Summary
Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de inmunofluorescencia indirecta de flotación libre en secciones de biopsia de piel que permite la identificación de variantes de conformación específicas de la enfermedad de la sinucleína alfa implicadas en la enfermedad de Parkinson y múltiples proteínas de la sistema nervioso periférico.
Abstract
Hasta la fecha, para la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas sólo se dispone de un diagnóstico definitivo histopatológico post mortem. Para la enfermedad de Parkinson (PD), el diagnóstico todavía se basa sólo en los signos clínicos de afectación motora que aparecen más adelante en el curso de la enfermedad, cuando la mayoría de las neuronas dopaminérgicas ya se han perdido. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de un biomarcador que pueda identificar a los pacientes al comienzo de la enfermedad o a riesgo de desarrollarla. En los últimos años, la biopsia de piel ha demostrado ser una excelente herramienta de investigación y diagnóstico para enfermedades de los nervios periféricos como la neuropatía de fibra pequeña. Curiosamente, una pequeña neuropatía de fibra y depósitos neuronales alfa de sinucleína (Syn) se han demostrado mediante biopsia de piel en pacientes con DP. De hecho, la biopsia de piel tiene la gran ventaja de ser un procedimiento fácilmente accesible, mínimamente invasivo e indoloro que permite el análisis de tejido nervioso periférico propenso a la patología. Además, la posibilidad de repetir la biopsia de piel en el curso del seguimiento del mismo paciente permite estudiar la correlación longitudinal con la progresión de la enfermedad. Creamos un protocolo estandarizado y confiable para investigar la presencia de agregados de Syn en las fibras nerviosas de la piel del paciente con DP. Este protocolo implica algunos pasos cortos de fijación, un corte criotomo y luego una doble tinción de inmunofluorescencia flotante con dos anticuerpos específicos: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) para marcar las fibras nerviosas cutáneas y anti 5G4 para detectar Agregados de Syn. Es un protocolo versátil, sensible y fácil de realizar que también se puede aplicar para apuntar a otras proteínas de interés en los nervios de la piel. La capacidad de marcar los agregados de La sinción es otro paso adelante en el uso de la biopsia de piel como herramienta para establecer un diagnóstico histopatológico premortem de DP.
Introduction
La biopsia de piel ha adquirido una gran importancia como herramienta de diagnóstico e investigación en el campo de los trastornos neurológicos1. De hecho, la epidermis y la dermis contienen abundantes fibras nerviosas sensoriales somáticas (mielinizadas y no mielinizadas), terminaciones nerviosas libres nociceptivas, receptores sensoriales e inervación autonómica de glándulas sudoríparas, vasos, glándulas sebáceas y arrector muscular pilorum 2.
A mediados del siglo XX, la configuración de la inmunohistoquímica del anticuerpo PGP9.5 permitió la evidencia de una extensa ertración de la piel de mamífero de epidermis humana3. PGP9.5 es una hidrolasa carboxilo-terminal distribuida equitativamente a lo largo de los axones del sistema nervioso central y periférico (PNS). La disponibilidad de este anticuerpo permitió no sólo aclarar la morfología y anatomía del PNS en la piel, sino que también implementó el estudio de enfermedades asociadas a él3,4. La biopsia de piel contribuyó a definir una nueva entidad clínica: la neuropatía de fibra pequeña. Varios grupos internacionales demostraron la asociación entre la pérdida de fibras nerviosas intraepidérmicas y los síntomas/signos de la neuropatía de fibra pequeña5 mediante el análisis de biopsia de piel y proporcionaron protocolos estandarizados para la morfometría nerviosa, así como valores de referencia normativaqueales que se utilizarán en la práctica clínica6,7,8.
Recientemente una gran cantidad de evidencia ha demostrado que las enfermedades neurodegenerativas, caracterizadas por acumulacionesde proteínas mal plegadas en el sistema nervioso central, son patologías multisistema 9. De hecho, la DP se caracteriza por la acumulación de Sinyn en la neurona dopaminérgica de la sustancia nigra,pero se ha demostrado que el syn y su forma patológica, fosforilado sinyn (P-Syn), podrían ser detectados también en los tejidos periféricos. Mucosa gastro-intestinal10, glándulas salivales11, fibras autonómicas de la piel que rodean las glándulas sudoríparas y los músculos pilomotor12,13,14, muestran inmunorreactividad a las formas patógenas de la sinía, en de acuerdo con la hipótesis de Braak de que intrigantemente postular que la patología de La Sinis puede comenzar en PNS con mucha antelación, antes de su acumulación en el cerebro15. Además, se ha demostrado la presencia de p-Syn en los nervios de la piel de pacientes con Trastornos del Comportamiento REM que se consideran PD16prodrómico,17 por lo tanto patológico de la piel - Syn puede ser considerado un prometedor periférico temprano periférico marcador histopatológico de la sinucleinopatía.
La asociación de la neuropatía de fibra pequeña en la DP se ha demostrado previamente y se ha encontrado que la densidad de las fibras nerviosas intraepidémicas refleja la progresión de la enfermedad18,19. Por lo tanto, la biopsia de piel es una herramienta útil para estudiar la neurodegeneración en PD y para establecer un diagnóstico histopatológico premortem de la enfermedad. De hecho, la biopsia de piel tiene una gran ventaja de ser un procedimiento fácilmente accesible y mínimamente invasivo, permitiendo el análisis de tejido nervioso propenso a la patología. Finalmente, la posibilidad de repetir la biopsia de piel en el curso del seguimiento de los mismos pacientes permite estudiar la correlación longitudinal con la progresión de la enfermedad.
En nuestro laboratorio, explotando una doble inmuno-mancha con PGP9.5 y el anticuerpo monoclonal 5G4 específico de la conformación, que reconoce las formas específicas de la enfermedad de Syn incluyendo pequeños agregados20,21, pudimos mostrar el presencia de agregados de la piel con una alta eficiencia diagnósticaprometedora 19. El análisis de inmunofluorescencia de la biopsia de piel en enfermedades conformacionales destaca como una fuente prometedora de biomarcadores al combinar tanto la detección de agregados proteicos como la medida de la neurodegeneración in vivo. A partir de ahora, ilustramos un protocolo fácil y versátil sobre el manejo de la biopsia de piel y la realización de la tinción de inmunofluorescencia flotante para detectar agregados de Syn. Además, este protocolo se puede adaptar para atacar cualquier otra proteína de interés expresada en el PNS de la piel.
El siguiente protocolo de estudio se ha utilizado para evaluar la utilidad diagnóstica del análisis agregado de Syn en el PNS de la DP mediante biopsia de piel19. Los criterios de inclusión para la DP fueron: un diagnóstico clínico definitivo de acuerdo con los criterios de diagnóstico del Banco del Cerebro del Reino Unido, duración de la enfermedad al menos 3 años, sin antecedentes familiares y sin deterioro cognitivo importante o síntomas disautonómicos importantes en la historia. Los criterios de exclusión eran causas conocidas de neuropatía (hemoglobina glicada, creatinina, vitamina B12, TSH, inmunofijación sérica, VIH, VHC, sífilis y borreliosis). Cada sujeto se sometió a biopsias cutáneas de 3 mm de diámetro en tres sitios anatómicos (cuello a nivel dermatómico C8, muslo 10 cm por encima de la rodilla, pierna 10 cm por encima del maléolo lateral) en el lado, que fue clínicamente más afectado. En general, el siguiente protocolo trata de manejar la biopsia de piel y realizar la tinción y análisis de inmunofluorescencia flotante. Por lo tanto, se puede adaptar y utilizar para la detección de otras proteínas de interés en el tejido de la piel.
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Protocol
El protocolo ha sido aprobado por el Comité Cantonal de ética y todos los sujetos inscritos dieron su consentimiento informado por escrito al estudio.
1. Colección de biopsia de piel
- Permita que un médico calificado realice la biopsia de piel en un entorno clínico adecuado.
- Elija el área para realizar la biopsia de piel y límpiela con un hisopo de alcohol.
- Preparar la solución anestésica con 1 cc de lidocaína 2%.
- Con la aguja paralela a la zona, inyecte anestesia local por vía subcutánea.
- Después de comprobar el efecto de la anestesia, tomar el punzón desechable de 3 mm y aplicar presión descendente rotacional y delicada para girarlo hacia abajo a través de la epidermis y la dermis, hasta que se alcance la grasa subcutánea.
- Retira el ponche.
- Utilice fórceps desechables para tirar suavemente del tapón de la piel.
- Use tijeras para cortar la base de la muestra a nivel del tejido graso.
- Coloque la muestra en un tubo que contenga 10 ml de solución fijadora de periodo-lisina-paraformaldehído (PLP).
- Desinfectar el área y cubrirla con un vendaje adhesivo.
2. Fijación y almacenamiento de tejidos
- Realice una solución fijativa PLP fresca (ver Tabla 1).
- Inmediatamente después de la recolección de la biopsia de piel, sumergirla en un tubo que contenga 10 ml de solución fijadora plP e incubarla durante la noche (O/N) a 4 oC.
- Al día siguiente, bajo la campana de humos, retire el fijador PLP suavemente y en el mismo tubo, lave la biopsia 3 veces durante 5 min con 5 ml de la solución de 0,1 M Sorensen (Tabla1).
- Deseche la solución del Sorensen e incubar la biopsia con 5 ml de solución crioprotectora O/N a 4oC.
- Conservar la biopsia a 4oC si el corte con criotome se realiza en el plazo de 1 semana; almacenar la biopsia a -20 oC si el corte se realiza en un plazo de 3 meses; incrustar la biopsia en un criomold (pasos 3.2-3.4) y almacenarla a -80 oC para conservarla durante un período de tiempo más largo.
3. Corte de tejido con un criotome
- Poner el criotome a -20 oC.
- Toma un criomold y llénalo con el medio de incrustación crio- Evite crear burbujas.
- Usando pinzas sumergir la biopsia en el medio de incrustación crio-con el eje longitudinal (epidermis - dermis) paralelo a la parte inferior del criomold.
- Congele la muestra con nitrógeno líquido para obtener un cubo sólido de medio de incrustación criogénica que contenga la biopsia en la orientación correcta.
- Ponga la muestra en el criostato y espere 30 minutos para permitir que la biopsia se aclimate.
- Fijar la muestra en el criostato y cortar secciones de 50 m.
- Con la ayuda de un cepillo pequeño, transfiera las criosecciones en una placa de 96 pocillos que contenga 200 ml de solución anticongelante en cada pocil. Una sección por pozo.
- Conservar a -20oC.
NOTA: Si no se analiza el análisis completo de la biopsia, córtala solo parcialmente. En este caso, las secciones deben almacenarse a -20 oC y la parte restante de la biopsia a -80 oC para conservarla durante un período de tiempo más largo.
4. Mancha de inmunofluorescencia
- Llene una placa de 96 pocillos, con 100 ml de solución de lavado.
- Transfiera las secciones a analizar de la placa de almacenamiento a la nueva que contenga la solución de lavado. 1 sección por cada pozo (4 secciones por sitio anatómico, por paciente: por lo general un total de 12 secciones por paciente).
- Deje la sección en la solución de lavado durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). Transfiera la sección a otro pozo que contenga la misma solución y repita el lavado.
- Mover las secciones a nuevos pozos que contengan 100 ml de solución de bloqueo e incubar durante al menos 90 min y durante un máximo de 4 h a RT.
- Diluir los anticuerpos primarios anti-PGP9.5 (Rabbit polyclonal, 1:1000) y anti-5G4 (Ratón monoclonal, 1:400) en la solución de trabajo.
- Transfiera las secciones a nuevos pozos que contengan 100 ml de la solución de trabajo de los anticuerpos primarios e incubarlas en RT.
- Como paso 4.3, lave las secciones 2 veces durante al menos 10 minutos a RT, con 100 sal de solución de lavado.
- Diluir los anticuerpos secundarios (conjugadocon diferentes fluoróforos) Cabra anti-Conejo para detectar PGP9.5 (1:700) y un anti-ratón de cabra para detectar 5G4 (1:700) en la solución de trabajo.
- Transfiera las secciones a nuevos pozos que contengan 100 ml de la solución de trabajo de los anticuerpos secundarios durante 90 minutos a RT. A partir de este punto, cubrir la placa de 96 pozos con papel de aluminio para evitar el blanqueo de fluoróforo conjugado con anticuerpos secundarios.
- Como paso 4.3, lave las secciones 2 veces durante al menos 10 min, con 100 sL de la solución de lavado.
- Transfiera las secciones a nuevos pozos que contengan 100 ml de DAPI (diluido 1:5.000 en PBS 1x) durante 5 min en RT.
- Como paso 4.3, lave las secciones 2 veces durante al menos 10 min, con 100 sL de la solución de lavado.
- Monte las secciones de una diapositiva en la posición correcta evitando el desdoblamiento.
- Agregue unas gotas del medio de montaje en la diapositiva y cúbrala con un cubreobjetos.
- Deje que los portaobjetos se sequen con O/N antes de utilizar el microscopio confocal/fluorescencia.
- Conservar las diapositivas en una caja adecuada a 4oC evitando la exposición a la luz. Si se almacena con precisión, la señal será visible durante unos 6 meses.
NOTA: La transferencia de una sección de la placa de pozo 96 que contiene las rodajas recién cortadas a la placa de 96 pozos que contiene la solución de lavado (paso 4.1) se realiza utilizando un pequeño cepillo que ayuda a recoger la biopsia. Después de la transferencia de la sección al primer pozo, cada vez que la rebanada necesita ser incubada con una solución diferente, muévela de bien a pozo con la ayuda del cepillo.
5. Imágenes de inmunofluorescencia
- Vea secciones bajo un microscopio de fluorescencia invertida o un microscopio confocal (aumento 20X, 40x o superior, utilice fotogramas sucesivos de incrementos de 2 m en un plan de pila Z para obtener mejores resultados).
- Adquirir imágenes por una cámara conectada por microscopio
-
Utilice un software de imagen adecuado (es decir, ImageJ) para analizar señales positivas en secciones en términos de distribución espacial e intensidad de la señal. Para ello, realice los pasos mencionados a continuación.
- Abra el archivo con el software ImageJ.
- Haga clic en Imagen > color > canales divididos para analizar cada canal de color.
- Haga clic en Imagen > pila > Proyecto Z para obtener una combinación de varias adquisiciones de sección.
- Haga clic en Imagen > color > fusionar canales para obtener una combinación de diferentes canales de color de la misma adquisición.
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Solución anticongelante (almacenar a 4 oC durante un máximo de 6 meses) |
30% Glicerol 30% Etilenglicol 30% dH2O 10% 2x tampón de fosfato |
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Solución de bloqueo (prepárese en este momento) |
4% Suero normal de cabra 1% Tritón X-100 en Solución de lavado |
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Crio-protector (almacenar a 4 oC durante un máximo de 6 meses) |
20% Glicerol 80% solución de Sorensen |
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Solución de fosfato de hidrógeno disódico (almacenar en RT hasta 6 meses) |
0.45M Fosfato de hidrógeno disódico (Na2HPO4) en dH2O Filtrar en una botella estéril |
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Solución de lisina (almacenar a 4oC hasta 3 semanas) |
50% de 0.3M Solución de monohidrocloruro de L-lisina 50% de la solución de 0.1M Sorensen pH7.6 pH 7.4, filtrar en una botella estéril |
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Paraformaldehyde (PFA) 8% (preparar bajo la campana de humo y almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes) |
2.6M PFA en dH2O (a 55oC_no exceder los 60oC para evitar la formación de filtro en una botella estéril |
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Tampón de fosfato 2x (almacenar a 4 oC durante un máximo de 6 meses) |
6% Solución de fosfato monosódico (NaH2PO4) 45% Solución de fosfato disódico (Na2HPO4) en dH2O |
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Solución fijativa PLP (prepárese en este momento, bajo la campana de humos) |
25% Paraformaldehyde 8% 0.01M Sodium (meta)periodato 75% Solución de lisina< |
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Fosfato dihidrógeno sódico monohidrato (almacenar en RT hasta 6 meses) |
0.52M Fosfato dihidrógeno sódico monohidrato (NaH2PO4*H2O) en dH2O Filtrar en una botella estéril. |
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Solución de Sorensen (almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes) |
2.5% Solución de fosfato monosódico 18,7% Solución de fosfato disódico pH7.6, en dH2O |
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Solución de lavado (prepárese en este momento) |
Base Trizma de 0.25M 0.26M NaCl pH7.6, en dH2O |
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Solución de trabajo (prepárese en este momento) |
Solución de bloqueo del 50% 50% Solución de lavado |
Tabla 1: Soluciones requeridas. Lista de soluciones necesarias para el protocolo y una breve descripción de cómo prepararlo.
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Representative Results
Siguiendo el procedimiento descrito (Figura1), detectamos los agregados de Syn, etiquetados con anticuerpo 5G4, en fascículos nerviosos dérmicos que inercen estructuras autonómicas de pacientes con DP. La morfología de los depósitos de alfa-sinucleína aparece como una señal punteada a lo largo de los axónicos de los nervios dérmicos (Figura2). De hecho, aprovechando este protocolo en 19 pacientes con DP y 17 controles en biopsias de piel en tres sitios anatómicos (cervical, muslo y pierna distal) encontramos que 5G4 tenía 81% de sensibilidad y 86% de especificidad respecto a los controles saludables y P--Syn tenía 56% de sensibilidad y el 100% de la especificidad19.
En particular, encontramos depósitos positivos 5G4 y P-Syn principalmente en los nervios alrededor de las glándulas sudoríparas, pero también en el erector muscular pili, vasos pequeños, y plexo subepidérmico y dérmico, nunca en fibras nerviosas intraepidérmicas.
Generalmente, dentro del lumen de la glándula sudorípara, es posible observar una señal inespecífica, que podría ser malinterpretada como positividad 5G4 / P--Syn. Este tipo de señal está punteada, esférica y es debido probablemente al material autofluorescente intraluminal, como hemos demostrado en controles técnicos sin anticuerpos primarios y secundarios (Figura3). La colocalización con PGP9.5 que marca las fibras nerviosas, que morfológicamente son filamentosas y alargadas, ayuda a identificar la señal correcta. Por lo tanto, la especificidad de la señal 5G4 se incrementa en gran medida por una inmunomancha doble con un marcador axonal (Figura4).
Una fijación precisa de la biopsia es un factor obligatorio para la buena calidad de la tinción de inmunofluorescencia y para la interpretación fiable de las señales fluorescentes. Si el fijador no está preparado correctamente o si se ha producido una sobrefijación, el resultado será una alta autofluorescencia que enmascarará la señal de las fibras nerviosas que cruzan la unión dérmica-epidérmica o inerva las estructuras dérmicas principales (Figura5 B, D, F). En este caso, la incapacidad de visualizar correctamente las fibras positivas PGP9.5 hará difícil analizar correctamente también 5G4.
Por último, este protocolo se puede utilizar para la detección de cualquier proteína de interés, incluyendo entre otros el subtipo de la energía y la artritis inervación (Figura6).
Figura 1 : Representación esquemática del protocolo. Representación gráfica de los pasos críticos en la fijación, corte y tinción de las secciones de la piel para la visualización de los agregados de la piel en las fibras nerviosas periféricas cutáneas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Presencia de agregados 5G4 en fibras nerviosas dérmicas. Imágenes de pila Z fusionadas confocales de inmunofluorescencia con PGP9.5 (verde) y 5G4 (rojo) de nervios dérmicos alrededor de las glándulas sudoríparas en pacientes con DP (A–C) y sujeto sano (D-F). Esta cifra se modifica a partir de 19. La visualización 3D de la misma glándula sudorípara se mostró anteriormente de PD (G) y sujetos sanos (H). Indicado por flechas blancas, colocación amarilla de los dos marcadores a lo largo de los axons. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Señales autofluorescentes: controles técnicos. Imágenes de la pila Z fusionada confocal de la sección de la piel teñida con DAPI y sin el anticuerpo primario (A-B), sin el anticuerpo secundario (C-D), sin anticuerpos primarios y secundarios (E-F). Las imágenes muestran la presencia de señales punteadas no específicas en las estructuras de las glándulas sudoríparas en todas las condiciones. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Considere la morfología de las fibras nerviosas para reconocer señales no específicas. Combinaimáges confocales de la pila Z de inmunofluorescencia con PGP9.5 (verde) y 5G4 (rojo) de nervios dérmicos alrededor de las glándulas sudoríparas. Las flechas blancas indican estructuras positivas; asteriscos indican tinción inespecífica en estructuras no neuronales. Barra de escala a 50 m. Esta cifra se modifica a partir de la referencia19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : La fijación incorrecta compromete la calidad de la tinción de inmunofluorescencia. Imágenes de la pila Z de fusión confocal de inmunofluorescencia con PGP9.5 (verde) y DAPI (azul) de fibras nerviosas intraepidérmicas (A-B) y nervios dérmicos alrededor de la glándula sebácea (C-D) y glándulas sudoríparas (E-F). En el resultado izquierdo de la fijación correcta, en el resultado derecho de la fijación excesiva. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Ejemplos de otras proteínas detectables en los nervios de la piel. Imágenes de microscopio de estructuras dérmicas teñidas mediante un ensayo de inmunofluorescencia flotante. En rojo , syn (A), p--Syn (B), y TH (C), en verde VIP (D). Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Describimos un ensayo de inmunofluorescencia flotante para biopsias de piel para el diagnóstico de DP: explota la inmunomancha doble con anticuerpo anti-PGP9.5, un marcador panaxonal y anti-5G4, un anticuerpo específico de conformación que reconoce la forma agregada de Syn.
Las grandes ventajas de la biopsia de piel con fines diagnósticos en DP y posiblemente en otros trastornos de la conformación de proteínas son: 1) el acceso directo al tejido nervioso propenso a la enfermedad mediante una técnica ligeramente invasiva y, por lo tanto, con una mejor determinación esperada sensibilidad para los agregados de la sinía que los fluidos biológicos como la sangre o el LESO; 2) la oportunidad de detectar y cuantificar la densidad de fibra nerviosa epidérmica y autonómica como medida de neurodegeneración; 3) la posibilidad de repetir la biopsia de piel en el curso del seguimiento de los mismos pacientes, con el fin de estudiar longitudinalmente la correlación con la progresión de la enfermedad.
El protocolo propuesto aquí es rápido, versátil y tiene pocos pasos críticos. En primer lugar, la fijación de tejido stiene que perseguirse correctamente, de lo contrario una alta autofluorescencia enmascarará la señal específica y evitará el análisis correcto de los datos. El paraformaldehído de la solución fijativa debe hacerse fresco y el pH de 7.4 debe comprobarse con precisión. Es extremadamente importante evitar la formación de ácido fórmico que podría dañar las biopsias. Antes de almacenarla y cortarla, si la compacidad de la biopsia sugiere una fijación incorrecta, la biopsia se debe enjuagar de nuevo con la solución de Sorensen y volver a incubarse con solución de PLP O/N a 4 oC. Además, al principio o al final del protocolo de tinción de inmunofluorescencia, se pueden introducir algunos pasos adicionales para contrarrestar la autofluorescencia. Al comienzo del protocolo (entre los pasos 4.1 y 4.2) se puede realizar un tratamiento con solución de borohidruro sódico (1 mg/ml en TBS; 3 veces durante 10 min), un tratamiento con peróxido de hidrógeno (3%; 15 min) o un tratamiento con glicina (0,1 M en TBS; 1h). Alternativamente al final de la tinción (entre los pasos 4.8 y 4.9), se puede realizar un tratamiento con trippan azul (250 g/ml en TBS; 20 min) o con Sudán Negro (0,5% en 70% EtOH; 30 min). Sin embargo, en todos los casos, además de la reducción de la autofluorescencia, también se producirá una reducción de la señal específica. Alternativamente, las biopsias fijadas incorrectamente se pueden utilizar para realizar inmunohistoquímica clásica de campo brillante. En este caso, sin embargo, la doble inmunomancha para la colocalización de 5G4 y PGP9.5 será más difícil de analizar y difícil de analizar.
Otro paso crítico es la inserción de una biopsia de piel en el criomold (paso 3.3). La orientación de la biopsia hacia la cuchilla de corte es crucial para obtener rodajas en las que la epidermis y la dermis están presentes. El eje longitudinal (epidermis-dermis) tiene que ser paralelo a la parte inferior del criomold, de modo que el lado de la biopsia, no la parte superior o inferior, está orientado hacia el operador. La elección del espesor de las rodajas, de 50 m, está de acuerdo con las directrices europeas para el uso de la biopsia de piel como herramienta de diagnóstico7. Por otra parte, para una detección de agregados de Syn, el espesor de 50 m permite tener con mayor probabilidad tener dentro de la sección estructuras más dérmicas, donde el depósito patológico se encuentra principalmente en PD. Debido al alto espesor, para asegurarse de que toda la sección está tetada, es no se recomienda colocar las secciones en la diapositiva para la tinción, pero en su lugar, una tinción flotante libre es obligatoria. Para este procedimiento, la principal dificultad es transferir las secciones de un pozo a otro usando un pincel pequeño sin dañar las secciones. Se recomienda insertar la punta del cepillo debajo de la biopsia que flota en el líquido, permitiendo que la biopsia se asiente en la punta del cepillo, lleve suavemente la biopsia de un pozo a otro, sumerja la biopsia en la nueva solución y retire el cepillo asegurándose de que no queda ningún residuo de biopsia en el cepillo. Es importante que el operador adquiera habilidades manuales con la práctica.
En conclusión, se trata de un protocolo corto y fácil para el manejo óptimo y la inmunomancha fluorescente de la biopsia de piel. La ventaja de este protocolo con respecto a estudios anteriores es el uso de anticuerpos 5G4, permitiendo la detección de pequeños agregados de la isla por primera vez en fibras nerviosas dérmicas autonómicas de pacientes con DP. Puede ser potencialmente utilizado para fines de diagnóstico en diferentes tipos de trastornos neurodegenerativos que implican PNS, especialmente en las primeras fases, cuando la cura potencial puede ser más eficaz. Las limitaciones del método es que la sensibilidad de la P--Syn y la especificidad de 5G4 siguen siendo subóptimas, pero una combinación de diferentes marcadores en estudios futuros sin duda podría mejorar el rendimiento diagnóstico de la biopsia de piel en PD.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Parkinson Schweiz y ABREOC (el Consejo Asesor de Investigación Científica del Ente Ospedaliero Cantonale) por su apoyo financiero a este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
