Summary
هنا، نقدم بروتوكولاً لفحص الفلور المناعي غير المباشر العائم الحر على أقسام خزعة الجلد التي تسمح بتحديد المتغيرات المطابقة الخاصة بالأمراض من ألفا سينوكلين المشاركة في مرض باركنسون والبروتينات المتعددة لل الجهاز العصبي المحيطي.
Abstract
حتى الآن ، بالنسبة لمعظم الأمراض العصبية لا يتوفر سوى تشخيص نهائي للتشريح. لمرض باركنسون (PD), التشخيص لا يزال يعتمد فقط على العلامات السريرية للمشاركة الحركية التي تظهر في وقت لاحق في مسار المرض, عندما يتم فقدان معظم الخلايا العصبية الدوبامينبالفعل. وبالتالي، هناك حاجة قوية إلى مؤشر حيوي يمكن أن تحدد المرضى في بداية المرض أو في خطر تطويره. على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد ثبت خزعة الجلد لتكون ممتازة البحث وأداة التشخيص لأمراض الأعصاب الطرفية مثل الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة. ومن المثير للاهتمام، وقد أظهرت الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة وألفا synuclein (αSyn) الرواسب العصبية عن طريق خزعة الجلد في مرضى PD. في الواقع، خزعة الجلد لديه ميزة كبيرة لكونه سهل الوصول إليها، والإجراءات طفيفة التوغل وغير مؤلم الذي يسمح بتحليل الأنسجة العصبية الطرفية المعرضة لعلم الأمراض. وعلاوة على ذلك ، فإن إمكانية تكرار خزعة الجلد خلال متابعة نفس المريض تسمح بدراسة العلاقة الطولية مع تطور المرض. وضعنا بروتوكول اعدّي ّيّة يمكن الاعتماد عليه للتحقيق في وجود المجاميع αSyn في ألياف الأعصاب الجلدية لمريض PD. يتضمن هذا البروتوكول بضع خطوات تثبيت قصيرة، وتقسيم cryotome ومن ثم الفلور المناعي العائمة الحرة مزدوجة التلطخ مع اثنين من الأجسام المضادة محددة: مكافحة البروتين الجينات المنتج 9.5 (PGP9.5) للاحتفال الألياف العصبية الجلدية ومكافحة 5G4 للكشف عن αSyn المجاميع. وهو متعدد الاستخدامات وحساس وسهل الأداء البروتوكول الذي يمكن تطبيقه أيضا لاستهداف البروتينات الأخرى ذات الاهتمام في أعصاب الجلد. القدرة على وضع علامة على المجاميع αSyn خطوة أخرى إلى الأمام إلى استخدام خزعة الجلد كأداة لإنشاء تشخيص الأنسجة قبل الوفاة من PD.
Introduction
وقد اكتسبت خزعة الجلد أهمية كبيرة كأداة التشخيص والبحث في مجال الاضطرابات العصبية1. في الواقع، البشرة والأدمة تحتوي على ألياف عصبية حسية جسدية وفيرة (الميالينات وغير الميالينات)، نهايات العصب الحر nociceptive، مستقبلات الحسية والتعصيب اللاإرادي من الغدد العرقية، والأوعية، والغدد الدهنية والعضلات العاقد بيلروم 2.
في منتصف القرن العشرين، سمح الإعداد للكيمياء المناعية للالأجسام المضادة PGP9.5 بدليل على تعصيب واسع النطاق للبشرة جلد الثدييات3. PGP9.5 هو هيدرولاز كاربوكسيل محطة موزعة على قدم المساواة على طول محاور من كل من الجهاز العصبي المركزي والطرفية (PNS). توافر هذا الأجسام المضادة يسمح ليس فقط لتوضيح المورفولوجيا والتشريح من PNS في الجلد ولكن أيضا تنفيذ دراسة الأمراض المرتبطة به3,4. ساهمت خزعة الجلد في تحديد كيان سريري جديد: الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة. أظهرت عدة مجموعات دولية العلاقة بين فقدان الألياف العصبية داخل الجلد وأعراض / علامات اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة5 عن طريق تحليل خزعة الجلد وقدمت بروتوكولات موحدة لmorphometry العصب وكذلك القيم المرجعية المعيارية لاستخدامها في الممارسة السريرية6و7و8.
في الآونة الأخيرة أظهرت كمية كبيرة من الأدلة أن الأمراض العصبية، التي تتميز تراكمات البروتين المطوية في الجهاز العصبي المركزي، هي أمراض متعددة النظام9. في الواقع, يتميز PD بتراكم αSyn في الخلايا العصبية الدوبامينية من نيجرا substantia, ولكن ثبت أن αSyn وشكله المرضي, فوسفوريلاتيد αSyn (P-αSyn), يمكن الكشف أيضا في الأنسجة الطرفية. المعدة والأمعاء الغشاء المخاطي10، الغدد اللعابية11، ألياف الجلد اللاإرادي المحيطة الغدد العرقية والعضلات الحركي12،13،14، تظهر المناعة لأشكال الإمراض من αSyn ، في وفقا لافتراض براك أن يفترض بشكل مثير للاهتمام أن علم الأمراض αSyn قد تبدأ في PNS في وقت مبكر، قبل تراكمه في الدماغ15. وعلاوة على ذلك، تم إثبات وجود p-αSyn في الأعصاب الجلدية للمرضى الذين يعانون من اضطرابات السلوك REM التي تعتبر PD prodromal16،17 وبالتالي يمكن اعتبار αSyn الجلد علم الأمراض واعدة في وقت مبكر الطرفية مؤشر الأنسجة المرضية من اعتلال الخلايا النخاعية.
وقد تم إثبات ارتباط الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة في PD سابقا، وقد وجد أن كثافة الألياف العصبية داخل الجلد يعكس تطور المرض18،19. وبالتالي، فإن خزعة الجلد هي أداة مفيدة لدراسة التنكّر العصبي في PD ولإنشاء تشخيص الأنسجة قبل الوفاة للمرض. في الواقع، خزعة الجلد لديه ميزة كبيرة لكونه إجراء يسهل الوصول إليه او طفيفة التوغل، مما يسمح بتحليل الأنسجة العصبية المعرضة لعلم الأمراض. وأخيرا ، فإن إمكانية تكرار خزعة الجلد في سياق متابعة نفس المرضى يسمح بدراسة العلاقة الطولية مع تطور المرض.
في مختبرنا، واستغلال مزدوج المناعية تلطيخ مع PGP9.5 والأجسام المضادة أحادية النسيلة التطابق 5G4 محددة، التي تعترف أشكال محددة من المرض αSyn بما في ذلك المجاميع الصغيرة20،21، كنا قادرين على إظهار وجود المجاميع αSyn في الأعصاب الجلد مع كفاءة تشخيصية عالية واعدة19. تحليل الفلور المناعي لخزعة الجلد في أمراض التشكل تبرز كمصدر واعد للمؤشرات الحيوية من خلال الجمع بين كل من الكشف عن مجاميع البروتين وقياس التنكّر العصبي في الجسم الحي. فيما بعد، نوضح بروتوكولًا سهلًا ومتعدد الاستخدامات بشأن التعامل مع خزعة الجلد وأداء تلطيخ الفلور المناعي العائم الحر للكشف عن مجاميع αSyn. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستهداف أي بروتين آخر من الاهتمام أعرب في PNS الجلد.
وقد تم استخدام بروتوكول الدراسة التالية لتقييم فائدة التشخيص من تحليل αSyn مجمعة في PNS من PD عن طريق خزعة الجلد19. وكانت معايير الشمول للPD: تشخيص سريري واضح وفقا لمعايير التشخيص بنك الدماغ في المملكة المتحدة، ومدة المرض على الأقل 3 سنوات، لا تاريخ الأسرة، وليس ضعف الإدراك الرئيسية أو أعراض خلل التغذية الذاتية الرئيسية في التاريخ. كانت معايير الاستبعاد أسباب معروفة للاعتلال العصبي (الهيموغلوبين الغليكات، الكرياتينين، فيتامين B12، TSH، تثبيت المناعة المصل، فيروس نقص المناعة البشرية، فيروس التهاب الكبد C، الزهري، وداء البوريلي). خضع كل موضوع لخزعات الجلد قطرها 3 مم في ثلاثة مواقع تشريحية (الرقبة على مستوى C8 الجلد، الفخذ 10 سم فوق الركبة، الساق 10 سم فوق malleolus الجانبية) على الجانب، الذي كان سريريا أكثر تضررا. بشكل عام، البروتوكول التالي هو حول التعامل مع خزعة الجلد وأداء تلطيخ الفلور المناعي العائمة الحرة والتحليل. وبالتالي فإنه يمكن تكييفها واستخدامها للكشف عن البروتينات الأخرى ذات الاهتمام في أنسجة الجلد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في الكانتونات على البروتوكول، وأعطى جميع الأشخاص المسجلين موافقة خطية مستنيرة على الدراسة.
1. مجموعة خزعة الجلد
- السماح للطبيب المؤهل بإجراء خزعة الجلد في بيئة سريرية مناسبة.
- اختر المنطقة لإجراء خزعة الجلد وتنظيفها بمسحة كحولية.
- إعداد محلول مخدر مع 1 سم مكعب من ليدوكائين 2٪.
- مع الإبرة موازية للمنطقة ، حقن التخدير الموضعي تحت الجلد.
- بعد التحقق من تأثير التخدير، خذ لكمة 3 ملم المتاح وتطبيق الضغط التناوبي والدقيق إلى أسفل لتدوير أسفل من خلال البشرة والأدمة، حتى يتم التوصل إلى الدهون تحت الجلد.
- سحب لكمة.
- استخدم ملقط المتاح لسحب بلطف المكونات الجلد.
- استخدام مقص لقطع قاعدة العينة على مستوى الأنسجة الدهنية.
- ضع العينة في أنبوب يحتوي على 10 مل من محلول تثبيتي للفترة-يسين-بارافورالديهايد (PLP).
- تطهير المنطقة وتغطيتها مع ضمادة لاصقة.
2. تثبيت الأنسجة وتخزينها
- جعل حل الإصلاح PLP جديدة (انظر الجدول 1).
- مباشرة بعد جمع خزعة الجلد، غمره في أنبوب يحتوي على 10 مل من الحل التثبيتي PLP واحتضانه بين عشية وضحاها (O / N) في 4 درجة مئوية.
- في اليوم التالي، تحت غطاء محرك الأدخنة، إزالة مثبت PLP بلطف وفي نفس الأنبوب، وغسل الخزعة 3 مرات لمدة 5دقائق مع 5 مل من 0.1 M سورنسن الحل (الجدول 1).
- تجاهل محلول سورنسن وحضن الخزعة مع 5 مل من محلول الحماية بالتبريد O/N عند 4 درجة مئوية.
- تخزين الخزعة في 4 درجة مئوية إذا تم إجراء قطع مع cryotome في غضون 1 أسبوع; تخزين الخزعة في -20 درجة مئوية إذا تم إجراء القطع في غضون 3 أشهر؛ تضمين الخزعة في cryomold (الخطوات 3.2-3.4) وتخزينها في -80 درجة مئوية للحفاظ عليه لفترة أطول من الزمن.
3. قطع الأنسجة مع Cryotome
- تعيين cryotome في -20 درجة مئوية.
- خذ قالب كريو وملء الأمر مع وسيلة التبريد التضمين. تجنب خلق فقاعات.
- باستخدام ملاقط تزج خزعة في وسيلة التبريد التضمين مع المحور الطولي (البشرة - الأدمة) موازية إلى الجزء السفلي من كريومولد.
- التقط يُجمّد العينة بالنيتروجين السائل للحصول على مكعب صلب من وسيط ة التضمين بالتبريد يحتوي على الخزعة في الاتجاه الصحيح.
- وضع العينة في كريوستات وانتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للخزعة لتتأقلم.
- إصلاح العينة على كريوستات وقطع المقاطع 50 ميكرومتر.
- مع مساعدة من فرشاة صغيرة، نقل الكريو-المقاطع في لوحة بئر 96 تحتوي على 200 ميكرولتر من محلول التجمد في كل بئر. قسم واحد لكل بئر.
- يخزن في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا لم يتم تحليل الخزعة بأكملها، قطع هاه جزئيا. في هذه الحالة، يجب تخزين المقاطع في -20 درجة مئوية والجزء المتبقي من الخزعة عند -80 درجة مئوية للحفاظ عليه لفترة أطول من الزمن.
4. الأشعة الفلورية المناعية تلطيخ
- ملء لوحة بئر 96، مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- نقل المقاطع لتحليلها من لوحة التخزين إلى واحدة جديدة تحتوي على محلول الغسيل. قسم واحد لكل بئر (4 أقسام لكل موقع تشريحي، لكل مريض: عادة ما يكون مجموع 12 قسملكل مريض).
- اترك القسم في محلول الغسيل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). نقل القسم إلى بئر آخر يحتوي على نفس الحل وكرر الغسيل.
- نقل المقاطع إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول الحظر واحتضان لمدة 90 دقيقة على الأقل وبحد أقصى 4 ح في RT.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية المضادة PGP9.5 (أرنب متعدد النسيلة، 1:1000) ومكافحة 5G4 (ماوس أحادي النسيلة، 1:400) في حل العمل.
- نقل المقاطع إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من حل العمل من الأجسام المضادة الأولية واحتضان لهم O / N في RT.
- وكخطوة 4.3، اغسل المقاطع مرتين لمدة 10 دقائق على الأقل في RT، مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية (متقارنة مع الفلوروفورس مختلفة) الماعز المضادة للأرنب للكشف عن PGP9.5 (1:700) ومكافحة الفأر الماعز للكشف عن 5G4 (1:700) في حل العمل.
- نقل المقاطع إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من حل العمل من الأجسام المضادة الثانوية لمدة 90 دقيقة في RT. من هذه النقطة، وتغطية لوحة بئر 96 مع رقائق الألومنيوم لتجنب ابيضاض فلوروفور مترافق مع الأجسام المضادة الثانوية / ق.
- وكخطوة 4.3، اغسل المقاطع مرتين لمدة 10 دقائق على الأقل، مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- نقل المقاطع إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولتر من DAPI (مخففة 1:5,000 في PBS 1X) لمدة 5 دقائق في RT.
- وكخطوة 4.3، اغسل المقاطع مرتين لمدة 10 دقائق على الأقل، مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.
- تحميل المقاطع على شريحة في الموضع الصحيح تجنب misfolding.
- إضافة بضع قطرات من وسط تصاعد على الشريحة وتغطية مع غطاء.
- السماح الشرائح الجافة O / N قبل استخدام المجهر البؤري / الفلورسنت.
- تخزين الشرائح في مربع مناسب في 4 درجة مئوية تجنب التعرض للضوء. إذا تم تخزينها بدقة، فإن الإشارة ستكون مرئية لمدة 6 أشهر تقريبا.
ملاحظة: يتم نقل مقطع من لوحة البئر 96 التي تحتوي على شرائح قطع حديثا إلى لوحة بئر 96 التي تحتوي على محلول الغسيل (الخطوة 4.1) باستخدام فرشاة صغيرة تساعد على التقاط الخزعة. بعد نقل القسم إلى البئر الأول، في كل مرة تحتاج شريحة إلى احتضان مع حل مختلف، نقله من جيد إلى جيد مع مساعدة من الفرشاة.
5. التصوير المناعي
- عرض المقاطع تحت المجهر الفلورسنت مقلوب أو المجهر البؤري (20X، 40X أو أعلى التكبير، واستخدام إطارات متتالية من 2 ميكروم الزيادات على خطة Z-المكدس للحصول على أفضل النتائج).
- الحصول على الصور بواسطة كاميرا متصلة بالمجهر
-
استخدام برنامج تصوير مناسب (أي ImageJ) لتحليل الإشارات الإيجابية في الأقسام من حيث التوزيع المكاني وكثافة الإشارة. للقيام بذلك تنفيذ الخطوات المذكورة أدناه.
- افتح الملف مع برنامج ImageJ.
- انقر على الصورة > اللون > قنوات تقسيم من أجل تحليل كل قناة ملونة.
- انقر فوق صورة > كومة > مشروع Z للحصول على دمج عمليات استحواذ مقاطع متعددة.
- انقر فوق صورة > اللون > دمج القنوات للحصول على دمج قنوات ألوان مختلفة لنفس عملية الاستحواذ.
|
حل مضاد للتجمد (يخزن في 4 °C لمدة تصل إلى 6 أشهر) |
30% الجلسرين 30% جلايكول الإيثيلين 30% dH2O 10٪ 2x الفوسفات العازلة |
|
حظر الحل (استعد في الوقت الحالي) |
4% سيروم الماعز العادي 1% تريتون X-100 في محلول الغسيل |
|
واقية من البرد (يخزن في 4 °C لمدة تصل إلى 6 أشهر) |
20% الجلسرين 80% حل سورنسن |
|
محلول فوسفات الهيدروجين الصوديوم (مخزن في RT تصل إلى 6 أشهر) |
0.45M فوسفات الهيدروجين الصوديوم (Na2HPO4) في dH2O فلتر في زجاجة معقمة |
|
حل ليسين (يخزن في 4 °C لمدة تصل إلى 3 أسابيع) |
50% من محلول كلوريد أحادي هيدروكلوريد L-Lysine 0.3M 50% من حل سورنسن بقيمة 0.1 مليون pH7.6 pH 7.4، فلتر في زجاجة معقمة |
|
بارافورمالديهايد (PFA) 8% (إعداد تحت غطاء الدخان وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر) |
2.6M PFA في dH2O (إلى 55 درجة مئوية لا تتجاوز 60 درجة مئوية فلتر في زجاجة معقمة |
|
الفوسفات 2x العازلة (يخزن في 4 °C لمدة تصل إلى 6 أشهر) |
6% أحاديال فوسفات (NaH2PO4) حل 45% الصوديوم الفوسفات (Na2HPO4) الحل في dH2O |
|
حل تثبيتي PLP (أعد في الوقت الراهن، تحت غطاء الدخان) |
25% بارافورمالديهايد 8% 0.01M الصوديوم (ميتا) periodate 75% حل يسين< |
|
الصوديوم ثنائي الهيدروجين الفوسفات مونوهيدرات (مخزن في RT تصل إلى 6 أشهر) |
0.52M الصوديوم ثنائي الهيدروجين الفوسفات مونوهيدرات (NaH2PO4 * H2O) في dH2O قم بتصفيته في زجاجة معقمة. |
|
حل سورنسن (يخزن في 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر) |
2.5٪ أحادية الصوديوم الفوسفات الحل 18.7% محلول فوسفات الصوديوم pH7.6, في dH2O |
|
غسل الحل (استعد في الوقت الحالي) |
0.25M قاعدة تريزما 0.26M كلوريد الصوديوم pH7.6, في dH2O |
|
حل العمل (استعد في الوقت الحالي) |
50% حل الحظر 50% محلول الغسيل |
الجدول 1: الحلول المطلوبة. قائمة بالحلول المطلوبة للبروتوكول ووصف موجز لكيفية إعداده.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد الإجراء الموصوف(الشكل1)، اكتشفنا المجاميع αSyn، وصفت مع الأجسام المضادة 5G4، في اللفافات العصبية الجلدية تشعب الهياكل اللاإرادية من المرضى PD. يظهر مورفولوجيا رواسب ألفا-سينوكلين كإشارة منقط على طول محاور الأعصابالجلدية (الشكل 2). في الواقع، استغلال هذا البروتوكول في 19 PD المرضى و 17 الضوابط في الخزعات الجلد في ثلاثة موقع التشريحية (عنق الرحم والفخذ والساق البعيدة) وجدنا أن 5G4 كان 81% من الحساسية و 86% من خصوصية احترام الضوابط الصحية وP-αSyn كان 56% من الحساسية و 100٪ من التحديد19.
على وجه الخصوص، وجدنا 5G4 و P-αSyn الرواسب الإيجابية أساسا في الأعصاب حول الغدد العرقية ولكن أيضا في العضلات منتصب pili، السفن الصغيرة، والضفيرة تحت الجلد والجلد، أبدا في ألياف الأعصاب داخل الجلد.
عموما، داخل تجويف الغدة العرق، فمن الممكن لمراقبة إشارة غير محددة، والتي يمكن أن يساء تفسيرها على أنها 5G4 / P-αSyn الإيجابية. هذا النوع من الإشارات منقط، كروية، ويرجع ذلك على الأرجح إلى مادة الفلور التلقائي داخل المنورين،كما أظهرنا في الضوابط التقنية دون الأجسام المضادة الأولية والثانوية (الشكل 3). التوطين المشترك مع PGP9.5 الذي يميز الألياف العصبية، والتي مورفولوجية هي خيوط وممدودة، ويساعد على تحديد الإشارة الصحيحة. ولذلك، فإن خصوصية إشارة 5G4 هو زيادة عالية من خلال المناعية مزدوجة مع علامة محور (الشكل 4).
تثبيت دقيق للخزعة هو عامل إلزامي لنوعية جيدة من تلطيخ الفلور المناعي، والتفسير الموثوق به للإشارات الفلورسنت. إذا لم يتم إعداد المثبت بشكل صحيح أو إذا حدث الإفراط في التثبيت، فإن النتيجة ستكون عالية لصناعة السيارات في الفلورسنت التي سوف تخفي إشارة الألياف العصبية عبور تقاطع الجلد والبشرة أو innervate الهياكل الجلدية الرئيسية (الشكل5 باء، دال، واو). في هذه الحالة، فإن عدم القدرة على تصور بشكل صحيح ألياف PGP9.5 الإيجابية سيجعل من الصعب تحليل بشكل صحيح أيضا 5G4.
وأخيرا، يمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن أي بروتين من الفائدة، بما في ذلك من بين أمور أخرى αSyn، P-αSyn أو التيروزين هيدروكسيلاز (TH) والببتيد المعوي ة (VIP) التي تميز على التوالي نوع فرعي من اللاإرادي وكوليني على التوالي من اللاإرادي التعصيب (الشكل6).
الشكل 1 تمثيل تخطيطي للبروتوكول. تمثيل رسومي للخطوات الحرجة في تثبيت، وقطع وتلطيخ أجزاء الجلد لتصور المجاميع αSyn في الألياف العصبية الطرفية الجلدية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 وجود 5G4 المجاميع في ألياف الجلد العصبي. دمج التركيز Z-المكدس صور من الفلور المناعي مع PGP9.5 (الأخضر) و 5G4 (الأحمر) من الأعصاب الجلدية حول الغدد العرقية في مرضى PD (A -C) وموضوع صحي (D-F). يتم تعديل هذا الرقم من 19. وأظهرت التصور ثلاثي الأبعاد من نفس الغدة العرق أعلاه من PD (G)وصحية (H) المواضيع. يشار إليها من قبل السهام البيضاء، والترجمة الصفراء من علامات اثنين على طول المحاور. شريط مقياس = 50 ميكرومتر.
الشكل 3 إشارات الفلورسنت التلقائي: الضوابط التقنية. دمج تكيس Z صور من قسم الجلد ملطخة DAPI وبدون الأجسام المضادة الأولية(A-B)،دون الأجسام المضادة الثانوية(C-D)،دون الأجسام المضادة الأولية والثانوية(E-F). وتظهر الصور وجود إشارات منقط غير محددة في هياكل الغدد العرقية في جميع الظروف. شريط مقياس = 50 ميكرومتر.
الشكل 4 النظر في مورفولوجيا الألياف العصبية للتعرف على إشارة غير محددة. دمج التركيز Z-المكدس صور من الفلور المناعي مع PGP9.5 (الأخضر) و 5G4 (الأحمر) من الأعصاب الجلدية حول الغدد العرقية. السهام البيضاء تشير إلى الهياكل الإيجابية؛ تشير العلامات النجمية إلى تلطيخ غير محدد في الهياكل غير العصبية. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. يتم تعديل هذا الرقم من المرجع19. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 تثبيت غير صحيح يعرض للخطر نوعية تلطيخ الفلورالمناعي. دمج الكست Z صور من الفلور المناعي مع PGP9.5 (الأخضر) وDAPI (الأزرق) من ألياف الأعصاب داخل البشرة(A-B)والأعصاب الجلدية حول الغدة الدهنية (C-D)والغدد العرقية (E-F ). على النتيجة اليسرى من التثبيت الصحيح، على النتيجة الصحيحة من أكثر من التثبيت. شريط مقياس = 50 ميكرومتر.
الشكل 6 أمثلة على البروتينات الأخرى التي يمكن اكتشافها في أعصاب البشرة. صور المجهر من الهياكل الجلدية الملطخة باستخدام فحص المناعة العائمة الحرة. في αSyn(A) ، p-αSyn (B)، وTH (C)، في كبار الشخصيات الخضراء (D). شريط مقياس = 50 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نوصف فحص المناعة العائمة الحرة لخزعات الجلد لتشخيص PD: فإنه يستغل الصبغ المناعي المزدوج مع الأجسام المضادة PGP9.5، علامة باناكسونال، والمضادة 5G4، وهو الأجسام المضادة التشكل محددة التي تعترف شكل مجمعة من αSyn.
المزايا الكبيرة لخزعة الجلد لغرض التشخيص في PD وربما في اضطرابات التطابق البروتين الأخرى هي: 1) الوصول المباشر إلى الأنسجة العصبية المعرضة للمرض عن طريق تقنية الغازية أقل ما يقال، وبالتالي مع تحديد أفضل المتوقع حساسية لمجموعαSyn من السوائل البيولوجية مثل الدم أو CSF؛ 2) الفرصة للكشف عن وقياس كثافة الألياف العصبية اللاإرادية كمقياس للتنكّر العصبي؛ 3) إمكانية تكرار خزعة الجلد في سياق متابعة نفس المرضى، من أجل دراسة طولية العلاقة مع تطور المرض.
إن البروتوكول المقترح هنا سريع ومتعدد الاستخدامات ولا يتخذ سوى خطوات حاسمة قليلة. أولا وقبل كل شيء، تثبيت الأنسجة يجب أن يكون السعي بشكل صحيح، وإلا فإن ارتفاع لصناعة السيارات في الفلورسنت قناع إشارة محددة، وسوف تمنع التحليل الصحيح للبيانات. وينبغي أن يتم paraformaldehyde في الحل المثبت الطازجة وpH من 7.4 ينبغي أن يتم فحصبدقة. من المهم للغاية لتجنب تشكيل حمض الفورميك التي يمكن أن تضر الخزعات. قبل التخزين والقطع، إذا كان ضغط الخزعة يشير إلى تثبيت غير صحيح، يجب شطف الخزعة مرة أخرى مع حل سورنسن، وإعادة احتضان مع حل PLP O /N في 4 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك، في بداية أو في نهاية بروتوكول تلطيخ الفلور المناعي، يمكن إدخال بضع خطوات إضافية لمواجهة الفلور التلقائي. في بداية البروتوكول (بين الخطوتين 4.1 و 4.2) يمكن إجراء علاج مع محلول بوروهيدريد الصوديوم (1 ملغ/مل في TBS؛ 3 مرات لمدة 10 دقيقة)، أو علاج ببيروكسيد الهيدروجين (3%؛ 15 دقيقة) أو علاج بالجليسين (0.1 مليون في TBS؛ 1h) يمكن إجراء. وكبديل في نهاية تلطيخ (بين الخطوتين 4.8 و4.9)، يمكن إجراء علاج مع التربان الأزرق (250 ميكروغرام/مل في TBS؛ 20 دقيقة) أو مع سودان بلاك (0.5% في 70% EtOH; 30 دقيقة). ومع ذلك، في جميع الحالات، بالإضافة إلى الحد من الفلور التلقائي، وسوف يحدث أيضا انخفاض في إشارة محددة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام الخزعات التي تركز بشكل غير صحيح لأداء الكلاسيكية مشرق المجال المناعي. في هذه الحالة، ومع ذلك، فإن التصبغ المناعي المزدوج للتمركز من 5G4 وPGP9.5 سيكون أكثر تحديا وصعوبة لتحليل.
خطوة حاسمة أخرى هي إدخال خزعة الجلد في كريومولدل (الخطوة 3.3). إن اتجاه الخزعة نحو شفرة القطع أمر بالغ الأهمية للحصول على شرائح توجد فيها البشرة والأدمة. المحور الطولي (البشرة-الأدمة) يجب أن تكون موازية إلى الجزء السفلي من cryomold، بحيث الجانب من الخزعة، وليس أعلى أو أسفل، تواجه المشغل. اختيار شرائح سمك، 50 ميكروم، وفقا للمبادئ التوجيهية الأوروبية لاستخدام خزعة الجلد كأداة تشخيصية7. وعلاوة على ذلك، وبالنسبة لكشف المجاميع αSyn، يسمح سمك 50 ميكرومتر مع احتمال أكبر أن يكون داخل القسم المزيد من الهياكل الجلدية، حيث توجد أساسا في PD الرواسب المرضية. لا ينصح لوضع المقاطع على الشريحة لتلطيخ، ولكن بدلا من ذلك، تلطيخ عائمة مجانية إلزامية. لهذا الإجراء، والصعوبة الرئيسية هي لنقل المقاطع من بئر إلى آخر باستخدام فرشاة صغيرة دون الإضرار المقاطع. من المستحسن إدخال طرف الفرشاة أسفل الخزعة التي تطفو في السائل، مما يسمح للخزعة لتسوية على طرف الفرشاة، وحمل الخزعة بلطف من بئر إلى آخر، وتزج الخزعة في الحل الجديد وإزالة الفرشاة التأكد من أن لا تترك بقايا الخزعة على الفرشاة. من المهم أن يكتسب المشغل مهارات يدوية مع الممارسة.
في الختام، هذا هو بروتوكول قصير وسهل للتعامل الأمثل والفلورسنت المناعي من خزعة الجلد. ميزة هذا البروتوكول فيما يتعلق بالدراسات السابقة هو استخدام الأجسام المضادة 5G4، مما يسمح للكشف عن المجاميع الصغيرة αSyn لأول مرة في ألياف الأعصاب اللاإرادية الجلدية من مرضى PD. يمكن استخدامه لأغراض التشخيص في أنواع مختلفة من الاضطرابات العصبية التي تنطوي على PNS، وخاصة في المراحل المبكرة، عندما يمكن أن يكون العلاج المحتمل أكثر فعالية. القيود على الطريقة هي أن حساسية P-αSyn وخصوصية 5G4 لا تزال دون المستوى الأمثل ولكن مزيج من علامات مختلفة في الدراسات المستقبلية يمكن بالتأكيد تحسين الغلة التشخيصية لخزعة الجلد في PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر باركنسون شفايز وABREOC (المجلس الاستشاري للبحث العلمي في كانتون إنتي أوسبيدالييرو) على دعمهما المالي لهذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
