Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für einen frei schwebenden indirekten Immunfluoreszenz-Assay auf Hautbiopsieabschnitten vor, das die Identifizierung von krankheitsspezifischen Konformationsvarianten von Alpha-Synuclein ermöglicht, die an der Parkinson-Krankheit und mehreren Proteinen der peripheren Nervensystems.
Abstract
Bis heute steht für die meisten neurodegenerativen Erkrankungen nur eine postmortale histopathologische definitive Diagnose zur Verfügung. Bei der Parkinson-Krankheit (PD) beruht die Diagnose immer noch nur auf klinischen Anzeichen einer motorischen Beteiligung, die später im Krankheitsverlauf auftreten, wenn die meisten dopaminergen Neuronen bereits verloren sind. Daher besteht ein starker Bedarf an einem Biomarker, der Patienten zu Beginn der Krankheit oder mit dem Risiko, sie zu entwickeln, identifizieren kann. In den letzten Jahren hat sich die Hautbiopsie als ausgezeichnetes Forschungs- und Diagnoseinstrument für periphere Nervenkrankheiten wie kleine Faserneuropathie erwiesen. Interessanterweise, eine kleine Faser Neuropathie und Alpha-Synuclein (Syn) neuronale Ablagerungen wurden durch Hautbiopsie bei PD-Patienten gezeigt. Tatsächlich hat die Hautbiopsie den großen Vorteil, dass sie ein leicht zugängliches, minimalinvasives und schmerzloses Verfahren ist, das die Analyse von peripherem Nervengewebe ermöglicht, das anfällig für die Pathologie ist. Darüber hinaus ermöglicht die Möglichkeit, die Hautbiopsie im Zuge der Nachbeobachtung desselben Patienten zu wiederholen, die Untersuchung der Längskorrelation mit dem Krankheitsverlauf. Wir haben ein standardisiertes, zuverlässiges Protokoll eingerichtet, um das Vorhandensein von Syn-Aggregaten in den Hautnervenfasern des PD-Patienten zu untersuchen. Dieses Protokoll beinhaltet nur wenige kurze Fixierungsschritte, eine Kryotome-Sektion und dann eine frei schwebende Immunfluoreszenz-Doppelfärbung mit zwei spezifischen Antikörpern: Antiprotein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5), um die hautförmigen Nervenfasern zu markieren, und Anti-5G4 zum Nachweis Syn-Aggregate. Es ist ein vielseitiges, empfindliches und einfach durchzuführendes Protokoll, das auch für andere Proteine angewendet werden kann, die für Hautnerven von Interesse sind. Die Fähigkeit, Syn-Aggregate zu markieren, ist ein weiterer Schritt nach vorn bei der Verwendung der Hautbiopsie als Werkzeug zur Etablierung einer vor-mortem histopathologischen Diagnose von PD.
Introduction
Die Hautbiopsie hat als diagnostisches und forschungsmedizinisches Instrument im Bereich neurologischer Erkrankungen1eine große Bedeutung erlangt. Tatsächlich enthalten Epidermis und Dermis reichlich somatische sensorische Nervenfasern (myeliniert und unmyeliniert), nozizeptive freie Nervenenden, sensorische Rezeptoren und autonome Innervation von Schweißdrüsen, Gefäßen, Talgdrüsen und Muskelarrector Pilorum 2.
In der Mitte des 20. Jahrhunderts erlaubte das Setup für die Immunhistochemie von PGP9.5-Antikörpern den Nachweis einer umfangreichen Innervation der menschlichen Epidermis-Säugetierhaut3. PGP9.5 ist eine Carboxyl-Terminal-Hydrolase, die gleichmäßig entlang von Axonen des zentralen und peripheren Nervensystems (PNS) verteilt ist. Die Verfügbarkeit dieses Antikörpers ermöglichte es nicht nur, die Morphologie und Anatomie von PNS in der Haut zu klären, sondern auch die Untersuchung von damit verbundenen Krankheiten3,4. Die Hautbiopsie trug zur Definition einer neuen klinischen Einheit bei: der kleinen Faserneuropathie. Mehrere internationale Gruppen demonstrierten den Zusammenhang zwischen dem Verlust von intraepidermalen Nervenfasern und Symptomen/Zeichen einer kleinen Faserneuropathie5 durch Hautbiopsieanalyse und lieferten standardisierte Protokolle für die Nervenmorphometrie sowie normative Referenzwerte, die in der klinischen Praxis verwendet werden sollen6,7,8.
Kürzlich hat eine große Menge an Beweisen gezeigt, dass neurodegenerative Erkrankungen, gekennzeichnet durch falsch gefaltete Proteinansammlungen im zentralen Nervensystem, Multisystempathologiensind 9. In der Tat, PD ist gekennzeichnet durch die Syn-Akkumulation im dopaminergen Neuron von Substantia nigra, aber es wurde gezeigt, dass ,Syn und seine pathologische Form, phosphoryliertes Syn (P-Syn), auch in den peripheren Geweben nachgewiesen werden konnte. Magen-Darm-Schleimhaut10, Speicheldrüsen11, hautautonome Fasern um Schweißdrüsen und pilomotorische Muskeln12,13,14, zeigen Immunreaktivität zu pathogenen Formen von Syn, in nach Braak Hypothese, dass faszinierend postulieren, dass 'Syn Pathologie kann in PNS lange im Voraus beginnen, vor seiner Akkumulation im Gehirn15. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von p-Syn in Hautnerven von Patienten mit REM-Verhaltensstörungen nachgewiesen, die als prodromal PD16,17 gelten, so dass hautpathologische Syn als vielversprechende frühe periphere histopathologischen Marker der Synukenopathie.
Der Zusammenhang der kleinen Faserneuropathie in PD wurde bereits gezeigt und es wurde festgestellt, dass intraepidermale Nervenfasern Dichte reflektiert Krankheitsprogression18,19. Daher ist die Hautbiopsie ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Neurodegeneration bei PD und für die Etablierung einer vor-mortem histopathologischen Diagnose der Krankheit. Tatsächlich hat die Hautbiopsie einen großen Vorteil, ein leicht zugängliches und minimalinvasives Verfahren zu sein, das die Analyse von Nervengewebe ermöglicht, das anfällig für die Pathologie ist. Schließlich ermöglicht die Möglichkeit, die Hautbiopsie im Zuge der Nachbeobachtung der gleichen Patienten zu wiederholen, die Untersuchung der Längskorrelation mit dem Fortschreiten der Erkrankung.
In unserem Labor, die Nutzung einer doppelten Immunfärbung mit PGP9.5 und dem konformen monoklonalen 5G4-Antikörper, der krankheitsspezifische Formen von Syn einschließlich kleiner Aggregate20,21, erkennt, konnten wir die Vorhandensein von Syn-Aggregaten in Hautnerven mit einer vielversprechenden hohen diagnostischen Effizienz19. Die Immunfluoreszenzanalyse der Hautbiopsie bei Konformationserkrankungen zeichnet sich als vielversprechende Quelle von Biomarkern aus, indem sowohl der Nachweis von Proteinaggregaten als auch das Maß der Neurodegeneration in vivo kombiniert werden. Im Folgenden veranschaulichen wir ein einfaches und vielseitiges Protokoll über den Umgang mit der Hautbiopsie und die Durchführung der frei schwebenden Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis von Syn-Aggregaten. Darüber hinaus kann dieses Protokoll angepasst werden, um jedes andere Protein von Interesse, das in Haut-PNS ausgedrückt wird, zu zielen.
Das folgende Studienprotokoll wurde verwendet, um den diagnostischen Nutzen der aggregierten Syn-Analyse in den PNS von PD durch Hautbiopsie19zu bewerten. Inklusionskriterien für PD waren: eine definitive klinische Diagnose nach den diagnostischen Kriterien der UK Brain Bank, die Krankheitsdauer von mindestens 3 Jahren, keine Familiengeschichte und keine größeren kognitiven Beeinträchtigungen oder großen dysautonomen Symptome in der Geschichte. Ausschlusskriterien waren bekannte Ursachen der Neuropathie (glykiertes Hämoglobin, Kreatinin, Vitamin B12, TSH, Serumimmunfixation, HIV, HCV, Syphilis und Borreliose). Jedes Subjekt wurde an drei anatomischen Stellen (Hals bei C8-Dermatomal, Oberschenkel 10 cm über dem Knie, Bein 10 cm über seitlichem Malleolus) seitlich mit 3 mm Durchmesser biopsien, was klinisch stärker betroffen war. Im Allgemeinen geht es im folgenden Protokoll um den Umgang mit der Hautbiopsie und die Durchführung der frei schwebenden Immunfluoreszenzfärbung und -analyse. Daher kann es angepasst und für den Nachweis anderer Proteine von Interesse im Hautgewebe verwendet werden.
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Protocol
Das Protokoll wurde von der kantonalen Ethikkommission genehmigt und alle eingeschriebenen Probanden gaben der Studie schriftlich ihre Zustimmung.
1. Hautbiopsie-Sammlung
- Lassen Sie einen qualifizierten Arzt die Hautbiopsie in einem geeigneten klinischen Umfeld durchführen.
- Wählen Sie den Bereich, um die Hautbiopsie durchzuführen und reinigen Sie sie mit einem Alkoholtupfer.
- Bereiten Sie die Anästhetikumlösung mit 1 cc Lidocain 2%.
- Mit der Nadel parallel zum Bereich, injizieren lokale Anästhesie subkutan.
- Nach der Überprüfung der Wirkung der Anästhesie, nehmen Sie die 3 mm Einweg-Stanz und wenden Sie Rotations- und empfindlichen Abwärtsdruck, um es nach unten durch die Epidermis und Dermis zu drehen, bis das subkutane Fett erreicht ist.
- Ziehen Sie den Stempel zurück.
- Verwenden Sie Einwegzange, um den Hautstecker vorsichtig nach oben zu ziehen.
- Verwenden Sie eine Schere, um die Basis der Probe auf der Ebene des Fettgewebes auszuschneiden.
- Legen Sie die Probe in ein Rohr, das 10 ml Periodat-Lysin-Paraformaldehyd (PLP) fixative Lösung enthält.
- Desinfizieren Sie den Bereich und bedecken Sie ihn mit einem Klebeband.
2. Gewebefixierung und Lagerung
- Erstellen Sie eine neue PLP-Fixierungslösung (siehe Tabelle 1).
- Unmittelbar nach der Entnahme der Hautbiopsie in ein Rohr mit 10 ml PLP-Fixierlösung tauchen und über Nacht (O/N) bei 4 °C inkubieren.
- Am Tag danach, unter der Dunstabzugshaube, entfernen Sie die PLP Fixativ sanft und in der gleichen Röhre, waschen Sie die Biopsie 3 mal für 5 min mit 5 ml von 0,1 M Sorensen Lösung (Tabelle 1).
- Entsorgen Sie die Lösung des Sorensen und inkubieren Sie die Biopsie mit 5 ml kryoschützender Lösung O/N bei 4 °C.
- Die Biopsie bei 4 °C aufbewahren, wenn der Schnitt mit einem Kryotom innerhalb von 1 Woche durchgeführt wird; die Biopsie bei -20 °C aufbewahren, wenn der Schnitt innerhalb von 3 Monaten durchgeführt wird; die Biopsie in einen Kryomold (Schritte 3.2-3.4) einbetten und bei -80 °C lagern, um sie über einen längeren Zeitraum zu konservieren.
3. Gewebeschnitt mit einem Kryotome
- Setzen Sie das Kryotome auf -20 °C.
- Nehmen Sie einen Kryomold und füllen Sie es mit dem Kryo-Einbettungsmedium. Vermeiden Sie blasen.
- Mit einer Pinzette tauchen Sie die Biopsie in das Kryo-Einbettungsmedium mit der Längsachse (Epidermis - Dermis) parallel zum Boden des Kryomolds ein.
- Fangen Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein, um einen festen Würfel mit Kryo-Einbettungsmedium zu erhalten, das die Biopsie in der richtigen Ausrichtung enthält.
- Legen Sie die Probe in den Kryostat und warten Sie 30 min, damit sich die Biopsie akklimatisiert.
- Fixieren Sie die Probe auf dem Kryostat und schneiden Sie 50 m Abschnitte.
- Mit Hilfe einer kleinen Bürste die Kryo-Sektionen in eine 96-Well-Platte mit 200 l Frostschutzlösung in jedem Brunnen übertragen. Ein Abschnitt pro Brunnen.
- Bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Wenn die Analyse der gesamten Biopsie nicht analysiert wird, schneiden Sie sie nur teilweise. In diesem Fall müssen die Abschnitte bei -20 °C und der verbleibende Teil der Biopsie bei -80 °C gelagert werden, um sie über einen längeren Zeitraum zu konservieren.
4. Immunfluoreszenz Färbung
- Füllen Sie eine 96-Well-Platte mit 100 l Waschlösung.
- Übertragen Sie die zu analysierenden Abschnitte von der Lagerplatte auf die neue, die die Waschlösung enthält. 1 Abschnitt pro Brunnen (4 Abschnitte pro anatomischer Stelle, pro Patient: in der Regel insgesamt 12 Abschnitte pro Patient).
- Lassen Sie den Abschnitt in der Waschlösung für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Übertragen Sie den Abschnitt in einen anderen Brunnen, der die gleiche Lösung enthält, und wiederholen Sie die Wäsche.
- Verschieben Sie die Abschnitte in neue Brunnen, die 100 l Blockierlösung enthalten, und brüten Sie für mindestens 90 min und für maximal 4 h bei RT.
- Verdünnen Sie die primären Antikörper Anti-PGP9.5 (Rabbit polyklonal, 1:1000) und Anti-5G4 (Maus monoklonal, 1:400) in der Arbeitslösung.
- Übertragen Sie die Abschnitte in neue Brunnen, die 100 l der Arbeitslösung der primären Antikörper enthalten, und inkubieren Sie sie O/N bei RT.
- Waschen Sie die Abschnitte in Schritt 4.3 2 mal für mindestens 10 min bei RT, mit 100 l Waschlösung.
- Verdünnen Sie die sekundären Antikörper (Konjugat mit verschiedenen Fluorophoren) Ziege Anti-Rabbit, um PGP9.5 (1:700) und eine Ziege Anti-Maus zu erkennen, um 5G4 (1:700) in der Arbeitslösung zu erkennen.
- Übertragen Sie die Abschnitte in neue Brunnen, die 100 l der Arbeitslösung der Sekundärantikörper für 90 min bei RT enthalten. Von diesem Punkt aus bedecken Sie die 96-Well-Platte mit Aluminiumfolie, um das Bleichen von Fluorophor konjugiert mit Sekundärantikörpern zu vermeiden.
- Waschen Sie die Abschnitte in Schritt 4.3 2 mal für mindestens 10 min, wobei 100 l der Waschlösung.
- Übertragen Sie die Abschnitte in neue Brunnen mit 100 l DAPI (verdünnt 1:5.000 in PBS 1x) für 5 min bei RT.
- Waschen Sie die Abschnitte in Schritt 4.3 2 mal für mindestens 10 min, wobei 100 l der Waschlösung.
- Montieren Sie die Abschnitte auf einer Folie in der richtigen Position, um Fehlfalten zu vermeiden.
- Fügen Sie ein paar Tropfen des Montagemediums auf dem Schlitten und Abdeckung mit einem Deckelschlupf.
- Lassen Sie die Dias O/N trocknen, bevor Sie das Konfokal-/Fluoreszenzmikroskop verwenden.
- Bewahren Sie die Dias in einer geeigneten Box bei 4 °C auf, um die Lichteinwirkung zu vermeiden. Bei genauer Speicherung ist das Signal ca. 6 Monate lang sichtbar.
HINWEIS: Die Übertragung eines Abschnitts von der 96-Wellplatte mit den neu geschnittenen Scheiben auf die 96-Well-Platte mit der Waschlösung (Schritt 4.1) erfolgt mit einer kleinen Bürste, die hilft, die Biopsie aufzunehmen. Nach der Übertragung des Abschnitts in den ersten Brunnen, jedes Mal, wenn die Scheibe mit einer anderen Lösung inkubiert werden muss, bewegen Sie es von gut zu gut mit Hilfe des Pinsels.
5. Immunfluoreszenz-Bildgebung
- Zeigen Sie Abschnitte unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop (20X, 40x oder höher Vergrößerung, verwenden Sie aufeinanderfolgende Frames von 2 m Schritten auf einem Z-Stack-Plan für beste Ergebnisse).
- Bilder mit einer mit dem Mikroskop verbundenen Kamera erfassen
-
Verwenden Sie eine geeignete Bildgebungssoftware (z.B. ImageJ), um positive Signale in Abschnitten in Bezug auf räumliche Verteilung und Intensität des Signals zu analysieren. Führen Sie dazu die unten beschriebenen Schritte aus.
- Öffnen Sie die Datei mit ImageJ-Software.
- Klicken Sie auf Bild > Farbe > Geteilte Kanäle, um jeden Farbkanal zu analysieren.
- Klicken Sie auf Bild > Stapel > Z-Projekt, um eine Zusammenführung mehrerer Abschnittserfassungen zu erhalten.
- Klicken Sie auf Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen, um eine Zusammenführung verschiedener Farbkanäle derselben Erfassung zu erhalten.
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Frostschutzlösung (bei 4 °C bis zu 6 Monate lagern) |
30% Glycerin 30% Ethylenglykol 30% dH2O 10% 2x Phosphatpuffer |
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Blockierlösung (vorbereitung im Moment) |
4% Normales Ziegenserum 1% Triton X-100 in Waschlösung |
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Kryo-Schutz (bei 4 °C bis zu 6 Monate lagern) |
20% Glycerin 80% Sorensens Lösung |
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Dinatriumhydrogenphosphatlösung (Lager bei RT bis zu 6 Monate) |
0,45M Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) in dH2O Filter in einer sterilen Flasche |
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Lysin-Lösung (bei 4 °C bis zu 3 Wochen lagern) |
50% der 0,3 M L-Lysin-Monohydrochloridlösung 50% der 0,1Mio Sorensen-Lösung pH7,6 pH 7,4, Filter in einer sterilen Flasche |
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Paraformaldehyd (PFA) 8% (unter Rauchhaube vorbereiten und bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern) |
2,6 M PFA in dH2O (bis 55°C_nicht überschreiten 60 °C, Filter in einer sterilen Flasche |
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Phosphatpuffer 2x (bei 4 °C bis zu 6 Monate lagern) |
6% Mononatriumphosphat (NaH2PO4) Lösung 45% Dinatriumphosphat (Na2HPO4) Lösung in dH2O |
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PLP-Fixlösung (bereiten Sie sich im Moment, unter Rauchhaube ) |
25% Paraformaldehyd 8% 0,01M Natrium (Meta)Periodat 75% Lysin-Lösung< |
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Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (Lager bei RT bis zu 6 Monate) |
0,52M Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4*H2O) in dH2O Filtern Sie in einer sterilen Flasche. |
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Sorensens Lösung (bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern) |
2,5% Mononatriumphosphatlösung 18,7% Dinatriumphosphatlösung pH7.6, in dH2O |
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Waschlösung (vorbereitung im Moment) |
0,25 M Trizma Basis 0,26 M NaCl pH7.6, in dH2O |
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Arbeitslösung (vorbereitung im Moment) |
50% Blockierlösung 50% Waschlösung |
Tabelle 1: Erforderliche Lösungen. Liste der erforderlichen Lösungen für das Protokoll und kurze Beschreibung der Vorbereitung.
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Representative Results
Nach dem beschriebenen Verfahren (Abbildung 1) haben wir Syn-Aggregate, mit 5G4-Antikörpern gekennzeichnet, in dermalen Nervenfasziden festgestellt, die autonome Strukturen von PD-Patienten innervieren. Die Morphologie der Alpha-Synuclein-Ablagerungen erscheint als gepunktetes Signal entlang der Axone dermaler Nerven (Abbildung 2). In der Tat, ausnutzen dieses Protokoll bei 19 PD-Patienten und 17 Kontrollen in Hautbiopsien an drei anatomischen Stelle (Zervix, Oberschenkel und distalen Bein) fanden wir, dass 5G4 hatte 81% der Empfindlichkeit und 86% der Spezifität in Bezug auf gesunde Kontrollen und P-Syn hatte 56% der Empfindlichkeit und 100% der Spezifität19.
Insbesondere fanden wir 5G4 und P-Syn positive Ablagerungen vor allem in Nerven um Schweißdrüsen, sondern auch in Muskelerector Pili, kleine Gefäße, und subepidermalen und dermalen Plexus, nie in intraepidermalen Nervenfasern.
Im Allgemeinen ist es innerhalb des Lumens der Schweißdrüse möglich, ein unspezifisches Signal zu beobachten, das als 5G4/ P-Syn Positivität fehlinterpretiert werden könnte. Diese Art von Signal ist gepunktet, sphärisch und ist höchstwahrscheinlich auf intraluminal autofluoreszierendes Material zurückzuführen, wie wir in technischen Kontrollen ohne primäre und sekundäre Antikörper gezeigt haben (Abbildung 3). Die Co-Lokalisierung mit PGP9.5, die die Nervenfasern markiert, die morphologisch fadenförmig und länglich sind, hilft, das richtige Signal zu identifizieren. Daher wird die Spezifität des 5G4-Signals durch eine doppelte Immunfärbung mit einem axonalen Marker stark erhöht (Abbildung 4).
Eine genaue Fixierung der Biopsie ist ein zwingender Faktor für die gute Qualität der Immunfluoreszenzfärbung und für die zuverlässige Interpretation der fluoreszierenden Signale. Wenn das Fixativ nicht richtig vorbereitet ist oder eine Überfixierung aufgetreten ist, wird das Ergebnis eine hohe Autofluoreszenz sein, die das Signal von Nervenfasern maskiert, die die dermal-epidermale Kreuzung kreuzen oder die wichtigsten dermalen Strukturen innervieren (Abbildung5 B, D, F). In diesem Fall wird die Unfähigkeit, die PGP9.5-positiven Fasern richtig zu visualisieren, die korrekte Analyse auch 5G4 erschweren.
Schließlich kann dieses Protokoll für den Nachweis jedes Proteins von Interesse verwendet werden, einschließlich unter anderem syn, Syn, P-Syn oder Tyrosin-Hydroxylase (TH) und vasoaktives intestinäres Peptid (VIP), die bzw. adrergen und cholinerge Subtyp von autonomen Innervation (Abbildung 6).
Abbildung 1 : Schematische Darstellung des Protokolls. Grafische Darstellung kritischer Schritte bei der Fixierung, dem Schnitt und der Färbung von Hautabschnitten zur Visualisierung von Syn-Aggregaten in kutanen peripheren Nervenfasern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Vorhandensein von 5G4-Aggregaten in dermalen Nervenfasern. Konfokale verschmolzene Z-Stack-Bilder der Immunfluoreszenz mit PGP9.5 (grün) und 5G4 (rot) von dermalen Nerven um Schweißdrüsen bei PD-Patienten (A-C) und gesundem Thema (D-F). Diese Zahl wird von 19geändert. 3D-Visualisierung der gleichen Schweißdrüse zeigte oben von PD (G) und gesunden (H) Themen. Angezeigt durch weiße Pfeile, gelbe Kolokalisierung der beiden Markierungen entlang der Axone. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Auto-Fluoreszenzsignale: technische Steuerungen. Konfokale zusammengeführte Z-Stack-Bilder von mit DAPI und ohne primärer Antikörper (A-B) gefärbten Hautabschnitt ohne sekundären Antikörper (C-D), ohne primäre und sekundäre Antikörper (E-F). Die Bilder zeigen das Vorhandensein unspezifischer gepunkteter Signale in Schweißdrüsenstrukturen unter allen Bedingungen. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Betrachten Sie Nervenfasern Morphologie, um unspezifisches Signal zu erkennen. Konfokale Zusammenführung von Z-Stack-Bildern der Immunfluoreszenz mit PGP9.5 (grün) und 5G4 (rot) dermalen Nerven um Schweißdrüsen. Weiße Pfeile zeigen positive Strukturen an; Sternchen weisen auf eine unspezifische Färbung in nicht-neuronalen Strukturen hin. Skalenbalken = 50 m. Diese Zahl wird ab Referenz19geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Falsche Fixierung beeinträchtigt die Qualität der Immunfluoreszenzfärbung. Konfokale Verschmelzung von Z-Stack-Bildern der Immunfluoreszenz mit PGP9.5 (grün) und DAPI (blau) von intraepidermalen Nervenfasern (A-B) und dermalen Nerven um Talgdrüse (C-D) und Schweißdrüsen (E-F). Auf der linken Seite Ergebnis der korrekten Fixierung, auf der rechten Seite Ergebnis der Überfixierung. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 : Beispiele für andere Proteine, die in Hautnerven nachweisbar sind. Mikroskopbilder von dermalen Strukturen, die mit einem frei schwebenden Immunfluoreszenztest gefärbt wurden. In rot ,Syn (A), p-Syn (B), und TH (C), in grüner VIP (D). Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir beschreiben einen frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay für Hautbiopsien zur Diagnose von PD: Er nutzt die doppelte Immunfärbung mit Anti-PGP9.5-Antikörpern, einem panaxonalen Marker und Anti-5G4, einem konformationsspezifischen Antikörper, der die aggregierte Form erkennt. von Syn.
Die großen Vorteile der Hautbiopsie zu diagnostischen Zwecken bei PD und möglicherweise bei anderen Proteinkonformationsstörungen sind: 1) der direkte Zugang zu krankheitsanfälligem Nervengewebe durch eine leicht invasive Technik und damit mit einer erwarteten besseren Bestimmung Empfindlichkeit für Syn-Aggregate als biologische Flüssigkeiten wie Blut oder CSF; 2) die Möglichkeit, epidermale und autonome Nervenfaserdichte als Maß für die Neurodegeneration zu erkennen und zu quantifizieren; 3) die Möglichkeit, die Hautbiopsie im Zuge der Nachbeobachtung der gleichen Patienten zu wiederholen, um längs die Korrelation mit dem Fortschreiten der Erkrankung zu untersuchen.
Das hier vorgeschlagene Protokoll ist schnell, vielseitig und hat nur wenige kritische Schritte. Zunächst muss die Gewebefixierung korrekt verfolgt werden, da sonst eine hohe Autofluoreszenz das spezifische Signal verdeckt und die korrekte Analyse der Daten verhindert. Das Paraformaldehyd in der fixativen Lösung sollte frisch gemacht und der pH-Wert von 7,4 genau überprüft werden. Es ist äußerst wichtig, die Bildung von Ameisensäure zu vermeiden, die Biopsien schädigen könnte. Vor der Lagerung und beim Schneiden, wenn die Kompaktheit der Biopsie auf eine falsche Fixierung hindeutet, sollte die Biopsie mit Sorensens Lösung erneut gespült und mit der PLP-Lösung O/N bei 4 °C wieder inkubiert werden. Darüber hinaus können am Anfang oder am Ende des Immunfluoreszenz-Färbeprotokolls einige zusätzliche Schritte eingeleitet werden, um der Autofluoreszenz entgegenzuwirken. Zu Beginn des Protokolls (zwischen den Schritten 4.1 und 4.2) kann eine Behandlung mit Natriumborohydridlösung (1 mg/ml in TBS; 3 mal für 10 min), eine Behandlung mit Wasserstoffperoxid (3%; 15 min) oder eine Behandlung mit Glycin (0,1 M in TBS; 1h) durchgeführt werden. Alternativ kann am Ende der Färbung (zwischen den Schritten 4.8 und 4.9) eine Behandlung mit Trypanblau (250 g/ml in TBS; 20 min) oder mit Sudan Black (0,5% in 70% EtOH; 30 min) durchgeführt werden. In allen Fällen wird es jedoch neben der Reduzierung der Autofluoreszenz auch zu einer Verringerung des spezifischen Signals kommen. Alternativ können falsch fixierte Biopsien zur klassischen Hellfeld-Immunhistochemie verwendet werden. In diesem Fall wird jedoch die doppelte Immunfärbung für die Kolokalisierung von 5G4 und PGP9.5 schwieriger und schwieriger zu analysieren sein.
Ein weiterer kritischer Schritt ist das Einsetzen einer Hautbiopsie in den Kryomold (Schritt 3.3). Die Ausrichtung der Biopsie auf die Schneideklinge ist entscheidend, um Scheiben zu erhalten, in denen Epidermis und Dermis vorhanden sind. Die Längsachse (Epidermis-Dermis) muss parallel zum Boden des Kryomolds sein, so dass die Seite der Biopsie, nicht die Ober- oder Unterseite, dem Bediener gegenübersteht. Die Wahl der Scheibendicke, 50 m, entspricht den europäischen Richtlinien für die Verwendung der Hautbiopsie als diagnostisches Werkzeug7. Darüber hinaus ermöglicht die Dicke von 50 m für eine Syn-Aggregaterkennung mit größerer Wahrscheinlichkeit, innerhalb des Abschnitts mehr dermale Strukturen zu haben, bei denen pathologische Ablagerungen hauptsächlich in PD zu finden sind. nicht empfohlen, die Abschnitte auf der Folie für die Färbung zu platzieren, sondern eine frei schwebende Färbung ist obligatorisch. Bei diesem Verfahren besteht die Hauptschwierigkeit darin, die Abschnitte mit einer kleinen Bürste von einem Brunnen zum anderen zu übertragen, ohne die Abschnitte zu beschädigen. Es wird empfohlen, die Spitze der Bürste unter der Biopsie, die in der Flüssigkeit schwimmt, einzufügen, so dass sich die Biopsie auf der Spitze des Pinsels absetzen kann, die Biopsie sanft von einem Brunnen zum anderen tragen, die Biopsie in die neue Lösung eintauchen und die Bürste entfernen, um sicherzustellen, dass es werden keine Biopsierückstände auf dem Pinsel zurückgelassen. Es ist wichtig, dass der Bediener manuelle Fähigkeiten mit Praxis erwerben.
Zusammenfassend ist dies ein kurzes und einfaches Protokoll für die optimale Handhabung und fluoreszierende Immunfärbung der Hautbiopsie. Der Vorteil dieses Protokolls gegenüber früheren Studien ist die Verwendung von 5G4-Antikörpern, die zum ersten Mal den Nachweis kleiner Aggregate in dermalen autonomen Nervenfasern von PD-Patienten ermöglichen. Es kann potenziell für diagnostische Zwecke in verschiedenen Arten von neurodegenerativen Erkrankungen mit PNS verwendet werden, vor allem in frühen Phasen, wenn potenzielle Heilung am effektivsten sein kann. Einschränkungen der Methode ist, dass die Empfindlichkeit von P-Syn und Spezifität von 5G4 noch suboptimal sind, aber eine Kombination verschiedener Marker in zukünftigen Studien könnte sicherlich die diagnostische Ausbeute der Hautbiopsie bei PD verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Parkinson Schweiz und ABREOC (dem Wissenschaftlichen Forschungsbeirat der Ente Ospedaliero Cantonale) für die finanzielle Unterstützung dieser Studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
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