yağ çözeltisi hazırlanması
- 20 μL POPC çözeltisi ve 4 μL biotin-PEG-DSPE solüsyonu bir cam tüpüne dökün (Şekil 1B (ı)).
- Bir lipid filmi oluşturmak ve organik çözücüyü tamamen Buharlaştırıcı 1 h için bir kurutucu içine film yerleştirmek için hava akışı ile organik çözücü Buharlık (Şekil 1B (ii)).
Not: Bir duman kaputu içinde organik çözücü Buharlık gerekir. - Cam şişeye 200 μL mineral yağı (0,84 g/mL, malzeme tablosu) ekleyin (Şekil 1B (iii)).
- Cam şişenin açılış parçasını film ile sarın ve ultrasonik banyoda (120 W) en az 1 h (Şekil 1B (iii)) olarak sonlayın. POPC ve biotin-PEG-DSPE son konsantrasyonları sırasıyla 1 mM ve 0,002 mM vardır.
- Bakteriyel hücrelerin öncesi kültür
- E. coli IÇINE 1x lb Orta (1 g maya ekstresi, 2 g Bacto Tripton, ve 2 g sodyum klorür 200 ml deiyonize su) bir lb plaka ve inkübe Içinde 37 °c için 12 – 14 h (gece).
- Kuluçk sonra, 20 μL kültür çözümü toplamak ve 1,98 mL taze 1x LB orta transfer ve kültür hücreleri 2 h için tekrar.
- 600 Nm (OD600) ön kültür çözeltisi (adım 1.3.2 ' de hazırlanmış) cinsinden optik yoğunluğu kontrol edin. OD600 = 1,0 – 1.5 öncesi kültür çözümü kullanılmalıdır.
- GVs 'nin dış ve iç sulu çözeltileri hazırlanması
- GVs bir dış sulu çözeltisi hazırlamak için 1x LB orta glikoz çözülür. 20 mL 'lik bir stok glikoz çözeltisi hazırlayın (500 mM).
- 200 mM (Tablo 1) 1x lb orta ile stok glikoz çözeltisi seyreltilebilir.
- GVs bir iç sulu çözeltisi hazırlamak için 1x LB orta sukroz çözülür. 20 mL 'lik bir stok sukroz çözeltisi hazırlayın (500 mM).
- Kültür öncesi çözümü (OD600 = 1.0 – 1.5), sakaroz çözeltisi (500 mm) ve 1x lb Orta (Tablo 1) karıştırın. Kültür çözümün son OD600 değeri 0.01 – 0.015 olmalıdır ve son sukroz konsantrasyonu 200 mm olmalıdır.
Not: Osrotik basıncını önlemek için dikkat alın. İç ve dış sulu solüsyon arasındaki konsantrasyonu dengelemek gerekir.
- Bakteriyel hücreler içeren su içinde yağ (W/O) damlacıkları hazırlanması
- 0,6 mL 'Lik bir plastik tüpte (Şekil 1B (IV)), lipidler (popc ve BIOTIN-Peg-DSPE ile maden yağı) içeren yağ çözeltisi Ile 50 μL arasında (adım 1.4.4 ' de hazırlanmış) GVS 'nin iç sulu çözeltisi 2 μL ekleyin.
- Tüp elle dokunarak plastik tüpteki iki bileşeni emulsify (Şekil 1B (v)).
- Bakteriyel hücreler içeren GVs oluşumu
- 1,5 mL delikli plastik tüpte (adım 1.4.2 ' de hazırlanan) GVs 'nin dış sulu çözeltisi 50 μL ekleyin (Şekil 1B (VI)) ve lipidler (popc ve BIOTIN-Peg-DSPE ile mineral yağı) içeren yağ çözeltisi ile hafif bir şekilde katman 150 μL dış sulu (Şekil 1B (vii)). Bu numuneyi oda sıcaklığında (RT, 25 °C) 10 – 15 dk. yağ ve sulu solüsyonların arayüzünün düz olduğundan emin olmak için kontrol edin.
- Bir pipet kullanarak yağ ve sulu çözeltinin arayüzünde (1.5.2 adımda hazırlanmış) W/O damlacık çözeltisi 50 μL ekleyin (Şekil 1B (viii)).
- 1,5 mL 'Lik plastik tüpü (adım 1.6.2) bir masaüstü santrifüjünde RT 'de 1.600 x g 'de 10 dakika boyunca santrifüjle (Şekil 1B (ix)). Santrifüjden sonra, 1,5-ml kapaklı plastik tüpten yağ (üst tabaka) bir pipet kullanarak Aspire ve bakteriyel hücreler içeren GV 'leri toplar (Şekil 1B (x)).
2. GV gözlem sisteminin hazırlanması (bakteriyel hücre kültürü sistemi)
-
Dolapları için küçük veziküller (SVS) hazırlanması ng a desteklenen fosfolipid membran
- 20 μL POPC çözeltisi ve 4 μL biotin-PEG-DSPE solüsyonu bir cam tüpüne dökün (1,1 adımda GV hazırlama için kullanılan aynı lipid bileşimi kullanılarak).
- Bir lipid filmi oluşturmak için hava akışı ile organik çözücüyü Buharlaştırıcı ve 1 h için bir kurutucu içinde bu örnek yer tamamen organik çözücü Buharlık.
- 200 mM glikoz 200 μL 1x LB Orta (GVs dış sulu solüsyon) cam şişeye ekleyin.
- Cam şişenin açılış parçasını film ile sarın ve ultrasonik banyoda (120 W) en az 1 saat boyunca sonlayın.
- 100 Nm gözenek boyutu ile mini Extruder ve polikarbonat membran kullanarak ekstrüzyon yöntemi21 Ile SVS hazırlayın.
-
El yapımı bir odanın hazırlanması
- Çift yüzlü mühür (10 mm x 10 mm x 1 mm) üzerinde boş bir yumruk ile 7 mm delik matkap.
- Çift yüzlü mührü bir kapak camı üzerindeki delikle (30 mm x 40 mm, kalınlık 0,25 – 0.35 mm) yapıştırın.
-
Odanın delikteki kapak camında desteklenen bir fosfolipid membranın hazırlanması
- Oda delikine (2,2 bölümünde hazırlanmış) SV çözeltisi 30 μL ekleyin ve 30 dakika boyunca RT 'de inküye yapın.
- 200 mM glikoz içeren 20 μL 1x LB orta ile deliği iki kez yavaşça yıkayın (GVs 'nin dış sulu çözeltisi) pipetleme ile.
-
Üzerinde GVs Immobilizasyon odanın delikteki kapak camında desteklenen fosfolipid membran
- 10 μL neutravidin (1 mg/mL) deliğe GVs dış sulu çözeltisi ile tanıtmak ve RT 15 dakika boyunca inkübe.
- 200 mM glikoz içeren 20 μL 1x LB orta ile deliği iki kez yavaşça yıkayın (GVs 'nin dış sulu çözeltisi) pipetleme ile.
- GVs (adım 1.6.3) içeren tüm çözümleri, kapak camı (18 mm x 18 mm, kalınlık 0.13 – 0.17 mm) (Şekil 2B) ile odanın deliğe ve mührüne ekleyin.
-
GVs içinde bakteriyel hücre büyümesini mikroskobik gözlem
- Uzun çalışma mesafesi (Şekil 2B) ile 40X/0.6 sayısal DIYAFRAM (na) objektif lens ile donatılmış ters mikroskop ile mikroskobik Isıtma aşaması sistemi ayarlayın.
- Odası mikroskobik Isıtma aşaması sistemine yerleştirin (Şekil 2B). 37 °C ' de 6 h için statik bir durumda odada bakteriyel hücreler içeren GV 'leri inkük etmek.
- Bir bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarıiletken (sCMOS) kamera kullanarak her 30 dakika içinde GVs içinde bakteriyel hücre büyümesi mikroskop görüntüleri yakalama ve kayıt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Damlacık Transfer yöntemini kullanarak tek bakteriyel hücreler içeren GVs oluşturmak için basit bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1). Şekil 1a bakteri Içeren GVS yağışında bir şematik görüntü gösterir. Bakteri içeren W/O damlacıkları yağ-su (lipid monolayer) arayüzünde santrifüjleme ile GVs oluşturmak için aktarılır. Sakaroz (iç sulu solüsyon) ve glikoz (dış sulu solüsyon) arasındaki yoğunlukta fark, W/O damlacıkları yağ su arayüzünün geçişte de yardımcı olur. Bu çözümler arasındaki konsantrasyonda hafif bir fark deformasyon ve GVs çöküşü neden olabilir çünkü iç ve dış sulu çözeltisi içinde osrotik basınç izlemek için gereklidir. Damlacık transfer yöntemiyle bakteriyel hücreler içeren GV 'Ler hazırlamak için bir akış şeması Şekil 1B'de gösterilir. Bu prosedürü izleyerek, tek bakteriyel hücreler içeren GVs kolayca elde edilebilir.
GVs içinde bakteriyel hücre büyümesini gözlemlemek için mikroskobik gözlem için orijinal bir kültür sistemi inşa edildi (Şekil 2). Bakteriler içeren GVs, bir kapak camında neutravidin ile kaplanmış desteklenen bir membran yüzeyinde immobilize edildi (Şekil 2a). Bu immobilizasyon tekniği GVs uzun süreli gözlem sağladı.
Tek bakteriyel hücreler içeren farklı boyutta GVs 'nin tipik faz kontrast mikroskopisi görüntüleri Şekil 3' te gösterilir. Bu deneyde, 10 μm ila 30 μm arasında değişen boyutlarda bakteriyel hücreler içeren GVs elde ettik. Şekil 3 farklı boyutlarda 10,7 μm (Şekil3a) ve 28 μm (Şekil 3b) ile GVS içinde tek hücreli seviyede bakteriyel büyüme gösterir. GVs her iki boyut için, e. coli hücreleri uzama ve bölme süreçleri, bir veya iki E. coli hücreleri ile 6 h üzerinde hücrelerin çok sayıda büyüyen ile uygulandı. Böylece, E. coli hücreleri GVS içinde stabil büyüdü.
Belirli sayıda bakteriyel hücre içeren GVs 'nin göreli frekansı Şekil 4' te gösterilir. Deneysel durumumuzu (OD600 = 0.01 – 0.015), bakteriyel hücreler elde edilen GVS yaklaşık% 10 ' da tek hücre seviyesinde kapsüllenmiş (boş GVS yaklaşık% 80 idi). Tek hücre seviyesinde kapsüllenmiş GV 'Ler, Şekil 4' ün insetinden tahmin edilen gibi, bakteriyel hücreler Içeren GV 'lerden yaklaşık% 50 idi.
Şekil 1: bakteriler Içeren GVs 'Nin deneysel prosedürleri. (a) bir damlacık-transfer yöntemi ile hazırlanan bakteriler Içeren GVS şeması. Bakteri içeren W/O mikrodamlacıklar, santrifüj kuvveti ile lipid Tek tabakalı arayüzünden geçerek bir lipid fosfolipid membranı oluşturur. (b) bakteriler Içeren GVS sentezinin akışı. (ı) organik solvent içeren lipidler (POPC ve biotin-PEG-DSPE, 100:0.2 molar oranı). (ii) cam şişenin altındaki lipid filmi. (iii) lipidler içeren yağ çözeltisi. (iv) 50 μL yağ çözeltisi ve 2 μL iç sulu çözeltisi (200 mm sakaroz ve 1x lb orta) bakteri hücrelerini içeren karışımı. (v) el dokunarak Emülsifikasyon (üzerinde 50 kez). (VI) 50 dış sulu çözeltinin μL (1x LB orta 200 mM glikoz). (vii) dış sulu çözelti üzerinde 150 μL yağ çözeltisi katmanlama. (viii) W/O damlacık çözeltisi katmanlama. (IX) tüpün santrifüjleme. (x) yağ aspirasyonu sonrası bakteriyel hücreler içeren GVs çöktürülmüş. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: o GVs içinde bakteriyel hücre kültürü bservation sistemi. (a) GVS, kapak camında biotin-neutravidin bağlayıcı yoluyla desteklenen bir membran üzerinde immobilize edilir. GVs bir ısıtma sistemi ile inkübe edilir. (b) el yapımı bir oda da dahil olmak üzere gözlem sisteminin resmi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: tek bakteri hücrelerini (siyah oklar ile gösterilir) Içeren GVs 'Nin faz karşıtlığı mikroskop görüntüleri. Farklı ölçekli GVs içinde bakteriyel hücre büyümesi Snap-Shots. (a) vezikül boyutu = 10,7 μm. (b) vezikül boyutu = 28 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: GV başına kapsüllenmiş bakteriyel hücrelerin sayısının istatistiksel analizi. GVs göreli Frekanslar histogramlar olarak çizilir. Inset: tek-10 < hücrelerden bakteriyel hücreler içeren GVs göreli frekanslarının büyütme. Toplam 235 GVs analiz edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Dış sulu solüsyon | İç sulu solüsyon | Son | |
| 500 LB orta ile mM glikoz | 200 (μL) | – | 200 mM |
| 500 LB orta ile mM sucrose | – | 200 (μL) | 200 mM |
| 1x LB orta | 300 (μL) | 295 (μL) | – |
| Kültür öncesi çözüm (OD600 = 1.0 – 1.5) | – | 5 μL | OD600 = 0.01 – 0.015 |
| Toplam hacim | 500 (μL) | 500 (μL) |
Tablo 1: GVs 'nin dış ve iç sulu çözümlerinin bileşimi ve hacimleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, biz GVs içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu basit yöntem, damlacık Transfer yöntemini kullanarak tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler içeren GVs oluşturma içerir. Bakteriyel hücreler içeren GVs almak için diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, bu yöntem iki avantajı vardır: (i) geliştirmek kolaydır, ve (ii) örnek çözümün küçük bir hacmi (2 μL) GVs hazırlamak için gereklidir. Bakteriyel hücreler içeren GVS hazırlamak için damlacık transfer yöntemi20 klasik hidrasyon22 ve Mikroakiskan sistemler yöntemleri17daha basittir. Örneğin, klasik hidrasyon yöntemi22 GVS hazırlamak için basit ve kolay bir yöntemdir, ancak materyallerin GVS içine kapsülleme verimliliği oldukça düşüktür ve en azından birkaç yüz mikrolitresindeki örnek gereklidir. Son zamanlarda geliştirilen Selüloz kağıt-yatkın hidrasyon23 ve jel destekli hidrasyon24 GVS yapmak için yöntemler klasik hidrasyon yöntemi22ile karşılaştırıldığında biyomoleküllerin yüksek bir kapsülleme verimliliği var. Kapsülleme verimliliği, damlacık transfer tekniğinin olduğu kadar yüksektir ve bu iki yöntemin GVs içindeki hücrelerin kapsüllerine izin vermesi beklenmektedir. Dahası, Mikroakiskan sistemler yöntemi17 doğru GVS içinde tek hücreleri saklar ve GVS içine malzemelerin çok yüksek bir kapsülleme verimliliği gösterir ama karmaşık işleme ve mikro cihazlar ve büyük bir imalat teknikleri gerektirir örnek hacim (en az birkaç mililitre) tüp akışı için.
Bu protokolde, yağ-su arayüzünün stabilitesi, bakteriyel hücreler içeren GV 'leri elde etmek için önemlidir (Şekil 1B (vii)). Birçok GVs elde etmek için, yağ su arayüzünü düzleştirmek için esastır. Bu nedenle, yağ fazının uygun hazırlanması gereklidir. Biz en az 1 h için yağ faz sonicated yüksek güçlü ultrasonik banyo (120 W) tamamen lipid molekülleri çözülür. Yağ fazını sonication hemen sonra dış sulu solüsyon üzerinde katmanlandırılması önemlidir (Şekil 1B (vii)).
Burada açıklanan yöntem iki sınırlama vardır. İlk olarak, GVs genellikle kırmak ve bakteri hücreleri dış sulu çözeltisi içine sızıntı. Bunun nedeni GV oluşumu sırasında, bazı W/O damlacıkları yağ-su arayüzünden aktaramaz ve yırtılamaz hale gelir. Bu, damlacık transfer yöntemi20kullanıldığında kaçınılamaz bir yöntemdir. Ayrıca, GVs gözlem sırasında kırabilir. GV 'lerde istikrar, GVs25' i stabilize eden yapay bir Siton iskelet kullanımı gibi geliştirilmiş olmalıdır. İkinci olarak, kapsüllenmiş bakteriyel hücrelerin sayısı mükemmel kontrol edilemez. Şekil 4 , çok sayıda bakteriyel hücrenin GV 'de kapsüllendiği ve bu nedenle, damlacık Transfer yöntemini kullanarak GVS 'de bakteriyel hücrelerin sayısını kontrol etmek zor olduğunu gösterir. Hücre numarasını kontrol etmek için Mikroakiskan sistemler teknolojisi kullanılabilir.
GVS diğer malzemelerden (jel damlacıkları12,13 veya W/O damlacıkları5,11) daha etkili bir şekilde iç sulu çözeltisi kontrol edebilir. Örneğin, GVs iç ve dış çözeltileri sulu koşulları doğal membran geçirgenliği26 veya bir membran gözenek16 veya Transporter27tarafından kolaylaştırılmış geçirgenliği ile değiştirilir. Bu yöntemle, yağ molekülleri (Bu durumda maden yağı) membranda20kaldı. Bakterilerin büyüme için besin veya oksijen geçirgenliği üzerinde membran kalan yağ etkisi bilinmiyor. Biz besin veya oksijen doğal membran geçirgenliği bilmiyorum rağmen, biz büyüme ortamında besin veya oksijen miktarını Bu çalışmada bakteriyel büyüme için yeterli olduğunu düşünün. Besin veya oksijeni doğal membran geçirgenliği bakteriyel hücre büyümesi için çok önemlidir ve gelecekteki çalışma için önemli bir konudur. Geçirgenliği kontrol tekniği, jel damlacıkları12,13 veya W/O damlacıkları5,11ile kültür yöntemi kullanılarak gerçekleştirilemez. GVs böylece kapalı bir alanda bakteriyel kültür uygulamaları için ilk seçim olacak.
Bakteriyel kültür yöntemimiz, metabolik ürünlerini elde etmek veya analiz etmek için Mikrobiyoloji19 ' da kültür bilinmeyen çevresel bakterilerde potansiyel olarak yeni bir kavram ve araçtır. Dahası, bizim bakteriyel hücre-GVs içeren bir yapay hücre modeli hibrid sistemi (GVs) ve bir yaşam hücresi (bakteriyel hücreler) biyoteknoloji için yeni bir araç yapmak için28 ve Bottom-yukarı sentetik biyoloji29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Japonya 'nın eğitim, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) Bakanlığından mükemmel genç araştırmacılar (lıder, No. 16812285) için önde gelen bir girişim tarafından destekleniyordu (No. 18K18157, 16K21034) genç bilim adamı araştırmaları için hibe-in-Aid Japonya 'dan m. ' ye bilim (JSPS) tanıtımı için ve MEXT 'den K.K. 'ye (No. 17H06417, 17H06413) Grant-ın-Aid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
